mamários p63 positivos.

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1 UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO FACULDADE DE MEDICINA DE RIBEIRÃO PRETO DEPARTAMENTO DE PATOLOGIA Heveline Becker de Moura A expressão diferencial da telomerase e do fator de crescimento vascular endotelial pode contribuir para o comportamento mais agressivo dos carcinomas mamários p63 positivos. Ribeirão Preto 2008

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3 Heveline Becker de Moura A expressão diferencial da telomerase e do fator de crescimento vascular endotelial pode contribuir para o comportamento mais agressivo dos carcinomas mamários p63 positivos. Dissertação de Mestrado apresentada ao Departamento de Patologia da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo para obtenção do título de Mestre em Patologia Humana Orientador: Prof. Dr. Alfredo Ribeiro-Silva Ribeirão Preto 2008

4 FICHA CATALOGRÁFICA Moura, Heveline Becker de A expressão diferencial da telomerase e do pode contribuir para o comportamento mais agressivo dos carcinomas mamários p63 positivos. 115 p.: il.; 30 cm Dissertação de mestrado apresentada à Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto - Universidade de São Paulo. Área de Concentração: Patologia. Orientadora: Prof. Dr. Afredo Ribeiro-Silva 1. p63 2. carcimoma mamário 3. imuno-histoquímica 4. Telomerase 5. fator de crescimento vascular endotelial

5 "Grandes realizações não são feitas por impulso, mas por uma soma de pequenas realizações." Vincent Van Gogh

6 Dedicatórias À minha mãe, Ana Cândida Becker Campos, pelo apoio e amor incondicional para com os filhos, que possibilitaram o meu desenvolvimento profissional. A meu pai, Estevido José Moura, pelos bons momentos da minha infância. A meu irmão, Newton Célio Becker de Moura, pela amizade e carinho constantes. Ao Doug e Juca, pela alegria que sempre trazem a minha vida. À minha prima e madrinha, Jaqueline, pela iniciação no mundo das artes. Às minhas Tias, que sempre acompanharam meus passos com carinho, amor e atenção. À minhas primas e aos meus primos, pela amizade.

7 Aos meus avós e avôs, pelas lembranças encantadoras da vida; A toda minha família, que apesar da distância, sempre prezou pelo sentimento de união. Aos amigos de Ribeirão Preto, Fernanda, Gyl, Raquel, Luciana, Vinicius, Isabel, Igor e Guilherme, pelos bons momentos vividos nesta saudosa cidade. À Dra Catarina Schaletich, pelo acolhimento, pelos ensinamentos de patologia e pela amizade que tornaram inesquecíveis os momentos que morei em Ribeirão Preto; Ao meu amigo e companheiro, Régis Eric Maia Barros, pelo amor, paciência e a vida que construímos juntos.

8 Agradecimentos Agradeço a todos que contribuíram para a realização deste trabalho Agradeço ao meu Orientador, Prof. Dr. Alfredo Ribeiro-Silva, por ter acreditado no meu potencial; Agradeço a Deisy Mara da Silva pelo apoio técnico na realização dos exames de imuno-histoquímica; Agradeço aos Residentes e Médicos Assistentes do Serviço de Patologia os quais e aos docentes do Departamento de Patologia da FMRP/USP, através do convívio diário, transformaram a rotina do trabalho em algo especial, estimulante e prazeroso; Agradeço ao Prof. Dr. Sérgio Zucoloto, Chefe do Departamento de Patologia da FMRP/USP, ao Prof. Dr. Roberto Silva Costa, Coordenador do Serviço de Patologia do HCFMRP/USP, e ao Dr. Daniel Ferracioli Brandão, Diretor Técnico do Serviço de Patologia do HCFMRP/USP, por terem fornecido as condições necessárias para a realização do projeto;

9 Agradeço à histotécnica Deisy Mara da Silva pelo suporte técnico na realização do método imuno-histoquímico; Agradeço aos arquivistas do Serviço de Patologia do HCFMRP/USP, Décio Antônio Barrionovo Filho e César Alberto Brigato Júnior, pela presteza em separar dos arquivos as lâminas e blocos de parafina utilizados no projeto; Agradeço ao Prof. Dr. Sérgio Britto Garcia, coordenador do Programa de pós-graduação do Departamento de Patologia da FMRP/USP, pelo apoio em todas as atividades acadêmicas relacionadas à pós-graduação; Agradeço às secretárias, aos técnicos do laboratório e da sala de necropsia do Serviço de Patologia da FMRP/USP que contribuíram que os estudos da residência de patologia cirúrgica continuassem na pós-graduação; Agradeço à saudosa Edna Pio, pelo apoio em todas as atividades da residência de patologia da FMRP/USP e da pós-graduação; Agradeço às secretárias do Departamento de Patologia da FMRP/USP, Neide Terezinha Gonçalves e Rosângela Mazzucoto Castania de Paiva, pela solicitude.

10 Este trabalho contou com apoio financeiro da Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP- Processo 2003/ )

11 Este trabalho resultou na seguinte publicação The differential regulation of human telomerase reverse transcriptase and vascular endothelial growth factor may contribute to the clinically more aggressive behavior of p63-positive breast carcinomas The International Journal of Biological Markers 2005; 20: 1-8.

12 Sumário LISTA DE TABELAS LISTA DE ILUSTRAÇÕES LISTA DE ABREVIATURAS RESUMO SUMMARY 1. INTRODUÇÃO REVISÃO DA LITERATURA A família do gene p A estrutura dos membros da família p As isoformas da família p53: funções e vias metabólicas A família p53 e a carcinogênese O gene p Estrutura do gene p Função do gene p O gene p63 como fator de transcrição O gene p63 na regulação do ciclo celular e apoptose p63: Oncogene ou gene supressor tumoral? A relação do gene p63 com o desenvolvimento embrionário e com os tecidos epiteliais Expressão da proteína p63 em tecidos normais... 14

13 2.2.5 O p63 em síndromes humanas O p63 e neoplasias de células escamosas O p63 em neoplasia de cabeça e pescoço O p63 em neoplasias uroepiteliais O p63 em neoplasias ginecológicas O p63 e outras neoplasias O p63 em patologia mamária A biologia molecular do câncer O Ciclo celular e genes que regulam o ciclo celular Alterações essenciais para a transformação maligna Transformação maligna na mama Auto-suficiência nos sinais de crescimento Insensibilidade aos sinais inibidores Potencial infinito de replicação: Telomerase Angiogênese Invasão tecidual e Metástase Fatores prognósticos em câncer de mama Fatores clínico-patológicos e prognósticos utilizados na rotina de patologia mamária Marcadores imuno-histoquímicos não definidos quanto ao seu papel ou com papel secundário na rotina de patologia mamária JUSTIFICATIVA OBJETIVOS... 66

14 5. METODOLOGIA Sujeito Imuno-histoquímica Controles da imuno-histoquímica Interpretação das reações de imuno-histoquímica Análise estatística RESULTADOS DISCUSSÃO CONCLUSÕES BIBLIOGRAFIA

15 Lista de tabelas Tab. 1 Distribuição da proteína p63 em tecidos adultos normais Tab. 2 Concentrações, clones, diluições e fabricantes dos anticorpos utilizados Tab. 3 Interpretação da positividade dos anticorpos utilizados no estudo Tab. 4 Padrão de imunomarcação e escores utilizados para a avaliação de expressão do c-erbb Tab. 5 Interpretação imuno-histoquímica do ki Tab.6 Tab. 7 Tab. 8 Tab. 9 Tab. 10 Tab. 11 Padrão de imunomarcação e escores utilizados para a avaliação de expressão do EMMPRIN, MMP1, MMP2, PAI, TIMP1 e TIMP Estudo imuno-histoquímico dos fatores clínico-patológicos e prognósticos utilizados na rotina de patologia mamária Relação da expressão da proteína p63 nos carcinoma ductais invasores com fatores clínico-patológicos Positividade da reação de imuno-histoquímica para as proteínas que atuam como reguladores do ciclo celular nos carcinomas ductais invasores Relação entre a expressão de fatores reguladores do ciclo celular e a expressão da proteína p63 nos carcinoma ductais invasores Positividade da reação de imuno-histoquímica para as proteínas que atuam como reguladores da apoptose nos carcinomas ductais invasores

16 Tab.12 Relação entre a expressão imuno-histoquímica de fatores reguladores da apoptose e a expressão da proteína p63 nos carcinoma ductais invasores Tab.13 Tab.14 Positividade da reação de imuno-histoquímica para as proteínas que atuam no processo de invasão e metástase nos carcinomas ductais invasores Relação da proteína p63 com o VEGF e com outras proteínas envolvidas no processo de invasão e metástase nos carcinomas ductais invasores... 90

17 Lista de ilustrações Figura 1 Marcação nuclear da proteína p Figura 2 Exemplo de marcação nuclear Figura 3 Exemplo de marcação citoplasmática Figura 4 Exemplo de marcação de membrana... 80

18 Lista de abreviaturas Akt: APAF-1: proteína da família serina/treonina quinase; protease apoptótica ativadora do fator 1 ( apoptotic protease activating factor 1 ); APO-1: proteína indutora de apoptose 1( apoptosis inducing protein 1 ); ATP: Bad: Bag-1: Bax: Bcl-2: Bcl-2: BRCA-1: BRCA-2: CDK: C-erbB-2: Chk-2: Cip/Kip: adenosina tri-fosfato; proteína que está ligada à membrana mitocondrial de membros antiapoptóticos da família Bcl-2; proteína anti-apoptótica da família bcl-2. O gene que codifica esta proteína está em itálico (Bag-1); proteína pró-apoptótica da família bcl-2 (bcl-2 associated X protein antibody). O gene que codifica esta proteína está em itálico (Bax); gene que está localizado na membrana mitocondrial interna de numerosos tipos celulares. Considerado um proto-oncogene; proteína codificada pelo gene bcl-2 e promove a sobrevivência celular, inibindo a ocorrência de apoptose; gene breast cancer 1 responsável pela reparação do DNA; gene breast cancer 2 responsável pela reparação do DNA; quinases ciclina-dependentes; produto do oncogene HER-2/neu(c-erbB-2); proteína responsável pela parada do ciclo celular ou apoptose quando o DNA celular sofre danos; inibidores de quinases ciclina-dependentes. A família Cip/Kip é constituída pelas proteínas p21, p27 e p57; COOH-terminal: carboxiterminal; CpG: DAB: DBD: são citosinas que são seguidas imediatamente por uma guanina (dinucleotídeos CpG). diamino-benzidina; domínio de ligação ao DNA ( Domain Binding DNA );

19 DNA: E2F: EGFR: ácido desoxirribonucléico; proteína E2F regula a expressão de vários genes promotores de crescimento Receptor do fator de crescimento epitelial. EMMPRIN: Indutor das metaloproteinases da matriz extracelular ; FAK: FAS: FMRP: quinase de adesão focal intracitoplasmática; proteína codificada pelo gene Fas e é um membro da família dos receptores TNF; Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto; G1: fase pré-sintética do ciclo celular; G2: fase pré-mitótica do ciclo celular; HCFMRP: Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto; HER-1, HER-2, HER-3, HER-4: são membros da família de receptores HER (factor de crescimento epidérmico humano- EGFR); htert: htr: INK4a/ARF: Ki-67: LOH: sub-unidade catalítica com atividade transcriptase reversa da telomerase; htp: sub-unidade da telomerase que desempenha papel estrutural; sub-unidade de RNA da telomerase; gene que codifica proteínas inibidoras da quinase ciclinadependentes; indicador de proliferação celular; perda da heterozigosidade; M: fase mitótica do ciclo celular; MDM2: MMP: proteína importante na via de degradação da p53. Abreviação de Mouse double minute 2 ; metaloproteinases; NH 2 -terminal: aminoterminal; NOXA: gene pró-apoptótico depedente do p53; NOS: sem outra especificação ( nother otherwise specified );

20 OD: OPN: PAI: PBS: PCR: domínio de oligomerização ( oligomerization domain ); osteopontina; Inibidor do ativador do plasminogênio; solução salina fosfatada e tamponada; reação de polimerase em cadeia; PERP: gene pró-apoptótico depedente do p53; PI-3 quinase: PIK3CA: P14ARF: P16INK4a: fosfatidil-inositol-3-quinase. Importante na regulação da mitogênese; enzima fosfoinositídeo 3-quinase; proteína reguladora do ciclo celular e produzida no locus INK4A; proteína reguladora do ciclo celular e produzida no locus CDKN2A (INK4A); p21, p27, p57: proteínas reguladoras do ciclo celular. Atuam como inibidoras das quinases ciclina-dependentes; P53: gene supressor tumoral. Codifica a proteína p53; p53 - / - : célula sem alelos p53; p63: gene da família p53. Codifica a proteína p63; p63 - / - : célula sem alelos p63; p73: gene da família p53. Codifica a proteína p73; Rb: RE: RET: RNA: RP: RT-PCR: S-100: SAM: proteína de susceptibilidade ao retinoblastoma que atua na regulação do ciclo celular; Receptor de estrógeno; proto-oncogene. Abreviação de "rearranged during transfection ; Ácido ribonucléico; Receptor de progesterona; reverso da transcrição da reação em cadeia de polimerase; proteína utilizada em reações de imuno-hsitoquímica; domínio de interação proteína-proteína conhecido como sterile alpha motive das proteínas p63α (TAp63 e Np63);

21 Síndrome ADULT: Síndrome AEC: Síndrome EEC: Síndrome LMS: Síndrome SHFM: acro-dermato-ungual lacrimal tooth syndrome ; ankyloblepharon-ectodermal dysplasia-clefting syndrome ; ectodermal dysplasia, ectrodactyly and clefting syndrome ; limb-mammary syndrome ; split hand/split foot malformation syndrome ; SV40/H-ras: oncogene. Abreviação de simian virus 40 e harvey rat sarcoma viral oncogene homolog, respectivamente; TAD (TA): domínio de transativação ( transactivation domain ) ; TAp63α, TAp63β, TAp63γ: proteínas que codificam o domínio de transativação (TA) do p63; TIMP-1: Inibidor da metaloproteinase tipo 1; TIMP-2: Inibidor da metaloproteinase tipo 2; tpa: TNF: TNM: TRAP: USP: upa: VEGF: VEGFR: ativador de plasminogênio do tipo tecidual; Fator de necrose tumoral; sistema usado para o estadiamento de neoplasias; protocolo da amplificação repetida da telomerase; Universidade de São Paulo; ativador de plasminogênio do tipo uroquinase; Fator de crescimento endotelial vascular; Receptor do fator de crescimento endotelial vascular. Np63α, Np63β, Np63γ: proteínas que não apresentam o domínio de transativação ( N) do p63; 34βE12: citoqueratina de baixo peso molecular.

22 Resumo O p63, homólogo do p53, é marcador de células mioepiteliais nas glândulas mamárias normais e pode ser encontrada em cerca de 11% dos carcinomas mamários invasivos. O objetivo deste trabalho é estudar a relação entre a expressão da p63, fatores clínico-patológicos e marcadores utilizados em patologia mamária, incluindo reguladores do ciclo celular, oncogenes, proteínas relacionadas a apoptose, metaloproteinases e inibidores das metaloproteinases. Foi realizado estudo imunohistoquímico com 27 anticorpos primários em 100 casos de carcinomas ductais invasores. Células p63 positivas foram encontradas em 16% dos carcinomas. Os carcinomas p63-positivos são pouco diferenciados, negativos para receptores hormonais e apresentam índice de proliferação elevado. Estes carcinomas também apresentam correlação com estadiamento patológico avançado, tamanho tumoral e expressão de htert, TIMP1 e VEGF. A expressão de TIMP1 sugere que o estímulo antiproteolítico pode estar presente nos carcinomas p63 positivos. A atividade do htert está associada com metástase para linfonodos e proliferação celular. O VEGF regula a angiogênese que é um evento fundamental para o processo de crescimento tumoral e disseminação metastática. Portanto a expressão do htert e do VEGF nos carcinomas p63 positivos pode contribuir para o comportamento clínico mais agressivo destes carcinomas

23 Summary p63, a p53 homologue, is a myoepithelial cell marker in the normal mammary gland but p63-positive neoplastic cells may be found in up to 11% of invasive breast carcinomas. This study aims to verify the relationship between p63 expression and several clinicopathological features and tumor markers of clinical significance in breast pathology including key regulators of the cell cycle, oncogenes, apoptosisrelated proteins, metalloproteinases and their inhibitors. Immunohistochemistry with 27 primary antibodies was performed in 100 formalin-fixed paraffin-embedded samples of invasive ductal carcinomas. p63-positive cells were found in 16% of carcinomas. p63-positive carcinomas were poorly differentiated, hormone receptornegative neoplasms with a high proliferation rate. p63 also correlated with advanced pathological stage, tumor size, and the expression of human telomerase reverse transcriptase (htert), tissue inhibitor of matrix metalloproteinase 1 (TIMP1) and vascular endothelial growth factor (VEGF). The expression of TIMP1 suggests that the anti-proteolytic stimuli may be preponderant in p63-positive carcinomas. htert activity is associated with nodal metastases and cellular proliferation. VEGF regulates angiogenesis, which is also a fundamental event in the process of tumor growth and metastatic dissemination. Thus, the differential regulation of htert and VEGF in p63-positive breast carcinomas may contribute to the clinically more aggressive behavior of these neoplasms.

24 Introdução 1 1. INTRODUÇÃO O p63 é um homólogo do gene p53 localizado no cromossomo 3q27-29 (Osada et al., 1998; Yang et al., 1998). Ele faz parte da família do gene p53, mas codifica proteínas com propriedades distintas dos outros genes de sua família. O p53 é considerado como gene supressor tumoral, no entanto o p63 apresenta atividade biológica diversa, complexa e pouco definida (Moll; Slade, 2004; Westfall; Pietenpol, 2004). Em condições normais, a proteína p63 é expressa nos tecidos embrionários e no núcleo de células basais de muitos tecidos epiteliais em adultos como a epiderme, o epitélio glandular mamário, o epitélio oral, o epitélio glandular prostático e o urotélio (Di Como et al., 2002; Signoretti et al., 2000; Westfall; Pietenpol, 2004). O gene p63 está envolvido no desenvolvimento de órgãos que contêm tecidos epiteliais, membros, estruturas crânio-faciais e anexos. De fato, camundongos deficientes em p63 apresentam anomalias no desenvolvimento embrionário, como ausência de folículos pilosos, dentes, glândulas mamárias, salivares e lacrimais (Mills et al., 1999; Yang et al., 1999). Em patologia mamária, a proteína p63 é considerada um marcador com alta especificidade e sensibilidade para células mioepiteliais, tanto em cortes histológicos como em estudos citológicos (Barbareschi et al., 2001; Batistatou et al., 2003). Através de estudos imuno-histoquímicos, a proteína p63 é expressa por um padrão de marcação contínua nas células mioepiteliais do tecido glandular mamário normal. Na hiperplasia ductal florida e no carcinoma ductal in situ são observadas raras células p63-positivas. Os carcinomas ductais invasivos geralmente são negativos para a proteína p63. Estes dados sugerem associação entre a perda da expressão da proteína p63 com a progressão do carcinoma ductal (Ribeiro-Silva et al., 2003; Stefanou et al., 2004; Wang et al.,

25 Introdução ). Entretanto, uma positividade de até 11% é observada em células neoplásicas de carcinomas mamários (Barbareschi et al., 2001; Ribeiro-Silva et al., 2003; Stefanou et al., 2004). O papel da proteína p63 na regulação do ciclo celular, na apoptose, em síndromes genéticas e na carcinogênese ainda é pouco conhecido. Este estudo tem por finalidade investigar, em carcinomas ductais invasores, a relação entre a expressão da proteína p63, fatores clínico-patológicos e prognósticos utilizados na rotina de patologia mamária e proteínas envolvidas na progressão tumoral, incluindo proteínas reguladoras do ciclo celular, da apoptose, da angiogênese, da metástase e invasão tumoral, além de produtos de oncogenes.

