Ciclo Celular: Introdução. Rodrigo Martins ICB _ LaNCE _ HU rodrigomartins@ufrj.br

Transcrição

1 Ciclo Celular: Introdução Rodrigo Martins ICB _ LaNCE _ HU rodrigomartins@ufrj.br

2 Células são geradas a partir de células e a única maneira de se fazer nova célula é a DIVISÃO de uma célula pré existente De bactérias a mamíferos multicelulares Ciclos sucessivos de duplicação

3 Quando na presença de estímulos adequados as células podem se multiplicar através de repetidos ciclos de proliferação e divisão celular, que em função dessa natureza cíclica, esse ciclo de vida das células proliferantes foi denominado CICLO CELULAR

4 > Proliferação Celular vs. Crescimento Celular > Nem todas as células precisam crescer para se dividir Divisão Celular em Blastômeros

5 Roteiro Fases do Ciclo Celular Relevância da Pesquisa sobre Ciclo Celular Histórico Os Artistas do Espetáculo : Ciclinas e CDKs Métodos de Estudo do Ciclo Celular

6 Copiar e segregar/dividir material genômico de modo perfeito!

7 Fases do Ciclo Celular

8 > Mitose pode ocorrer sem citocinese > Formação de célula com muitos núcleos > Embriões de Drosophila

9 Particularidades do Ciclo Celular durante a Organogênse/ Desenvolvimento de Organismos Multicelulares Mitose G1 G0 (pós-mitótica) Nascimento G2 Ciclo Celular está Acoplado a Mecanismos de Diferenciação Celular **divisões simétricas vs. assimétricas Síntese de DNA (S)

10 Divisão Meiótica Gera Células Germinativas Haplóides

11 Relevância do Estudo do Ciclo Celular

12 Biologia do Desenvolvimento wt Sox2 Microftalmia Fantes et al. Nature Genet. 33: 461 2, 2003 Olena et al. Genes and Dev. 20: , 2006

13 A Retina de Vertebrados

14 Coordenação entre Proliferação, Saída do Ciclo e Diferenciação é Crucial para Formação da Retina Mitose Desenvolvimento Proliferação Saída do Ciclo Celular Especificação do Tipo Celular Fase S Morte Celular Migração Sinaptogênese

15 Particular Importância do Controle de Ciclo Celular para o Desenvolvimento da Retina Saída Precoce do Ciclo Functional Retina Retinoblastoma Saída Tardia do Ciclo

16 Importância Clínica do Estudo do Ciclo: Biologia do Câncer Saída de um estado quiescente para um estado de proliferação celular ativa é um pré requisito para formação de diversos tumores Necessidade de Controle Inequívoco do Estado Pós-mitótico

17 Células Tronco e Terapias Celulares Células Multipotentes com capacidade de gerar diferentes tipos celulares / tecidos / órgãos Teratomas

18 Prêmio Nobel O Nobel em Fisiologia ou Medicina de 2001 foi dado a pesquisadores que fizeram descobertas sobre os mecanismos moleculares do ciclo celular (proteínas cdk e ciclina e seus mecanismos de ação). Leland Hartwell Tim Hunt Paul Nurse Evans, R., Rosenthal, E.T., Youngblom, J., Distel, D. & Hunt, T. Cyclin: a protein specified by maternal mrna in sea urchin eggs that is destroyed at each cleavage division. Cell 33, (1983) Nurse, P. et al. Genetic control of the cell division cycle in the fission yeast Schizosaccharomyces pombe. Mol. Gen. Genet. 146, (1976). Hartwell, L. H., Culotti, J., Pringle, J.R. & Reid, B.J. Genetic control of the cell division cycle in yeast. Science 183, (1974). Hartwell, H. L.,Culotti, J. & Reid, B. Genetic control of the cell division cycle in yeast. I Detection of mutants. PNAS 66, (1970).

