Trabalho de conclusão do curso de especialização Lato sensu em Reprodução e Produção de Bovinos - UCB

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1 GUILHERME DUTRA MUNIZ DE OLIVEIRA ALUNO DO CURSO DE PRODUÇÃO E REPRODUÇÃO DE BOVINOS-UCB FISIOLOGIA DA REPROUÇÃO BOVINA E MÉTODOS DE CONTROLE DO CICLO ESTRAL Trabalho de conclusão do curso de especialização Lato sensu em Reprodução e Produção de Bovinos - UCB RIO DE JANEIRO, OUT.2006

2 UNIVERSIDADE CASTELO BRANCO CURSO DE ESPECIALIZAÇÃO LATO SENSU EM PRODUÇÃO E REPRODUÇÃO DE BOVINOS FISIOLOGIA DA REPROUÇÃO BOVINA E MÉTODOS DE CONTROLE DO CICLO ESTRAL GUILHERME DUTRA MUNIZ DE OLIVEIRA RIO DE JANEIRO, OUT.2006

3 FISIOLOGIA DA REPROUÇÃO BOVINA E MÉTODOS DE CONTROLE DO CICLO ESTRAL ELABORADO POR GUILHERME DUTRA MUNIZ DE OLIVEIRA ALUNO DO CURSO DE PRODUÇÃO E REPRODUÇÃO DE BOVINOS FOI ANALISADO E APROVADO COM GRAU:... RIO DE JANEIRO,...DE...DE MEMBRO... MEMBRO... MEMBRO... PROFESSOR ORIENTADOR JOSÉ RIBAMAR DE SOUZA TORRES JÚNIOR RIO DE JANEIRO, OUT.2006 II

4 LISTA DE ILUSTRAÇÕES página Fig. 01 Ciclo sexual da vaca Fig. 02 Perfil endócrino do ciclo estral na vaca Fig. 03 Etapas da foliculogênese Fig. 04.Padrões de desenvolvimento folicular em diferentes 11 espécies de mamíferos... Fig. 05 Crescimento folicular Fig. 06 Padrão de secreção de FSH durante o ciclo estral em 13 novilhas com duas ondas de crescimento folicular... Fig. 07 Sumário dos principais eventos que ocorrem durante uma onda de desenvolvimento folicular Fig.08. Esquema proposto para o retorno da atividade ovariana no pós-parto... 15

5 SUMÁRIO página 1. INTRODUÇÃO REVISÃO DE LITERARURA Caracterização do ciclo estral em bovinos Hormônios relacionados à reprodução GnRH (Hormônio Liberador de Gonadotrofinas) FSH (Hormônio Folículo Estimulante.) LH (Hormônio Luteinizante) Liberação de LH e FSH Hormônios com atividade FSH e LH Gonadotrofina Coriônica Eqüina.(eCG) Gonadotrofina Coriônica Humana (hcg) Hormônios ovarianos Estrógenos Ação dos Estrógenos Progestágenos Prostaglandinas Ação da Prostaglandina Controle Endócrino do Ciclo Estral Foliculogênese Padrões de Ondas Foliculares Desenvolvimento Folicular no período pós-parto Tratamentos com Prostaglandina F2α Tratamentos com GnRH associado a Prostaglandina F2α Tratamentos com Progestágenos/Progesterona associado a 17 ésteres de estradiol Conclusões Referência Bibliográfica... 21

6 1.Introdução A adaptação do gado Bos indicus a ambientes tropicais e subtropicais levou esses animais a serem amplamente distribuídos por todo o mundo. Embora o gado Zebu seja geralmente considerado como tendo uma menor eficiência reprodutiva do que o gado taurino em climas temperados, a situação oposta também ocorre quando eles são comparados em ambientes tropicais. A situação econômica mundial leva à necessidade de se utilizar práticas de manejo eficientes para se aumentar a rentabilidade dos sistemas de produção de bovinos. Uma ótima eficiência reprodutiva é crucial para se aumentar o retorno da atividade. Com a evolução e o estabelecimento da técnica de inseminação artificial (IA), alguns fatores como taxa de serviço e necessidade de otimização da mão-de-obra conduziram à busca de técnicas de controle exógeno do ciclo estral para sincronização do estro e da ovulação, visando se obter elevados índices reprodutivos com o uso da IA. Os protocolos para sincronização do estro e da ovulação oferecem a vantagem de serem de simples aplicação e de poderem ser utilizados em momento mais adequado aos produtores e técnicos, não havendo a necessidade de detecção do estro. Este trabalho tem por objetivo rever a fisiologia da reprodução bovina e revisar os principais métodos utilizados atualmente para controlar o ciclo estral e a ovulação. 2.Revisão de Literatura 2.1.Caracterização do ciclo estral em bovinos O ciclo estral é o ritmo funcional dos órgãos reprodutivos femininos que se estabelece a partir da puberdade. Compreende as modificações cíclicas na fisiologia e na morfologia dos órgãos genitais e também no perfil dos hormônios relacionados. Didaticamente o ciclo pode ser dividido em 4 fases que são limitadas por eventos reprodutivos coordenados pela secreção de hormônios. As fases são: (1) Pró-estro: fase que antecede o estro ou cio. Esta fase é marcada por um aumento gradativo circulante de estrógeno, devido ao início do desenvolvimento folicular. Os achados principais são decorrentes desse perfil hormonal: ocorre um aumento gradativo na vascularização e tônus muscular dos órgãos genitais, edemaciação inicial da vulva, proliferação do epitélio vaginal e