26 Revisão da Literatura 3 2. REVISÃO DA LITERATURA 2.1 A família do gene p53 O gene p53 está localizado no braço curto do cromossomo 17 e codifica a proteína nuclear 53-kd. Este gene exerce função de supressor tumoral em mamíferos. Ele pode se apresentar na forma selvagem e na forma mutada. O tipo selvagem encontra-se no núcleo de todas as células dos mamíferos. Está envolvido na regulação do ciclo celular e na indução da apoptose quando há agressão ao DNA celular. A forma mutada ou a inativação do gene p53 estão relacionadas com eventos que resultam no desenvolvimento e progressão tumoral (Moll; Slade, 2004;Yang et al., 1998). Em 1997 e 1998 foram identificados genes homólogos ao p53 denominados p63 e p73 (Osada et al., 1998; Yang et al., 1998). O p63 e o p73 apresentam estrutura semelhante a do p53, funções relacionadas com as do p53 e funções diferentes das exercidas pelo p53. As funções relacionadas ao p53 ainda podem ser sinérgicas ou de interferência (Moll; Slade, 2004). Por exemplo, camundongos deficientes em p73 apresentam taxas de apoptose aumentadas, sugerindo que em condições normais o p73 tem uma atividade anti-apoptose, contrapondo-se ao efeito pró-apoptose do p53. Esta seria a função de inteferência relacionadas ao p53 (Moll; Slade, 2004; Ribeiro-Silva; Zucoloto, 2003). Entretanto, de maneira similar ao p53, o p73 e o p63 podem bloquear o ciclo celular e desencadear apoptose quando há lesão ao DNA, exemplificando a função sinérgica relacionadas ao p53 (Moll; Slade, 2004; Ribeiro-Silva; Zucoloto, 2003).

27 Revisão da Literatura A estrutura dos membros da família p53 Os membros da família p53 apresentam homologia estrutural. Todos possuem um domínio de transativação (TAD transactivation domain ) próximo ao aminoterminal (NH 2 -terminal), um domínio de ligação ao DNA (DBD DNA binding domain ) e um domínio de oligomerização (OD oligomerization domain ) próximo ao carboxiterminal (COOH-terminal). O mais alto grau de homologia entre os genes da família p53 é verificado no DBD (63% da seqüência de aminoácidos são idênticos entre o p53 e o p73 e 60% são idênticos entre o p53 e o p63) (Di Como et al., 2001; Moll; Slade, 2004; Yang et al., 1998; Westfall; Pietenpol, 2004). As proteínas codificadas pelos genes podem possuir ou não o domínio de transativação. As proteínas que codificam o domínio de transativação são denominadas TA (TAp53, TAp63 e TAp73). As proteínas que não apresentam o domínio de transativação são denominadas N ( Np53, Np63 e Np73) (Di Como et al., 2001; Yang et al., 1998; Westfall; Pietenpol, 2004). Segundo Moll e Slade (2004), as proteínas com o domínio TA simulam as funções do p53 em culturas de células, incluindo a ativação de genes alvo do p53 e a indução da apoptose. As proteínas denominadas N atuam como inibidores de membros da família p53 (Moll; Slade, 2004). As proteínas derivadas dos genes p63 e p73 podem acrescentar emendas no COOH-terminal e dar origem a diferentes produtos conhecidos como isoformas destes genes. O p73, por exemplo, pode formar isoformas produzindo pelo menos seis proteínas diferentes que foram identificadas com letras gregas de α a ζ. As proteínas codificadas pelo p73 podem apresentar o domínio de transativação: TAp73α a TAp63ζ. As proteínas que não apresentam o domínio de transativação são denominadas de

28 Revisão da Literatura 5 Np73α a Np73ζ (Di Como et al., 2001; Ribeiro-Silva; Zucoloto, 2003; Yang et al., 1998; Westfall; Pietenpol, 2004). O p63 e o p73 exibem estrutura mais complexa do que a do p53. Eles possuem no COOH-terminal um domínio denominado sterile alpha motif (SAM) que não está presente nos produtos derivados do p53. Foi descrito que este domínio está envolvido no processo de desenvolvimento embrionário, de apoptose e na ativação de transcrição (Westfall; Pietenpol, 2004). O p63 e o p73 ainda possuem um domínio inibidor nas isoformas α e dois promotores. O promotor P1 produz isoformas TA que possuem atividade transcricional e o promotor P2 produz isoformas N que possuem atividade de dominante negativo (Moll; Slade, 2004) As isoformas da família p53: funções e vias metabólicas A depender da isoforma atuante, os produtos dos genes da família p53 podem exercer funções diferentes. Por exemplo, estruturalmente as isoformas γ dos genes p63 e p73 são as que mais se assemelham ao gene p53. A isoforma TAp63γ possui atividade de transcrição e de indução da apoptose tão potente quanto ao do p53. No entanto, a isoforma TAp73γ exerce as mesmas atividades da TAp63γ de forma menos intensa. Já a isoforma TAp73α exerce as atividade de transcrição e de indução da apoptose de forma mais intensa que a da TAp63α (Moll; Slade, 2004). As isoformas da família p53 exercem atividades diversificadas, pois atuam sobre proteínas-alvo e vias metabólicas diferentes que serão pormenorizados no decorrer do texto (Moll; Slade, 2004). Por exemplo, o p53 age em diferentes vias. Entre elas encontram-se as que envolvem as proteínas p21, bax, bcl-2 e ChK2. Atuando como reparador do DNA, o p53 induz a proteína p21. Esta promove parada do ciclo celular

29 Revisão da Literatura 6 para que o DNA possa ser reparado. Quando ocorre dano grave ao DNA e este não pode ser reparado, o p53 induz a apoptose, regulando positivamente o bax e negativamente o bcl-2(rieger, 2004). A proteína ChK2, também conhecida como quinase de estresse, ativa o p53 quando ocorre ação dano ao DNA celular (Ahn et al., 2004; Moll; Slade, 2004). O p53 ainda exerce ação inibitória sobre o VEGF (fator de crescimento endotelial vascular) (Hanahan; Weinberg, 2000; Moll; Slade, 2004; Rieger, 2004). Outras vias como a da proteína p14arf aumenta os níveis da proteína p53 através da inibição da atividade da MDM2 ( mouse double minute 2 ), proteína que promove a degradação do p53 (Hanahan; Weinberg, 2000; Rieger, 2004). O p73 age na via das proteínas p21, σ e p16. Esta última exerce sua atividade sobre membros anti-apoptótico da família bcl-2. O p73 a induz a formação do MDM2. Ao estimular a formação do MDM2, o p73 deve exercer o que Moll e Slade (2004) denominaram de função de interferência relacionada ao p53. Portanto, o p73 deve exercer algum tipo de efeito inibitório sobre o p53 (Ribeiro-Silva; Zucoloto, 2003; Moll; Slade, 2004). Moll e Slade (2004) descreveram que alguns oncogenes, como o c-myc, podem induzir isoformas do p73. Este gene ainda inibe o VEGF e interage com várias ciclinas e quinases ciclina-dependentes (Garcia et al., 2004; Ishimoto et al., 2002; Moll; Slade, 2004). Em relação à embriogênese, o p63 parece ser essencial ao desenvolvimento e à diferenciação de determinados tecidos epiteliais. Já o p73 está envolvido no desenvolvimento de estruturas e células do sistema nervoso (Moll; Slade, 2004, Yang et al., 1998) A família p53 e a carcinogênese Em relação à carcinogênese, o supressor tumoral p53, é um dos genes mais freqüentemente mutado em todos os cânceres humanos. Neoplasias de cólon, mama,

30 Revisão da Literatura 7 cérebro e pulmão mostram mutação de sentido trocado ( missense ) do p53. Outras neoplasias malignas, como os sarcomas, não apresentam alterações no p53, mas apresentam superexpressão da proteína MDM2 ( mouse double minute 2 ), que promove a degradação da proteína p53 (Yang et al., 1998). O p73 foi mapeado no cromossomo 1p36, uma região em que a perda da heterozigosidade é freqüentemente observada em tumores humanos, como câncer de mama, cólon, neuroblastomas, oligodendrogliomas e melanoma (Moll; Slade, 2004; Ribeiro-Silva; Zucoloto, 2003). A perda de alelos no braço 1p é observada em 13% a 75% dos carcinomas mamários, conforme o intervalo gênico estudado. Tumores mamários com estas perdas apresentam pior prognóstico, apresentando alto grau histológico, invasão angiolinfática peritumoral e ausência de receptores hormonais (Ribeiro-Silva; Zucoloto, 2003). A superexpressão do gene p73 é encontrada em leucemia linfóide crônica de células B, meningiomas, neuroblastomas, câncer de mama, de pulmão, de esôfago e em diversos outros tumores (Moll; Slade, 2004). Estudos de mutação realizados em diferentes tumores humanos detectaram raras mutações do p73 aparentemente sem significado. Vários tumores expressam altos níveis da proteína p73 quando comparados com o tecido normal que os origina, sugerindo que, na realidade, possa ocorrer uma expressão alterada do p73, e não a perda de sua função, como ocorre com o p53 (Ribeiro-Silva; Zucoloto, 2003). Nos carcinomas de células escamosas de cabeça e pescoço, tanto o p53 como as isoformas do p63 e do p73 são expressas, sugerindo que tanto o p63 quanto o p73 tenham participação importante na carcinogênese dos tumores escamosos da cabeça e pescoço, atuando como oncogenes (Gwosdz et al., 2005). Apesar de estar presente em diversos tumores, a função do p73 na carcinogênese não é bem definida. Alguns estudos denominam o p73 e, por vezes, o p63 como

31 Revisão da Literatura 8 oncogenes. Outros estudos descrevem estes genes como supressores tumorais (Ishimoto et al., 2002; Moll; Slade, 2004). Pesquisas adicionais são necessárias para melhor compreensão das funções, interações, identificação das proteínas-alvo e das vias metabólicas dos membros da família p53 (Moll; Slade, 2004). 2.2 O gene p63 O p63, clonado em 1998, é alvo de várias pesquisas que tentam elucidar as complexas interações entre os membros da família p53 (Osada et al., 1998; Trink et al., 1998; Yang et al., 1998). Clonado por vários grupos de forma independente, o gene p63 apresenta nomenclatura diversa, a depender da isoforma expressa: KET, p51a, p51b, p40 e p73l (Westfall; Pientepol, 2004). Apesar de ser considerado o membro mais novo da família p53, estudos filogenéticos demonstram que o p63 é predecessor do p53 e do p73 e a sua organização genômica está altamente conservada entre as diferentes espécies (Yang et al., 1998). Como já foi dito, os três membros da família p53 apresentam alto grau de homologia entre si. No entanto as proteínas codificadas pelos genes desta família são similares, mas não idênticas. Os produtos do gene p63 compartilham algumas funções, mas o papel fisiológico nas células parece ser diferente (Yang et al., 1998) Estrutura do gene p63 O gene p63 está localizado no braço longo do cromossomo 3, no locus 3q27-29 (Osada et al., 1998; Trink et al. 1998; Yang et al., 1998). Como todos os membros da família p53, possui um domínio de transativação (TAD), um domínio de ligação ao

32 Revisão da Literatura 9 DNA (DBD), um domínio de oligomerização (OD), um domínio SAM, um domínio inibidor nas suas isoformas α e dois promotores (P1 e P2) (Di Como et al., 2001; Moll; Slade, 2004; Yang et al., 1998; Westfall; Pietenpol, 2004). As proteínas derivadas do gene p63 podem acrescentar emendas no COOH-terminal e dar origem a pelo menos diferentes seis proteínas diferentes: TAp63α, TAp63β, TAp63γ, Np63α, Np63β e Np63γ (Di Como et al., 2001; Yang et al., 1998; Westfall; Pietenpol, 2004). As isoformas com o domínio TA do p63(tap63α, TAp63β, TAp63γ) possuem a habilidade de ativar o gene p53 e, com isso, induzir apoptose e bloquear o ciclo celular. Entretanto os outros três isotipos ( Np63α, Np63β e Np63γ), agem como dominante negativo à ação supressora tanto do p53 (Di Como et al., 2001; Moll; Slade, 2004; Yang et al., 1998; Westfall; Pietenpol, 2004) Função do gene p O gene p63 como fator de transcrição O gene p63 exerce função de transativação que atua de forma diferente a depender da isoforma expressa. As isoformas com o domínio TA do p63 (TAp63α, TAp63β, TAp63γ) possuem a habilidade de transativação sobre o gene p53 ou sobre proteínas-alvo do p53, com isso, podem induzir apoptose e bloquear o ciclo celular (Moll; Slade, 2004; Ribeiro-Silva; Zucoloto, 2003). Entretanto, existem variações da atividade de transativação entre as isoformas TA. Por exemplo, a isoforma TAp63γ estimula a transcrição de outros genes de forma semelhante à do gene p53. Porém, a isoforma TAp63α mostra pouca ou nenhuma atividade de transativação sobre suas proteínas-alvo (Reis-Filho; Schmitt, 2001; Ribeiro-Silva; Zucoloto, 2003; Yang et al., 1998; Westfall; Pietenpol, 2004).

33 Revisão da Literatura 10 As isoformas sem o domínio TA, principalmente as isoformas Np63α e Np63γ, agem como dominante negativo, inibindo a transativação do p53, proteínasalvo do gene p53 e outras isoformas TAp63, principalmente a TAp63γ. A variante Np63α mostra uma atividade supressora da transativação mais intensa que a variante Np63γ (Yang et al., 1998). Estudos identificaram um domínio de inibição da transativação que é responsável pela atividade das isoformas α da p63. Sugere-se que este domínio de inibição interaja com as formas TA do p63 em uma região homóloga ao sítio do MDM2 do p53. Este sítio impede a formação de proteínas co-ativadoras, não havendo, portanto, a transativação (Westfall; Pietenpol, 2004). Outra hipótese é que as isoformas Np63α e Np63γ competem com sítios do p53 responsáveis pela transativação, inibindo este processo por competição inibitória (Yang et al., 1998) O gene p63 na regulação do ciclo celular e apoptose As isoformas TA, principalmente a TAp63γ, e a isoforma Np63γ podem induzir parada do ciclo celular e apoptose. Corroborando com estes dados, foram descritas variantes TA e Np63γ em células p53 - / - causando parada do ciclo celular e apoptose através da regulação ( up-regulation ) de proteínas-alvo do gene p53. Entretanto, a porcentagem de células que entram em apoptose induzidas pela isoforma Np63γ é menor que as induzidas pelas isoformas TA (Yang et al., 1998; Westfall; Pietenpol, 2004). Westfall e Pietenpol (2004) demonstraram que a perda da expressão do p63 resulta no impedimento da célula entrar em apoptose após dano do DNA, mesmo em células contendo o gene p53. Foi descrito que células p63 - / - encontram-se alteradas em relação à

34 Revisão da Literatura 11 indução dos genes bax, NOXA e PERP, que são responsáveis pelo processo de apoptose dependente do p53. Isto sugere que de alguma forma o p53 é afetado pela perda do p63 e os genes responsáveis pela apoptose são regulados através de interações entre os membros da família p53 (Moll; Slade, 2004; Westfall; Pietenpol, 2004). Por outro lado, Reis-Filho e Schmitt (2001) descreveram, em seus estudos, ratos p63 - / - que apresentavam p53 normal e possuiam resposta adequada ao processo de apoptose, seja este induzido ou espontâneo. Por outro lado, as células que apresentavam mutação do p53 entravam em apoptose em pequena porcentagem após lesão do DNA (Yang et al., 1998). Estudos adicionais das variantes TA e Np63γ são necessários para melhor entendimento da função do gene p63 no ciclo celular, na apoptose e na interação com os outros membros da família p53 (Westfall; Pietenpol, 2004) p63: Oncogene ou gene supressor tumoral? De forma semelhante ao gene p73, as diversas propriedades das isoformas do p63 mostram sua complexidade e não definem claramente o papel deste gene. Estudos descrevem o p63 ora como oncogene, ora como gene supressor tumoral, a depender da isoforma atuante. A isoforma TAp63γ pode causar parada do ciclo celular e induzir apoptose. Este processo é semelhante à função exercida pelo gene p53 no ciclo celular, que o classifica como gene supressor tumoral (Yang et al., 1998). Por outro lado, o p63 também possui várias propriedades que poderiam classificá-lo como oncogene. Por exemplo, as isoformas da p63 ( Np63α e Np63γ) podem inibir a função de transativação do p53 e de outras isoformas da p63. Esta atividade inibitória sugere que, de alguma forma, as isoformas Np63α e Np63γ podem induzir a proliferação celular contínua. Outra propriedade oncogênica estaria relacionada às isoformas Np63 que estariam amplificadas nos

35 Revisão da Literatura 12 carcinomas de células escamosas do colo uterino, de cabeça e pescoço, do pulmão e, conseqüentemente, envolvidas na carcinogênese (Yang et al., 1998). Estes dados, segundo Westfall e Pietenpol (2004), sugerem que o p63 não funciona como um gene supressor tumoral, mas como um oncogene (Westfall; Pietenpol, 2004). Por outro lado, Osada e colaboradores (1998) estudaram a seqüência do gene p63 de vários tumores humanos e descreveram que este gene é raramente expresso nos tumores analisados. Reforçando o papel de oncogene do p63, Burstein e colaboradores (2004) propuseram um modelo que envolve o p63 na carcinogênese dos carcinomas papilíferos da tireóide. O modelo sugere que os remanescentes embrionários p63-positivos contribuem de forma mais significativa na origem dos carcinomas papilíferos da tireóide do que as células epiteliais foliculares maduras alteradas pelo gene RET (Burstein et al., 2004). O gene p53 está associado à perda da heterozigosidade (LOH) em tumores humanos. O gene p63, em humanos, encontra-se no locus 3q27-9. Em camundongos, encontra-se o locus denominado loh2. O loh2 está associado à perda de heterozigosidade de modo semelhante ao que ocorre em tumores humanos que possuem esta alteração relacionada ao p53 LOH. As semelhanças estruturais e funcionais dos genes p53 e p63 em humanos e camundongos sugerem que o p63 possa contribuir de alguma forma com a carcinogênese (Yang et al., 1998). No entanto, mutações no p63 são raras e seu papel na carcinogênese ainda necessita ser mais bem explorado (Ribeiro-Silva; Zucoloto, 2003). Diversas funções são descritas como pertinentes ao p63, porém devido à complexidade deste gene e a sua interação com os outros membros da família p53, estudos complementares são necessários para sua melhor compreensão e definição do seu papel na biologia celular (Ribeiro-Silva; Zucoloto, 2003).

36 Revisão da Literatura A relação do gene p63 com o desenvolvimento embrionário e com os tecidos epiteliais O desenvolvimento epitelial em humanos é um processo complexo, no qual muitas etapas biológicas ainda não foram elucidadas. Estudos com camundongos sugerem que a proteína p63 exerça papel importante no desenvolvimento dos tecidos epiteliais (Westfall; Pietenpol, 2004). Enquanto camundongos p53 - / - apresentam desenvolvimento embrionário normal, os camundongos p63 - / - apresentam anomalias severas no seu desenvolvimento embrionário (Osada et al., 1998; Trink et al., 1998; Yang et al., 1998). Os camundongos p63 - / - mostram defeitos no desenvolvimento dos membros e tecidos epiteliais como a epiderme, o epitélio glandular prostático, o epitélio glandular mamário, o urotélio, o epitélio da mucosa lingual e o epitélio da mucosa gástrica (Reis-Filho; Schmitt, 2001; Westfall; Pietenpol, 2004). Várias estruturas embrionárias relacionadas ao desenvolvimento epitelial expressam a proteína p63. Em estágios iniciais da embriogênese, a p63 é expressa no ectoderma dos folhetos embrionários, na crista ectodérmica apical e na superfície ectodérmica que envolve os arcos branquiais. A integridade da crista ectodérmica apical possibilita o desenvolvimento dos membros. Os arcos branquiais são responsáveis pelo desenvolvimento crânio-facial e por vários tecidos de partes moles (Reis-Filho; Schmitt, 2001; Westfall; Pietenpol, 2004). A isoforma TAp63 parece ser necessária para a iniciação do programa de estratificação epitelial, e a isoforma Np63, principalmente a variante Np63α, promove a manutenção da epiderme madura. As células epidérmicas de embriões de camundongos, que apresentam a função das variantes Np63 bloqueada, mostram falhas na proliferação de tecidos epiteliais (Westfall; Pietenpol, 2004).

