DETERMINAÇÃO DE NÍQUEL URINÁRIO POR ESPECTROMETRIA DE ABSORÇÃO ATÔMICA EM FORNO DE GRAFITE (GFAAS) 1. INTRODUÇÃO / FINALIDADE DO MÉTODO

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1 1/8 1. INTRODUÇÃO / FINALIDADE DO MÉTODO O níquel é um elemento necessário ao organismo do homem e dos outros animais em pequenas quantidades. Não é um composto tóxico cumulativo, mas quando as quantidades ultrapassam as requeridas, este torna-se prejudicial. O homem está exposto ao níquel através do ar que respira, da água ingerida e com a qual entra em contato, do fumo dos cigarros, e do que ingere diariamente em alimentos como cocos, alguns frutos secos, nabos, chocolate, gorduras e flocos de aveia que têm altos níveis de níquel em sua constituição. As quantidades ingeridas, diariamente são cerca de três vezes maiores das que necessitamos, mas são níveis seguros. Mesmo em casos, devido à dieta adotada, em que os valores atingem os µg/dia, não surgem graves problemas de toxicidade. Os próprios utensílios de cozinha e alguns detergentes libertam níquel contribuindo, significativamente, para a sua ingestão diária. Outra fonte de níquel é o cigarro, que se acumula diretamente a nível pulmonar (2-23μg níquel/dia oriundos de 40 cigarros diários). O níquel proveniente desta via pode levar a irritação respiratória e a pneumonias. Mas, no fundo, são as pessoas que estão expostas a elevados níveis deste composto, durante mais de quatro horas, que podem vir a ter consequências nefastas devido a uma elevada toxicidade, quer a nível pulmonar quer a nível gastrointestinal. O níquel e seus compostos são, primordialmente, absorvidos pelo trato respiratório, detendo-se neste, e em pequena extensão pelo trato gastrointestinal, de acordo com a dissolução e recaptação celular. 2. NOME DO TESTE E SINONÍMIAS Determinação de níquel em urina. 3. ABRANGÊNCIA Setor de Toxicologia. 4. PRINCÍPIO DO MÉTODO A determinação de níquel urinário é realizada por espectrofotometria de absorção atômica com forno de grafite. A espectrofotometria é o método de análise óptico mais usado nas investigações biológicas e físico - químicas. O espectrofotômetro é um instrumento que permite comparar a radiação absorvida ou transmitida por uma solução que contém uma quantidade desconhecida de soluto com a radiação absorvida ou transmitida por uma solução padrão de quantidade conhecida da mesma substância. Todas as substâncias podem absorver energia radiante. Mesmo o vidro, que parece completamente transparente, absorve comprimento de ondas que pertencem ao espectro visível. A água absorve fortemente na região do infravermelho. A radiação absorvida (absorbância) e o que é transmitida (transmitância) é direta e inversamente proporcional à concentração dos analitos em determinação. Quanto maior for a radiação absorvida, maior será a concentração do analito, quanto maior for a transmitância (o que passa pelo caminho óptico), menor será a concentração. A concentração destes obedece à Lei de Beer-Lambert-Bouguer, conhecida simplesmente como Lei de Beer, que fornece uma relação empírica que, na óptica, relaciona a absorção de luz com as propriedades do material atravessado por esta através da fórmula A = abc, onde A = absorbância, a = absortividade molar do analito, b = caminho óptico e c = concentração.