7 relaxamento da cérvix. Tem duração média de 2 a 3 dias, termina quando a fêmea passa a aceitar a monta do macho. (2) Estro: caracteriza-se pela aceitação do macho. É a fase de mais fácil definição. Nesta fase os níveis circulantes de estrógeno são elevados, os achados decorrem desta alta taxa. O útero e as tubas se encontram túrgidos, a cérvix relaxada, vagina e vulva com sinais de hiperemia e edema com corrimento de muco. Esta fase tem duração variada entre 10 a 18 horas na vaca, assim terminando quando a fêmea deixa de aceitar o macho. Segundo alguns autores a duração do estro tende a ser mais curta em animais Bos indicus do que Bos taurus (Randel, 1976; Galina and Arthur, 1990), porém não se observou diferença significativa no intervalo de tempo entre o início do estro até a ovulação, que é de aproximadamente 27 horas em ambos. (Nebel et al., 2000). Alguns fatores relacionados ao ambiente (chuva, sol, ventos fortes/frios), relacionados ao manejo (movimentação entre piquetes ou manter os animais por longo tempo no curral) ou ainda fatores relacionados ao próprio temperamento do animal podem afetar expressão do estro e ovulação normal pois alteram a freqüência e amplitude da liberação de GnRH e pulsos de LH atrasando o pico de LH pré-ovulatório. (Dobson e Smith, 2000 e Galina et al., 1996). A particularidade do temperamento de animais B. indicus e a tendência de expressar o estro durante a noite afeta grandemente a eficiência de programas de IA que requerem a detecção de cio. (3) Metaestro: fase de mais difícil caracterização. Após a ovulação por estímulo do LH as células da teca e granulosa, sofrem uma diferenciação em células luteínicas que formarão o corpo lúteo (CL). O CL secreta quantidades crescentes de progesterona até atingir sua produção máxima. A ovulação na vaca ocorre nesta fase. Com a produção inicial de progesterona, a genitália tende a ficar com menor tônus, menos vascularizada e edemaciada. Em bovinos pode ocorrer uma pequena hemorragia caruncular, decorrente das alterações hormonais. Dura em média 2 ou 4 dias e termina quando o corpo lúteo atinge sua plena capacidade de produção de progesterona. (4) Diestro: fase de maior duração, que ocorre sob predomínio da progesterona. Devido à presença deste esteróide, o endométrio fica mais espesso e com maior atividade glandular, a cérvix se fecha, a musculatura do genital relaxa e ocorre uma diminuição da vascularização e hipotrofia do epitélio vaginal. Dura cerca de 13 a 15 dias, terminando quando ocorre a regressão fisiológica do corpo lúteo, tendo início outro ciclo (Figura 1).

8 FIGURA 1: Ciclo sexual da vaca (parcialmente adaptado de: Smidt & Ellendorff Fortpflanzungsbiologie landwirtschaftlicher Nutiztiere, 1969). 2.2.Hormônios relacionados à reprodução GnRH (Hormônio liberador de gonadotrofinas) O GnRH apresenta larga aplicação em programas de manipulação do ciclo estral, como diagnóstico e terapêutica das endocrinopatias, atuando nas disfunções endócrinas de causa periférica hipofisária e hipotalâmica; nos transtornos da fertilidade, tais como cistos foliculares, ovulação retardada, ciclos anovulatórios; na puberdade retardada e outras condições de

9 infertilidade. É produzido no Hipotálamo e atua na Hipófise estimulando a liberação de FSH e LH FSH (Hormônio folículo estimulante) Estimula o crescimento dos folículos ovarianos, maturação dos ovócitos, secreção de estrógeno pela camada da granulosa do folículo ovariano, em ação sinérgica com o LH; atuam com estrógeno na formação de receptores para LH, nas células granulosas. O FSHp (FSH purificado obtido da hipófise de suínos) é usado principalmente para estimular o desenvolvimento folicular (superovulação) para a transferência de embriões LH (Hormônio Luteinizante) Os níveis basais ou tônicos de LH agem juntamente com FSH para induzir a secreção de estrógenos no folículo ovariano; a onda pré-ovulatória de LH induz uma série de alterações estruturais no folículo, que culminam com a ruptura do folículo e expulsão do óvulo do seu interior (ovulação). O LH tem ação luteotrófica e estimula as células do corpo lúteo a produzirem progesterona Liberação de LH e FSH O GnRH para estimular a liberação do LH e FSH é secretado de forma tônica ou basal pelos núcleos hipotalâmicos ventro-medial, arqueados e eminência média e controlados pelo sistema de feed-back negativo por meio dos hormônios gonadais (estrógeno e progesterona). Os níveis tônicos séricos de LH sofrem oscilações a cada hora e são mais elevados após a castração. O aumento do LH e FSH no animal castrado se deve à falta de um mecanismo retrógrado negativo dos esteróides gonadais sobre o centro de controle de liberação do LH tônico na eminência média do hipotálamo. Níveis tônicos de FSH e LH agem juntos para induzir a secreção de estrógeno pelo folículo ovariano. A onda pré-ovulatória de LH e FSH é responsável pela ovulação e dura de 6-12 horas, na maioria dos animais. A onda se inicia devido ao aumento dos níveis de estrógeno circulante que tem um efeito positivo (feed-back positivo) sobre o hipotálamo atuando no cento de pico que termina por induzir uma maior liberação de GnRH e de LH e FSH pela hipófise (Figura 2). O estrógeno atua na área hipotalâmica anterior e nos núcleos pré-óptico e supraquiasmático, aumentando a liberação de LH-RH (hormônio liberador de hormônio luteinizante) e na hipófise e aumentando a sua sensibilidade ao LH-RH. 2.3.HORMÔNIOS COM ATIVIDADE FSH E LH Gonadotrofina coriônica eqüina (ecg) A ecg, antigamente chamada de PMSG (pregnant mare serum gonadotrophin), é uma glicoproteína, com duas subunidades, alfa e beta, semelhantes ao FSH e LH, com maior

10 conteúdo de carboidrato (ácido siálico), de efeitos biológicos prolongados (até 7 dias) devido a uma meia-vida longa. A ecg estimula o desenvolvimento folicular ovariano e tem ação de FSH e LH, sendo essencialmente estimulante. É isolada do soro da égua gestante entre 50 e 150 dias de gestação. O alto conteúdo de ácido siálico protege o hormônio da rápida degradação enzimática, prolongando sua vida média circulatória mais do que a FSH purificado (FSHp). É utilizada em programas de manipulação do ciclo estral e em programas de superestimulação folicular para transferência de embriões Gonadotrofina coriônica humana (hcg) A hcg é uma glicoproteína, com duas subunidades alfa e beta, com cadeias de aminoácidos e cadeias de carboidratos sintetizadas nas células sinciciotrofoblásticas da placenta (vilosidades do córion) nos primatas e nas mulheres. É obtida na urina e no soro sanguíneo da mulher gestante. É detectada por radioimunoensaio, na urina, 8 dias após a concepção na mulher (o que corresponde a um dia após a implantação). Observa-se um pico 62 dias após a última menstruação, declinando rapidamente após 150 dias. Possui funções semelhantes à do LH, sendo indicada no tratamento de ovários císticos, indução da ovulação e no estudo de receptores de LH. A hcg, substitui o LH pituitário, por seu alto custo de purificação para induzir ovulação em vacas com ovários císticos, em programas de sincronização da ovulação e superovulação. 2.4.HORMÔNIOS OVARIANOS Estrógenos Definição São substâncias derivadas do colesterol e seus precursores imediatos são a androstenediona e testosterona. Pelo menos oito estrógenos são secretados pelos ovários dos mamíferos: 17β estradiol, estrona, estriol e outras substâncias. O LH estimula as células tecais do folículo para secretar testosterona, a qual é convertida (aromatização) em estradiol nas células da granulosa por ação do FSH. Os estrógenos são secretados pelas células da granulosa, no folículo maduro e no corpo lúteo (células luteínicas), placenta, testículos e córtex adrenal (quantidades reduzidas). Como os demais esteróides, os estrógenos não são armazenados na glândula, mas rapidamente utilizados, degradados no fígado, conjugados com sulfatos inorgânicos ou com ácido glicurônico e eliminados pela urina. B A Ação dos estrógenos 1. Promovem o desenvolvimento dos órgãos e caracteres sexuais secundários da fêmea.