37 Revisão da Literatura 14 Estudos imuno-histoquímicos mostram a proteína p63 em células basais/ progenitoras de muitos tecidos epiteliais como a epiderme, folículos pilosos, glândulas sudoríparas, ectocérvice, língua, esôfago, glândulas mamárias, próstata e urotélio. Nestes tecidos epiteliais, a expressão da isoforma Np63α é predominante. Portanto o gene p63 é responsável tanto pelo desenvolvimento como pela manutenção da população de célulastronco ( stem cells ) de vários tecidos epiteliais. (Reis-Filho; Schmitt, 2001; Ribeiro-Silva; Zucoloto, 2003; Yang et al.,1998; Westfall; Pietenpol, 2004) Expressão da proteína p63 em tecidos normais A proteína p63 é expressa em tecidos humanos e murinos normais, particularmente no núcleo das células basais ou mioepiteliais dos tecidos epiteliais (Barbareschi et al., 2001; Batistatou et al., 2003; Reis-Filho; Schmitt, 2001). As células mioepiteliais expressam o fenótipo epitelial e miogênico (Barbareschi et al., 2001; Reis- Filho et al., 2003). Elas constituem a camada basal de vários tecidos epiteliais normais, principalmente nos lóbulos e nos ductos do tecido mamário. A identificação destas células é utilizada em patologia mamária para diferenciar neoplasias benignas de malignas invasoras, já que estas últimas não apresentam células mioepiteliais (Barbareschi et al., 2001; Batistatou et al., 2003; Reis-Filho; Schmitt, 2001). Os anticorpos S-100, actina de músculo liso, actina músculo-específica, calponina, citoqueratinas 5/6, citoqueratina 14 e 34βE12 são marcadores de células mioepiteliais. O S- 100 apresenta alta sensibilidade, porém baixa especificidade para as células mioepiteliais. A maioria dos anticorpos relacionados com diferenciação de músculo liso, sobretudo a actina músculo-específica e a calponina, apresenta baixa especificidade, pois pode marcar células estromais e miofibroblastos. As citoqueratinas apresentam baixa sensibilidade para as

38 Revisão da Literatura 15 células mioepitelias, principalmente as localizadas nos lóbulos mamários, pois, neste local, podem marcar as células epiteliais, secretórias e neoplásicas de vários carcinomas (Barbareschi et al., 2001; Reis-Filho et al., 2003; Stefanou et al., 2004). A proteína p63 é o primeiro marcador nuclear de células mioepiteliais, sendo considerado um marcador com sensibilidade de 100% e especificidade de 95% na identificação destas células (Barbareschi et al., 2001). A expressão nuclear da p63 facilita identificar a presença das células mioepiteliais em relação a outros marcadores que, na sua maioria, marcam o citoplasma (Barbareschi et al., 2001; Reis-Filho et al., 2003; Yang et al., 1998). Entretanto, Bratthauer e colaboradores (2005) demonstraram uma forte expressão citoplasmática da proteína p63 em células com alterações secretórias e carcinomas secretores da mama. Estes últimos apresentam alterações no cromossomo 3q, onde se encontra o gene p63 (Bratthauer et al., 2005). Além de marcar células mioepiteliais, a p63 apresenta expressão imunohistoquímica variável em tecidos normais de mamíferos adultos. Quatro diferentes anticorpos anti-p63 foram desenvolvidos: 4A4, p6302, H137 e PC424. Os anticorpos 4A4, P6302 e H137 reconhecem todas as diferentes isoformas do p63. O PC424 reconhece as isoformas Np63. O anticorpo monoclonal 4A4, além de abranger todas as isoformas da p63, mostra uma marcação imuno-histoquímica mais intensa em relação aos outros clones (Reis-Filho; Schmitt, 2001). Os epitélios estratificados pavimentosos escamosos, queratinizados ou não, são organizados em várias camadas de células escamosas e uma camada de células basais. As células tornam-se maduras à medida que se distanciam das células basais. Di Como e colaboradores (2002) demonstraram através de estudos imuno-histoquímicos que todos os epitélios estratificados pavimentosos escamosos, incluindo o epitélio da pele, das tonsilas, do esôfago e da ectocérvice, apresentam positividade nuclear de moderada a intensa para a

39 Revisão da Literatura 16 p63 nas células basais e uma positividade nuclear que diminui gradativamente nas células escamosas à medida que elas vão se diferenciando. Portanto, as células que se diferenciam perdem a expressão da p63 (Burstein et al., 2004). As células dos epitélios transicionais encontrados nos cálices renais, ureteres, bexiga e uretra apresentam intensa expressão nuclear da p63, com exceção das umbrella cells (Di Como et al., 2002). O epitélio prostático normal apresenta três tipos de células: as basais, as secretórias e as neuroendócrinas. Os ácinos e ductos da próstata expressam em suas células basais marcação nuclear de moderada a intensa da p63, principalmente da isoforma Np63α. Este dado sugere que o gene p63 pode exercer papel importante no desenvolvimento prostático e manutenção da população de células-tronco. As células secretórias e neuroendócrinas não apresentam reatividade para a proteína p63 (Signoretti et al., 2000). Expressão semelhante à da próstata é observada nas células basais de glândulas sebáceas e sudoríparas da pele (Ivan et al., 2005). Na mama, as células mioepiteliais dos lóbulos e ductos mostram intensa expressão da p63 no núcleo, porém as células luminais não apresentam reatividade para esta proteína (Reis- Filho; Schmitt, 2001). A proteína p63 não é detectável em estruturas de origem mesenquimal, como células endoteliais, células de músculo liso e fibroblastos. Entretanto, Di Como e colaboradores (2002) demonstraram, através de reação em cadeia de polimerase (PCR), que células do músculo esquelético expressam um dos isotipos da p63. Osada e colaboradores (1998) também demonstraram expressão da p63 em células do músculo esquelético. Células neuronais, gliais e neuroendócrinas de tecidos normais não expressam a p63 (Di como et al., 2002). A tabela 1 mostra a expressão da p63 nos tecidos normais de adultos.

40 Revisão da Literatura 17 Tabela 1 - Distribuição da proteína p63 em tecidos adultos normais. Órgão Escore* Componente positivo Sistema Nervoso Central Córtex Trato Digestivo Esôfago Estômago Intestino Delgado Cólon Glândulas do trato digestivo Pâncreas Fígado Sistema Endócrino Adrenal Tireóide Sistema Linfóide Linfonodos Baço Tonsilas (-) (++) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (+/-) (-) (++) Epitélio escamoso Células do centro germinativo Células epiteliais escamosas Tecido Muscular Músculo estriado esquelético (-) Sistema reprodutivo feminino Mama Endocérvice Endométrio Ovário Placenta Cordão umbilical (++) Epitélio basal (++) Epitélio escamoso (-) (-) (+) Citotrofoblasto (-) Sistema reprodutivo masculino Próstata Testículo Sistema respiratório Laringe Pulmão Pele Epiderme Folículos Pilosos Glândulas sudoríparas (++) (+/-) (++) (++) (++) (++) (++) Epitélio basal Células do túbulo seminífero Mucosa e epitélio glandular Epitélio bronquiolar Sistema urinário Bexiga Rim (++) (+/-) Epitélio transicional Células epiteliais da cápsula de Bownman *- indetectável; +/- ocasional; + moderado; ++ forte. Adaptado de Di Como et al: p63 expression profiles in Human Normal and Tumor Tissue, Clinical Cancer Research 495: 8, 2003.

41 Revisão da Literatura O p63 em síndromes humanas As mutações do p53 podem ser encontradas tanto em células germinativas quanto em células somáticas (Di Como et al., 2002). As mutações do gene p53 em células da linhagem germinativa estão associadas com a síndrome de Li Fraumeni. Esta síndrome tem como característica principal a alta prevalência de sarcomas de partes moles, linfomas, tumores do sistema nervoso central e carcinomas mamários (Reis- Filho; Schmitt, 2001). Mutações do gene p63 em células somáticas são raras (Di Como et al., 2002). Em seres humanos, foram descritas mutações do p63 em células de linhagens germinativas que estão relacionadas a anormalidades congênitas. Estas são caracterizadas por desenvolvimento anormal de extremidades e displasia ectodérmica (Westfall; Pietenpol, 2004). Diferente do p53, segundo Reis-Filho e Schmitt (2001) as mutações do p63 que ocorrem nas células de linhagem germinativa não apresentam predisposição à formação de neoplasias (Reis-Filho; Schmitt, 2001). Mutação do gene p63 foi encontrada na síndrome EEC- ectrodactyly-ectodermal dysplasia. A mutação da EEC foi identificada no locus do cromossomo 3q27, coincidindo com a localização do p63 (Westfall; Pietenpol, 2004). Outras desordens relacionadas ao desenvolvimento envolvem o p63, como a síndrome de AEC- ankyloblepharon ectodermal dysplasia and clefting - ou Síndrome de Hay-Wells; a síndrome ADULT- acro-dermato-ungueal-lacrimal-tooth ; a LMS- limb-mammary syndrome - e a síndrome SHFM- split hand/split foot malformation (Reis-Filho; Schimitt, 2001; Westfall; Pietenpol, 2004). As síndromes EEC e ADULT estão relacionadas à mutação pontual no domínio de transativação do gene p63 (Di Como et al., 2002; Westfall; Pietenpol, 2004). A

42 Revisão da Literatura 19 síndrome AEC e a LMS estão relacionadas à mutação pontual no domínio SAM. A SHFM é encontrada quando o gene p63 é mutado por completo. Estes dados sugerem que existam diversos mecanismos que provocam alteração do gene p63 (Westfall; Pietenpol, 2004) O p63 e neoplasias de células escamosas Como citado anteriormente, a proteína p63 está expressa em grande parte dos epitélios estratificados pavimentosos escamosos, incluindo a epiderme, o epitélio das tonsilas, do esôfago e da ectocérvice. Eles apresentam positividade nuclear de moderada a intensa para a p63 nas células basais e uma positividade nuclear que diminui gradativamente nas células escamosas à medida que elas vão se diferenciando. Como no epitélio normal, os carcinomas de células escamosas localizados em cabeça e pescoço, esôfago, pulmão e pele expressam de forma consistente a p63. Em adenocarcinomas de esôfago, próstata e mama, a p63 é negativa ou apresenta expressão mínima (Hara et al., 2004; Reis-Filho et al., 2003; Reis-Filho; Schmitt, 2001). O gene p63 foi mapeado no cromossomo 3q27-28, um região frequentemente amplificada em carcinomas escamosos, carcinomas cervicais, carcinomas prostáticos e neoplasias pulmonares (Hara et al., 2004; Moll; Slade, 2004; Reis-Filho et al., 2003; Westfall; Pietenpol, 2004). A Np63α é a isoforma que está expressa em muitos carcinomas escamosos, como, por exemplo, nos orais e nos carcinomas do trato respiratório superior (Reis-Filho; Schmitt, 2001; Yang et al., 1998). A região do cromossomo 3q27-28, onde o p63 está localizado, contém também o gene PIK3CA, que é um regulador positivo da via phosphoinositide-3-quinase. A isoforma Np63α é regulada por esta via, explicando a superexpressão da isoforma Np63α nos carcinomas

43 Revisão da Literatura 20 de células escamosas (Westfall; Pietenpol, 2004). As isoformas Np63, segundo Moll e Slade, fazem com que as células permaneçam com o fenótipo de células tronco, promovendo proliferação celular intensa e contribuindo para o crescimento tumoral. Segundo estudos realizados por Hara e colaboradores (2004), a expressão da p63 nos carcinomas escamosos não pode ser utilizada como fator prognóstico, pois não apresenta relação com características clinico-patológicas. No entanto, pesquisas de Uramoto e colaboradores (2006), envolvendo membros da família p53, descrevem a relação destes genes com variáveis clínicas e prognósticas em câncer de pulmão. Dentre estes carcinomas a forma Np63 encontrava-se expressa nos carcinomas escamosos de pulmão (Uramoto et al., 2006). Lo Muzio e colaboradores (2007) relataram que a expressão do anticorpo p63 em carcinomas escamosos orais é um indicador de grau histológico e marcador de mau prognóstico. Outros estudos envolvendo a p63 com carcinomas escamosos e sua relação com fatores prognósticos são descritos na literatura (de Oliveira et al., 2007; Takahashi et al., 2006) O p63 em neoplasia de cabeça e pescoço O modelo de oncogênese clássico proposto para o carcinoma papilífero da tireóide sugere que a origem desta neoplasia estaria relacionada à alteração do gene RET nas células tireoidianas epiteliais foliculares maduras. Burstein e colaboradores (2003) propuseram outro modelo que envolve o p63 na carcinogênese dos carcinomas papilíferos da tireóide. O modelo propõe que os remanescentes embrionários p63- positivos contribuam de forma mais significativa que as células epiteliais foliculares maduras para a origem dos carcinomas papilíferos da tireóide (Burstein et al., 2003).

44 Revisão da Literatura 21 Dentre os remanescentes embrionários, estão os ninhos sólidos celulares/grupos sólidos celulares ( solid cell nest ), que são estruturas celulares não foliculares encontradas em 61% a 89% das tireóides. Considerados remanescentes embrionários relacionados ao corpo ultimobranquial, os ninhos sólidos celulares podem apresentar células com diferenciação escamosa, glandular, microcística e ciliada, além de outras linhagens de diferenciação celular. Durante o desenvolvimento embrionário o corpo ultimobranquial contribui para formação de grande parte dos lobos laterais da tireóide e das células que se encontram nestes lobos (células epiteliais foliculares e células C). Outro remanescente embrionário é o ducto tireoglosso. Ele é derivado do divertículo tireoidiano e responsável pela formação do istmo (Burstein et al., 2003). Burstein e colaboradores (2003) observaram em seu estudo morfológico da tireóide a presença de ninhos celulares não foliculares em pacientes com tireoidite de Hashimoto, com carcinoma papilífero e em pacientes com a associação destas duas patologias. Estes ninhos expressavam a proteína p63 e eram morfologicamente compatíveis com ninhos sólidos celulares (remanescentes embrionários). Segundo Burstein e colaboradores (2003), a proteína p63 é um marcador sensível para detectar os ninhos sólidos celulares. O modelo de carcingênese proposto por estes autores considera estes ninhos sólidos celulares p63-positivos como células pluripotentes, e a expressão da p63 nestas células seria responsável pela manutenção desta população celular indiferenciada (Burstein et al., 2003; Reis-Filho; Schmitt, 2001; Yang et al.,1998; Westfall; Pietenpol, 2004). As células pluripotentes podem seguir caminhos diferentes. Elas poderiam permanecer indiferenciadas ou poderiam sofrer diferenciação celular (diferenciação escamosa ou diferenciação para células epiteliais foliculares da tireóide). Entretanto, a persistência destas células pluripotentes, consideradas células lábeis e mais susceptíveis

45 Revisão da Literatura 22 às alterações do conteúdo genômico, dariam origem aos carcinomas papilíferos da tireóide (Burstein et al., 2003). Segundo o novo modelo carcinogênico, a razão do carcinoma papilífero da tireóide ser multifocal não está associada a metástases intra-tireoideanas, mas à transformação carcinogênica de remanescentes embrionários p63-positivos. Sugere-se também que os focos de diferenciação escamosa, freqüentes na tireoidite de Hashimoto, no carcinoma papilífero e nos ninhos sólidos celulares, ocorram devido à presença de remanescentes embrionários contendo células pluripotentes p63-positivas que se diferenciam em células de linhagem escamosa. A existência de células pluripotentes embrionárias residuais na tireóide pode ser a base biológica que explicaria a predisposição de pacientes com tireoidite de Hashimoto para desenvolver carcinoma papilífero (Burstein et al., 2003). Burstein e colaboradores (2003) também descrevem que o carcinoma mucoepidermóide da tireóide tem sua origem nos ninhos sólidos celulares, já que estes últimos podem apresentar mucina e diferenciação escamosa. Entretanto o carcinoma muco-epidermóide surge geralmente no istmo, local onde os ninhos sólidos celulares não são detectados. O corpo ultimobranquial só contribui para a formação dos ninhos nas porções laterais dos lobos da tireóide e não no istmo (Burstein et al., 2003). Na pesquisa, porém, os autores detectaram a presença de células p63-positivas no istmo, em estruturas sólidas (ninhos sólidos símile) e císticas da parede do ducto tireoglosso. O modelo destes autores propõe que, a partir das estruturas embrionárias remanescentes (células progenitoras pluripotentes do corpo ultimobranquial e do divertículo tireoideano), surjam os carcinomas papilíferos, escamosos e muco-epidermóides da tireóide (Burstein et al., 2003).

46 Revisão da Literatura 23 Nos carcinomas de células escamosas de cabeça e pescoço, tanto o p53 como as isoformas do p63 e do p73 são expressas, sugerindo que tanto o p63 quanto o p73 tenham participação importante na carcinogênese dos tumores escamosos da cabeça e pescoço, atuando como oncogenes (de Oliveira et al., 2007; Gwosdz et al., 2005; Lo Muzio et al., 2007). É observada também a expressão da p63 em tumores mioepiteliais de glândulas salivares (Reis-Filho; Schmitt, 2001) O p63 em neoplasias uroepiteliais Na próstata, o produto do gene p63 marca as células basais do tecido epitelial glandular normal, da hiperplasia prostática e das neoplasias intra-epiteliais de baixo e alto grau. Nos carcinomas, sua expressão só é verificada em menos de 1% dos espécimes provenientes de prostatectomia radical (Signoretti et al., 2000; Reis-Filho; Schmitt, 2001). A maioria dos carcinomas de próstata expressa marcadores de células secretórias, como o receptor de androgênio e o antígeno prostático específico, sugerindo que o câncer de próstata é resultado da transformação maligna de células secretórias (Signoretti et al., 2000). Na glândula prostática, a proteína p63 é expressa nas células basais do epitélio glandular e não apresenta reatividade nas células de fenótipo secretor (Signoretti et al., 2000). Os carcinomas de próstata são caracterizados pela ausência de células basais e pela presença de alterações arquiteturais das glândulas. Como nos carcinomas invasores da mama, a expressão da p63 nas células basais das glândulas prostáticas pode ser utilizada na diferenciação entre lesões benignas e malignas (Signoretti et al., 2000; Reis-Filho; Schmitt, 2001).