2 2/8 A espectrofotometria de absorção atômica é o método de análise usado para determinar qualitativamente e quantitativamente a presença de metais. O método consiste em determinar a presença e quantidade de um determinado metal em uma solução qualquer, usando como princípio a absorção de radiação ultravioleta por parte dos elétrons que, ao sofrerem um salto quântico depois de devidamente excitados por uma chama de gás ar/acetileno (1800 a 2500 graus Celsius) ou em tubos de grafite, devolvem a energia recebida para o meio, voltando assim para a sua camada orbital de origem. A energia devolvida na forma de um fóton de luz, por sua vez, absorve a radiação ultravioleta emitida pela fonte específica (cátodo ôco) do elemento químico em questão. Dessa forma, elétrons que estão contidos na solução, e que sofrem também um salto quântico e que não pertencem ao mesmo elemento que constitui o cátodo ôco que está sendo usado no momento, não serão capazes de causar uma interferência, isso porque eles absorvem apenas radiação com comprimento de onda referente ao elemento químico do qual fazem parte. Na espectrometria de absorção atômica em forno de grafite (GFAAS Graphite Furnace Atomic Absorption Spectrometry), a função do forno de grafite é promover a excitação do átomo para que seus elétrons possam emitir fótons de luz. Este equipamento possui uma câmara interna (contatos de grafite) onde são colocados os tubos de grafite, onde o amostrador automático injetará a amostra. Este tubo sofrerá mudanças de temperatura determinadas pela rampa de aquecimento específico para esta análise. A amostra sofre desidratação (secagem) nos dois primeiros degraus da rampa, excitação eletrônica no terceiro degrau, pirólise no quarto degrau e limpeza na última etapa da rampa. Em algumas análises por GFAAS, é recomendado o uso de maodificadores químicos de matriz. Os modificadores químicos têm grande influência nas análises realizadas por GFAAS. Estes compostos são introduzidos junto com as amostras a fim de reduzir significativamente os efeitos da matriz. Os modificadores convertem o analito em uma forma menos volátil, permitindo maiores temperaturas de pirólise. Weltz et al. (1992) propuseram o uso da mistura de Pd e Mg como modificador universal devido a sua capacidade de estabilizar a maioria dos elementos determinados por GFAAS. Alguns determinações de metais em urina não precisam usar modificadores, pois suas matrizes não causam interferências significativas. 5. APLICAÇÃO CLÍNICA Os problemas de toxicidade surgem porque o homem, como os outros animais, não tem enzimas ou cofatores que usam o níquel. Quase todos os casos de toxicidade aguda causada pelo níquel em humanos resultam da exposição ao carbonilo, subsulfito ou óxido de níquel. Os efeitos iniciais envolvem dores de cabeça frontais, vertigens, náuseas, vômitos, insônias, irritação do trato respiratório e, posteriormente, sintomas pulmonares semelhantes a uma pneumonia viral. As lesões pulmonares patológicas incluem, hemorragias, edemas e desarranjo celular. O fígado, rins, glândula adrenal, baço e o cérebro também são afetados. No entanto, é a pneumonia intersticial difusa e o edema cerebral a maior causa de morte. Os efeitos crônicos tais como rinites, sinusites, perfuração naso-septal, nasal displasia e asma surgem mais em trabalhadores de refinarias e de chapas de níquel por estarem, diariamente, expostos a elevados níveis. Sintomas nefrotóxicos como, edema renal e degeneração parenquimatosa também foram revelados em trabalhadores com exposição industrial ao níquel carbonilo. Já os efeitos transitórios de nefrotoxicidade surgiram após ingestão de sais de níquel. O níquel também é uma agente sensibilizante causando dermatites de contato nas pessoas mais sensíveis. O níquel e seus compostos ainda podem ser carcinogênicos quando em concentrações muito superiores às que o organismo consegue suportar, apesar de ainda não se saber exatamente o porquê. Também podem surgir problemas de fertilidade e no desenvolvimento do feto, (más formações a nível ocular, quistos pulmonares,

3 3/8 hidronefroses, deformações nos ossos, etc.) O níquel, um dos componentes dos aparelhos ortodônticos, produz mais reações alérgicas do que todos os outros metais combinados, podendo promover um amplo espectro de reações de hipersensibilidade nos indivíduos suscetíveis. 6. AMOSTRA a) Tipo de amostra Urina: urina de início de jornada de trabalho, de final de jornada de trabalho ou amostra aleatória. b) Quantidade mínima 2 ml de urina. c) Restrições e critérios para rejeição de amostras Amostras com volume inferior a 2,00 ml ou com creatinina urinária inferior a 0,3 g/l. d) Condições de acondicionamento das amostras e seu período de guarda - Armazenamento: por 7 dias refrigerado 2 o C a 8 o C ou congeladas por 30 dias. e) Procedimentos de tratamento ou pré-tratamento da amostra As amostras devem ser acidificadas com ácido nítrico numa proporção aproximada de100 ul do ácido para 10 ml de urina. f) Preparo do paciente Vide o PO Orientação de Preparo e Coleta de Amostras Biológicas (cód. PO-LB-CO-005). g)transporte da amostra Vide o PO Manuseio de Transporte de Amostras Biológicas (cód. PO-LB-CO-006). 7. BIOSSEGURANÇA Utilizar o EPI (Equipamento de Proteção Individual) comum a toda área técnica sendo eles: jaleco, luva, pro-pé e touca, conforme descrito no PO Orientações de Biossegurança (Cód. PO-LB-CQ-001) em vigor. 8. MATERIAIS E EQUIPAMENTOS