11 2. Estimulam o crescimento do endométrio (proliferação e espessamento da mucosa, aumento das glândulas, do fluxo sanguíneo, edema, glândulas espiraladas e pregueadas, secreção ativa). 3. Aumentam a contratilidade uterina. 4. Tornam o útero mais sensível à ação da progesterona. 5. Hipertrofiam o endométrio em doses crônicas. 6. Estimulam o crescimento e a atividade muscular dos ovidutos. 7. Atuam sobre o conduto cervical (secreção de muco abundante, fluido, elástico e colo uterino relaxado). 8. Promovem o crescimento e desenvolvimento dos dutos mamários. 9. Agem sobre o sistema nervoso central para induzir o estro ou cio na fêmea (receptividade sexual). 10. Potencializam os efeitos da ocitocina e prostaglandina F2α nas contrações uterinas. 11. Produzem relaxamento da sínfise púbica e do ligamento interpúbico. 12. Produzem efeitos sobre órgãos endócrinos (inibem o FSH, estimulam o LH, PRL e ACTH) no controle do feed-back negativo e positivo sobre os centros tônico e pré-ovulatório do hipotálamo. 2.5.Progestágenos Definição A progesterona é o progestágeno natural mais importante secretado pelas células luteínicas (hormônio luteínico). Assim como os estrógenos, é derivada do colesterol sendo também secretada pela placenta, testículos e córtex adrenal (pequenas quantidades). Grande número de progestágenos sintéticos tem sido obtido na prática: MAP (acetato de medroxiprogesterona); CAP (acetato de clormadinona); MGA (acetato de melengestrol) e FGA (acetato de flurogesterona = clonolone). Estas substâncias são altamente potentes, efetivas por via oral, sendo aplicadas como sincronizadores de estro e aumento de peso em novilhos. O MGA inibe a ovulação, mas permite o crescimento de folículos ovarianos. Ação da progesterona 1. Induz à formação de um endométrio secretor previamente sensibilizado pelos estrógenos (mucosa espessa, glândulas tortuosas, edema e presença de glicogênio). 2. Inibe a motilidade uterina espontânea e a resposta do miométrio à ocitocina. 3. Promove o crescimento do deciduoma (diferenciação da porção materna da placenta). 4. Promove o crescimento e desenvolvimento do sistema lóbulo alveolar da glândula mamária em sinergismo com os estrógenos. 5. Mantém a prenhez. 6. Age sinergicamente com os estrógenos para induzir o cio na fêmea (vaca e ovelha). 7. Inibe o estro e a onda pré-ovulatória do LH, se em altos níveis.

12 2.6.PROSTAGLANDINAS Definição São substâncias orgânicas, biologicamente ativas, com efeitos fisiológicos e farmacológicos no organismo, extremamente potentes. Ocorrem naturalmente em muitos tecidos e situações biológicas. Inicialmente encontradas na próstata (Von Euler, 1934), daí o nome de prostaglandina, depois em outros órgãos. A maior parte das prostaglandinas seminais se origina das vesículas seminais e não da próstata, mas o nome primitivo permanece. Do ponto de vista químico, as prostaglandinas são derivadas do ácido araquidônico, ácido graxo hidroxilado, não saturado, com 20 carbonos e um anel ciclopentano (lipídios). Do ponto de vista estrutural e funcional, as prostaglandinas se dividem em quatro grandes grupos, A, B, E e F, sendo E e F as mais bem descritas por suas relações com reprodução. A síntese da PGF2α a partir de ácidos graxos precursores tem sido possível e vários análogos sintéticos são atualmente comercializados. Os níveis sanguíneos dessas substâncias são geralmente muito baixos, elevando-se na época do parto. São rapidamente metabolizadas, degradadas e excretadas. A PGF2α e seus análogos sintéticos são utilizados na sincronização do ciclo estral nos animais domésticos devido à sua ação luteolítica Ação da prostaglandina 1. Contração da musculatura lisa (motilidade uterina e tubárica). 2. Regressão morfológica e fisiológica de corpo lúteo (luteólise). 3. Indução do parto (efeito ocitócico). 4. Transporte dos gametas (óvulo e espermatozóides). 5. Participa nos eventos ligados à ovulação. FIGURA 2: Perfil endócrino do ciclo estral na vaca (parcialmente adaptado de: MacDonalds & Pineda, Veterinary Endocrinology and Reproduction, 1989).