47 Revisão da Literatura 24 Quanto aos tumores de urotélio, estudos indicam que os genes da família p53, incluindo o p63 estão relacionados com a carcinogênese de neoplasias uroteliais, principalmente com os localizados na bexiga (Compérat et al., 2007; Mhawech- Fauceglia et al., 2006). Segundo Zigeuner e colaboradores (2004), a p63 é expressa no tanto no urotélio normal, como nos carcinomas invasivos de células transisionais. No entanto as isoformas expressas nestes dois locais são diferentes e, em alguns carcinomas invasivos de células transicionais da bexiga, observa-se perda da expressão da p63. O urotélio normal da bexiga expressa as isoformas TAp63. No entanto, os carcinomas de bexiga apresentam diminuição da expressão das isoformas TAp63 e começam a apresentar a expressão das isoformas Np63 (Reis-Filho; Schmitt, 2001; Zigeuner et al., 2004). Zigeuner e colaboradores (2004) demonstraram que a diminuição da reatividade da p63 e a superexpressão da p53 nos carcinomas de células transicionais da bexiga estão associadas com estágio tumoral avançado e pior prognóstico (Zigeuner et al., 2004) O p63 em neoplasias ginecológicas Estudos demonstraram que a p63 é expressa nas células basais/progenitoras do epitélio escamoso e do epitélio colunar da zona de transformação do colo uterino, como também nas células escamosas imaturas do epitélio cervical. O gene p63 foi mapeado no cromossomo 3q27-29, região que se encontra alterada nas neoplasias de colo uterino (Hara et al., 2004; Westfall; Pietenpol, 2004). No colo uterino, a p63 é expressa em carcinomas de células escamosas, mas não em adenocarcinomas (Di Como et al., 2002; Reis-Filho; Schmitt, 2001). Carcinomas adenoescamosos do colo uterino apresentam expressão da p63 no componente

48 Revisão da Literatura 25 escamoso. Considerado variante do carcinoma de células escamosas, o carcinoma linfoepitelioma-símile do colo uterino também expressa p63. Segundo Reis-Filho e Schmitt (2001), os carcinomas indiferenciados do colo uterino não expressam a proteína p63 (Reis-Filho; Schmitt, 2001). A isoforma Np63 é considerada, nos carcinomas de colo uterino, marcadora de diferenciação escamosa, sendo utilizada na exclusão de diferenciação glandular e neuroendócrina (Linz et al., 2006). Portanto, a p63 tem sido utilizada em patologia ginecológica para identificar neoplasias epiteliais do colo uterino cuja presença de diferenciação escamosa é duvidosa (Reis-Filho; Schmitt, 2001). A associação entre infecções virais e a expressão da proteína p63 em neoplasias ainda necessita ser mais investigado. Dados experimentais mostram que existe uma forte correlação entre infecção pelo papilomavírus humano (HPV) do tipo 16 e expressão do produto do gene p63 no carcinoma escamoso invasor do colo uterino. Nestes, o locus do p63 encontra-se amplificado (Westfall; Pietenpol, 2004). Em relação ao p53, as proteínas E6 do gene HPV podem interromper o processo de morte celular ao se ligarem à proteína p53. Após esta ligação, a E6 induz rápida degradação da p53 por meio de proteólise dependente de ubiquitina. Estes dados sugerem a existência de dois eventos que contribuem para a carcinogênese dos carcinomas cervicais. Um deles seria a perda da função da p53 pela degradação mediada pela O outro seria o aumento da atividade oncogênica do p63, devido à sua superexpressão (Westfall; Pietenpol, 2004). No entanto, Moll e Slade (2004), descrevem que nenhuma interação entre a p63 e a via da proteína E6 foi encontrada. A região do cromossomo 3q27-29, onde se encontra o p63, também está alterada nas neoplasias do ovário (Hara et al., 2004; Westfall; Pietenpol, 2004). Liao e colaboradores (2007) descrevem que a p63 encontra-se expressa em tumores de Brenner benignos e boderlines do ovário. Nos tumores de células transicionais do ovário a p63

49 Revisão da Literatura 26 não é expressa. A p63 pode ser utilizada para auxiliar no diagnóstico diferencial destes tumores (Liao et al., 2007). O p63 é expresso em 25% e 12,9% dos carcinomas endometrióides e serosos do ovário, respectivamente (Reis-Filho et al., 2003). Segundo Reis-Filho e Schmitt, o produto do gene p63 não é expresso em carcinomas endometriais, mas está presente na metaplasia escamosa do tecido endometrial. Stefansson e colaboradores (2006) não encontraram expressão da p63 em carcinomas endometrióides do endométrio. Contradizendo a informação de que a p63 não é expressa em carcinomas do endométrio, a expressão desta proteína foi descrita em carcinoma de células escamosas papilar do endométrio com diferenciação de células transicionais (Ribeiro-Silva, 2007). A expressão da p63 também foi descritas em focos de endometriose, adenomiose e pólipos endometriais (Nogueira et al., 2006; Poli Neto et al., 2007) O p63 e outras neoplasias Na pele, a p63 é expresso intensamente em 65% e moderadamente em 35% dos tumores de anexo benignos. Todos os carcinomas cutâneos primários, incluindo os adenocarcinomas, expressam a proteína p63. Em contraste, nenhum adenocarcinoma metastático localizado na pele apresenta a expressão da p63. Portanto, a presença desta proteína pode auxiliar na diferenciação entre adenocarcinomas primários e metastáticos da pele (Ivan et al., 2005). Em relação às neoplasias de linhagem hematológica, os linfomas não Hodgkin de células B, assim como o linfoma folicular, expressam a p63. Porém, linfomas de Hodgkin são negativos para esta proteína (Di Como et al., 2002). Os timomas expressam p63 principalmente no componente neoplásico epitelial (Di Como et al.,

50 Revisão da Literatura ; Dotto et al., 2007). Mutações no gene p63 geralmente ocorrem entre os códons e estão associados à crise blástica na leucemia mielóide crônica (Yang et al., 1998). Apesar da proteína p63 não estar expressa na maioria dos tecidos mesenquimais, Di Como e colaboradores (2002) demonstraram positividade da p63 em 2 de 31 rabdomiossarcomas (Di Como et al., 2002). Reis-Filho e colaboradores (2003) descreveram positividade da p63 em 10% dos melanomas e 12% dos glioblastomas (Reis-Filho et al., 2003). Todas estas informações sugerem que o p63 esteja associado a vários tipos de tumores, além dos carcinomas de células escamosas (Reis-Filho et al., 2003) O p63 em patologia mamária No Brasil, o câncer de mama é considerado uma das neoplasias malignas mais incidentes em mulheres. Quando diagnosticado precocemente, o câncer de mama pode ser potencialmente curável. Ele está associado a vários fatores de risco para seu desenvolvimento. Os principais são os hormonais e os genéticos. O carcinoma é a neoplasia maligna mais freqüente da mama e pode ser dividido em esporádicos, possivelmente relacionados com a exposição hormonal, e casos hereditários, associados às mutações da linhagem germinativa (Abreu; Koifman, 2002; Esteva; Hortobagyi, 2004). A mutação do gene p53 é um evento comum, encontrado em 15 a 50% dos carcinomas mamários. A expressão da proteína p53 nestes carcinomas pode ser observada através de estudos imuno-histoquímicos e está associada a prognóstico reservado (Ribeiro-Silva et al., 2003).

51 Revisão da Literatura 28 A identificação de células mioepiteliais nas glândulas mamárias é um recurso diagnóstico valioso em patologia cirúrgica. As células mioepiteliais estão presentes na camada basal do epitélio glandular normal, nas lesões benignas e nos carcinomas in situ da mama. No entanto, estão ausentes nos carcinomas invasores (Barbareschi et al., 2001; Harton et al., 2007; Reis-Filho; Schmitt, 2001; Stefanou et al., 2004). Nos cortes histológicos corados por hematoxilina e eosina, a identificação das células mioepiteliais pode ser difícil devido à presença de desmoplasia estromal e de infiltrado inflamatório periglandular (Ribeiro-Silva et al., 2003). Nos estudos citológicos, as células mioepiteliais podem ser confundidas com células apoptóticas, macrófagos e células estromais. Desse modo, com base no fenótipo epitelial e miogênico das células mioepiteliais, vários marcadores imuno-histoquímicos foram desenvolvidos, a maioria com expressão citoplasmática (Barbareschi et al., 2001; Reis-Filho et al., 2003). Através de estudos imuno-histoquímicos, a expressão da proteína p63 pode ser observada no núcleo de células mioepiteliais/ basais de vários tecidos epiteliais (Barbareschi et al., 2001; Batistatou et al., 2003; Reis-Filho; Schmitt, 2001). A localização e a morfologia das células p63-positivas na mama normal são correspondentes às das células mioepiteliais. Através da dupla marcação imunohistoquímica, experimentos mostram que células com expressão nuclear da p63 apresentam co-expressão com marcadores imuno-histoquímicos citoplasmáticos nas células mioepiteliais. Menos de 1% das células mioepiteliais expressaram a p63 na ausência de marcadores mioepiteliais citoplasmáticos (Barbareschi et al., 2001; Reis- Filho; Schmitt, 2001; Stefanou et al., 2004). A proteína p63 é um marcador nuclear de células mioepiteliais, com sensibilidade de 100% e especificidade de 95% na identificação destas células (Barbareschi et al., 2001). A expressão nuclear da p63 facilita identificar a presença das

52 Revisão da Literatura 29 células mioepiteliais em relação a outros marcadores que, na sua maioria, marcam o citoplasma (Barbareschi et al., 2001; Reis-Filho et al., 2003; Yang et al., 1998). Entretanto, Bratthauer e colaboradores (2005) demonstraram uma forte expressão citoplasmática da proteína p63 em células com alterações secretórias e carcinomas secretores da mama. Estes últimos apresentam alterações no cromossomo 3q, onde se encontra o gene p63 (Bratthauer et al., 2005). Barbareschi e colaboradores (2001) descreveram que na camada basal do tecido epitelial glandular mamário, além das células mioepiteliais, encontram-se células progenitoras responsáveis pela manutenção epitelial (Barbareschi et al., 2001). A proteína p63 é considerada um marcador de células mioepiteliais e de células progenitoras (Osada et al.,1998; Trink et al.,1998; Yang et al., 1998). A isoforma Np63, proteína responsável pela manutenção das células progenitoras, é expressa nas células mioepiteliais dos tecidos mamários normais, sugerindo que exista correlação entre as células mioepiteliais e células progenitoras (Barbareschi et al., 2001; Reis- Filho; Schmitt, 2001). Barbareschi e colaboradores (2001), no entanto, questionaram como a proteína p63 pode ser considerada marcadora de células progenitoras e, ao mesmo tempo, ser considerada marcadora de células mioepiteliais, que são células bem diferenciadas e especializadas (Barbareschi et al., 2001). No tecido mamário normal e nas lesões benignas, a p63 mostra positividade contínua nas células basais dos ductos e ácinos. Nas células estromais, incluindo os miofibroblastos, a proteína p63 é negativa. Raras células epiteliais luminais da hiperplasia ductal florida expressam a p63. Nos carcinomas, a expressão da p63 é controversa. Carcinomas ductais e lobulares in situ apresentam positividade contínua ou focalmente descontínua da p63 em suas células mioepiteliais. As células luminais destes carcinomas são negativas (Barbareschi et al., 2001; Reis-Filho et al., 2003; Stefanou et

53 Revisão da Literatura 30 al., 2004). No entanto, Reis-Filho e colaboradores (2003) descreveram células p63- positivas em carcinomas ductais in situ em estudos imuno-histoquímicos de citologias. Carcinomas ductais invasivos são geralmente p63-negativos (Ribeiro-Silva et al., 2003, Stefanou et al., 2004; Wang et al., 2002). Porém, Barbareschi e colaboradores (2001) descreveram que 4,6% a 11% dos carcinomas mamários expressaram, por meio de estudos imuno-histoquímicos, a proteína p63 em cerca de 5% a 15% das células neoplásicas (Barbareschi et al., 2001). Através de pesquisa semelhante, Reis-Filho e colaboradores (2003) demonstraram em estudos citológicos que 23% dos carcinomas mamários expressaram a proteína p63 em cerca de 1% a 5% das células neoplásicas. Em 13% dos carcinomas mamários, as células neoplásicas eram positivas em mais de 5% das células (Reis-Filho et al., 2003). Nos carcinomas mamários invasores grau III da graduação de Nottingham, as neoplasias com contagem de mitose elevada, menor formação tubular e atipias celulares acentuadas apresentam mais células p63-positivas que as neoplasias de contagem menos elevadas (Ribeiro-Silva et al., 2003). Ribeiro-Silva e colaboradores (2003) descreveram que a positividade da p63 em células de carcinomas mamários está relacionada com vários fatores de mau prognóstico, incluindo tamanho tumoral, estadiamento patológico, grau histológico, metástases para linfonodos e negatividade para receptores de estrógeno. Estes autores demonstraram que em 10 casos de carcinomas ductais mamários positivos para a p63, apenas um dos casos expressou a proteína p53. Segundo Ribeiro-Silva e colaboradores (2003), estes resultados são contraditórios, pois a p63 geralmente é expressa em carcinomas ductais pouco diferenciados, nos quais a expressão da p53 é freqüente. Os autores sugeriram que o p63 poderia exercer indiretamente função de oncogene inibindo o p53. Estes dados poderiam explicar a correlação da expressão da proteína p63 com indicadores de mau prognóstico (Ribeiro-Silva et al., 2003).

54 Revisão da Literatura 31 A proteína p63, p-caderina e CK5, marcadores de diferenciação basal e mioepitelial, encontram-se expressos em câncer de mama com história familiar (Dufloth et al., 2007). Mais de 18% dos carcinomas ductais invasores mamários de alto grau expressam diferenciação basal-símile ou mioepitelial-símile. Este dado é constatado pela positividade que as células neoplásicas expressam para marcadores mioepiteliais (actina de músculo liso, citoceratina 14, proteína S100 e calponina) em estudos imunohistoquímicos (Reis-Filho; Schmitt, 2001; Reis-Filho et al., 2003). Pesquisas propuseram a hipótese de que a presença das células neoplásicas p63-positivas seria explicada pela expressão aberrante de diferenciação basal-símile ou mioepitelial-símile durante a expressão clonal (Reis-Filho et al., 2003; Stefanou et al., 2004). Outra hipótese seria que as células neoplásicas p63-positivas fossem originadas de células progenitoras, que pudessem expressar fenótipo miogênico (Ribeiro-Silva et al., 2003). A maioria das células dos carcinomas adenóide-císticos, dos mioepiteliomas e dos tumores mistos, que são neoplasias de diferenciação mioepitelial, expressa a proteína p63 (Barbareschi et al., 2001; Reis-Filho; Schmitt, 2001). Ela também é expressa em neoplasias com morfologia papilar (papilomas e carcinomas papilíferos), sugerindo que elas apresentem diferenciação mioepitelial (Stefanou et al., 2004). A p63 pode ser utilizada no diagnóstico diferencial das lesões papilares da mama (Troxell et al., 2007; Tse et al., 2007). Carcinomas metaplásicos apresentam positividade da proteína p63 no componente neoplásico escamoso (Barbareschi et al., 2001). A p63 é um marcador sensível e específico para os carcinomas metaplásicos da mama, principalmente aqueles constituídos de células fusiformes e com áreas escamosas. Esta proteína pode ser utilizada em painel imuno-histoquímico para diferenciar carcinomas metaplásicos de lesões com componente mesenquimal como tumor filóide, o osteossarcoma primário da

55 Revisão da Literatura 32 mama e a fibromatose (Koker; Kleer, 2004; Tse et al., 2006). A proteína p63 é negativa nas células neoplásicas dos carcinomas tubulares e medulares (Ribeiro-Silva et al., 2003). Em relação ao tratamento dos carcinomas mamários, estudos de Leong e colaboradores (2007) relatam que as vias dos genes p63/p73 estão relacionadas à sensibilidade a cisplatina nos carcinomas mamários associados ao BRCA-1 e negativos para RE, RP e c-erbb-2. Estes autores ainda descrevem que a isoforma Np63 se liga a TAp73, promovendo a sobrevivência das células neoplásicas nos carcinomas mamários através da inibição da atividade pró-apoptótica da TAp73 (Leong et al., 2007). 2.3 A biologia molecular do câncer O Ciclo celular e genes que regulam o ciclo celular Diferenças estruturais e bioquímicas foram estabelecidas entre células normais e cancerosas. As células normais mantêm a integridade do seu DNA através de vias que regulam o ciclo celular. O ciclo celular é dividido em fases: G 1 (pré-sintética), S (sintética), G 2 (pré-mitótica) e M (mitótica). A progressão ordenada das células através das fases do ciclo celular é controlada pelas ciclinas, quinases ciclina-dependentes (CDK) e seus inibidores (Rieger, 2004). As ciclinas são responsáveis pela fosforilação de proteínas-alvo que permitem a progressão das fases do ciclo celular. A ciclina D é a primeira a entrar no ciclo celular e as ciclinas E, A e B aparecem seqüencialmente durante as fases subseqüentes. As proteínas-alvo são as CDK, que, junto com as ciclinas, formam complexos moleculares permitindo à célula atravessar os pontos de verificação do ciclo celular. Nos pontos de

56 Revisão da Literatura 33 verificação, os genes percebem e reparam a lesão causada ao DNA celular (Rieger, 2004). Um defeito nos componentes destes pontos causa instabilidade genômica, favorecendo proliferação celular descontrolada, um dos princípios fundamentais da fisiologia celular para a carcinogênese (Rieger, 2004). Existem dois principais pontos de verificação, um na transição de G 1 /S e outro em G 2 /M. Resumindo, os pontos de verificação checam possíveis danos ao DNA celular e decidem se a célula pode prosseguir no ciclo celular (Hanahan; Weinberg, 2000; Rieger, 2004). Durante a fase G 1, a ciclina D se liga e ativa a quinase cliclina-dependente 4 (CDK4), formando um complexo ciclina D-CDK4. Este complexo tem papel importante no ciclo celular, pois promove a fosforilação da proteína de susceptibilidade ao retinoblastoma (Rb), eliminando a principal barreira do ciclo celular. A proteína Rb é ligada a um complexo de proteínas que contêm o fator de transcrição E2F. A fosforilação da Rb dissocia esse complexo, ativando a transcrição dos genes-alvo de E2F. A atividade da E2F promove a transcrição da ciclina E, da ciclina A e de outras proteínas, tornando possível a passagem do ponto de restrição no final de G 1. As ciclinas A e B regulam alguns eventos críticos na transição G 2 /M. Em estado hipofosforilado, a Rb impede a replicação celular ao formar um complexo inativo com o fator de transcrição E2F. Após ultrapassar as etapas do ciclo celular, as células recém divididas podem retornar a G 1 ou entrarem em período de latência (Hanahan; Weinberg, 2000; Rieger, 2004). A atividade dos complexos de ciclina e CDK é regulada também por inibidores de CDK. Estes inibidores apresentam duas classes de genes: as famílias Cip/Kip e INK4a/ARF. A família Cip/Kip tem três componentes: p21, p27 e p57. Estas proteínas se ligam às CDKs e as inativam. A p21, componente da família Cip/Kip, tem sua atividade sob controle do gene p53. Quando ocorre lesão no DNA celular, a proteína

57 Revisão da Literatura 34 p53 pode seguir por duas vias. A primeira via promove parada do ciclo celular através do inibidor p21 para que o DNA possa ser reparado. A p21 inibe a ligação das ciclinas da fase G1 com as CDKs, bloqueando a continuação do ciclo celular. Caso a p53 não promova a ação da p21 e se a célula com lesões no DNA continuar a proliferar desordenadamente, podem originar células neoplásicas. Na segunda via, ocorre dano grave ao DNA e este não pode ser reparado. Portanto, a proteína p53 induz apoptose através da indução da transcrição de genes pró-apoptóticos como o bax. No G 2 /S a parada do ciclo celular envolve mecanismos tanto dependentes como independentes do gene p53 (Rieger, 2004). O gene INK4a/ARF codifica duas proteínas: p16ink4a e p14arf. A p16ink4a compete com a ciclina D na ligação com CDK4 e inibe o complexo ciclina D-CDK4 de fosforilar Rb, causando uma parada celular no final de G 1. A p16ink4a pode sofrer mutação e hipermetilação nos tumores humanos. A p14arf aumenta os níveis de p53 através da inibição da atividade da MDM2, proteína que promove a degradação do p53 (Hanahan; Weinberg, 2000; Rieger, 2004). Os principais alvos de lesão genética são os genes que estão relacionados com a regulação do ciclo celular. Dentre estes genes, encontram-se os proto-oncogenes, os supressores do tumor, os que regulam a morte celular (apoptose) e os genes envolvidos no reparo do DNA (Rieger, 2004). Proto-oncogenes são genes celulares normais que participam do controle das funções celulares vitais como proliferação, diferenciação, migração e morte celular (apoptose). Quando estes genes se encontram mutados ou sua expressão encontra-se descontrolada por alguns dos mecanismos de lesão gênica (amplificação gênica, mutação pontual e rearranjo gênico), diz-se que estão ativados, e passam a receber o nome de oncogenes (Hanahan; Weinberg, 2000; Rieger, 2004).

