INVESTIGAÇÃO DE ENZIMAS XILANASES A PARTIR DE FUNGOS DE RESIDUOS AGROINDUSTRIAIS.

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1 INVESTIGAÇÃO DE ENZIMAS XILANASES A PARTIR DE FUNGOS DE RESIDUOS AGROINDUSTRIAIS. Cláudia Maria da Silva COSTA - Laboratório de Microbiologia - Grupo de Biotransformações - Universidade federal do Pará Rua Augusto Correa n 01, Guamá, Belém-PA, Brasil. claudiamscosta08@hotmail.com Elaine Cristina Souza MEDEIROS - Laboratório de Microbiologia - Grupo de Biotransformações - Universidade federal do Pará Rua Augusto Correa n 01, Guamá, Belém-PA, Brasil. elaine_sm00@hotmail.com Kelly Christina Mendes de SOUZA - Laboratório de Microbiologia - Grupo de Biotransformações - Universidade federal do Pará Rua Augusto Correa n 01, Guamá, Belém-PA, Brasil. kellychrismen@hotmail.com Marcela do Socorro de Oliveira LEE - Laboratório de Microbiologia - Grupo de Biotransformações - Universidade federal do Pará Rua Augusto Correa n 01, Guamá, Belém-PA, Brasil. marcela.lee.biotec@gmail.com Márcia Gleice da Silva SOUZA - Laboratório de Microbiologia - Grupo de Biotransformações - Universidade federal do Pará Rua Augusto Correa n 01, Guamá, Belém-PA, Brasil. marcia.alimentos@gmail.com Alberdan Silva SANTOS - Laboratório de Microbiologia - Grupo de Biotransformações - Universidade federal do Pará Rua Augusto Correa n 01, Guamá, Belém-PA, Brasil. Alberdan.ufpa@gmail.com RESUMO: A xilana, após a celulose, é a mais abundante fonte renovável de carbono presente na madeira e em resíduos agrícolas. Na natureza, o interesse pela hidrólise da xilana se dá pela ação de várias enzimas do complexo xilanolítico, dentre estas se destacam as xilanases. Estas enzimas são produzidas, principalmente, por microrganismos e são responsáveis pela decomposição da parede celulare das plantas. Os microrganismos, especialmente os fungos, são muito importantes por apresentarem grandes habilidades de produção destas biomoléculas, sobretudo enzimas hidrolíticas extracelulares. Neste contexto, o objetivo deste trabalho foi investigar e avaliar a produção de xilanases extracelular de nove linhagens de fungos isolados de diferentes fontes proveniente de resíduo agroindustrial. As linhagens foram obtidas da micoteca de microrganismos de interesse biotecnológico da Amazônia (MIBA). Todas as linhagens foram investigadas quanto a produção de xilanase em meio semi-sólido. Após 72h de incubação a 30ºC as placas foram reveladas com uma solução de vermelho congo 1% seguida de solução salina 0,1M e um halo translúcido ao redor da colônia foi o indicativo da presença da enzima. Em seguida, as linhagens foram submetidas ao cultivo submerso e a cada 24 horas foram realizadas coletas para determinação de atividade enzimática. Os resultados mostraram que as 9 linhagens de fungos filamentosos apresentaram halo de degradação para produção de xilanase em meio semi-sólido, com halos de produção que variaram de 0,2cm a 0,5cm. Já no cultivo submerso, apenas três linhagens apresentaram atividade enzimática variando de 1,5 a 2,3U/mL. As demais linhagens não apresentaram atividades satisfatórias. PALAVRAS-CHAVE: Xilanase; Fungos; Enzimas. BIOTECNOLOGIA (BIOTEC) 1. INTRODUÇÃO As enzimas são os elementos catalisadores do metabolismo e, como tal, são o foco deintensa investigação em nível mundial na comunidade biológica. A segunda metade do século XX presenciou expansão de conhecimento sem precedentes sobre a utilização de microrganismos e os seus produtos metabólicos, as enzimas, em diversas áreas da pesquisa (BEG et al., 2001). A utilização de enzimas nas indústrias é indispensável, pois através dela pode-se melhorar a qualidade de um produto ou tornar mais fácil a obtenção do mesmo. Essa capacidade deve-se ao fato de que as enzimas atuam sobre as substâncias que compõem um determinado produto, sendo que, para cada substância, existem enzimas específicas que a degradam (LIMA et al, 2001). Dentre os 69