19 Periódicos Internacionais Especializados Desde

20 Histórico

21 Omnis cellula e cellula Toda célula se origina de outra célula similar pré existente Rudolf Virchow, Robert Remak,

22 Na vidada para o XX, a divisão celular foi estudada em detalhe por embriologistas e microscopistas Eduard Strasburger (1875), botânico, e Walther Flemming (1979), que estudava células animais, são considerados os descobridores da MITOSE; Flemming descreveu a cromatina e ambos deduziram que o núcleo estaria relacionado com hereditariedade; Walther Flemming, Eduard Strasburger,

23 Nas décadas de 1970 e 1980, novas metodologias de biologia molecular permitiram os pesquisadores das áreas de biologia celular, bioquímica e genética, de forma conjunta, elucidar os mecanismos moleculares de controle do ciclo celular; Novamente, o progresso científico foi fruto das pesquisas e descobertas terem sido feitas em diversos organismos vivos cada um com suas vantagens biológicas ou metodológicas; Embriologistas vs. Geneticistas Embriologistas Anfíbios, Ouriço do mar e outros invertebrados marinhos Geneticistas Leveduras

24 Cell Cycle Classics

25 Pesquisas em leveduras levaram a descoberta de Genes essenciais para o Ciclo Celular Reprodução rápida Genoma relativamente pequeno ( em torno de 1% do nosso) Fácil manipulação genética Rápida identificação e caracterização de mutantes genéticos;

26 Genes Cdc (Cell division cycle) Busca sistemática por mutações que inativavam genes necessários para o ciclo/divisão celular Cdc15 selvagem Cdc15 mutante

27 Muitas Descobertas sobre a Bioquímica do Ciclo foram feitas Estudando de Ovócitos Anfíbios 1 ovócito de Xenopus tem 1mm de diâmetro e um volume de citoplasma vezes maior que uma célula humana; Fertilização dispara Divisão por Clivagem* do ovócito; Total de 4096 células em 7 horas ( ~15 minutos de fase S e M) Fases G1 e G2 indetectáveis; Fácil de injetar substâncias nas células e observar efeitos no ciclo.

28 Descoberta do MPF ( Maturation promotion factor ) Maturação = indução de entrada em meiose MPF = complexo proteico formado pelas ptns : Cinase Cdc2 (hoje também chamada de Cdk1) e Ciclina B2 Masui e Markert, J. Exp. Zool. 177:

29 A natureza do MPF ( Maturation promotion factor ) COMPORTAMENTO CÍCLICO DO MPF ATIVIDADE DO MPF DEPENDE DE SÍNTESE PROTÉICA Newport, J.W. & Kirschner, M. Cell 37: , 1984 Gerhart, J.; Wu, M. & Kirschner, M. J. Cell Biol. 98: , 1984

30 IDENTIFICAÇÃO DE CICLINAS EM OVOS DE INVERTEBRADO MARINHO MPF E CICLINAS Hunt, T.; Luca, F.C. & Ruderman, J.V. J. Cell Biol. 116: , 1992

31 Cdc2 = CDK1!! Alguns dos genes essenciais para divisão das leveduras codificavam exatamente proteínas que mediavam a atividade bioqímica/biológica do MPF MPF was first known for its function, then as a protein and finally as a gene. In contrast, CDC28 (S. cerevisiae) or cdc2 (S. pombe) was first described as a gene with a known function and only later was the protein identified. Cyclin was first discovered as a protein, then as a gene and finally its function was known as a component of MPF

32 Os Artistas do Espetáculo: Ciclinas e CDKs Ciclinas Proteínas cuja expressão varia de forma dependente da fase do ciclo celular CDK (cinases dependentes de ciclina ) 1 Proteínas cinase capazes de transferir radicais fosfato para seus substratos (vídeo) 2 CDKs são serina treonina cinases 3 Atividade de cinase das CDK depende de associação com as ciclinas 4 Eventos pós traducionais de fosforilação e defosforilação contribuem para a ativação plena das CDK

33 Moléculas Reguladoras do Ciclo são extremamente conservadas evolutivamente

34 Em camundongos, por exemplo, existem aproximadamente 20 enzimas CDK, mas somente algumas regulam a transição entre as fases do ciclo celular (ex: CDK1, CDK2, CDK4, CDK6 e CDK7 A fosforilação de dezenas de substratos celulares por enzimas CDKs específicas em estágios específicos do ciclo celular induz modificações funcionais dos diferentes substratos Eventos como a desmantelamento da membrana nuclear, condensação da cromatina, indução da replicação do DNA e montagem dos fusos mitóticos dependem das fosforilações mediadas por diferentes CDKs Alterações cíclicas na atividade das CDKs depende da associação dessas cinases com as ciclinas. Ao contrário das CDK, cuja expressão não varia muito, a expressão das ciclinas muda dependendo da fase ciclo celular. A transição entre as fases do ciclo celular é regulada por diferentes complexos ciclina/cdk