58 Revisão da Literatura 35 Genes supressores de tumores codificam proteínas com funções específicas que atuam impedindo o acúmulo de mutações no genoma da célula, garantindo sua integridade. Entre os supressores tumorais estão: o produto do gene p53, que controla a progressão da célula ao longo das fases do ciclo celular, o produto do gene Rb e os inibidores das quinases ciclina-dependentes. Alguns genes supressores de tumor são conhecidos como guardiões ( gatekeeper ). Eles regulam a entrada das células nas vias carcinogênicas inibindo a proliferação ou promovendo a apoptose. O Rb e aqueles envolvidos na síndrome de Von Hippel-Lindau são considerados genes guardiões. As mutações que ocorrem nos genes supressores do tumor causam perda de função ou inativação. A transformação neoplásica que envolve estes genes pode se originar devido metilação ou perda de uma grande porção da seqüência genética (Rieger, 2004). Em relação aos genes que regulam a apoptose e reparam o DNA, podemos citar o p53. Este é um dos genes que, quando existe lesão no DNA, pode provocar em G 1 parada do ciclo celular ou indução da apoptose. Em G2/M o p53 pode induz os genes envolvidos no reparo do DNA. Muitas neoplasias, portanto, possuem alteração no p53 (Rieger, 2004) Alterações essenciais para a transformação maligna O desenvolvimento do câncer é considerado um processo multifatorial. Os efeitos cumulativos de alterações genéticas, juntamente com as alterações ocorridas em conseqüência do estilo de vida e dos efeitos do meio ambiente, proporcionam uma transição gradual de tecido normal para tecido neoplásico (Rieger, 2004). As alterações genéticas podem ser adquiridas através de mutações. Estas podem ser divididas em duas categorias: as mutações pontuais e alterações cromossomiais. As

59 Revisão da Literatura 36 mutações pontuais são alterações que causam substituição de um único nucleotídeo, podendo alterar a seqüência de trinucleotídeos. Esta mutação pode levar a produção de um produto gênico com alterações físico-químicas ou a interrupção da produção do produto. As alterações cromossomiais podem envolver segmentos ou cromossomos inteiros e podem ser detectadas em exame de cariótipo. As translocações e inversões cromossomiais são exemplos destas alterações (Rieger, 2004). A amplificação gênica e as alterações epigenéticas são consideradas alterações cromossomiais. A amplificação gênica é mecanismo que leva produção de múltiplas cópias de um gene. O aumento do número de cópias de um alelo pode levar ao aumento da proteína expressa por esse gene. A depender da função da proteína que se encontra aumentada, a célula pode desregular o ciclo celular e entrar no processo de carcinogênese. Esta alteração pode ocorrer em adenocarcinomas de mama, onde o gene c-erbb-2 encontra-se amplificado (Rieger, 2004). As alterações epigenéticas são definidas como modificações na regulação da expressão gênica. Estas alterações podem persistir por uma ou mais gerações. Não são consideradas como mutação, pois não causam mudança na seqüência de DNA. Tem como principais exemplos a metilação do DNA e a acetilação das histonas. A metilação do DNA é a alteração epigenética mais estudada e corresponde à adição de um grupo metil ao carbono na posição 5 da citosina. Ela modifica o fenótipo celular, pois provoca inibição de funções gênicas, mas sem produzir alteração na seqüência do DNA (Rieger, 2004). A metilação pode fazer parte do processo de carcinogênese quando provoca a metilação de ilhas CpG no DNA. Estas ilhas constituem pequenas porções de DNA que normalmente não são metiladas. Elas são constituídas por dinucleotídeos formados por citosinas seguidas por uma guanina (Rieger, 2004).

60 Revisão da Literatura 37 A maioria das alterações genéticas é adquirida através de mutações das células somáticas. Os tumores que apresentam estas mutações são conhecidos como esporádicos (Rieger, 2004). As mutações que ocorrem nas células germinativas são conhecidas como hereditárias e estão associadas às diversas síndromes humanas. As mutações hereditárias estão presentes em cerca de 5% a 10% dos tumores sólidos humanos (Rieger, 2004). Em 1971, a hipótese da oncogênese em duas etapas de Kunudson foi proposta para explicar a ocorrência esporádica e hereditária de um tumor: o retinoblastoma. O desenvolvimento deste é possível pela inativação de ambos os alelos normais no locus Rb. A hipótese sugere que, nos casos hereditários, uma alteração genética é herdada de um dos pais afetados e está presente em todas as células somáticas do corpo. Esta seria a primeira etapa. Portanto, a criança é portadora de um alelo mutante Rb em todas as células somáticas e apresenta fenótipo normal. A heterozigosidade para o gene Rb não afeta o comportamento celular. A segunda etapa seria a ocorrência de uma segunda mutação numa das muitas células da retina, que já são portadores da primeira mutação. O câncer se desenvolve quando a célula perde a heterozigosidade, uma condição conhecida como LOH. Nos casos esporádicos, as duas etapas ocorreriam dentro de uma única célula somática da retina, cuja proliferação formaria o tumor (Rieger, 2004). Um tumor, então, é o resultado de diversos ciclos de replicação celular, acúmulo de mutações e expansão clonal (Rieger, 2004). De acordo com o conceito proposto por Hanahan e Weinberg (2000), com as alterações gênicas acumuladas ao longo do tempo no processo de carcinogênese, as células tumorais adquirem progressivamente habilidades que as distinguem das células normais. Estas habilidades adquiridas, comuns a todas as neoplasias, são enumeradas como: auto-suficiência de sinais de crescimento, insensibilidade a sinais inibitórios, escape dos mecanismos de apoptose,

61 Revisão da Literatura 38 potencial de replicação ilimitado, angiogênese sustentada, capacidade de invasão e metástases. A ordem temporal pelas quais essas habilidades são adquiridas é variável. O repertório de alterações capazes de fazer a célula adquirir tais habilidades são múltiplos e o conhecimento acerca destes está se acumulando rapidamente na literatura oncológica, principalmente através de estudos que avaliam a expressão gênica (Hanahan; Weinberg, 2000; Rieger 2004) 2.5. Transformação maligna na mama Auto-suficiência nos sinais de crescimento As células neoplásicas são resultantes de proliferação desordenada pelas quais as células adquirem novas habilidades e acumulam alterações no seu DNA. Uma destas habilidades é a auto-suficiência de crescimento. No câncer de mama as células desenvolvem auto-suficiência do crescimento adquirindo a capacidade de sintetizar fatores de crescimento e seus receptores, além de outros sinalizadores mitogênicos como proteínas transdutoras de sinal, fatores de transcrição, ciclinas e quinases ciclinadependentes. Estas substâncias podem interagir entre si formando uma rede de sinalizações que levam as células a entrar no ciclo celular e proliferar desordenadamente, formando clones de células neoplásicas (Hanahan; Weinberg, 2000; Rieger 2004). A auto-suficiência do câncer de mama é resultado da produção pelas células neoplásicas de receptores de estrógeno (RE), receptores de progesterona (RP), membros da família do receptor de fator de crescimento epidérmico (EGFR) e reguladores do

62 Revisão da Literatura 39 ciclo celular como a ciclina D1, a p21, a p16, a p27 e a Checkpoint Kinase 2 (Chk 2) (Hanahan; Weinberg, 2000; Rieger 2004). As células neoplásicas que expressam RE agem como reguladores transcricionais hormônio-dependentes. Existem dois tipos de RE: o REα e REβ. A pesquisa do REα tem valor prognóstico estabelecido na terapia hormonal, porém o REβ não tem valor prognóstico definido no câncer de mama (Esteva; Hortobagyi, 2004). Estudos mostram que o REα e REβ estão associados a diferentes variáveis clínicopatológicas, mas estudos adicionais precisam ser realizados para verificar as funções destes receptores. O RP tem um papel funcional, pois indica a integridade da via estrogênica nas células neoplásicas (Esteva; Hortobagyi, 2004). O receptor do fator de crescimento epitelial (EGFR) é um membro da família de fatores de crescimento EGFR ou família do receptor tirosino-quinase do tipo I. Esta família é constituída pelo HER1, HER2, HER3 e HER4. É descrito que esta família está envolvida no desenvolvimento e progressão dos carcinomas mamários. O EGFR, também conhecido como c-erbb-1, ErbB-1 e HER-1, está relacionado com pior prognóstico nos carcinomas mamários e a sua expressão indica menor sobrevida, maior potencial metastático e negatividade para receptor de estrógeno. O HER2, também conhecido como c-erbb-2, HER2/neu e ErbB-2, é o produto do do oncogene HER2 que está relacionado com menor sobrevida e alto grau histológico. A literatura é pouco informativa quanto à relação entre os carcinomas mamários e o HER-3 e o HER-4 (Srinivasan et al., 2000). É descrito que o estudo dos quatros membros da família EGFR oferece informações mais precisas sobre o comportamento tumoral do que apenas o estudo isolado de cada componente (El-Rehim et al., 2004; Lebeau et al., 2003). A ciclina D1 é um regulador do ponto de restrição em G1. A superexpressão da ciclina D1 torna o crescimento das células menos dependente dos fatores de

63 Revisão da Literatura 40 crescimento usuais e aceleram a passagem de G1 no ciclo celular. Ela é considerada, por alguns autores, um oncogene em potencial (Umekita et al., 2002). Estudos relataram que a ciclina D1 contribui para a carcinogênese mamária. Ela é expressa em 40% a 60% dos carcinomas mamários, porém o valor prognóstico da ciclina D1 em relação a estas neoplasias ainda é incerto. É proposto pela literatura que a expressão da ciclina D1 em neoplasias é induzida por estrógenos. Corroborando com estes dados, vários trabalhos descreveram que tumores com superexpressão de ciclina D1 são mais propensos a apresentarem RE positivos (Lebeau et al., 2003; Umekita et al., 2002). A proteína p21 é considerada inibidora das quinases ciclina-dependentes e reguladora da transição da fase G1 para S (Lebeau et al., 2003). Esta proteína liga-se às ciclinas D e E, inibindo as quinases dependentes destas ciclinas (CDK 2 e CDK 4) necessárias para a progressão do ciclo celular (Hanahan; Weinberg, 2000; Rieger 2004). Lebeau e colaboradores (2003). Em carcinomas de mama a expressão da p21 é relacionada às neoplasias que apresentam alto grau histológico (Lebeau et al., 2003). Sobre os carcinomas de mama, estes autores ainda escreveram que a regulação da p21 é complexa e não apenas regulada pela p53, mas por outras vias independentes desta proteína (Lebeau et al., 2003). A proteína p16 atua inibindo as quinases dependentes de ciclina. Ela se liga a CDK 4, inibe sua ação e provoca parada do ciclo celular na fase G1. É considerada como proteína, cuja função é inibir a proliferação celular (Hanahan; Weinberg, 2000). O gene p16 pertence à família INK4a e está localizado no cromossomo 9p21, uma região que sofre deleções freqüentes em cânceres humanos, inclusive nos carcinomas mamários. Está ligada a fatores clínicos associados com pior prognóstico (Milde- Langosch et al., 2000).

64 Revisão da Literatura 41 A p27 é também um regulador do ciclo celular que atua inibindo as quinases ciclina-dependentes, provocando parada do ciclo celular em G1. A expressão do p27 confere um comportamento mais agressivo aos tumores (Milde-Langosch et al., 2000). A Chk 2 é uma proteína responsável pela parada do ciclo celular ou apoptose quando o DNA celular sofre danos, envolvendo mecanismos que promovem a fosforilação do p53. Mutações no Chk 2 estão presentes em pacientes com síndrome de Li-Fraumeni, sugerindo que este gene esteja relacionado com a inativação do p53. Ahn e colaboradores (2004) descreveram que mutações no Chk 2 são responsáveis pelo aumento do risco de adquirir câncer de mama, independente da presença de mutação do gene BRCA-1 e BRCA-2 (Ahn et al., 2004). O Chk2 é denominado por alguns autores como supressor tumoral, mas na tumorigênese do câncer mamário sua função ainda não é bem compreendida (Ahn et al., 2004) Insensibilidade aos sinais inibidores Apoptose é um mecanismo de morte celular programada, que participa de várias situações fisiológicas tais como o colapso endometrial durante a menstruação e a deleção de células durante a embriogênese. A apoptose atua na manutenção da homeostase tecidual, controlando o equilíbrio entre a proliferação e a morte celular. Este processo é importante em certas condições patológicas como o câncer (Sirvent et al., 2004). A apoptose é controlada por vários genes que determinam a sobrevida da célula. Alguns destes genes são: bcl-2, bax, survivin, p53, bag-1. Eles induzem a ativação de enzimas que degradam o DNA e as proteínas citoplasmáticas (Sirvent et al., 2004).

65 Revisão da Literatura 42 Para apoptose iniciar é necessária a presença de estímulos externos ou internos. Todos os estímulos levam a uma cascata de eventos moleculares que termina na ativação de enzimas chamadas caspases. As caspases são proteases de cisteína aspartato-específicas. O nome caspase origina-se de c de caspase e asp de ácido aspártico mais o terminal ase (c + asp-ase = caspases) (Schimmer, 2004; Zhang et al., 2004). As caspases estão presentes nas células em sua forma inativa e precisam que o programa de morte seja iniciado para serem ativadas. Existem dois tipos de caspases: caspases iniciadoras e caspases efetoras. As caspases iniciadoras (caspase-8 e caspase- 9) clivam formas inativas das caspases tornando-as ativas. As caspases ativadas são chamadas de efetoras (caspase-3 e caspase-7). Estas clivam outros substratos protéicos da célula resultando no processo apoptótico (Schimmer, 2004; Zhang et al., 2004). A ativação das caspases pode ser deflagrada através de uma via intrínseca ou extrínseca. A via extrínseca é iniciada por receptores de morte celular, como o fator de necrose tumoral (TNF) e o FAS, também conhecido por apoptosis inducing protein 1 (APO-1). Esta via permite a liberação das pró-caspases, que, após sofrerem autoativação, desencadeiam a liberação de caspases efetoras (Rieger, 2004; Schimmer, 2004; Sirvent et al., 2004). A via intrínseca é iniciada pela privação de fatores de crescimento e de hormônios e envolve a ativação da pró-caspase 9. Esta é ativada por eventos de transição da permeabilidade mitocondrial e culmina com liberação de citocromo c para o meio intracitoplasmático. Esta via culmina com a ativação da pró-caspase-9, levando à liberação em cadeia de caspases efetoras. Uma vez ativada, a caspase 9 ativa uma série de outras pró-caspases (caspase 3, 6 e 7), resultando numa amplificação do sinal de morte (Rieger, 2004; Schimmer, 2004; Sirvent et al., 2004).

66 Revisão da Literatura 43 As proteínas intracelulares que regulam diretamente o processo de ativação das caspases constituem a denominada família bcl-2. Os membros desta família podem ser divididos em moléculas pró-apoptóticas e antiapoptóticas (Rieger, 2004). O equilíbrio relativo entre as diferentes proteínas da família bcl-2 define a via de atuação anti-apoptótica ou pró-apoptótica do mecanismo de morte celular programada (Rieger, 2004). Este mecanismo é complexo. A proteína bad está acoplada a membrana mitocondrial e a membros anti-apoptóticos da família bcl-2, inibindo a atividade destes últimos. A proteína bad fosforilada se liga à proteína σ e vai para o citoplasma celular, deixando livres os membros anti-apoptótico da família bcl-2 para exercer sua atividade. Quando ativadas, as proteínas anti-apoptóticas inibem a bax, evitando que o citocromo c seja liberado para o meio intracitoplasmático e impedem a ativação das caspases. Do contrário, quando os membros anti-apoptóticos estão ligados a bad, não há inibição da bax. Esta libera o citocromo c para o meio intracitoplasmático e ativa a via das caspases (Würtz et al., 2005). O gene bcl-2 foi clonado em 1985 e sua proteína está localizada na membrana mitocondrial interna de numerosos tipos celulares. Este gene é considerado um protooncogene e foi descrito pela primeira vez na translocação cromossômica t(14;18), que ocorre no linfoma folicular de células B. O produto deste gene promove a sobrevivência, inibindo a ocorrência de apoptose (Sirvent et al., 2004; Zhang et al., 2004). A bag-1, também conhecida como RAP46, é uma proteína multifuncional. Uma de suas funções é proteger a célula da apoptose e permitir a proliferação celular. A superexpressão da bag-1 é descrita no processo de carcinogênese em várias neoplasias humanas, entre eles o câncer de mama (Townsend et al., 2005).

67 Revisão da Literatura 44 Entre as proteínas pró-apoptóticas, a mais conhecida é a bax, que está relacionado com a bcl-2, com quem pode produzir heterodímeros. Pode também produzir homodímeros consigo mesma. Ao que parece, a bcl-2 suprime a morte celular quando heterodimerizada com a bax (bcl-2/bax). Por outro lado, o homodímero bax/bax promove a morte celular programada (Sirvent et al., 2004; Zhang et al., 2004). A p53 exibe um mecanismo complexo em relação a apoptose. Quando ocorre lesão no DNA celular, o gene p53 pode seguir dois caminhos diferentes. Ele pode promover a parada do ciclo celular em G1 para que o DNA celular possa ser reparado ou induzir a apoptose, se o dano celular for irreversível. Para que ocorra a apoptose, a expressão do p53 regula positivamente o bax e negativamente o bcl-2, estimulando a apoptose. Tumores invasivos de mama mostram positividade imuno-histoquímica para a p53. Esta positividade reflete a presença do p53 mutado, que é incapaz de induzir a expressão do bax, não permitindo as células neoplásicas de entrar em apoptose (Sirvent et al., 2004; Zhang et al., 2004). O processo de apoptose é controlado por um família de proteínas inibidoras da apoptose. Estas são proteínas anti-apoptóticas que se ligam às caspases 3, 7 e 9, inativando-as e impedindo a progressão da cascata de morte celular. A proteína survivin é um membro das proteínas inibidoras da apoptose. Ela é expressa normalmente em tecidos fetais, mas não em tecidos adultos. É descrita sua superexpressão em adenocarcinomas de pulmão, pâncreas, cólon, próstata e mama. A proteína survivin está sendo investigada como marcador de transformação maligna precoce, já que não é expresso nas células adultas normais (Schimmer, 2004). A presença de distúrbios no mecanismo de apoptose é um dos fatores essenciais para a carcinogênese, pois podem levar a proliferação celular descontrolada (Schimmer, 2004; Sirvent et al., 2004).