4 4/8 a) Equipamentos ADVIA 1800 Siemens Analyst 600 PerkinElmer b) Materiais Pipeta de volume variável de 100 a 1000 ul; Pipeta de volume variável de 10 a 100 ul Ponteiras para as pipetas citadas acima; Balão volumétrico de 50 ml; Balão volumétrico de 1000 ml; Tubos de grafite (THGA Graphite Tubes); Tubos de contato (THGA Contact Set); Lâmpada de cátodo oco de níquel. c) Reagentes: Ácido nítrico P.A. Solução padrão de níquel1000 mg/l (1000 ppm). 9. CALIBRAÇÃO A calibração deste ensaio deve ocorrer sempre que o analista ou o técnico da bancada julgar necessário. Para tanto, soluções-padrão deverão ser utilizadas para a confecção da curva de calibração. Os controles aquosos ou urinários (urina batizada ou urina-controle comercial) serão analisados no início da corrida analítica para validação da calibração. 10. CONTROLE DE QUALIDADE a) Interno Deve-se realizar o controle interno conforme descrito no Plano da Qualidade do Setor. b) Externo O controle externo será realizado conforme descrito no Plano da Qualidade do Setor. 11. PROCEDIMENTO TÉCNICO Preparação da amostra: a. Aliquotar 400 ul da amostra de urina e transferir para o copo de análise do carrossel do

5 5/8 amostrador (sample cup) do AA 600. b. A este copo, adicionar 400 ul da solução de ácido nítrico 0,2%. c. Organizar os copos com as amostras, padrões e brancos de calibração e de amostra no carrossel e levá-lo ao equipamento. Preparação de soluções: Solução de ácido nítrico 0,2%: Aliquotar 2 ml de ácido nítrico concentrado e transferir para balão volumétrico de 1000 ml. Avolumar com água ultrapura. Preparação de soluções-padrão: Solução-padrão de níquel 1000 ug/l em HNO 3 0,2 %: Aliquotar 50 ul do padrão de níquel 1000 mg/l e transferir para o balão de 50 ml. Avolumar com ácido nítrico (HNO 3 ) 0,2%. Solução-padrão de níquel 10 e 20 ug/l: Aliquotar respectivamente 0,5; 1 ml da solução-padrão de níquel 1000 ug/l e transferir para balão volumétrico de 50 ml. Avolumar com ácido nítrico HNO 3 0,2%. Solução aquosa de níquel 8 e 15 ug/l: Aliquotar respectivamente 0,4 e 0,75 ml da solução-padrão de níquel 1000 ug/l e transferir para balão volumétrico de 50 ml. Avolumar com ácido nítrico HNO 3 0,2%. Solução urinária de níquel 8,00 e 15,00 ug/l: Aliquotar respectivamente 0,4 e 0,75 ml da solução-padrão 1000 ppb e transferir para balão volumétrico de 50 ml. Adicionar 100 ul de ácido nítrico HNO 3 P.A. e avolumar com pool de urina previamente testada e livre de níquel. Branco dos padrões e da amostra: Será o próprio ácido nítrico 0,2%. Condições do espectrofotômetro: Comprimento de onda: 351,5 nm Fenda: 0,2 L Corrente da lâmpada: 25 ma Programação do forno (rampa de aquecimento): ETAPA TEMP. o C RAMP. TIME (s) HOLD TIME (s) INTERNAL FLOW GAS TYPE SECAGEM Normal SECAGEM Normal EXCITAÇÃO Normal PIRÓLISE Normal LIMPEZA Normal a) Limites de Detecção/Sensibilidade: 1,00 ug/l

