UNIVERSIDADE FEDERAL DO TRIÂNGULO MINEIRO

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1 UNIVERSIDADE FEDERAL DO TRIÂNGULO MINEIRO PATRÍCIA DIAS NETO GUIMARÃES PREVENÇÃO DE CÂNCER DE COLO UTERINO EM PACIENTES COM ASCUS NO SISTEMA ÚNICO DE SAÚDE: CUSTO-EFETIVIDADE DE MÉTODO DE BIOLOGIA MOLECULAR PARA PAPILOMAVÍRUS HUMANO (HPV) Uberaba - MG 2012

2 PATRÍCIA DIAS NETO GUIMARÃES PREVENÇÃO DE CÂNCER DE COLO UTERINO EM PACIENTES COM ASCUS NO SISTEMA ÚNICO DE SAÚDE: CUSTO-EFETIVIDADE DE MÉTODO DE BIOLOGIA MOLECULAR PARA PAPILOMAVÍRUS HUMANO (HPV) Dissertação apresentada ao Curso de Pós-Graduação em Patologia, área de concentração Patologia Ginecológica e Obstétrica, da Universidade Federal do Triângulo Mineiro, como requisito parcial para obtenção de título de Mestre. Orientadora: Prof.ª Dr.ª Rosekeila Simões Nomelini Coorientadores: Prof. Dr. Eddie Fernando Candido Murta, Prof.ª Dr.ª Márcia Antoniazzi Michelin Uberaba - MG 2012

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4 PATRÍCIA DIAS NETO GUIMARÃES PREVENÇÃO DE CÂNCER DE COLO UTERINO EM PACIENTES COM ASCUS NO SISTEMA ÚNICO DE SAÚDE: CUSTO-EFETIVIDADE DE MÉTODO DE BIOLOGIA MOLECULAR PARA PAPILOMAVÍRUS HUMANO (HPV) Dissertação apresentada ao Curso de Pós-Graduação em Patologia, Área de concentração Patologia Ginecológica e Obstétrica, da Universidade Federal do Triângulo Mineiro, como requisito parcial para obtenção de título de Mestre. Uberaba, MG, de de BANCA EXAMINADORA Prof.ª Dr.ª Rosekeila Simões Nomelini - Orientadora Universidade Federal do Triângulo Mineiro Prof. Dr.Hélio Humberto Angotti Carrara Universidade de São Paulo Prof.ª Dr.ª Renata Margarida Etchebehere Universidade Federal do Triângulo Mineiro

5 A Deus, por me fortalecer a cada dia. Aos meus pais, por cuidarem dos meus filhos e me apoiarem sempre. Ao Lorenzo e à Valentina, anjos de luz na minha vida. Ao Alessandro, por embarcar comigo nessa viagem. À professora Rosekeila, por me guiar com sabedoria e compreensão. Aos familiares e amigos pelas manifestações de carinho e apoio.

6 AGRADECIMENTOS À professora Rosekeila Simões Nomelini, minha eterna gratidão, por ter abraçado comigo esse projeto, seu entusiasmo com os resultados me dava ânimo para a pesquisa, e por ter compreendido minhas limitações. Na minha essência, tento absorver suas melhores características, não só para minha vida profissional, mas também pessoal, como ética e empenho ao colocar brilho em tudo que faz. É digna de admiração sua elegância ao pontuar um erro e fazer suas correções com grande estilo. Aprendi que o verbo orientar tem uma definição muito mais ampla do que habitualmente encontrada nos dicionários. Conseguimos caminhar de mãos dadas, apesar dos cento e cinquenta quilômetros de distância física, e com a ajuda das inovações do mundo moderno. Independente de crenças e religiões, diria que é um espírito acima do seu tempo, uma mulher guerreira e, certamente, conhece o segredo. Ao professor Eddie Fernando Cândido Murta pela confiança, pela honra em ter o seu nome junto às minhas produções científicas; coroou a nossa UFTM (Universidade Federal do Triângulo Mineiro) com um grande centro de pesquisas, o IPON (Instituto de Pesquisa em Oncologia), e por ser elogiada sempre que menciono esse ilustre pesquisador. À professora Márcia Antoniazzi Michelin, por estar sempre presente num momento importante do trabalho, e com habilidade e competência auxiliou, sobretudo, nas leituras dos géis de eletroforese. Técnica com tanta minúcia e delicadeza. Pesquisar assim também é uma arte. Às funcionárias do setor de Citologia da UFTM, Dóris Lima Dayrell de Carvalho, Heloísa Helena Vieira, Nilva Aparecida da Silva Aveiro e Zelma Rocha Camargos Pereira, que se empenharam na busca das pacientes selecionadas, e pela disponibilidade em auxiliar para o progresso da pesquisa e o benefício das pacientes. Aos residentes de Ginecologia e Obstetrícia e à professora Márcia Mendonça pelo trabalho cooperativo no ambulatório Maria da Glória. À Pâmela Aparecida Candido e Ana Cláudia Camargo Campos pelo apoio técnico no laboratório e por compartilhar comigo as expectativas em cada etapa. Aos outros pós-graduandos que também pesquisaram no IPON, especialmente Aline Almeida Barbaresco e Douglas Reis Abdala, pelo auxílio durante a realização da PCR (reação em cadeia de polimerase), e pelos bons momentos de descontração.