2 microrganismos com potencial para aplicações biotecnológicas são os fungos que vêm despertando interesse, devido à grande diversidade de enzimas que secretam no ambiente, sendo responsáveis pela deterioração de vários materiais naturais. Esses microrganismos desempenham um importante papel na natureza por sua capacidade de ciclagem de nutrientes, decompondo resíduos lignocelulósicos (BENNET, 1998). Sob o ponto de vista industrial, a importância dos fungos para a produção e comercialização de enzimas está na facilidade das mesmas, uma vez produzidas, de serem extraídas, sem a necessidade de haver ruptura celular (HALTRICH et al., 1996).Diversos resíduos estão sendo aproveitados como substratos na produção de enzimas pelos microrganismos. Resíduos lignocelulósicos como palha de arroz, palha de trigo, farelo de trigo e bagaço de cana tem sido utilizados para produção de xilanase com Aspergillus fumigatus (ANTHONY et al., 2003). A produção de xilanase por fungos filamentosos está relatada para várias espécies como, Aspergillus sp (SOUZA, SOUZA e PERALTA, 2001; PALMA, 2003); Fusarium sp (SAHA et al., 2002), Melanocarpus sp e Penicillium sp (PALMA et al., 1996; PALMA, 2003). Xilanases são β- glucanases capazes de catalisar a hidrólise do xilano e devido à sua estrutura heterogênea demandam complexo xilanolítico para sua total degradação e não apenas uma enzima. Os componentes desse sistema que têm sido mais extensivamente estudados são as endoxilanases e as - β-xylosidases. Dependendo de sua origem biológica, uma ou mais isoformas de endo 1,4-βxilosidase (1,4-β-D-xilano-hidrolase, EC ) clivam o xilano randomicamente em suas ligações β-1,4 em pequenos fragmentos como xilotriose e xilobiose. Já a β-xilosidase (β- D-xilosídeoxilohidrolase, EC ) hidroliza xilobiose e pequenos xilo-oligossacarídeos em regiões nãoredutoras até xilose. Endo-xilanases, os maiores componentes do sistema xilanolítico de microrganismos, têm sua ação facilitada por enzimas acessórias que removem as ramificações da cadeia do xilano como a α-l-arabinofuranosidase, α-glucuronidase, acetilxilano esterase e ácido felúrico esterase, entre outras (PRADE, 1995; SIMÃO, SOUZA e PERALTA, 1997; ZANOELO et al., 2004; POLIZELI et al., 2005; COLLINS, GERDAY e FELLER, 2005). 2. OBJETIVO O objetivo deste trabalho foi investigar e avaliar a produção de xilanases extracelular de nove linhagens de fungos isolados de diferentes fontes proveniente de resíduo agroindustrial. 3. MATERIAL E METODOS 3.1 Avaliação da Atividade Xilanásica Meio Semi-Sólido A atividade xilanásica foi investigada utilizando meio XPY (1% (m/v) de xilano, 0,25% (m/v) de extrato de levedura, 0,25% (m/v) de peptona e 2% (m/v) de Agar). As linhagens foram inoculadas no centro do meio de cultivo e incubadas à 30 C por 48 horas. Em seguida, verteu-se sobre as placas uma solução de vermelho congo (0,1% m/v) a qual permaneceu em reação por 30 minutos. O excesso da solução foi drenado e as placas foram lavadas com uma solução de cloreto de sódio 1M e deixou-se reagir por 20 minutos, o excesso foi drenado e o halo indicativo da atividade enzimática, foi mensurado de acordo com a formação de uma zona pálido ao redor da colônia (CHOI et al, 2005). 3.2 Cultivo Submerso para Produção Xilanase. Para o cultivo da atividade xilanásica o meio de cultura utilizado foi XPY, contendo xilana de birchwood (Sigma), sem adição do agar. O ph foi ajustado para 5,0 com HCl. O meio de cultura foi autoclavado a 121ºC por 15 min. Para o preparo do inóculo retirou-se 5 fragmentos de micélio da cultura em placa, o inoculo foi vertido no erlenmeyer e mantido sob agitação de 120 RPM/ 30ºC em shaker rotativo por 10 dias. O processo de produção da enzimas foi acompanhado retirando-se alíquotas no intervalos de 24 horas e analisando-os quanto à produção enzimática. O sobrenadante foi centrifugado a 5000 RPM/ 3 minutos. A análise para a quantificação da atividade xilanásica foi realizada em duplicatas. 70