68 Revisão da Literatura Potencial infinito de replicação: Telomerase Os telômeros são estruturas complexas e especializadas encontrados nas extremidades dos cromossomos. Eles são formados por repetições de seis nucleotídeos TTAGGG que compreendem até dezenas de quilobases (Bièche et al., 2000; Kirkpatrick et al., 2004; Mokbel et al., 1999). Os telômeros estabilizam os cromossomos, protegendo-os da degradação por nucleases. A cada ciclo de replicação celular, os telômeros progressivamente se encurtam. Ao atingirem um comprimento criticamente curto de telômero, a célula interrompe a divisão e envelhece. Criou-se a hipótese de que o telômero funcionaria como um relógio celular e seria um dos fatores responsáveis pela senescência (Bièche et al., 2000; Kirkpatrick et al., 2004; Mokbel et al., 1999). A enzima telomerase é uma ribonucleoproteína que reconhece os terminais dos telômeros e acrescenta repetições adicionais aos cromossomos (Bièche et al., 2000; Mokbel et al., 1999). Observou-se que esta enzima é inativa ou inibida na maioria das células somáticas (Bièche et al., 2000). Nas células germinativas (espermatozóides, óvulos e em algumas células tronco), a telomerase é uma enzima normalmente ativa. Esta enzima apresenta atividade bioquímica aumentada em 80 a 90% das neoplasias (Kirkpatrick et al., 2004). As células neoplásicas que possuem a telomerase ativa podem replicar-se sem limite. A este processo é dado o nome de imortalização (Ikeda et al., 2003; Mokbel et al., 1999). A telomerase possui uma subunidade catalítica com atividade transcriptase reversa denominada de htert- human telomerase reverse transcriptase - e uma subunidade de RNA, denominada de htr- human telomerase RNA. Possui também um componente htp- telomerase associated protein, que desempenha papel estrutural

69 Revisão da Literatura 46 (Bièche et al., 2000; Kirkpatrick et al., 2004, Poremba et al., 2002). A htert é a proteína responsável pela atividade da telomerase. A detecção dessa proteína pode ser realizada através do protocolo da amplificação repetida da telomerase (TRAP- telomerase repeat amplification protocol ), reverso da transcrição da reação em cadeia de polimerase (RT-PCR- reverse transcription polymerase chain reaction ) e de estudos imuno-histoquímicos (Bièche et al., 2000). A TRAP e a RT-PCR são métodos complexos, que exigem maior tempo e não estão associados com parâmetros morfométricos. A imuno-histoquímica, além de utilizar parâmetros morfológicos, é um método utilizado na rotina de patologia cirúrgica (Ikeda et al, 2003; Poremba et al., 2002). A telomerase tem sido foco de muitas pesquisas, havendo um interesse crescente no estudo de seu papel na carcinogênese. Em várias publicações, é descrito que a presença da telomerase está associada com aumento da proliferação celular em cânceres humanos. O aumento da proliferação celular pode ser mensurado através da detecção imuno-histoquímica da proteína Ki-67 (Ikeda et al., 2003; Morkbel et al., 1999). Foi observada correlação entre telomerase e Ki-67 no câncer colo-retal, carcinomas de pequenas células do pulmão e carcinoma papilífero da tireóide (Ikeda et al., 2003) Angiogênese A angiogênese é um mecanismo dinâmico que consiste no desenvolvimento e crescimento de vasos sanguíneos a partir de outros preexistentes. Este processo acompanha o indivíduo desde o período embrionário até a vida pós-natal. A angiogênese pode ser fisiológica ou patológica (angiogênese tumoral) e ambas são compostas por diversas etapas (Hicklin; Ellis, 2006).

70 Revisão da Literatura 47 A angiogênese tumoral é semelhante à fisiológica, porém os novos vasos formados têm algumas particularidades. Eles não possuem pericitos e as paredes constituídas por células endoteliais são finas, tortuosas, dilatadas e muito permeáveis devido à presença de diversos poros e à inexistência de membrana basal (Hicklin; Ellis, 2006). Para que as etapas da angiogênese se processem normalmente, é necessário um equilíbrio entre os fatores estimuladores e inibidores. Dentre os fatores estimuladores, detacam-se a família VEGF (factor de crescimento vascular endotelial) e seus receptores. No processo de inibição, destacam-se as interleucinas e os inibidores tecidulais das metaloproteinases (TIMP) (Hicklin; Ellis, 2006). O VEGF também é conhecido como fator de permeabilidade vascular (VPF), uma vez que permite que os fluidos e as proteínas do plasma extravasem. Muitos tecidos produzem pequenas concentrações deste fator. Porém, durante a angiogênese, este fator aumenta consideravelmente. O VEGF tem seis isoformas: VEGF-A, VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D, VEGF-F e o fator de crescimento plaquetário 1 e 2. Possui três receptores de tirosina quinase: VEGFR-1, VEGFR-2 e VEGFR-3. O VEGFR-1 e o VEGFR-2 estão relacionados com os processo de angiogênese e vasculogênese. O VEGFR-3 atua na linfangiogênese e é produzido por células endoteliais linfáticas (Hicklin; Ellis, 2006). O VEGF interfere em passos essenciais da angiogênese e exerce diversos efeitos nas células endoteliais. Além do aumento da permeabilidade, ele promove ativação, aumento da ação mitogênica e inibição da apoptose nas células endoteliais. O VEGF ainda pode induzir a ativação das metaloproteinases de matriz extracelular (MMP), facilitando o processo de angiogênese (Hicklin; Ellis, 2006).

71 Revisão da Literatura 48 A expressão do VEGF pode ser regulada por vários fatores como a hipóxia, as cicloxigenases, oncogenes e genes supressores tumorais. Nestes dois últimos grupos, destacam-se o c-erbb 2 e o p53. O c-erbb-2 induz a angiogênese, estimulando a produção do VEGF. O p53 previne a expressão do VEGF em células do câncer de mama (Hicklin; Ellis, 2006). Inibir a angiogênese tumoral através do bloqueio do VEGF é uma estratégia terapêutica que vem sendo pesquisada, uma vez que este fator pode estar relacionado ao crescimento, proliferação e resistência ao tratamento tumoral Invasão tecidual e Metástase Durante o processo de tumorigênese, algumas células adquirem fenótipo agressivo tornando-se capazes de invadir e formar metástases à distância. As células metastáticas freqüentemente apresentam a expressão de moléculas identificadas como marcadores de progressão tumoral. Estas moléculas estão sendo utilizadas em estudos que envolvem a fisiopatologia da disseminação metastática e na descoberta de novos fatores prognósticos (Baker et al., 2002; Noel et al., 2006). A metástase é um processo complexo resultante da interação entre as células tumorais e o tecido onde estas células se encontram. Na disseminação tumoral, as células neoplásicas devem adquirir habilidades para se soltar do tumor primário, invadir a matriz extracelular, migrar pelo estroma intersticial, induzir angiogênese, atravessar a membrana basal e o endotélio dos vasos, alcançar a corrente sanguínea e linfática, sobreviver na corrente sanguínea, ligar-se ao endotélio vascular, sofrer extravasamento, e proliferar no parênquima do órgão-alvo (Baker et al., 2002; Noel et al., 2006; Tang et al., 2005).

72 Revisão da Literatura 49 Entre as etapas de progressão do processo metastático, destaca-se a degradação da matriz extracelular. As moléculas efetoras desta etapa são enzimas pertencentes às metaloproteinases de matriz extracelular (MMP). Estas proteínas pertencem a uma família de endopeptídeos zinco-dependente que contém mais de 20 membros. Elas podem estar superexpressas nas células do estroma tumoral em vários tipos de câncer. Entre as células que expressam o MMP, estão as células endoteliais, fibroblastos e células mioepiteliais (Baker et al., 2002; Tang et al., 2005). As MMP são encontradas em sua forma inativa. São ativadas pela plasmina, principal ativador das MMP. A plasmina resulta da conversão do plasminogênio pelos membros do sistema ativador do plasminogênio (upa - Ativador de plasminogênio do tipo uroquinase; tpa - ativador de plasminogênio do tipo tecidual). Além disso, a plasmina é regulada pelo inibidor da ativação do plasminogênio (PAI) (Baker et al., 2002). As MMP ativadas degradam a matriz extracelular e a membrana basal nas fases iniciais do processo de carcinogênese e, nas fases tardias deste processo, promovem o crescimento sustentado, a angiogênese, invasão local e metástase à distância (Tange et al, 2005). Noel e colaboradores (2006) relataram a associação entre a expressão das MMP com a invasão tecidual, o crescimento tumoral e o aumento da vascularização (Noel et al., 2006). A degradação da matriz extracelular também é regulada pelo equilíbrio entre moléculas inibidoras e estimuladoras. As moléculas estimuladoras são conhecidas como indutoras da metaloproteinase da matriz extracelular (EMMPRIN). Estas são membros da família de imunoglobulinas e estão presentes na superfície de várias células tumorais. As EMMPRIN estimulam a expressão das MMP nos fibroblastos, nas células

73 Revisão da Literatura 50 endoteliais e nas células tumorais, por um mecanismo envolvendo interação entre moléculas de EMMPRIN (Tang et al., 2005). Além de exercer papel proteolítico, alguns membros da família das MMP exercem papel importante na regulação da angiogênese. Com a ação proteolítica, as MMP preparam a matriz extracelular para receber os fatores angiogênicos. Algumas MMP podem participar da mobilização destes fatores. A MMP-9 pode promover a mobilização do VEGF de moléculas presentes na matriz extracelular estimulando a neovascularização. Por outro lado, outras MMP induzem fatores anti-angiogênicos como a angiostatina e endostatina (Tang et al., 2005). Dentre os inibidores, destaca-se a família dos inibidores de metaloproteinases teciduais (TIMP). A família é composta de quatro componentes: TIMP-1, TIMP-2, TIMP-3 e TIMP-4. Elas estão expressas no estroma peritumoral, em células como fibroblastos e endotélio vascular (Würtz et al., 2005). Além de inibir as MMP, as TIMP estimulam o crescimento de vários tipos celulares e modulam negativamente o processo de angiogênese (Baker et al., 2002). No entanto, Noel e colaboradores (2006) escreveram que as TIMP são proteínas multifatorias e podem estar relacionadas tanto aos fatores inibidores quanto aos estimuladores da carcinogênese (Noel et al., 2006). Segundo estes autores, as TIMP podem induzir proliferação de alguns tipos celulares, promover angiogênese e ação anti-apoptótica às células tumorais (Noel et al., 2006). A angiogênse promovida pelas TIMP está relacionada ao fato de que algumas MMP estimulam fatores anti-angiogênicos (endostatina e angiostatina). As TIMP, sendo inibidoras da MMP, impediriam a estimulação destes fatores (Würtz et al., 2005). Würtz e colaboradores (2005) ainda relatam relação das TIMP com a expressão VEGF em células de carcinomas mamários humanos (Würtz et al., 2005).

74 Revisão da Literatura 51 A ação anti-apoptótica relacionada às TIMPs envolvem mecanismo dependente e indepentente das MMP. Würtz e colaboradores (2005) relataram que a integridade da matriz extracelular e as interações celulares da matriz suprimem a apoptose. Quando ocorre degradação da matriz pelas MMP, fatores pró-apoptóticas são liberados e induzem a ativação das caspases. Este seria o mecanismo dependente das MMP, pois com a TIMP inibindo-as não haveria degradação da matriz extracelular (Würtz et al., 2005). O mecanismo independente das MMP ainda não é bem estabelecido. Würtz e colaboradores (2005) sugerem que este último mecanismo seja decorrente da fosforilação pelas TIMP da quinase de adesão focal (FAK) intracitoplasmática, iniciando a via PI-3/Akt/bad/bcl-2 (Würtz et al., 2005). Muitas pesquisas vêm investigando marcadores biológicos que possam determinar a predisposição metastática tumoral. Entendendo melhor este processo, os cientistas poderiam descobrir uma forma de controlar a disseminação metastática ou, até mesmo, erradicá-la (Wang-Rodrigues et al., 2003). A linhagem de células M-4A4 secreta uma proteína chamada osteopontina (OPN). Esta é uma glicoproteína que está envolvida no desenvolvimento ósseo e na regulação do sistema imune. A OPN é expressa normalmente em alguns tipos celulares, incluindo leucócitos e células de linhagem epitelial (Wang-Rodrigues et al., 2003). De acordo com os estudos preliminares, a OPN parecia se comportar como um clássico marcador biológico preditor de metástase. No entanto, níveis elevados de OPN foram detectados em macrófagos e linfócitos localizados no estroma perilesional e também em condições fisiológicas, como gravidez e amamentação. Dados mais recentes sugerem que aumento nos níveis de OPN em pacientes com carcinoma primário é uma etapa necessária, mas não suficiente para a disseminação metastática. Portanto, a expressão aumentada de OPN pode ser utilizada na diferenciação de lesões benignas e

75 Revisão da Literatura 52 malignas, mas o seu papel como preditor de metástase ainda não está bem esclarecido (Wang-Rodrigues et al., 2003). Os eventos relacionados à invasão tecidual e à metástase são alvos de várias pesquisas. Estas se propõem a desvendar novos marcadores tumorais que possibilitem detectar precocemente a tendência dos tumores na produção de metástases. 2.6 Fatores prognósticos em câncer de mama A história natural do câncer de mama indica que o curso clínico da doença e a sobrevida variam de paciente para paciente (Abreu; Koifman, 2002). Esta variação é determinada por uma série de variáveis clínico-patológicas e prognósticas ainda não completamente compreendidas e que podem estar relacionadas com a condição imunológica, hormonal, nutricional e genética do paciente. Estes fatores estão sendo estudados para predizer o prognóstico de pacientes com câncer, incluindo o carcinoma mamário (Elston; Ellis, 1991; Fitzgibbons et al., 1999). O termo fator prognóstico pode ser definido como um parâmetro possível de ser mensurado, em um paciente com câncer, no momento do diagnóstico e que servirá como preditor da sobrevida ou do tempo livre de doença. O aprimoramento do conhecimento sobre fatores prognósticos é constante. Estudos científicos continuam publicando novos fatores prognósticos para pacientes com câncer, dos quais muitos são considerados promissores (Abreu; Koifman, 2002). Nos tumores mamários, a conduta terapêutica a ser escolhida não é baseada apenas na avaliação dos fatores prognósticos. A combinação e o conhecimento das variáveis clínico-patológicas e prognósticas permitem a escolha da terapêutica mais benéfica e individualizada, com intensidade e efetividade adequadas ao paciente, maior

76 Revisão da Literatura 53 seletividade na aplicação dos tratamentos adjuvantes, além de reduzir o sofrimento oriundo dos efeitos colaterais das drogas utilizadas no tratamento do câncer (Abreu; Koifman, 2002; Elston; Ellis, 1991; Esteva; Hortobagyi, 2004; Fitzgibbons et al., 1999) Fatores clínico-patológicos e prognósticos utilizados na rotina de patologia mamária Estes são fatores clínico-patológicos definidos como de importância prognóstica em patologia mamária e utilizados no manejo clínico dos pacientes. Alguns fatores prognósticos clínico-patológicos, como grau e subtipo histológico do tumor, tamanho tumoral e envolvimento dos linfonodos axilares são fatores prognósticos bem estabelecidos (Fitzgibbons et al., 1999). Além dos fatores prognósticos e clínico-patológico, existem marcadores moleculares detectados por imuno-histoquímica que são considerados importantes para a avaliação do paciente com câncer. Alguns destes marcadores estão relacionados ao prognóstico, outros, à resposta terapêutica ou a ambos (Esteva; Hortobagyi, 2004). Receptores hormonais (RE e RP), c-erbb-2, p53 e ki-67 são marcadores imunohistoquímicos utilizados na rotina de patologia mamária. Estes marcadores, embora apresentem valor prognóstico bem estabelecido em patologia mamária, freqüentemente estão participando de estudos que tentam verificar as interações com outras variáveis clínicas, patológicas e terapêuticas (Esteva; Hortobagyi, 2004). A influência da idade na determinação da sobrevida no câncer de mama permanece controversa. Esta informação pode ser resultado do pequeno número de pacientes envolvidos nos estudos realizados, das diferentes formas de estratificação das idades e da falta de correlação dos óbitos ocorridos por outras causas diferentes do

77 Revisão da Literatura 54 câncer de mama. Estudos relatam que pacientes com câncer de mama pertencentes a quarta e quinta décadas de vida apresentam melhor prognóstico. Por outro lado, um pior prognóstico estaria relacionado ao grupo de mulheres mais jovens (idade igual ou inferior a 35 anos) e àquelas cujo diagnóstico do câncer venha a ser estabelecido a partir dos 75 anos de idade (Abreu; Koifman, 2002). O tamanho tumoral e a condição dos linfonodos axilares são os dois mais importantes indicadores prognósticos para câncer de mama, tanto que constituem a base do estadiamento TNM (Abreu; Koifman, 2002). O tamanho tumoral é um importante preditor do comportamento tumoral (Fitzgibbons et al., 1999). Ele está relacionado ao desenvolvimento de metástase, recidiva e a indicação do tratamento no momento do diagnóstico. Na ausência de comprometimento metastático dos linfonodos axilares, o tamanho do tumor torna-se o melhor preditor da recidiva tumoral (Abreu; Koifman, 2002). Quanto maior o tamanho tumoral, maiores são as chances de comprometimento metastático dos linfonodos loco-regionais. Os tumores de menor tamanho estão relacionados a um melhor prognóstico tanto para sobrevida quanto para o tempo livre de doença (Abreu; Koifman, 2002; Elston; Ellis, 1991; Fitzgibbons et al., 1999). O estudo do envolvimento axilar e do número de linfonodos comprometidos são informações prognósticas importantes. Os tumores de até 1,0 cm de diâmetro apresentam de 20% a 30% de chance de apresentarem linfonodos envolvidos pela doença e os tumores ductais com grau histológico elevado podem até dobrar este percentual em relação ao comprometimento dos linfonodos (Abreu; Koifman, 2002). Estudos demonstram que o tamanho tumoral, a sobrevida das pacientes e a recorrência da doença estão diretamente relacionados ao número de linfonodos comprometidos (Abreu; Koifman, 2002, Fitzgibbons et al., 1999). Pacientes com linfonodos axilares negativos apresentam 20% a 30% recorrência, enquanto pacientes com linfonodos

78 Revisão da Literatura 55 positivos apresentam 70% de recorrência. Pacientes com quatro ou mais linfonodos acometidos apresentam pior prognóstico (Fitzgibbons et al., 1999). O prognóstico está relacionado com o subtipo histológico do tumor. O carcinoma ductal e o carcinoma lobular invasor, na sua apresentação pura ou em combinação com outros tipos, são as formas mais comuns de carcinoma mamário. Quando dois ou mais diferentes tipos de tumores estão presentes, a classificação é feita de acordo com o tipo de tumor que exibe o maior percentual de células neoplásicas (Abreu; Koifman, 2002). O carcinoma ductal invasor é considerado a neoplasia mamária maligna de pior prognóstico e com maior envolvimento linfático. De maneira simplificada e tendo o carcinoma ductal invasor como referencial, o carcinoma tubular puro, o carcinoma mucinoso e o carcinoma cribiforme invasivo apresentam melhor prognóstico. O carcinoma lobular e o carcinoma medular apresentam prognóstico intermediário em relação aos carcinomas ductais invasores (Abreu; Koifman, 2002; Elston; Ellis, 2001). O grau histológico reflete o potencial de malignidade do tumor indicando a sua maior ou menor capacidade de metastatizar, sobrevida, tempo livre de doença, além de permitir a estratificação de risco e a formulação do estadiamento tumoral para cada paciente (Abreu; Koifman, 2002; Elston & Ellis, 2001; Fitzgibbons et al., 1999). Porém, o emprego do grau histológico na determinação prognóstica do câncer da mama apresenta controvérsias. Isto se deve à dificuldade na reprodutibilidade do diagnóstico histológico entre diferentes patologistas e entre diferentes serviços, visto a natureza subjetiva de sua determinação (Abreu; Koifman, 2002; Elston & Ellis, 2001). Esta variável se tornou mais reprodutível após a graduação de Nottinghan (Esteva; Hortobagyi, 2004).