7 Ao professor e primo Benito André Silveira Miranzi pelo auxílio no preparo técnico das aulas e na compreensão de análise estatística. Às pacientes pela boa vontade ao participarem da pesquisa. À UFTM e à Disciplina de Ginecologia e Obstetrícia pela estrutura na qual pôde ser desenvolvida a pesquisa. Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) e à Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Minas Gerais (FAPEMIG) pelo apoio financeiro.

8 RESUMO Os objetivos foram avaliar o desempenho da PCR única sonda para HPV de alto risco e PCR para HPV 16 e 18 na detecção de lesões intraepiteliais cervicais em pacientes com ASCUS, avaliar e comparar os custos de citologia, PCR única sonda de alto risco HPV, PCR para HPV 16 e 18, colposcopia e biópsia do Sistema Único de Saúde do Brasil, verificar a concordância de esfregaço cervical e PCR para HPV 16 e 18 com o PCR para HPV de alto risco para o diagnóstico do HPV. Ao rever os casos que evoluíram para NIC de alto grau, o valor preditivo negativo foi de 93,75% para PCR HPV 16/18 e 100% para PCR sonda única para HPV de alto risco. Custo anual de 81 pacientes, seguindo os protocolos: encaminhando todas as pacientes com ASCUS para a colposcopia: R$2,144.52; encaminhando à colposcopia as pacientes com ASCUS e PCR positivo para HPV 16/18: R$6,307.44; encaminahndo à colposcopia aquelas pacientes com ASCUS e PCR sonda única para HPV de alto risco positivo: R$3, Considerando eventual redução dos custos para utilização em grandes quantidades, este método poderia ser realizado em ASCUS. Palavras-chave: Papilomavírus humano. Neoplasia Intraepitelial Cervical. Reação em cadeia de polimerase.

9 ABSTRACT The objectives were to evaluate the performance of PCR single probe for high-risk HPV and PCR for HPV 16 and 18 in the detection of cervical intraepithelial lesions in patients with ASCUS, evaluate and compare the costs of cytology, PCR single probe for high-risk HPV, PCR for HPV 16 and 18, colposcopy and biopsy of the Brazilian National Health System, to check the concordance of cervical smear and PCR for HPV 16 and 18 with the PCR for HPV high risk for HPV diagnosis. In reviewing the cases that progressed to high-grade CIN, the negative predictive value was 93.75% for PCR HPV 16/18 and 100% for PCR probe only high-risk HPV. Annual cost of 81 patients, following the protocols: referring all patients with ASCUS cytology for colposcopy: R$2,144.52; referring for colposcopy the patients with ASCUS cytology and PCR positive for HPV 16/18: R$6,307.44; referring for colposcopy those patients with ASCUS cytology with PCR probe only positive for high-risk HPV: R$3, Considering a possible reduction of cost for use in large quantities, this method could be performed in ASCUS. Key words: Human papillomavirus. Cervical intraepithelial neoplasia. Polymerase chain reaction.

10 LISTA DE TABELAS Tabela 1: Resultado do diagnóstico de HPV pelo PCR para HPV 16 e 18 comparados ao PCR sonda única para HPV de alto risco Tabela 2: Resultado da sugestão de diagnóstico de HPV por colposcopia comparados ao PCR sonda única para HPV de alto risco Tabela 3: Achados citológicos de SIL na evolução em 12 meses das pacientes avaliadas Tabela 4: Resultado do diagnóstico de NIC no seguimento de 12 meses pelo PCR para HPV 16 e Tabela 5: Resultado do diagnóstico de NIC no seguimento de 12 meses pelo PCR sonda única para HPV de alto risco Tabela 6: Resultado do diagnóstico de HSIL no seguimento de 12 meses pelo PCR para HPV 16 e Tabela 7: Resultado do diagnóstico de NIC no seguimento de 12 meses pelo PCR sonda única para HPV de alto risco Tabela 8: Custo, em reais, dos métodos diagnósticos para HPV e lesões do trato genital inferior por paciente... 38