3 3.3 Determinação da atividade xilanásica. A atividade da enzima xilanase (endo-1,4-ß-xilanase, EC ) foi determinada segundo Menezes, Silva e Durrant (2009). A reação consiste na reação de 400 ml de tampão citrato, 500 ml de solução substrato de 0,5% (m/v) de xilana (Sigma) em 0,05 M de tampão citrato ph 4,8 e 100ml de extrato enzimático em tubo de ensaio, incubada 50º C, por 30 minutos. No controle do reagente, foram adicionados 500 ml da solução tampão, 500 ml de solução substrato, enquanto que no controle da amostra foi adicionado 100 ml de extrato enzimático e 900 ml de uma solução tampão citrato ph 4,8 de 0,05M, também incubados a mesma temperatura pelo mesmo período de tempo. A quantificação de açucares foi realizada de acordo com (Miller, 1959). Após o período de incubação, a reação foi interrompida adicionando-se 1000 ml da solução de ácido 3,5- dinitrosalicílico (DNS). Todos os tubos foram submetidos à água fervente por 5 minutos. Os tubos contendo as reações foram lidos em espectrofotômetro em 540nm. A unidade de atividade enzimática (U) foi definida como a quantidade de enzima capaz de liberar 1 µmol de produto. Foram realizadas as determinações de absorbância, correlacionando os valores absorbâncias apresentadas pelas amostras, com a equação de reta extraída de uma Curva Padrão, construída a partir de uma solução de xilose (1g/L). 4. RESULTADOS E DISCURSSÃO 4.1 Atividade Xilanolítica em Meio Semi-Sólido Inúmeras metodologias foram descritas de forma a facilitar a seleção e o isolamento de microrganismos excretores de hidrolases. Estas metodologias são principalmente baseadas em cultivos dos microrganismos em meio semi sólido, onde o meio específico apresenta a capacidade de identificar a produção de uma determinada enzima (MACIEL, 2006; STAMFORD; ARAÚJO; STAMFORD, 1998; HANKIN; ANAGNOSTAKIS, 1975). A atividade xilanolítica em meio semisólido foi determinada pela correlação entre o tamanho do halo e a capacidade degradativa dos microrganismos. A presença do halo indica que o fungo é capaz de produzir enzimas xilanolíticas, hidrolisando o xilano do meio. Decorrido os cinco dias do experimento, constatou-se que os nove microrganismos foram capazes de hidrolisar o substrato. O halo para ser visualizado depende de diversos fatores: além dos parâmetros físicos e químicos há a interferência da presença de outras substâncias presentes no meio que podem originar resultados positivos pela reação com os corantes, ou negativos, por precipitar o corante e ainda por inibir a ligação da enzima com o substrato (NEIROTTI e AZEVEDO, 1988; COLEN, 2006). Figura 01: Detecção da atividade xilanasica em meio XIL. Fonte: Dados do Autor 71

4 Cultivo Submerso Atividade enzimática xilanásica No screening inicial realizado em cultivo submerso para avaliação do potencial de produção das noves linhagens selecionadas observou-se que apenas três apresentaram potencial para tal atividade, na qual estão codificadas como MIBA0016, MIBA0041 e MIBA0300. Na figura 02 é observado os valores das atividades xilanásicas em (U/mL) nas condições aleatórias de 30 C e 120 rpm, verificando-se que as linhagens MIBA0016, MIBA0041 e MIBA0300 apresentaram atividades com valores de 0,140 U/mL, 0,1 U/mL e 0,140 U/mL, respectivamente, durante o período de aproximadamente 3 dias para MIBA0016, MIBA0041 e 5 dias para MIBA0300. As demais linhagens não apresentaram potencial de degradação do substrato no meio de cultivo. Figura 02. Atividade enzimática para xilanase. Fonte: Dados da pesquisa. 0,160 0,140 Atividade (U/mL) 0,120 0,100 0,080 0,060 0,040 0,020 MIBA-0016 MIBA-0041 MIBA-0089 MIBA-0119 MIBA-0300 MIBA-0494 MIBA-0500 MIBA-0512 MIBA , Período de Cultivo (dias) 5. CONCLUSÃO Através dos resultados obtidos pelos experimentos foi possível concluir que: Os microrganismos revelaram-se bons produtores de xilanases em meio semi-sólido tendo em vista o tamanho do halo formado em relação ao diâmetro de crescimento. Fungos filamentosos tornam-se uma alternativa na busca de enzimas com vasta aplicação industrial e ambiental. Estes fungos apresentam diferentes habilidades de produção de enzimas e está habilidade foi o ponto de partida para a seleção de linhagens de interesse tecnológico. 72