79 Revisão da Literatura 56 A condição do RE e do RP teve sua significância prognóstica estabelecida na segunda metade dos anos 70 (Abreu; Koifman, 2002; Elston; Ellis, 1991; Esteva; Hortobagyi, 2004; Fitzgibbons et al., 1999). A partir da introdução do método imunohistoquímico, que possibilitou a utilização do tecido fixado em formalina, o estudo dos receptores hormonais por biópsia tornou-se prático e de custo reduzido. O RE, quando positivo, está associado com a idade, baixo grau histológico, grau nuclear menor, baixo índice de proliferação celular e a paciente pode ser beneficiada com a terapia hormonal adjuvante. Por outro lado, a negatividade do RE está associada com baixa diferenciação tumoral, alta taxa de proliferação celular e outras variáveis que desfavorecem o prognóstico das pacientes com câncer de mama (Abreu; Koifman, 2002; Esteva; Hortobagyi, 2004). Com relação à sobrevida, as pacientes com tumores RE positivos tendem a ter uma sobrevida maior, e melhor resposta à terapia hormonal do que aquelas com RE negativos (Abreu; Koifman, 2002; Elston; Ellis, 1991; Esteva; Hortobagyi, 2004; Fitzgibbons et al., 1999). Estudos demonstram que o bom prognóstico conferido pela positividade do RE não é sustentável a longo prazo. Trabalhos citados no artigo de Abreu e Koifman (2002) descrevem que o valor preditivo da condição do RE no tumor primário decresce aproximadamente 20% ao ano. Outros autores descrevem que a significância estatística desaparece com 10 anos de seguimento. Se por um lado o RE não se apresenta como um preditor competente da sobrevida a longo prazo, por outro ele é um forte preditor de resposta para a terapia endócrina adjuvante (Abreu; Koifman, 2002). O RP tem sido apresentado, na maioria dos estudos, como portador de um papel secundário, indicando a integridade da via estrogênica nas células neoplásicas. No entanto, algumas pesquisas relatam que as pacientes mais idosas com metástase e RP

80 Revisão da Literatura 57 positivo apresentam maior tempo de intervalo livre de progressão da doença (Abreu; Koifman, 2002; Esteva; Hortobagyi, 2004). C-erbB-2 é um oncogene cuja amplificação gênica ou superexpressão são importantes na patogênese do câncer de mama (Elston; Ellis, 1991; Esteva; Hortobagyi, 2004). Ele está presente em cerca de 20% a 30% dos carcinomas mamários invasores e a expressão aumentada desta proteína é considerada como indicador de mau prognóstico. As pacientes com acometimento neoplásico dos linfonodos axilares, que expressam c-erbb-2, apresentam um alto risco de recidiva precoce, menor sobrevida, menor tempo livre de doença e alto grau histológico (Abreu; Koifman, 2002; Elston; Ellis, 1991; Fitzgibbons et al., 1999). Variáveis como sobrevida e tempo livre de doença estariam relacionadas ao mau prognóstico em carcinomas mamários positivos para c- erbb-2 devido ao aumento da atividade metastática apresentado pelas células tumorais que expressam esta proteína (Abreu; Koifman, 2002). Em relação ao tratamento, existem vários trabalhos com resultados conflitantes. Um destes relatos descreve pacientes com a expressão aumentada da c-erbb-2 apresentando maior resistência às drogas quimioterápicas (Abreu; Koifman, 2002). No entanto, é descrito que pacientes com c-erbb-2 positivo apresentam melhor resposta a alguns quimioterápicos, como a doxorubicina, e pacientes com carcinoma de mama metastático com c-erbb-2 positivo são fortes candidatos a terapia com anticorpo monoclonal Trastuzumab (Herceptin ). Em relação à terapia hormonal, a presença do c-erbb-2 é controversa (Esteva; Hortobagyi, 2004). O gene supressor tumoral p53 e suas mutações estão relacionados com um comportamento mais agressivo do tumor, negatividade para receptores de estrógeno, alto grau histológico e um prognóstico desfavorável. Outros estudos correlacionaram a expressão aumentada da p53 em carcinomas de mama com agressividade do tumor, recidiva

81 Revisão da Literatura 58 ou metástase precoce e menor sobrevida em pacientes com linfonodo axilares negativos (Abreu; Koifman, 2002; Esteva; Hortobagyi, 2004; Fitzgibbons et al., 1999). As mutações do p53 em células germinativas, como na síndrome de Li-Fraumeni, aumentam a incidência para o carcinoma mamário. Nos carcinomas mamários hereditários, é descrito uma correlação entre o p53 e o BRCA-1 e BRCA-2. As associações verificadas entre os estudos imuno-histoquímicos e os resultados clínicos em relação à proteína p53 são promissores, porém muito ainda necessita ser aprendido sobre a função do p53 e suas interações com seus produtos e outros genes, principalmente com os genes da família p53 (Abreu; Koifman, 2002; Fitzgibbons et al., 1999). O Ki-67 é uma proteína nuclear lábil que identifica células nas fases G1, S, G2 e M, mas não na fase G0. É um importante marcador imuno-histoquímico na detecção de proliferação celular. Quanto maior a expressão do ki-67 em células neoplásicas, pior é o prognóstico. Pacientes portadores de carcinoma mamário com mais de 50% das células neoplásicas positivas para ki-67 apresentam alto risco de desenvolver recorrência (Esteva; Hortobagyi, 2004; Fitzgibbons et al., 1999). Mokbel e colaboradores (1999) descreveram que quanto maior a percentagem de células neoplásicas nos carcinomas mamários, mais indiferenciado é o tumor (Mokbel et al., 1999). Estudos mostram associação do ki-67 com grau nuclear, idade, contagem mitótica e metástase para linfonodos (Esteva; Hortobagyi, 2004; Mokbel et al., 1999) Marcadores imuno-histoquímicos não definidos quanto ao seu papel ou com papel secundário na rotina de patologia mamária São marcadores imuno-histoquímicos que não apresentam estudos suficientes para defini-los como de uso freqüente na rotina de patologia mamária. Entre eles estão o

82 Revisão da Literatura 59 bcl-2, c-erbb-3, EGFR, VEGF, MMP, EMMPRIN, TIMP, PAI, telomerase, osteopontina (OPN) e a p63. Em relação à morte celular, quando as células neoplásicas apresentam baixo índice apoptótico, espera-se que o tumor tenha um comportamento mais agressivo. Paradoxalmente, apesar da proteína bcl-2 apresentar função anti-apoptótica, sua superexpressão está associada ao maior tempo livre de doença. Estudos mostram que este dado controverso é decorrente da associação da bcl-2 com a presença de RE nos carcinomas de mama. A presença de RE confere melhor resposta ao tamoxifeno, explicando a relação da proteína bcl-2 com maior tempo livre de doença. Ela também está relacionada com a resposta dos tumores ao tratamento quimioterápico. Os tumores bcl-2 negativos respondem melhor à quimioterapia, enquanto os tumores bcl-2 positivos geralmente não apresentam boa resposta quimioterápica (Elston; Ellis, 1991). Srinivasan e colaboradores descrevem que a marcação imuno-histoquímica nuclear do anticorpo c-erbb-4 está associado a melhor fenótipo dos carcinomas mamários. Estes autores também relatam a expressão do c-erbb-3 em algumas neoplasia malignas. O c-erbb-3 encontra-se superexpresso em 20% dos carcinomas mamários invasores (Srinivasan et al., 2000). No entanto, a literatura é pouco informativa quanto à relação entre os carcinomas mamários e o HER-3 e o HER-4 (Srinivasan et al., 2000). O EGFR, quando expresso em carcinomas de mama, tem sido correlacionado com a negatividade para RE, má resposta ao tratamento com tamoxifeno e tumores com grau histológico elevado (Elston; Ellis, 1991). Além da função proteolítica, estudos descrevem que os membros da família das MMP também participam da angiogênese através da estimulação do VEGF (Würtz at al., 2005). Com relação à progressão tumoral, a expressão das MMP está aumentada em

83 Revisão da Literatura 60 várias neoplasias humanas, inclusive em carcinomas mamários, quando comparada à expressão desta proteína em tecido normal. As neoplasias que apresentam expressão da MMP aumentada estão relacionadas a um pior prognóstico (Baker et al., 2002). Paradoxalmente, as TIMP, que são inibidoras das MMP, estão relacionadas a um pior prognóstico (Baker et al., 2002; Würtz et al., 2005). Para explicar este dado, Würtz e colaboradores (2005) propuseram que as TIMP estimulariam a proliferação celular através de mecanismo de receptor de superfície celular ainda não conhecido. Este mecanismo promoveria a angiogênese e exerceriam função anti-apoptótica, por um processo dependente e outro independente das MMP (Würtz e al., 2005). O PAI-1 e upa, componentes do sistema de ativação do plasminogênio, estão relacionados com prognóstico desfavorável, menor sobrevida livre de doença e menor sobrevida global (Baker et al, 2002). Por ser um inibidor do ativador das MMP, a proteína PAI deveria estar relacionada a bom prognóstico. No entanto, Würtz e colaboradores (2005) descreveram efeitos anti-apoptóticos e pró-angiogênicos relacionados a PAI, o que explicaria a sua relação com o prognóstico desfavorável (Würtz et al., 2005). O principal estímulo para a angiogênese é a interação entre o VEGF e seus receptores (Ferrara, 1999). Estudos relatam que a expressão do VEGF se correlaciona com pior prognóstico, pois em alguns tumores o VEGF estimula o crescimento tumoral, comportamento mais agressivo, recorrência e metástase, além de estar relacionado à menor sobrevida (Ferrara, 1999; Linderholm et al., 2001). Devido à importância do VEGF na angiogênese e na progressão tumoral, a sua inibição é um importante alvo nas terapias de cânceres experimentais (Weigand et al., 2005). Estudos relatam correlação entre a expressão da telomerase e maior agressividade tumoral. Esta agressividade é descrita nos neuroblastomas e nos cânceres

84 Revisão da Literatura 61 gástricos. Em relação ao prognóstico, a associação entre a telomerase e os carcinomas mamários é controversa (Poremba et al, 2002). Autores relatam que altos níveis de telomerase estão associados com a presença de metástase para linfonodos axilares, recorrência tumoral e aumento da proliferação celular mensurada pelo ki-67 (Ikeda et al., 2003; Morkbel et al., 1999; Poremba et al., 2002). Outros estudos sugerem que a telomerase pode ser utilizada como marcador prognóstico, marcador para quimioterapia anti-câncer e marcador biológico para detecção do câncer, mas estudos adicionais são necessários para validar essas hipóteses (Mokbel et al., 1999; Poremba et al., 2002). Através de estudos imuno-histoquímicos e de RT-PCR, foi detectada expressão aumentada de OPN em tumores primários de mama. Em pacientes com câncer mamário metastático, níveis elevados da OPN foram detectados no plasma (Wang-Rodrigues et al., 2003). Porém, como já foi dito, a expressão aumentada de OPN pode ser utilizada na diferenciação de lesões benignas e malignas, mas o seu papel como preditor de metástase ainda não está bem esclarecido (Wang-Rodrigues et al., 2003).

85 Justificativa JUSTIFICATIVA Os três genes da família p53 apresentam alto grau de homologia entre si. No entanto, apesar da semelhança estrutural e, em parte, funcional entre os genes da família p53, estudos descrevem funções diversificadas para estes genes a depender da isoforma e das circunstâncias atuantes. Os genes da família p53 atuam sobre proteínas-alvo em vias metabólicas diferentes. Com isso, várias interações entre proteínas-alvo, vias metabólicas e membros da família p53 podem ser possíveis. Por exemplo, a proteína p21 é alvo de dois membros da família p53 (o p53 e o p73) e atuam sobre a mesma via metabólica promovendo parada do ciclo celular para que o DNA celular possa ser reparado. Além de atuarem em diversas vias metabólicas, algumas das isoformas dos genes da família p53 também apresentam papel de cooperação e de dependência entre si para poder exercer suas funções. O conhecimento das proteínas-alvo, das vias biológicas e das interações entre os membros da família é um desafio, mas que vem progredindo em diversas pesquisas (Moll; Slade, 2004). Como o p63 faz parte da família p53, as informações obtidas sobre ele não são diferentes das demais. Ele apresenta atividade biológica diversa, complexa, pouco definida, nas quais muitas de suas proteínas-alvo são desconhecidas (Moll; Slade, 2004; Westfall; Pietenpol, 2004). Algumas destas proteínas-alvo podem ser expressas nas células e detectadas pela reação de imuno-histoquímica. Como as alterações do p53 estão relacionadas à carcinogênese de vários tumores, seria interessante verificar se o p63, como membro da família p53, apresentaria também relação com vias ligadas à progressão tumoral. Utilizamos casos de carcinoma ductal mamário invasor, pois estes são carcinomas encontrados em grande número no serviço de Patologia do Hospital das

86 Justificativa 63 Clínicas de Ribeirão Preto - Universidade de São Paulo, facilitando a obtenção do N e de informações clínicas completas e padronizadas para o estudo. Além disso, a literatura descreve que alguns carcinomas ductais invasores expressaram a proteína p63 (Barbareschi et al., 2001; Reis-Filho et al., 2003; Ribeiro-Silva et al., 2003). Para tentar verificar a relação da p63 com os carcinomas ductais invasores e possíveis proteínasalvo, selecionamos vários anticorpos que agem em vias metabólicas diferentes, nas quais muitos estão relacionados à carcinogênese. Além dos anticorpos, foram inclusos no estudo, variáveis clínico-patológicas e prognósticas consideradas importantes em patologia mamária, nas quais a relação com a expressão da proteína p63 não é bem esclarecida. Agrupamos os anticorpos em diferentes grupos: anticorpos com importância clínica-patológica e prognóstica em patologia mamária (RE, RP, p53, c-erbb-2, ki-67), reguladores do ciclo celular (c-erbb-3, ChK2, ciclina D1, EGFR, p16, p21, p27, telomerase), reguladores da apoptose (bag-1, bax, bcl-2, caspase-8, p53, survivin) e proteínas que atuam no processo de invasão e metástase (EMMPRIN, MMP1, MMP2, OPN, PAI, TIMP1, TIMP2, VEGF). Muitos destes anticorpos são descritos como alvos do p53 e do p73, mas não do p63. No entanto, devido às interações de funções entre os genes da família p53, procuramos verificar se haveria relação entre as proteínas-alvo de vias metabólicas diferentes e a expressão da proteína p63. Alguns dos anticorpos com importância clínica-patológica em patologia mamária (RE, RP, p53, c-erbb-2, ki-67) apresentam relação com pelo menos um dos membros da família p53 e, por esta razão, foram inclusos nos estudo. Outros anticorpos deste grupo não apresentam interação esclarecida com os membros da família p53 e para verificar esta relação também foram inclusos no estudo. Por exemplo, a literatura descreve que presença de RE negativo está relacionada com mutações no p53 (Abreu;

87 Justificativa 64 Koifman, 2002; Esteva; Hortobagyi, 2004; Fitzgibbons et al., 1999). Portanto, o RE foi adicionado no estudo. No entanto, o RP, o c-erbb-2 e o ki-67 são anticorpos também utilizados na rotina de patologia mamária e cuja relação com a p63 é pouco conhecida. A proteína p53 não poderia ficar fora do estudo, pois é um membro da família p53. Como os anticorpos com importância clínica-patológica em patologia mamária, muitos dos anticorpos relacionados à regulação do ciclo celular apresentam interação com pelo menos um membro da família p53. A p16, p21, ChK2 e algumas ciclinas são proteínas-alvo do p73 (Garcia et al., 2004; Ishimoto et al., 2002; Moll; Slade, 2004). Como a literatura é pouco informativa quanto à relação entre os carcinomas mamários e o c-erbb-3, esta proteína foi incluída no estudo para verificar se havia alguma correlação com os carcinomas mamários que expressam a p63 (El-Rehim et al., 2004; Lebeau et al., 2003). O EGFR, a telomerase e a expressão da p27 estão relacionados com pior prognóstico nos carcinomas mamários e seria importante saber sua relação com membros da família p53 (Lebeau et al., 2003; Milde-Langosch et al., 2000; Poremba et al., 2002). No trabalho de Lewis e colaboradores (2006), células sobre a ação ectópica da telomerase expressaram a proteína p63. Os três genes da família p53 atuam na regulação da apoptose (Moll; Slade, 2004). Portanto proteínas anti-apoptóticas, como a bag-1, e proteínas pró-apoptóticas, como a bax, foram adicionadas a este estudo (Sirvent et al., 2004; Townsend et al., 2005; Zhang et al., 2004). Em relação às proteínas que atuam no processo de invasão e metástase, incluímos as MMP por estas estarem expressas nas células mioepiteliais, células onde a p63 também é expressa (Baker et al., 2002; Tang et al., 2005). Como as proteínas EMMPRIN, PAI, TIMP1 e TIMP2 estão relacionadas à regulação das MMP também foram adicionadas ao estudo. Os membros p73 e p53 atuam de forma inibitória no

88 Justificativa 65 VEGF (Moll; Slade, 2004). Portanto, como o VEGF apresenta interação com membros da famíla p53, foi acrescentado ao estudo para varificar sua relação com carcinomas mamários p63-positivos. A OPN, além de estar relacionada a estudos do potencial metastático, é expressa em células da linhagem epitelial (Wang-Rodrigues et al., 2003). Como a p63 é expressa em alguns tecidos epiteliais, a OPN foi incluída no estudo para varificar sua relação com carcinomas mamários p63-positivos. Entendemos que o número de variáveis do estudo é grande, por isso dividimos em grupos com área de atuação semelhante. Com estas variáveis tentamos, pelo menos, compreender quais as possíveis proteínas-alvo e vias metabólicas que poderiam apresentar relação com a expressão da proteína p63 e com a progressão tumoral dos carcinomas ductais mamários invasores p63-positivos.

89 Objetivos OBJETIVOS Verificar a relação entre a expressão imuno-histoquímica da proteína p63 em carcinomas mamários com fatores clínico-patológicos de importância prognóstica; Verificar a relação da expressão imuno-histoquímica da proteína p63 em carcinomas mamários com reguladores do ciclo celular, oncogenes, proteínas relacionadas a apoptose e a angiogênese tumoral, metaloproteinases e inibidores das metaloproteinases.

90 Metodologia METODOLOGIA 5.1 Sujeito Dos arquivos do Serviço de Patologia do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto (HCFMRP/USP) foram selecionados aleatoriamente laudos anátomo-patológicos de casos de carcinoma de mama diagnosticados entre 1992 e O critério para a inclusão destes laudos no estudo foi baseado no diagnóstico histopatológico. Os carcinomas mamários deveriam estar laudados como carcinoma ductal invasor sem outra especificação ( not otherwise specified NOS ) e apresentar a graduação histológica segundo a graduação de Nottinghan (Bloom; Richardson, 1957; Elston; Ellis, 1991; Fitzgibbons et al., 2000). A partir dos laudos selecionados, foram requisitados os prontuários dos pacientes. Para inclusão dos pacientes nas pesquisas, eles tinham de preencher os seguintes requisitos: ser do sexo feminino e apresentar biópsia de carcinoma mamário com os critérios histológicos citados acima, sem ter sido submetido a qualquer esquema de tratamento hormonal ou quimioterápico prévios no momento da biópsia. Foi dada preferência às biópsias excisionais. Caso a paciente não tivesse sido submetida à exérese da lesão, as biópsias incisionais eram inseridas no estudo se estivessem dentro dos critérios de inclusão já estabelecidos. Selecionados os laudos e os prontuários, segundo os critérios de inclusão, os blocos de parafina e lâminas foram examinados. Os blocos de parafina deveriam apresentar amostra de tecido com tamanho de pelo menos 1,0 cm no maior eixo. As lâminas selecionadas deveriam apresentar tecido mamário com células neoplásicas ocupando, pelo menos, 50% da amostra representada.

