Ana Paula Mendonça Helena Souto Kleber Neves Luiza Erthal

Transcrição

1 Ana Paula Mendonça Helena Souto Kleber Neves Luiza Erthal

2 - Envelopados - 7 genes - > 8 proteínas no Ebola - RNA (- ) - Nucleocapsídeo: nucleoproteína (NP), proteínas virais (VP35 e VP30) e polimerase (L) - Matriz: VP40 e VP24 - Envelope: proteína GP Filoviridae: vírus Ebola e Marburg

3 Volchkov et al Proc. Natl. Acad. Sci. USA

4 Fusão direta vs Endocitose

5 Pep[deo de Fusão do Ebola - Induz fusão de membrana na presença de fosfa\dilinositol na membrana da célula e Ca++ durante processo. Glicina- Alalina- Alanina- Isoleucina- Glicina- Leucina- Alanina- Triptofano- Isoleucina- Prolina- Tirosina- Fenilalanina- Glicina- Prolina- Alanina- Alanina Ito et al Journal of Virology

6 Pep[deo de fusão: W8A triptofano alanina

7 Estrutura do pep[deo de fusão do Ebola em micelas SDS Freitas et al., 2007 The Journal of Biological Chemistry

8 Lipid Rads Alonso et al., 2001 Journal of Cell Science

9 Obje\vos Estudar a importância das interações aromá\cas- aromá\cas na estrutura do pep[deo Estudar o papel do colesterol durante a fusão de membranas Interação do pep[deo de fusão WT e do mutante em células sem colesterol e rads isolados de células Vero e BHK- 21

10 Resultados

11 Modelo experimental Depleção de colesterol Vero BHK- 21 C636 Interação de pep[deo- membrana FT- IR Microscopia de Força Atômica Agregação de vesículas

12 Depleção de Colesterol X Viabilidade Celular Essencial para a replicação de filoviridae; A entrada do vírus Ebola e Marburg é inibida pela depleção de colesterol.

13 Depleção de Colesterol X Viabilidade Celular BHK- 21 Vero C636 Figura 1. Efeito do MβCD na viabilidade celular. (A) Depleção de colesterol.células foram pre tratadas com MβCD por 30 min a 37 C, e a quan\dade de colesterol foi quan\fcada como descrito em materiais e métodos.(b) Viabilidade celular. Células foram incubadas com MβCD por 30 min a 37 C.

14 Interação de pep[deo- membrana wtebo16 Pep[deo hidrofóbico/presença de GP2

15 Interação de pep[deo- membrana 25 C 37 C Presença de MβCD Ausência de MβCD Figura 2. Interação Pep[deo- Membrana. (A) Células Vero foram incubadas com wtebo16 a 25 (circulos) ou 37 C (quadrados). A mistura de membrana diminuiu a razão excimero/monomero por 30 min. (B) Células viáveis na ausência (quadrado) ou na presença (círculos) de MβCD foram incubadas com wtebo16 a 37 C. A mistura de membrana diminuiu a razão excimero/monomero por 30 min.

16 Estrutura secundária e membranas Fourier Transform Infrared Spectroscopy (FTIR)

17 (A) 100% DMSO (B) 50% DMSO (C) PC (D) PC:PE:PI:Cho (E) PC:PE:SPM:Cho (F) DRM de Vero cells

18 Força da interação com a membrana Atomic Force Microscopy (AFM)

19 Lyubchenko, Micron Giessibl, Science

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23 Antes/depois de saturação com 1mM wtebo16

24 Agregação de vesículas induzida pelo pep[deo de fusão do vírus Ebola Mutante + vesícula WT + vesícula Controle (vesícula) Lipossomas PC wtebo 16 agregação de lipossomas EBO 16 W8A não induziu agregação

25 Mutante + vesícula WT + vesícula Controle (vesícula) Lipossomas PC:PE:PI:Cho wtebo 16 e EBO 16 W8A não induziram agregação

26 Mutante + vesícula WT + vesícula Controle (vesícula) Lipossomas PC:PE:SPM:Cho wtebo 16 e EBO 16 W8A apenas uma pequena população > eficiência de ligação não suficiente para levar à agregação.

27 Mutante + vesícula WT + vesícula Controle (vesícula) Células BHK- 21 lipid ra@s Ambos induziram agregação. EBO 16 W8A pequena população igual à original + diversos tamanhos de vesículas.

28 Mutante + vesícula WT + vesícula Controle (vesícula) Células Vero lipid ra@s wtebo 16 grandes agregados (1690nm) EBO 16 W8A duas populações de agregados (a menor ~597nm)

29 Comportamento energé\co da interação do pep[deo com a membrana Calorimetria de \tulação isotérmica

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31 PC LUVs mm de solução de wtebo16 ou W8A Não houve saturação dos sí\os de ligação. Componente endotérmico: pode ser desestabilização da membrana e mudanças conformacionais.

32 PC:PE:PI:Cho LUVs PC:PE:SPM:Cho LUVs

33 Lipid rads de células BHK- 21 Lipid rads de células VERO

34 Discussão Nova forma de entrada do vírus na célula: EBO 16 u\liza lipid- rads como alvo para entrada do vírus na célula. Trp8 tem um papel essencial no ciclo de infecção viral. GAAIGLAWIPYFGPAA

35 Discussão

36 Discussão Mudança estrutural está diretamente relacionada com a a\vidade de fusão. (fig.3- FTIR) A estrutura em β não é o único fator necessário para fusão- wtebo 16 e lipossomas de PC:PE:SPM:Cho (fig. 3D) wtebo 16 induz agregação de lipossomas importante passo para fusão de membrana.(fig. 5) Múl\plas contribuições energé\cas na interação pep[deo- membrana.(fig.6)