5 REFERÊNCIAS ANTHONY, T.; RAJ, K.C.; RAJENDRAN, A.; GUNASEKARAN, P. Highest molecular weight cellulase-free xilanase from alkali-tolerant Aspergillus fumigatus AR1. Enzyme and Microbial Technology, v. 32, p , BEG, Q.K.; KAPOOR, M.; MAHAJAN, L.; HOONDAL, G.S. Microbial xylanases and their industrial applications: a review. Applied Microbiology and Biotechnology, v. 56, p , Bennet, J.W. Mycothecnology: the role of fungi in biotechnology. J. Biotechnol., v.66, p , CHOI, Y. W., HODGKISS, I. J., HYDE, K. D. (2005). Enzyme production by endophytes of Brucea javanica. J. Agric. Sci. Technol. 1, COLLINS, T.; GERDAY, C.; FELLER, G. Xylanases, xilanase families and extremophilic xylanases. FEMS Microbiol. Rev., v. 29, p. 3-23, DOI: /j.femsre GHOSE, T.K. Measurement of celulase activities. Pure & Appl. Chem., Vol. 59, Nº 2, p , Haltrich, D., Nidetzky; B., Kulbe, K. D.; Steiner, W.; Zupancic. S. Production of fungal xylanases. Bioresource Technol. v.58, p , HANKIN, Lester; ANAGNOSTAKIS, S. L. The Use of Solid Media for Detection of Enzyme Production by Fungi. Mycological Society of America, v. 67, n. 3, p , LIMA, U. A. ; AQUARONE, E. ; BORZANI, W. ; SCHIMIDELL, W. Biotecnologia Industrial: Processos Fermentativos e Enzimáticos, v. 3, Ed. Edgard Blücher, São Paulo, 2001, 593 p. MACIEL, G. M. Desenvolvimento de bioprocesso para produção de xilanases por fermentação no estado sólido utilizando bagaço de cana de açúcar e farelo de soja p. Dissertação (Mestrado em Processos Biotecnológicos) - Universidade Federal do Paraná, Curitiba, 2006 MENEZES, C.L.; SILVA, I.S. e DURRANT, M.R. Bagaço de cana: fonte para produção de enzimas ligninocelulolíticas, Estudos Tecnológicos - Vol. 5, n 1:68-78, PALMA, M.B.; MILAGRES, A.M.F.; PRATA, A.M.R.; MANCILHA, I.M. Influence of aeration on agitation rate on the xylanase activity from Penicillium janthinellum. Process Biochemistry, v. 31, n. 2, p , PALMA, M.B. Produção de xilanases por thermoascus aurantiacus em cultivo em estado sólido. Florianópolis, p. Tese (Doutorado em Engenharia Química), Centro Tecnológico, Departamento de Engenharia Química e Engenharia de Alimentos, Universidade Federal de Santa Catarina. POLIZELI, M.L.T.M.; RIZZATI, A.C.S.; MONTI, R.; TERENZI, H.F.; JORGE, J.A.;. AMORIM, D. S. Xylanases from fungi: properties and industrial applications. Applied Microbiology Biotechnology, v. 67, p , PRADE, R. A. Xylanases from biology to biotechnology. Biotechnology and Genetic Engineering Reviews, v. 13, p ,

6 SAHA, B.C. Production, purification and properties of xylanase from a newly isolated Fusarium proleferatum. Process Biochemistry, v. 37, n.11, p , 2002 SIMÃO, R.C.; SOUZA, C.G.M.; PERALTA, R.M. Induction of xylanase in Aspergillus tamarii by methyl β-d-xyloside. Applied Microbiology and Biotechnology, v. 47, p , SOUZA, D.F; SOUZA, C.G.M.; PERALTA, R.M. Effect of easily metabolizable sugars in the production of xylanase by Aspergillus tamarii in solid-state fermentation. Process Biochemistry, v. 36, p , STAMFORD, T. L. M.; ARAÚJO, J. M.; STAMFORD, N. P. Enzymatic Activity of microorganisms isolated from yam bean legume (Pachyrhizus erosus L. Urban) (Pachyrhizus erosus L. Urban). Ciência e Tecnologia de Alimentos, v. 18, p , ZANOELO, F.F.; POLIZELI, M.L.T.M,; TERENZI, H.F.; JORGE, J.A. Purification and biochemical properties of a thermostable xyloside-tolerant β-d-xylosidade from Scytalidium thermophilum. Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology, v. 31, n. 4, p ,