13 3.Controle endócrino do ciclo estral O GnRH secretado pelo hipotálamo, através do sistema porta-hipotalâmico-hipofisário, atinge esta glândula e estimula a liberação das gonadotrofinas, FSH e LH. Existem dois locais de secreção e produção de GnRH no hipotálamo: os centros controladores de secreção tônica, que secretam GnRH de uma forma relativamente contínua, e os centros controladores da onda pré-ovulatória que secretam grandes quantidades de GnRH de uma só vez. As gonadotrofinas, além de se distribuírem no organismo via circulação sistêmica, atingem o hipotálamo, pelo vaso de fluxo retrógrado, onde causam um bloqueio parcial na liberação de GnRH ( mecanismo conhecido como feed-back negativo). Via circulação, as gonadotrofinas chegam aos ovários, especificamente aos folículos, onde o FSH principalmente, estimula o desenvolvimento dos mesmos. Com isto, os folículos iniciam a produção de estrógeno, que via circulação sistêmica atingem o hipotálamo causando um efeito positivo, estimulando os centros controladores da onda pré-ovulatória, além de um efeito positivo na secreção de gonadotrofinas na hipófise. Quando a quantidade de estrógeno na circulação alcança determinado nível ou limiar (devido a produção crescente/cumulativa pelos folículos em desenvolvimento) este sensibiliza áreas superiores do sistema nervoso central, fazendo com que a fêmea manifeste sinais de aceitação de cortejo e monta (estro) e age também nos centros controladores da onda pré-ovularória de GnRH, fazendo com que uma grande quantidade deste hormônio seja liberada na circulação. Na etapa final de seu desenvolvimento, os folículos secretam outro hormônio, a inibina, que via sistêmica tem a função de bloquear seletivamente a síntese de FSH na hipófise. Por este motivo, acompanhando o pico de liberação de GnRH (onda pré-ovulatória) teremos um pico maior de LH, já que a produção de FSH encontra-se parcialmente bloqueada. Este pico de LH é responsável pela ovulação dos folículos presentes nos ovários que tem desenvolvimento compatível. As células remanescentes do folículo ovulatório sofrem uma transformação chamada luteinização, se diferenciando em células luteínicas secretoras de progesterona que darão origem ao corpo lúteo. Estes eventos também são coordenados pelo LH. A produção de progesterona alcança seu limite máximo e estabiliza-se por volta de cinco a sete dias após a formação do corpo lúteo, e enquanto permanecer em níveis elevados na circulação é responsável por bloquear a liberação de GnRH e das gonadotrofinas hipofisárias, ou seja, o animal não apresenta estro novamente enquanto estiver com concentrações circulantes elevadas de progesterona devido à inibição do aumento da freqüência e pico de LH necessários à fase final de crescimento e ovulação, considerando que a fêmea não tenha ficado gestante no estro anterior, o corpo lúteo, cerca de 10 a 15 dias após a formação, iniciará a produção de ocitocina, que no endométrio estimulará a produção de prostaglandina, responsável pela regressão do corpo lúteo, processo conhecido como luteólise. Com isso, a

14 concentração plasmática de progesterona diminui, possibilitando aumentos gradativos na secreção de GnRH, FSH e LH, iniciando um novo ciclo. Caso a fêmea fique gestante, o corpo lúteo não sofrerá regressão, pois é a principal fonte produtora de progesterona no início da gestação em todas as espécies domésticas. O embrião bovino sinaliza sua presença intra-uterina e inibe a síntese de PGF2α secretando intergerontau, o bloqueio da luteólise, provavelmente, depende da quantidade total de interferon-tau secretada e da área do lúmen uterino ocupada pelo concepto (Mann et al.,1999). Em geral, as características de crescimento folicular e dominância são similares entre Bos indicus e Bos taurus, exceto o fato de que o Bos indicus parece ter um diâmetro máximo de folículo dominante, menor que o observado em Bos taurus, (10-12mm versus 14-20mm, respectivamente) e também corpo lúteo (17-21mm versus 20-30mm, respectivamente; Bó et al., 1993b; Ginter et al., 1989; Kastelic et al., 1990). Estas diferenças têm aplicações práticas importantes, porque o CL é mais difícil de ser identificado à palpação retal no gado Bos indicus. 4.Foliculogênese Em diversas espécies, evidências experimentais mostram que os estágios iniciais do crescimento folicular ocorrem vagarosamente. Nos mamíferos, os ovários apresentam um conjunto ou pool de folículos primordiais, pré-antrais, tendo apenas uma camada de células da granulosa e contendo um ovócito quiescente, cuja divisão meiótica foi interrompida na fase de prófase I. O desenvolvimento destes folículos pode iniciar-se no período fetal, tal como ocorre nos ruminantes, ou dar-se no período neonatal, como ocorre em roedores e no coelho, por exemplo. Após a formação do antro, o crescimento folicular passa a ser mais rápido. Na espécie bovina, o número de folículos primordiais presentes ao nascimento é de aproximadamente , quantidade que é drasticamente reduzida para cerca de 3000, por volta dos 15 a 20 anos de idade da vaca, e terão ocorrido, neste período, em torno de 300 ovulações. Após o início da atividade ovariana, os folículos primordiais iniciam seu desenvolvimento. Desde que o crescimento de um folículo individual tenha começado, ele é contínuo e seqüencial, e o folículo terminará por ovular ou entrar em atresia (Figura 3). Na vaca, aparentemente, o tempo para que um folículo primordial ativado cresça até o tamanho ovulatório é de cerca de 60 dias (Findlay,1994).

15 FIGURA 3: Etapas da foliculogênese, mostrando o desenvolvimento folicular, usando-se como modelo biológico a ovelha. Observar a assimetria das taxas de atresia folicular e as diferentes fases de modulação e dependência do estímulo das gonadotrofinas. (Adaptado de FINDLAY, 1994). Aparentemente, existem dois padrões de desenvolvimento de grandes folículos antrais nos mamíferos: em um primeiro padrão, que ocorre em primatas, camundongos e suínos, o desenvolvimento folicular até o tamanho ovulatório só ocorre na fase folicular do ciclo, sendo suprimido na fase luteal. No segundo padrão, onde se incluem as espécies bovina, ovina e eqüina, este desenvolvimento se dá tanto na fase luteal como na folicular, ocorrendo, portanto, ao longo de todo o ciclo estral (Figura 4).

16 FIGURA 4: Padrões de desenvolvimento folicular em diferentes espécies de mamíferos. Observar que na vaca, ovelha e égua existe crescimento folicular tanto na fase luteínica como folicular do ciclo estral. Já em primatas, na porca e camundonga, a divergência e dominância só são observadas na fase folicular, sendo inibidas na luteínica. Asteriscos representam a ovulação; (Adaptado de FORTUNE, 1994). O número de folículos que chegará à ovulação é espécie-específico, podendo variar também com a raça, dentro de uma mesma espécie. O processo de crescimento diferencial do folículo dominante é conhecido como divergência (Figura 5).

17 FIGURA 5: Crescimento folicular, divergência do folículo dominante e ovulação durante o ciclo estral em novilha com duas ondas de desenvolvimento folicular. Normalmente, o folículo dominante da primeira onda é anovulatório; Adaptado de WILTBANK, Padrões de ondas foliculares São estabelecidos padrões de duas ondas foliculares, onde a primeira tem início no dia zero (dia da ovulação) e a segunda no dia 10 e padrão de três ondas, onde a emergência destas ocorre entre os dias 0, 9 e 16 do ciclo estral, sendo as duas primeiras anovulatórias. O mecanismo que regula a dinâmica folicular está baseado nas diferentes respostas ao FSH e LH, os aumentos periódicos de concentrações de FSH circulante são responsáveis pela emergência das ondas foliculares, portanto vaca com duas ondas tem dois aumentos (Figura 6) e vacas com três ondas tem três aumentos de FSH. A supressão periódica do FSH circulante pelo mecanismo de feed-back negativo favorece a reserva do ovário, prevenindo o recrutamento contínuo de folículos antrais, já que 99% destes irão sofrer atresia. O aumento de FSH permite o crescimento folicular suficiente para que alguns, e não todos os folículos, adquiram a capacidade de responder ao LH, ao mesmo tempo em que permite o crescimento do folículo dominante, os subordinados começam a diferenciar-se (momento da seleção) o FSH tem um declínio rápido por volta do segundo dia de emergência da onda (Baruselli,2000). (Figura 6).