35 Como as células conseguem variar a quantidade das ciclinas? Transcrição Gênica e Síntese de proteínas vs. Proteólise Controlada Ubiquitinação e Degradação proteossomal

36 CDK1 regula Mitose e tem degradação mediada pelo complexo APC ( anaphase promoting complex )

37 Além da Expressão de Ciclinas (transcricional vs. proteólise) a atividade das CDKs também é regulada por eventos PÓS TRADUCIONAIS

38 Regulação Pós traducional da Ativação de CDK1 Wee1 CAK (MO15, Cdk7/CycH) Cdc25

39 Regulação Simplificada da Transição G1-S do Ciclo Celular G0 (Pós-mitótica) Reguladores Upstream G1 Rb Ciclina/CDK Proto oncogenes (MYC) Ativação de vias de sinalização por Mitógenos S Rb Ciclina / CDK Entrada na fase S Rb = Rb, p107 ou p130 Ciclina D1 Ciclina D3 Ciclina E CDK4/6 CDK2

40 Proteínas Rb: Supressores de Tumor que controlam o Ciclo Celular RBL: Terceiro tipo de câncer pediátrico mais comum Enucleação: Perda de visão Rb1 +/- Somente ~10% de sobrevivência quando ocorre metástase

41 Proteínas CKI (CDK inhibitor) Inibem as CDKs

42 Regulação Simplificada da Transição G1-S do Ciclo Celular G0 (Pós-mitótica) Reguladores Upstream G1 Rb Ciclina/CDK Proto oncogenes (MYC) Supressores de Tumor (p53/arf) S Rb CKI CKI Ciclina / CDK Entrada na fase S Rb = Rb, p107 ou p130 Kip p21 p27 Ink p15, p16 p18, p19 Ciclina D1 Ciclina D3 Ciclina E CDK4/6 CDK2 p57

43 Pontos de Checagem ou Checkpoints É necessário um controle de qualidade da replicação do DNA A perfeição na divisão mitotica é crucial para que os cromossomos duplicados sejam corretamente distribuídos para as células filha O ambiente está propício para que a célula continue se proliferando e entre na fase S novamente?

44 Mecanismos Moleculares de Checkpoints regulam diretamente a atividade das CDKs

45 Técnicas de Estudo Como determinar em que fase do ciclo celular uma célula está? Análogos de timidina são incorporados ao DNA na fase S do Ciclo Timidina Tritiada 3 [H] Bromodeoxi-Uridina BrdU Iododeoxi-Uridina - IrdU Citofluorometria

46 Uso de múltiplos marcadores de Fase S permite detectar Re-Entrada no Ciclo Celular P30 p107 single In vivo BrdU In vivo intervalo In vitro 3 [H] timidina 24 h 48 h 24 h

47 Comparando a Quantidade Total de Células Proliferantes 3 [H] thymidine retinas 3 [H] thymidine H 3 -thymidine 3 [H] thymidine H 3 -thymidine Rb RB1 p27 p27 Kip1 Kip1 Proportion of progenitors dividing at that developmental stage for each animal time (hr)

48 Estudo da Cinética de Progressão no Ciclo Celular: Saída do Ciclo Celular ou Aumento do tempo de Ciclagem? (Exit or Lengthening? ) time (hr) Proporção de células proliferantes se dividindo Velocidade de progressão no ciclo celular

49 Infecção por Retrovírus Incompetente de Replicação no Estudo da Proliferação Celular (Expansão Clonal) E14.5 retinas retina Retrovírus Incapaz de Replicação 10 dias de cultura Clone de 9 células

50 Modelos de Estudo mais Modernos Repórter fluorescente das diferentes fases do ciclo celular in vivo Sakaue Sawano et al., 2008 Cell. 132(3): Visualizing spatiotemporal dynamics of multicellular cell cycle progression

51 Mais Informações Molecular Biology of THE CELL Cap 17 php?title=19th_century_science ll/ncb0101_e1.html