91 Metodologia 68 As informações clínicas foram coletadas dos prontuários médicos do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto-USP. Os dados clínicos considerados importantes para o prognóstico foram coletados para o estudo. Estes dados foram: idade, status menopausal, presença de metástase para linfonodos e estadiamento patológico. Quando os dados clínicos do prontuário estavam incompletos, a paciente era excluída do estudo. Após a exclusão de pacientes que não se enquadravam nos critérios citados acima, as lâminas dos laudos histopatológicos inclusos no trabalho foram revisadas pelos autores deste trabalho, confirmando o tipo e grau histológico. Para determinar o tipo histológico foi utilizado os critérios da Organização Mundial de Saúde OMS (Ellis et al., 2003). O grau histológico foi determinado de acordo com a graduação de Nottinghan (Bloom; Richardson, 1957; Elston; Ellis, 1991). A graduação de Nottinghan baseia-se nas características arquiteturais do tumor (formação de túbulos), do núcleo (grau nuclear) e na contagem mitótica. As características arquiteturais são baseadas na formação de túbulos. Se a neoplasia mostrava formação de túbulos em mais de 50% da amostra, concedeu-se 1 ponto. Se a formação de túbulos for entre 10% a 50%, concedeu-se 2 pontos. Se as células mostravam formação de túbulos em menos de 10% da neoplasia, concedeu-se 3 pontos. O grau nuclear foi avaliado da seguinte forma: um ponto foi concedido se os núcleos mostravam satisfatória uniformidade no tamanho, forma e coloração. Dois pontos, se estas variações fossem moderadas. Quando a neoplasia apresentava marcado grau de pleomorfismo ganhava três pontos. Para determinar a contagem mitótica, as mitoses foram contadas em dez campos de grande aumento CGA (x 40) com um microscópio da marca Nikkon - Labophot, com diâmetro de campo de 0,44 mm e área do campo de 0,152 mm. Conferiu-se um ponto aos tumores com até

92 Metodologia figuras de mitoses por dez CGA, dois pontos àqueles com 11 a 20 e três pontos quando mais de 20 foram observadas. Os pontos da formação tubular, grau nuclear e contagem mitótica foram somados e classificados como: de 3 a 5 pontos seria igual ao grau I (bem diferenciado); de 6 a 7 pontos seria igual ao grau II (moderadamente diferenciado); de 8 a 9 pontos seria igual ao grau III (pouco diferenciado) (Bloom; Richardson, 1957; Elston; Ellis, 1991). Realizada a revisão das lâminas, foram selecionadas 100 pacientes com carcinoma ductal invasor sem outra especificação ( not otherwise specified NOS ). Dentre estes, 32 eram carcinoma ductal invasor de grau I (bem diferenciado), 39 carcinoma ductal invasor de grau II (moderadamente diferenciado) e 29 carcinoma ductal invasor de grau III (pouco diferenciado). 5.2 Imuno-histoquímica A partir dos blocos de parafina, representativos de cada lesão, foram feitos cortes histológicos de 3 µm (micrótomo Spencer, modelo 820, série n ) e colocados em lâminas de vidro. Estas ficaram expostas à temperatura ambiente por 30 minutos e foram colocadas na estufa para desparafinização, por 2 horas, à temperatura de 70 C. Saindo da estufa, as lâminas foram desidratadas em xilol e reidratadas em bateria de álcool de diferentes graduações. A imuno-histoquímica foi realizada segundo o método do complexo avidina biotina-peroxidase (Novostain Super ABC kit, Novocastra, Newcastle upon Tyne, UK). Primeiramente, as lâminas foram colocadas em solução de tampão citrato na concentração de 10mM e ph 6,0 submetidas à recuperação antigênica por quarenta minutos em panela a vapor. As lâminas foram resfriadas até temperatura ambiente e lavadas com solução salina de

93 Metodologia 70 tampão-tris. Após este processo, os cortes histológicos foram tratados com peróxido de hidrogênio a 3% (H 2 O 2 ) em metanol por 5 minutos para eliminar a atividade endógena da peroxidase. O soro normal do Novostain Super ABC kit (Novocastra) foi colocado nas lâminas por 30 minutos para bloquear as ligações não específicas. Os anticorpos primários foram incubados durante 12 horas ( overnight ) em temperatura ambiente. As concentrações e diluições dos anticorpos utilizados são mostrados na tabela 2. Em seguida as lâminas foram lavadas em solução salina fosfatada e tamponada (PBS) e o anticorpo secundário biotinilado (Novostain Super ABC kit, Novocastra) foi adicionado, sendo incubado em temperatura ambiente por 30 minutos. Em seguida, os cortes foram lavados duas vezes com água destilada e tratados com o reagente do complexo avidina-biotina (Novostain Super ABC kit, Novocastra) por trinta minutos. Seguindo-se nova lavagem com PBS, os cortes histológicos foram incubados com diamino-benzidina (DAB) com ph 7,5 e contendo 0,036% de peróxido de hidrogênio, por 5 minutos. O DAB é aplicado para se obter a visualização do cromógeno, que indica a positividade da imunomarcação nos cortes histológicos. A hematoxilina de Mayer foi aplicada como contra-corante. Após a reação, as lâminas foram cobertas por lamínula, com auxílio de Permount (Fischer ).

94 Metodologia 71 Tabela 2. Concentrações, clones, diluições e fabricantes dos anticorpos utilizados. Anticorpo Clone Fabricante Diluição Bag-1 5C5 Novocastra, Newcastle upon 1:50 Tyne, UK Bax Polyclonal Dako, carpinteria, CA 1:100 Bcl-2 Bcl- Novocastra, Newcastle upon 1:50 2/100/D5 Tyne, UK Caspase 8 11B6 Novocastra, Newcastle upon 1:50 Tyne, UK c-erbb-2 CB11 Novocastra, Newcastle upon 1:300 Tyne, UK c-erbb-3 RTJ1 Novocastra, Newcastle upon 1:100 Tyne, UK Checkpoint kinase 2 (Chk2) DCS Novocastra, Newcastle upon 1:50 Tyne, UK Cyclin D1 P2D11F11 Novocastra, Newcastle upon 1:50 Tyne, UK Epidermal growth factor receptor (EGFR) EGFR.113 Novocastra, Newcastle upon 1:50 Tyne, UK Extracellular matrix metalloproteinase inducer 8D6 Santa Cruz, Palo Alto, CA 1:50 (EMMPRIN) Estrogen receptor (ER) 6F11 Novocastra, Newcastle upon Tyne, UK 1:100 Human telomerase reverse transcriptase 44F12 Novocastra, Newcastle upon 1:100 (htert) Tyne, UK Ki67 MM1 Novocastra, Newcastle upon Tyne, UK 1:150 Matrix metalloproteinase 1 (MMP1) 3B6 Novocastra, Newcastle upon 1:50 Tyne, UK Matrix metalloproteinase 2 ( MMP2) 8B4 Santa Cruz, Palo Alto, CA 1:50 Osteopontin (OPN) AKm2A1 Santa Cruz, Palo Alto, CA 1:100 p16 6H12 Novocastra, Newcastle upon 1:50 Tyne, UK p21 4D10 Novocastra, Newcastle upon 1:50 Tyne, UK p27 1B4 Novocastra, Newcastle upon 1:50 Tyne, UK p53 DO-7 Novocastra, Newcastle upon 1:100 Tyne, UK p63 4A4 Santa Cruz, Palo Alto, CA 1:100 Plasminogen activator inhibitor (PAI) TJA6 Novocastra, Newcastle upon 1:50 Tyne, UK Progesterone receptor 1A6 Novocastra, Newcastle upon 1:150 Tyne, UK Survivin FL-142 Santa Cruz, Palo Alto, CA 1:100 Tissue inhibitor of matrix metalloproteinase 1 6F6a Novocastra, Newcastle upon 1:100 (TIMP1) Tyne, UK Tissue inhibitor of matrix metalloproteinase 2 3A4 Novocastra, Newcastle upon 1:100 (TIMP2) Tyne, UK Vascular endothelial growth factor (VEGF) A-20 Santa Cruz, Palo Alto, CA 1:200

95 Metodologia Controles da imuno-histoquímica As amostras utilizadas como controle das reações de imuno-histoquímica foram selecionadas dos arquivos do serviço de patologia cirúrgica do HCFMRP/USP. Casos de carcinoma ductal invasivo sabidamente positivo para c-erbb-2, ciclina D1, RE, p16, p21, p53, PAI, RP e VEGF foram usados como controle positivo para estes anticorpos. Pele normal foi usada como controle para p63 e EGFR. Tonsilas foram usadas como controle positivo para bag-1, bax, bcl-2, Ki67 e h-tert. Amostras de tecido normal de rim, de intestino grosso e de osso foram usadas como controle positivo para Chk2, TIMP1 e OPN, respectivamente. Amostras de testículo normal foram usadas como controle positivo de Caspase 8 e survivin. Amostras de adenocarcinoma colônico foram usadas como controle positivo para EMMPRIM, MMP1, MMP2 e TIMP2. Como controles negativos, foram utilizadas as lâminas dos casos de carcinoma mamário selecionados, sem o anticorpo primário. 5.4 Interpretação das reações de imuno-histoquímica A interpretação das reações de imuno-histoquímica foi feita através de análise semiquantitativa e visual por dois observadores. Foi utilizado microscópico de luz convencional (microscópio da marca Nikkon - Labophot, com diâmetro de campo de 0,44 mm e área do campo de 0,152 mm). No aumento de 100x foi selecionada a área de maior expressão dos anticorpos no espécime e, com aumento final de 400x, foram contados as células positivas para a reação de imuno-histoquímica. Para a interpretação imuno-histoquímica dos anticorpos descritos na tabela 3 foi considerado um valor de corte representado em porcentagem de células neoplásicas positivas. Os valores de corte

96 Metodologia 73 de vários anticorpos, como o RE, RP e p53, são padronizados na literatura e na rotina de patologia mamária (Fitzgibbons et al., 2000; Lebeau et al., 2003). Já outros anticorpos da tabela 3 não mostram padronização consensual quanto o valor de corte para sua positividade. Para estes últimos anticorpos, utilizamos os valores de corte descritos na literatura deste trabalho (Bodey et al., 2004; Chow et al., 2001; El-Rehim et al., 2004; Gasparini et al., 2000; Ikeda et al., 2003; Lebeau et al., 2003; Mokbel et al., 1999; Ribeiro-Silva et al., 2006; Shariat et al., 2007; Singh et al., Sirvent et al., 2004; 2004; Sonh et al., 2006; Srinivasan et al., 2000; Stefanou et al., 2004; Wang-Rodriguez et al., 2003; Zloblec et al., 2006). Citamos alguns exemplos destes anticorpos cujo valor de corte não é padronizado. Um deles é a proteína p63. Sobre esta proteína p63, não existe um valor de corte padronizado em relação ao número ou porcentagem de células que precisam expressar esta proteína para o resultado da reação de imuno-histoquímica ser considerado positivo. Nos estudos de Stefanou e colaboradores (2004) e Koker e Kleer (2004), a reação de imuno-histoquímica a p63 apresentou positividade entre 5% a 10% nas células epiteliais e luminais, excluindo as células mioepitelias, nas lesões benignas e malignas da mama. Portanto, utilizou-se o valor de corte de 5% para que a expressão da p63 fosse considerada positiva. Em várias publicações, é descrito que a presença da telomerase está associada com aumento da proliferação celular em cânceres humanos. O aumento da proliferação celular pode ser mensurado através da detecção imunohistoquímica da proteína Ki-67 (Ikeda et al., 2003; Morkbel et al., 1999). Como os valores de corte para a telomerase (htert) não são padronizados, utilizamos o valor de corte de 10%, o mesmo que foi utilizado para o ki-67. Adotamos este valor de corte porque Mokbel e colaboradores (1999) e Lebeau e colaboradores (2004) consideram que a expressão do ki-67 indica índice de proliferação celular aumentado quando cerca de 10% das células são positivas. Os anticorpos caspase-8, p16, survivin apresentaram

97 Metodologia 74 duas possibilidades de interpretação quanto à positividade da reação imunohistoquímica. Foi considerado resultado positivo quando se observou dupla marcação nas células neoplásicas, isto é, no citoplasma e no núcleo simultaneamente. A outra possibilidade era a presença de positividade apenas no citoplasma ou apenas no núcleo (Shariat et al., 2007; Singh et al., 2004; Sonh et al., 2006). O anticorpo EGFR foi interpretado de maneira semelhante, mas com marcação na membrana citoplasmática e no citoplasma (Bodey et al., 2004; Chow et al., 2001; El-Rehim et al., 2004; Gasparini et al., 2000; Ikeda et al., 2003; Lebeau et al., 2003; Mokbel et al., 1999; Ribeiro-Silva et al., 2006; Shariat et al., 2007; Singh et al., Sirvent et al., 2004; 2004; Sonh et al., 2006; Srinivasan et al., 2000; Stefanou et al., 2004; Wang-Rodriguez et al., 2003; Zloblec et al., 2006). A interpretação da intensidade das reações de imuno-histoquímica é subjetiva, portanto padronizamos os anticorpos da tabela 3 da seguinte forma: quando a intensidade da reação se apresentava muito fraca e focal, não atingindo o percentual de células positivas para o valor de corte do anticorpo (tabela 3), o resultado para a expressão do anticorpo era considerado negativo. Quando a intensidade do anticorpo era fraca, independente de se apresentar com distribuição focal ou difusa, se ela atingisse o percentual de células positivas para o valor de corte dos anticorpos, a reação era considerada positiva. Quando a intensidade era moderada ou intensa, atingindo o percentual de células positivas para o valor de corte dos anticorpos, a reação também era considerada positiva.

98 Metodologia 75 Tabela 3. Interpretação da positividade dos anticorpos utilizados no estudo. Anticorpo Marcação celular Padrão de imunomarcação das células neoplásicas p63 nuclear Pelo menos 5% das células neoplásicas Bag-1 citoplasmática Pelo menos 10% das células neoplásicas Bax citoplasmática Pelo menos 10% das células neoplásicas Bcl-2 citoplasmática Pelo menos 10% das células neoplásicas Caspase 8 Citoplasmática e/ou nuclear Pelo menos 10% das células neoplásicas c-erbb-3 citoplasmática Pelo menos 5% das células neoplásicas ChK2 nuclear Pelo menos 60% das células neoplásicas Ciclina D1 nuclear Qualquer marcação nas células neoplásicas independente da porcentagem EGFR Membrana e/ou citoplasma Pelo menos 5% das células neoplásicas Osteopontina citoplasmática Pelo menos 50% das células neoplásicas p16 Citoplasmática e/ou nuclear Pelo menos 5% das células neoplásicas p21 nuclear Pelo menos 10% das células neoplásicas p53 nuclear Pelo menos 10% das células neoplásicas RE nuclear Pelo menos 10% das células neoplásicas RP nuclear Pelo menos 10% das células neoplásicas Telomerase nuclear Pelo menos 10% das células neoplásicas Survivin Citoplasmática e/ou nuclear Pelo menos 10% das células neoplásicas VEGF citoplasmática Pelo menos 1% das células neoplásicas Os critérios aplicados para a interpretação imuno-histoquímica da proteína c- erbb-2 foram baseados no método de escores do HercepTest. A positividade ou a negatividade das reações foi evidenciada pela presença ou não de coloração marrom escura com padrão de membrana citoplasmática, delineando toda a circunferência dos limites celulares (Barrett et al., 2007; Jacobs et al., 1999; Sales et al., 2004). Os critérios para a interpretação imuno-histoquímica da c-erbb-2 estão descrito na tabela 4.

99 Metodologia 76 Tabela 4. Padrão de imunomarcação e escores utilizados para a avaliação de expressão da proteína c-erbb-2. Escore Expressão da proteína Padrão de imunomarcação das células neoplásicas 0 Negativa Marcação ausente ou presente em menos de 10% das células neoplásicas 1+ Negativa Marcação de membrana fraca e parcial em mais de 10% das células 2+ Positiva Marcação completa da membrana, fraca ou moderada em mais de 10% das células 3+ Positiva Marcação completa e forte da membrana em mais de 10% das células Anteriormente, o uso do Ki-67 era restrito aos tecidos frescos, pois o epítope não resistia à fixação histológica de rotina em formaldeído. O clone utilizado no estudo foi o MM1, um anticorpo anti-ki-67 que pode ser empregado em tecidos fixados em formalina e parafinizados. Para a análise da expressão da proteína Ki-67 foi usado um método semiquantitativo e visual, utilizando-se um índice de positividade (IP). Foram consideradas positivas as células cujos núcleos exibiram coloração acastanhada, independente da intensidade da coloração. No microscópio de luz convencional, em aumento de 100x foi selecionada a área de maior expressão do Ki-67 no espécime e, com aumento final de 400x, foram contados os núcleos positivos e negativos. O IP foi então calculado através da relação do número de células Ki-67 positivas por 1000 células contadas em cada caso estudado, e os valores foram expressos em porcentagem, segundo a fórmula: IP (%) = número de células imunopositivas/número total de células contadas (1000) x 100 (adaptado de Spyratos et al., 2002). Segundo Spyratos e colaboradores (2002) não existe um consenso em relação ao valor de corte para a interpretação imuno-histoquímica do ki-67, como existe para o c-erbb-2 ou para os receptores hormonais. No estudo destes autores, foram utilizados seis valores de corte

100 Metodologia 77 diferentes ( 10; 11-20; 21-30; 31-40; 41-50; 50), expressos em porcentagem, que foram relacionados com variáveis clínicas. A depender da variável clínica utilizada, os valores de corte mudavam (Spyratos et al., 2002). Outros trabalhos consideram que a expressão do ki-67 indica índice de proliferação celular aumentado quando cerca de 10% das células são positivas (Mokbel et al., 1999; Lebeau et al., 2004). Para a interpretação imuno-histoquímica do ki-67 neste trabalho, foi feita uma adaptação dos valores de corte utilizados por Spyratos e colaboradores (2002), dos utilizados por Mokbel e colaboradores (1999) e dos utilizados por Lebeau e colaboradores (2004). No lugar de seis valores de corte, utilizamos apenas três, como descrito na tabela 5. Outros estudos, como o de Lyzogubov e colaboradores (2005), também utilizam três valores de corte para o ki-67, porém com valores diferentes dos utilizados neste trabalho. Tabela 5. Interpretação imuno-histoquímica do ki-67. Porcentagem de células positivas para o ki-67 Índice de positividade <10% baixo 10-50% intermediário >50% alto Para avaliação do número de células p27 positivas, foram contadas células em diferentes áreas selecionadas de acordo com a maior positividade. Este índice foi definido como a porcentagem de células tumorais com imunomarcação nuclear positiva por células tumorais contadas (número de células tumorais positivas / células tumorais). A quantificação foi feita em microscópio de luz convencional, em aumento de 100x foi selecionada a área de maior expressão do p27 no espécime e, com aumento final de 400x, foram contados os núcleos positivos e negativos. Cada célula

101 Metodologia 78 corada foi considerada positiva quando havia qualquer imunomarcação nuclear independente da intensidade (Lima et al., 2000). Os marcadores EMMPRIN, MMP1, MMP2, PAI, TIMP1 e TIMP2 foram interpretados segundo sistema de graduação proposto na literatura. No microscópio de luz convencional, em aumento de 100x foi selecionada a área de maior expressão dos anticorpos da tabela 6 no espécime e, com aumento final de 400x. Foram consideradas positivas as células cujo citoplasma exibia coloração acastanhada, independente da intensidade da coloração (Baker et al, 2002; Noel et al., 2006; Tang et al., 2005; Würtz el al., 2005). Este sistema está descrito na tabela 6. Tabela 6. Padrão de imunomarcação e escores utilizados para a avaliação de expressão de EMMPRIN, MMP1, MMP2, PAI, TIMP1 e TIMP2. Expressão da proteína Negativa Positiva Positiva Positiva Padrão de imunomarcação das células neoplásicas Marcação ausente nas células neoplásicas Menos que 20% de células neoplásicas com marcação citoplasmática. 20% a 50% de células neoplásicas com marcação citoplasmática Mais de 50% de células neoplásicas com marcação citoplasmática

102 Metodologia 79 Figura 1. Marcação nuclear imuno-histoquímica da proteína p63. Os núcleos das células com a coloração marrom mostram a marcação positiva da reação imunohistoquímica para a proteína p63 nas células neoplásicas do carcinoma ductal invasor grau II, segundo a graduação de Nottinghan.400x Figura 2. Exemplo de marcação nuclear. Os núcleos das células com a coloração marrom mostram a marcação positiva da reação imuno-histoquímica para o receptor de estrógeno em pelo menos 10% das células neoplásicas do carcinoma ductal invasor grau II segundo a graduação de Nottinghan. 400x

103 Metodologia 80 Figura 3. Exemplo de marcação citoplasmática. O citoplasma das células com a coloração marrom mostram a marcação positiva da reação imuno-histoquímica para a proteína Bcl-2 em pelo menos 10% das células neoplásicas do carcinoma ductal invasor grau II segundo a graduação de Nottinghan. 400x Figura 4. Exemplo de marcação de membrana. A membrana das células neoplásicas com a coloração marrom mostram marcação positiva, completa e forte da membrana em mais de 10% das células da reação imuno-histoquímica para a proteína c-erbb-2 em carcinoma ductal invasor grau III segundo a graduação de Nottinghan. 400x