18 O folículo destinado a ser dominante aparentemente tem mais receptores para LH, estabelecendo assim uma vantagem competitiva sobre os outros folículos destinados a serem subordinados (Figura 7). Existem diversos fatores que afetam o desenvolvimento folicular tais como: nível nutricional, estresse calórico e anestro lactacional, que podem modificar o padrão de desenvolvimento. Um nível nutricional baixo estaria associado a uma proporção mais alta de ciclos de três ondas foliculares, estes fatores têm sido muito discutidos e aparentemente a fertilidade das vacas não demonstra diferença entre animais com duas ou três ondas de desenvolvimento folicular (Baruselli, 2000). Os folículos subordinados podem converter-se em folículo dominante se este for removido. A capacidade de um folículo subordinado em tornar-se dominante é observada em animais superestimulados com FSH, estes folículos alcançam um diâmetro máximo menor comparado ao de um folículo originalmente dominante. FIGURA 6: Padrão de secreção de hormônio folículo estimulante (FSH) durante o ciclo estral em novilhas com duas ondas de crescimento folicular. Observar que há um aumento nas concentrações de FSH quando ocorre o recrutamento e que, após a divergência, só o folículo dominante é capaz de crescer, quando a concentração deste hormônio é baixa. Adaptado de WILTBANK, 1998.

19 FIGURA 7: Sumário dos principais eventos que ocorrem durante uma onda de desenvolvimento folicular, mostrando o recrutamento, seleção, fase de dominância e ovulação. Adaptado de DRIANCOURT, Desenvolvimento folicular no período pós-parto O reinício da dinâmica folicular em vacas leiteiras e de corte ocorre no começo do período pósparto. Logo após o parto, ocorre um dramático aumento nos níveis de FSH que é seguido pela emergência da primeira onda de crescimento folicular (2-7 dias pós-parto; revisado em Wiltbank et al., 2002). Para que a ovulação ocorra, o folículo dominante deve estar exposto à correta freqüência de pulsos de LH (aproximadamente um pulso por hora) para que este cresça e aumente a produção de estradiol, que poderá resultar em um pico de LH e ovulação (revisado em Roche et al., 1992 e Wiltbank et al., 2002). A ocorrência de ovulação do folículo dominante da primeira onda folicular foi observada em 74% de vacas Friesian bem alimentadas (Sávio et al., 1990), e em 42% de vacas Holandesas de alta produção (Beam e Butler, 1997) e em apenas 11% das vacas de corte amamentando (Murphy et al., 1990). D Occhio e colaboradores (1990), estudando a concentração de LH no pós-parto em vacas Bos taurus e Bos indicus, observou que os níveis deste hormônio são influenciados pela condição corporal e pelo manejo no período pós-parto, sugerindo que a nutrição é um dos fatores mais importantes para o retorno da atividade reprodutiva no pós-parto no gado Bos taurus e Bos indicus. A má nutrição é reconhecidamente a causa da fertilidade reduzida em rebanhos criados a pasto em regiões subtropicais e tropicais. Uma dieta energética restrita afeta adversamente a

20 função ovariana em ambas as novilhas pré e pós púberes, reduzindo o diâmetro máximo e a persistência do folículo dominante, afeta também as vacas no pós-parto adiando o desenvolvimento de folículos ovarianos maiores (Rhodes et al., 1995b, 1996; Wiltbank et al., 2002). A amamentação também é um importante fator que afeta a ciclicidade no pós-parto, pois inibe pulsos de GnRH e LH, reduzindo o desenvolvimento folicular (revisado em Williams et al., 1996). Assim, melhorar a nutrição das vacas e remover os bezerros temporariamente ou definitivamente são pontos importantes a serem considerados quando se deseja iniciar um programa de sincronização de estro em vacas B. indicus amamentando. FIGURA 8: Esquema proposto para o retorno da atividade ovariana e o aparecimento de folículos dominantes em vacas de leite e corte que não tenham sofrido estresse nutricional. A freqüência de pulsos de LH é aquela que ocorre em um período de oito horas. As amostras de sangue foram colhidas em intervalos de 15 minutos. Adaptado de ROCHE et al., A ablação mecânica do folículo dominante por aspiração guiada por ultra-som no quinto dia após a ovulação em novilhas Nelore, resulta em uma emergência sincrônica de uma nova onda de crescimento folicular em 1,9±0,1 dias e em uma ovulação sincrônica após o tratamento com prostaglandina seis dias mais tarde (4,1 ±0,1 dias após a PGF2α) (Buratini Jr et al.,2000). Isso

21 ocorre devido à remoção do folículo dominante, diminuição dos níveis de estrógeno e inibina por ele produzida, fazendo com que o maior folículo subordinado assuma a dominância. Embora esta técnica possa ser facilmente aplicada, a ablação folicular é mais invasiva do que tratamento hormonal exógeno; por esta razão ela não é largamente aplicada em programas de sincronização de cio. Porém vem sendo usada com sucesso em programas de superovulação. (Bó et al.,2002ª). 7.Tratamentos com Prostaglandina F2α A prostaglandina F2α tem sido o hormônio mais utilizado para tratamento de sincronização de cio em bovinos (revisado em Odde, 1990). No entanto, o aparecimento do cio fica distribuído por um período de aproximadamente seis dias (Macmillan e Henderson, 1984), isso é influenciado não apenas pela responsividade do CL ao tratamento com PGF (Momont e Seguin, 1984), mas também pelo estágio de desenvolvimento do folículo dominante no momento do tratamento com PGF (Kastelic e Ginther, 1991). Esta variação no intervalo de tempo entre o tratamento, o estro e a ovulação dificulta o programa de inseminação artificial em tempo fixo (IATF), e requer uma boa detecção do estro para que se obtenham maiores taxas de prenhez. No Gado B. indicus, mesmo quando há presença de um CL no momento do tratamento, a resposta ao tratamento é 30% menor quando comparada aos 90% relatados para o B.taurus (revisto em Galina e Arthur,1990). Estes resultados assincrônicos, levam a necessidade da busca por tratamentos que controlem tanto a fase luteínica como a fase folicular, para que se consigam melhores taxas de prenhez na IATF, sem necessidade da detecção do estro. Existem muitas alternativas para controlar o desenvolvimento folicular em B. taurus que também vem sendo aplicadas com sucesso em B. indicus. A emergência da onda folicular pode ser alterada por procedimentos mecânicos ou por tratamentos hormonais. 8.Tratamentos com GnRH associado a prostaglandina F2α. Combinação de tratamentos com GnRH e PGF vem sendo usada com sucesso em protocolos de sincronização para inseminação em gado de corte e de leite. Um desses protocolos de tratamento GnRH-PGF é conhecido como Protocolo Ovsynch (Pursley et al., 1995) e consiste em uma injeção de GnRH seguida por uma de PGF sete dias mais tarde, e uma segunda injeção de GnRH 48hs após a aplicação de PGF; e IATF 16 horas mais tarde. O protocolo Ovsynch também vem sendo usado para controlar o desenvolvimento folicular e sincronizar a ovulação em B.indicus (Barros et al., 2000). Observou-se taxa de prenhez em B. taurus e B. indicus ao redor de 42 e 48% em animais em programa de IATF tratados pelo protocolo