6 6/8 b) Linearidade : 20 ug/l. c) Intervalo reportável (CRR): 20 ug/l. Diluir até obter resultado dentro da linearidade. d) Valor crítico: 30 ug/g creatinina e) Especificidade: Não se aplica f) Carryover : o teste do carryover para a análise do níquel urinário foi satisfatório, não havendo carreamento significativo para este analito. 12. CÁLCULOS Os resultados deverão ser expressos em ug/g de creatinina urinária. Portanto, deve-se dividir o resultado do paciente, obtido do espectrofotômetro (expresso em ug/l), pela sua respectiva creatinina urinária (expressa em g/l); Ex: Resultado do níquel no equipamento= 10 ug/l; Resultado da creatinina urinária = 2,0 g/l; Resultado do níquel corrigido: 5 ug/g creatinina. O valor dos resultados do níquel que estiver abaixo do seu limite de detecção deve ser digitado da seguinte forma: < valor do limite de detecção/ quantificação do analito. Para os resultados de creatinina urinária abaixo de 0,3 g/l, deve-se repetir o ensaio; caso persistam os resultados, deve-se solicitar nova amostra. 13. REGISTROS DOS RESULTADOS Conforme descrito no Plano da Qualidade do Setor. 14. PROCEDIMENTOS EM CASO DE RESULTADOS ANORMAIS Conforme descrito no Plano da Qualidade do Setor. 15. VALORES DE REFERÊNCIA Referência: até 2 ug/g creatinina, (NR-7, 1994, MT / Br); Valor Crítico / IBMP (Índice Biológico Máximo Permitido): 30 ug/g creatinina (NR-7, 1994, MT / Br); Fonte do valor de referência: NR-7, 1994, MT / Br 16. INTERFERÊNCIAS Não são comuns interferentes na análise de níquel urinário por espectrofotometria de absorção atômica por forno de grafite. Porém, é possível que haja contaminação externa da amostra por sais de cobre utilizados na área de trabalho. Para evitar tal evento, deve-se orientar o colaborador a realizar a devida lavagem das mãos no momento da micção.

7 7/8 17. DOCUMENTOS DE REFERÊNCIA a) Bibliografia ANDREWS, Larry S.; SNYDER, Robert. Toxic Effects of Solvents and Vapors. In: ANDUR, Mary O. et al (org.) Casarett and Doull s Toxicology: The Basic Science of Poisons. 4. Ed. São Paulo, SP: Pergamon p BRASIL. Norma Regulamentadora. Programa de Controle Médico de Saúde Ocupacional. Disponível em: at.pdf.in: Acesso em 23 set Long-zhu, J., Zhe-ming, N. Determination of Nickel in Urine and other Biological Samples by Graphite Furnace Atomic Absorption Spectrometry. Institute of Environmental Chemistry, Academia Sinica, PO Box 934, Beijing, People s Republic of China. b) Documentos Complementares Manual do equipamento automatizado Plano da qualidade do setor de Toxicologia (Cód. PQ-LB-TX-001) PO Orientações de Preparo e Coleta de Amostras Biológicas (Cód. PO-LB-CO-005). PO Manuseio de Transporte de Amostras Biológicas (Cód. PO-LB-CO-006). PO de Orientações de Biossegurança (Cód. PO-LB-CQ-001) 18. HISTÓRICO DAS REVISÕES Pg. Natureza da Revisão Data da Revisão Versão Responsáveis 4 Controle de Qualidade 25// Luiz Artur 4 Controle de Qualidade 28/02/ Luiz Artur 2 Reagentes 22/02/ Luiz Artur 2 Preparação da Amostra 22/02/ Luiz Artur 3 Cálculo e Liberação dos Resultados 22/02/ Luiz Artur 3 Controle de Qualidade 22/02/ Luiz Artur 3 Preparo das Soluções 05/08/ Luiz Artur 3 Preparo dos Padrões 05/08/ Luiz Artur 3 Cálculo e Liberação dos Resultados 05/08/ Luiz Artur 3 Controle de Qualidade 05/08/ Luiz Artur 1-7 Pop recodificado, codificação anterior PT-LB-TX /08/ Ana Regina e

8 8/ Procedimento adequado para atender ao item 5.3 da Norma PALC, versão 2013 Procedimento adequado para atender ao item 5.3 da Norma PALC, versão 2013 Após Pré auditoria. 01/08/ Luiz Artur 27/01/ Registro de resultados 19. REGISTRO DE TREINAMENTO DATA NOME COMPLETO ASSINATURA