22 Ovsynch (Fernandes et al., 2001; Willians et al., 2002). Como ocorre no gado B. taurus, a taxa de prenhez em novilhas B. indicus foi variável, entre 21 e 43%, e em vacas em anestro foi significativamente menor (14,9%) do que vacas ciclando (46,3%). A razão para a pequena resposta em novilhas parece estar relacionada à baixa incidência de ovulações do folículo dominante após o primeiro GnRH, o que resulta em baixa taxa de sincronização do estro após a segunda aplicação de GnRH (Martinez et al.,1999). Barros e colaboradores sugeriram um protocolo de IATF de baixo custo, similar ao Ovsynch, mas, substituindo a segunda aplicação de GnRH por 1mg de benzoato de estradiol (BE) 24 h após a PGF (dia 8). Este tratamento chamado GPE resultou em ovulação sincronizada (45,4 ± 2,0h após BE) em 7/10 vacas Nelore. As outras 3 vacas não ovularam em 3 dias após o tratamento com BE. IATF (30-34h após BE) resultou em 43.3% de gestação em 53 vacas Nelore em lactação (60-90 dias pós-parto), mas em apenas 14.7% em 68 vacas acíclicas (Fernandes et al., 2001) e 33.3% de novilhas Nelore (Barros et al.,1998). Estes resultados podem enfatizar que o protocolo Ovsynch e semelhantes podem ser usados com sucesso apenas em vacas ciclando, não sendo indicado para B. indicus devido à baixa taxa de ciclicidade, principalmente no início da estação de monta e em condições extensivas em áreas tropicais e subtropicais (Baruselli et al.,2001). 9.Tratamentos com progestágenos/progesterona associado a ésteres de estradiol. Por mais de 30 anos, estudos vêm sendo realizados com o objetivo de se formular diferentes tratamentos para sincronização de estro utilizando progestágenos e progesterona. O uso do estradiol em combinação com tratamentos progesterona/progestágeno, se iniciou quando se descobriu que o estradiol induz regressão luteal (Wiltbank et al.,1961). Durante os anos 90, se observou que o tratamento com estradiol suprime o crescimento do folículo antral (Bó et al.,1991). A administração de 5mg de estradiol-17β (E-17β) em implantes de progesterona, sincronizou a emergência de uma nova onda folicular, em média, 4,3±0,2dias mais tarde (Bó et al.,1995). Outros trabalhos foram feitos para se comparar os efeitos de diferentes ésteres de estradiol no desenvolvimento folicular. O Valerato de Estradiol (VE) na dose de 5mg resulta em um tempo de surgimento de onda menos previsível em novilhas de corte, não devendo ser usado nessas, pois, atrasa a emergência e bloqueia o crescimento folicular principalmente em novilhas indicus, que são mais sensíveis a estradiois de longa ação. Existem três tipos de dispositivos de progesterona no mercado nacional, os implantes auriculares os dispositivos intra-vaginais de liberação de P4 e o MGA oral. O tratamento com norgestomet envolve a inserção do implante contendo 6mg de norgestomet (Syncro-Mate-B, Merial) ou um implante de silicone contendo 3mg de norgestomet (Crestar, Intervet) que são colocados na região subcutânea, sobre a cartilagem auricular. Uma aplicação IM com 5mg de VE e 3mg de norgestomet (N) é feita no momento da aplicação do implante, o implante permanece por 9 ou 10 dias. Após a remoção do implante, vacas e

23 novilhas são inseminadas 12hs após a observação de cio ou é feita IATF 48hs (novilhas) ou 56hs (vacas) após a remoção (revisado em Mc Gowan, 1999). Resultados satisfatórios foram obtidos em gado B.indicus adulto, mas o resultado em novilhas se apresentou bastante variável (revisado McGowan,1999). Altas concentrações de estradiol por períodos prolongados podem resultar em supressão prolongada de crescimento folicular (Bó et al.,1993a). Outros trabalhos mostraram altas taxas de prenhez após o tratamento com VE e N em novilhas B.taurus (Odde,1990). É concebível que os níveis de estradiol induzidos pelo tratamento com VE e N são significativamente maiores em novilhas B.indicus leves mantidas a pasto em regiões tropicais e subtropicais do que novilhas B.taurus mais pesadas mantidas em pastagens temperadas de alta qualidade ou que ainda recebem suplementação de concentrado, como ocorre na América do Norte e Europa. Uma alternativa para aumentar a taxa de prenhez em novilhas nelore tratadas com VE e N é a aplicação de 400UI de ecg no momento da remoção do implante para estimular o crescimento folicular (Cavalieri et al.,1997); este programa vem sendo extensivamente utilizado em vacas no pós-parto (Mulvehill e Screenan,1977;Humblot et al.,1996;bó et al.,2002b) e resulta em taxas de prenhez aceitáveis após IATF em novilhas (Kerr et al.,1991;mc Gowan et al.,1992). No entanto, existem trabalhos que relatam efeito negativo de elevadas concentrações de estradiol encontradas em animais tratados com N e VE (Wherman et al.,1993; Cavalieri et al.,1997), principalmente em novilhas B. indicus. Verificou-se atraso e dispersão no início da onda de crescimento folicular quando novilhas Nelore foram tratadas com VE do que com BE (Sá Filho et al.,2006). Assim pode-se supor que novilhas B. indicus tratadas com 5 mg de VE podem estar apresentando comprometimento no protocolo de sincronização da ovulação. A ecg é um fármaco de meia vida longa (até 3 dias), produzido nos cálices endometriais da égua prenhe (40 a 130 dias; Murphy e Martinuk, 1991) e que se liga aos receptores foliculares de FSH e de LH a aos receptores de LH do corpo lúteo (Stewart e Allen,1981). A ecg cria condições de crescimento folicular e de ovulação e seu uso tem-se mostrado compensador em rebanhos com baixa taxa de ciclicidade, em fêmeas recém paridas (período pós parto inferior a dois meses) e em animais com condição corporal comprometida (Baruselli et al.,2004). Cavalieri e colaboradores (1997) mostraram que a sincronização do estro, a ovulação, e a onda de LH pré-ovulatória foram melhores em vacas B.indicus não lactantes tratadas com ecg do que naquelas não tratadas com ecg quando se removeu o implante (com intervalos desde a remoção do implante até a ovulação de 61-83h versus h, respectivamente). As taxas de concepção após uma ou duas IATF usando este protocolo de tratamento ficaram em torno de 37 a 54% (Kerr et al.,1991; Mc Gowan et al., 1992; Cavalieri and Fitzpatrick 1995ª,b). Outros tratamentos como utilizando uma aplicação de 1mg de BE 24hs após a remoção do implante ou GnRH 30-36h após a remoção do implante também foram utilizados para sincronizar a ovulação e aumentar as taxas de prenhez em vacas B.indicus (Bó et al., 2002b).

24 Dispositivos vaginais de progesterona associados ao benzoato de estradiol são atualmente um dos mais populares tratamentos para IATF ao redor do mundo para gado de leite e de corte (Macmillan and Burke, 1996; Bó et al., 2002ª,c). O tratamento mais comum usado em B.indicus é similar ao usado em B.taurus e consiste na administração de uma dose de BE intramuscular (2mg de BE em vacas e novilhas, Bó et al.,2002ª,c ou 1mg de BE em novilhas, Martinez et al.,2000,2002b; Cavalieri et al.,2002) no momento da inserção do dispositivo (Dia 0), o tratamento com PGF é feito quando se retira o dispositivo (dias 7 ou 8), e é feito 1mg de BE i.m. 24hs mais tarde. A IATF é feita entre 52 e 56hs após a remoção do dispositivo (Bó et al.,2002c). Inicialmente, o BE era administrado em forma de uma cápsula de gelatina disposta juntamente com o dispositivo intravaginal. Porém trabalhos subseqüentes mostraram que a administração de BE através de injeção i.m. resulta em uma emergência de onda mais sincrônica e consistente (Bó et al.,1996). Todavia, uma segunda aplicação de BE (1mg de BE i.m.) feita 24hs após a remoção do dispositivo é essencial, pois resulta em um estro e ovulação mais sincrônica e uma taxa de prenhez mais alta do que quando o BE não é aplicado após a remoção do dispositivo intravaginal. Devido a sua capacidade de induzir indiretamente o pico pré-ovulatório de LH e a ovulação. Yelich (2002) conseguiu melhores taxas de prenhez em vacas tratadas com CIDR-B que receberam BE no momento da inserção do dispositivo, do que nas que não receberam o BE no momento da inserção. Assim o uso do BE no momento da inserção do dispositivo de P4 é essencial para a indução da atresia dos folículos presentes e emergência sincrônica de uma nova onda folicular, pois a elevação da concentração sérica de estrógeno após a aplicação de BE irá causar feed-back negativo para liberação de FSH impedindo o desenvolvimento folicular, levando a sua regressão, evitando os efeitos adversos de um folículo dominante persistente nas taxas de prenhez. Um relato recente de taxa de prenhez em 5743 IATF foi de 51.3%, variando de 28.7% em vacas amamentando com escore corporal médio 2, na escala de 1 a 5, até 66.9% em vacas amamentando com escore corporal médio de 3,5 (Bó et al.,2002c), em vacas e novilhas tratadas com dispositivos de P4 e com BE submetidas à IATF 50-56h após a remoção do dispositivo (26-32h após a segunda aplicação de BE). Inúmeros trabalhos vem sendo realizados com o objetivo de se avaliar a viabilidade reutilização dos dispositivos intravaginais de progesterona, como Bó e colaboradores 2002ª e Cutaia e colaboradores 2001b, os resultados demonstraram que os dispositivos liberadores de P4 podem ser reutilizados e as taxas de prenhez são comparáveis, podendo ser ainda maiores àquelas obtidas quando da utilização de um dispositivo novo. O resultado desses estudos, tem importantes implicações econômicas, pois o custo por uso dos dispositivos para IATF serão consideravelmente reduzidos, favorecendo sua utilização por parte dos produtores.(cutaia et al.,2001ª,b; Whittaker et al.,2002). O sucesso da aplicação da IA no gado B.taurus e B.indicus, não está relacionado apenas ao problema de detecção do estro, mas também relacionado ao problema nutricional

25 principalmente em regiões tropicais e subtropicais e também está relacionado ao anestro induzido pela mamada. Uma alternativa para aumentar a taxa de prenhez em programas de IATF, principalmente no gado B.indicus em anestro é a utilização de UI de ecg no momento da remoção do dispositivo de P4. Tratamento com ecg vem sendo utilizados para aumentar a ciclicidade e taxa de prenhez em vacas com estresse nutricional. Cutaia e colaboradores (2003) estudando a utilização de ecg em protocolos de sincronização, utilizaram 181 vacas Braford amamentando, com condição corporal de (escala de 1-5), esses animais foram tratados com dispositivo de progesterona e 2mg de BE no dia 0. No dia 8, os dispositivos foram removidos e todas as vacas receberam uma dose de PGF. Apartir daí foram divididas ao acaso, sendo que o primeiro grupo recebeu 400UI de ecg no dia 8 (grupo ecg), o segundo grupo recebeu 1mg de BE i.m. no dia 9 (grupo BE) e o outro recebeu ecg no dia 8 e BE no dia 9 (grupo ecg+be). Foi realizada IATF em todas as vacas 52-56h após a remoção do dispositivo. A taxa de prenhez geral foi significativamente maior no grupo ecg+be do que no grupo ecg (35,5% versus 17,4%). Em vacas que tinham folículos pequenos no início do experimento, o grupo ecg+be teve uma taxa de prenhez melhor que o grupo BE. As diferenças porém, não foram significativas entre esses grupos nas vacas com CL ou nas que apresentavam folículos de médio a grande no início do experimento. A combinação ecg+be parece aumentar a taxa de prenhez, e em condições de anestro, esse efeito é mais pronunciado (vacas com folículos pequenos) (Bó et al., 2003). 10.Conclusões O conhecimento das particularidades da fisiologia reprodutiva das subespécies B. taurus e B.indicus é de grande importância, pois permite interferir de forma consciente objetivando a maximização da eficiência da técnica de inseminação artificial, principalmente em grandes rebanhos. A dinâmica folicular ovariana no gado B.indicus é caracterizada pela ocorrência de duas, três ou às vezes quatro ondas de crescimento folicular. Enquanto a dominância folicular é similar a do gado B.taurus, o diâmetro máximo do folículo dominante e do CL é geralmente menor em B.indicus do que no relatado em B.taurus. A duração do estro é de aproximadamente 10hs e o intervalo do estro até a ovulação é de 27hs. A particularidade do temperamento do gado B. indicus e a tendência de expressar o estro durante a noite afeta grandemente à eficiência de programas de IA que requerem a detecção de cio. Assim sendo, a incorporação de técnicas que controlem a dinâmica das ondas de crescimento folicular, como as colocadas na presente revisão, podem reduzir o problema da detecção de cio e favorecer a aplicação da IATF.

26 11. Referência Bibliográfica *Barros, C.M., Moreira, M.B.P., Fernandes, P., Pharmacological manipulation of the oestrous cycle to improve artificial insemination or embryo transfer programs, Arq. Fac. Vet. UFRGS, Porto Alegre, Brazil, 26 (Suppl.), *Barros, C.M., Moreira, M.B.B., Figueiredo, R.A., Teixeira, A.B., Trinca, L.A., Synchronization of ovulation in beef cows (Bos indicus), using GnRH, PGF2_ and estradiol benzoate. Theriogenology 53, *Baruselli, P.S., Madureira, E.H., Marques, M.O., Programas de IA a tiempo fijo en Bos indicus. Segunda Parte. Taurus 13, *Baruselli, P.S.,Controle farmacológico do ciclo estral em ruminantes. Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, Departamento de Reprodução Animal, Universidade de São Paulo * Baruselli, P.S.; Reis,E.L.;Marques, M.O.; Nasser, L.F.; Bó, G.A.. The use of hormonal treatments to improve reproductive performance of anestrous beef cattle in tropical climates. Animal Reproduction Science, v.82-83,p , *Beam, S.W., Butler, W.R., Energy balance, and ovarian follicle development prior to the first ovulation postpartum in dairy cows receiving three levels of dietary fat. Biol. Reprod. 56, *Bo, G.A., Pierson, R.A., Mapletoft, R.J., The effect of estradiol valerate on follicular dynamics and superovulatory response in cows with Syncro-Mate-B implants. Theriogenology 36, *Bo, G.A., Adams, G.P., Nasser, L.F., Pierson, R.A., Mapletoft, R.J., 1993a. Effect of estradiol valerate on ovarian follicles, emergence of follicular waves and circulating gonadotropins in heifers. Theriogenology 40, *Bo, G.A., Mart ınez, M., Nasser, L.F., Caccia, M., Tribulo, H., Mapletoft, R.J., 1993b. Follicular dynamics in Bos indicus and Bos taurus beef cattle under pasture conditions in Argentina. In: Proceedings of the 10th Congreso Brasileiro de Reproducao Animal, vol. 2. Campo Grande, p. 221 (abstract). *Bo, G.A., Adams, G.P., Caccia, M., Mart ınez, M., Pierson, R.A., Mapletoft, R.J., Ovarian follicular wave emergence after treatment with progestogen and estradiol in cattle. Anim. Reprod. Sci. 39, *Bo, G.A., Caccia, M.,Mart ınez, M.,Mapletoft, R.J., Follicularwave emergence after treatment with estradiol benzoate and CIDR-B vaginal devices in beef cattle. In: Proceedings of the 13th International Congress on Animal Reproduction. Sydney, Australia, 2, Section 7 (abstract 22). *Bo, G.A., Baruselli, P.S., Moreno, D., Cutaia, L., Caccia, M., Tr ıbulo, R., Tr ıbulo, H., Mapletoft, R.J., 2002a. The control of follicular wave development for self-appointed embryo transfer programs in cattle. Theriogenology 57, *Bo,G.A.,Baruselli, P.S.,Martínez, M.F.,2003. Pattern and manipulation of follicular development in Bos indicus cattle. Animal Reproduction Science *Buratini Jr., J., Price, C.A., Visintin, J.A., Bó, G.A., Effects of dominant follicle aspiration and treatment with recombinant bovine somatotropin (bst) on ovarian follicular development in nelore (Bos indicus) heifers. Theriogenology 54, *Cavalieri, J., Fitzpatrick, L.A., 1995a. Artificial insemination of Bos indicus heifers: the effects of body weight, condition score, ovarian cyclic status and insemination regimen on pregnancy rate. Aust. Vet. J. 72, *Cavalieri, J., Fitzpatrick, L.A., 1995b. Oestrus detection techniques and insemination strategies in Bos indicus heifers synchronised with norgestomet-oestradiol. Aust. Vet. J. 72, *Cavalieri, J., Rubio, I., Kinder, J.E., Entwistle, K.W., Fitzpatrick, L.A., Synchronization of estrus and ovulation and associated endocrine changes in Bos indicus cows. Theriogenology 47, *Cavalieri, J., Coleman, C., Rodrigues, H., Macmillan, K.L., Fitzpatrick, L.A., The effect of timing of administration of oestradiol benzoate on characteristics of oestrus, timing of ovulation and fertility in Bos indicus heifers synchronised with a progesterone releasing intravaginal insert. Aust. Vet. J. 80, *Cutaia, L., Moreno, D., Villata, M.L., Bo, G.A., 2001a. Synchrony of ovulation in beef cows treated with progesterone vaginal devices and estradiol benzoate administered at device removal or 24 h later. Theriogenology 55, 244 (abstract). *Cutaia, L., Tr ıbulo, R., Alisio, L., Tegli, J.C., Moreno, D., Bó, G.A., 2001b. Efecto de los tratamientos con dispositivos DIV-B nuevos o reutilizados en los ındices de preñez en vacas y vaquillonas inseminadas a tiempo fijo (IATF). M. Caccia (Ed.) Resúmenes Cuarto Simposio Internacional de Reproducción Animal, Huerta Grande, Córdoba, pp. 244 (abstract).

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