11 LISTA DE SIGLAS E ABREVIATURAS ASCUS - Células escamosas atípicas de significado indeterminado DNA - Ácido desoxirribonucleico HPV - Papilomavírus humano HSIL - Lesão intraepitelial escamosa de alto grau LSIL - Lesão intraepitelial escamosa de baixo grau NIC - Neoplasia intraepitelial cervical NIC I - Neoplasia intraepitelial cervical grau I NIC II - Neoplasia intraepitelial cervical grau II NIC III - Neoplasia intraepitelial cervical grau III PCR - Reação em cadeia de polimerase SIL - Lesão intraepitelial escamosa SUS - Sistema Único de Saúde VPN - Valor preditivo negativo VPP - Valor preditivo positivo

12 LISTA DE ILUSTRAÇÕES Figura 1: HPV - Modelo E6 - p Gráfico 1: Percentagem de diagnóstico de HPV de alto risco pelo PCR por faixa etária Gráfico 2: Percentagem de pacientes com positividade para o HPV 16, HPV 18, e HPV 16 e 18, pela técnica de PCR Gráfico 3: Resultados das colposcopias realizadas, em percentagem Organograma 1: Custo anual para o SUS das 81 pacientes, seguindo o protocolo de encaminhar todas as pacientes com ASCUS à citologia para a colposcopia Organograma 2: Custo anual para o SUS das 81 pacientes, seguindo o protocolo hipotético de encaminhar para a colposcopia somente as pacientes com ASCUS à citologia e PCR positivo para HPV 16 e/ou Organograma 3: Custo anual para o SUS das 81 pacientes, seguindo o protocolo hipotético de encaminhar para a colposcopia somente as pacientes com ASCUS à citologia com PCR sonda única positiva para HPV de alto risco... 41

13 SUMÁRIO 1 INTRODUÇÃO CÂNCER DE COLO UTERINO E LESÕES PRECURSORAS O PAPILOMAVÍRUS HUMANO RASTREAMENTO DO CÂNCER DE COLO UTERINO TESTES BIOMOLECULARES E INFECÇÃO PELO PAPILOMAVÍRUS HUMANO MANEJO DO ASCUS O SISTEMA ÚNICO DE SAÚDE E A PREVENÇÃO DO CÂNCER DE COLO UTERINO HIPÓTESES OBJETIVOS MATERIAL E MÉTODOS MATERIAL MÉTODOS Técnica Citológica Colposcopia Reação em Cadeia de Polimerase (PCR) Análise estatística RESULTADOS DISCUSSÃO CONCLUSÕES REFERÊNCIAS... 50

14 ANEXOS... 55

15 1 INTRODUÇÃO

16 CÂNCER DE COLO UTERINO EPIDEMIOLOGIA E O PAPILOMAVÍRUS HUMANO O câncer de colo uterino é o segundo mais comum entre as mulheres no mundo, com mais de novos casos diagnosticados a cada ano (ORGANIZAÇÃO MUNDIAL DA SAÚDE (OMS), 2012). Para o ano de 2012, esperam-se para os Estados Unidos novos casos (SIEGEL, 2012). Aproximadamente oitenta por cento dos casos ocorrem em países em desenvolvimento, como o Brasil (CASTRO et al., 2011), cuja estimativa para 2012 é de casos novos com risco de 17 casos a cada 100 mil mulheres (INSTITUTO NACIONAL DE CÂNCER JOSÉ ALENCAR GOMES DA SILVA (INCA), 2011). Desconsiderando os tumores de pele não melanoma, o câncer de colo de útero é o mais incidente na região Norte (24/100 mil). Nas regiões Centro-oeste (28/100 mil) e Nordeste (18/100 mil) é o segundo mais frequente. Na região sudeste, ocupa a terceira posição (15/100 mil), e na região Sul, a quarta posição (14/100 mil) (INSTITUTO NACIONAL DE CANCER JOSÉ ALENCAR GOMES DA SILVA (INCA), 2012). 1.2 PAPILOMAVÍRUS HUMANO O papilomavírus humano (HPV) é o principal fator de risco para a carcinogênese cervical e uma das mais prevalentes infecções sexualmente transmissíveis (GUDLEVICIENE et al., 2010; ZUR HAUSEN,1989). Outros fatores de risco para essa infecção são mulheres jovens, com início precoce da atividade sexual, em tabagistas, em mulheres com múltiplos parceiros sexuais e imunossuprimidas. A frequência da infecção por HPV declina com o aumento da idade em mulheres com citologia oncótica normal (NOMELINI et al., 2007). O tabagismo, particularmente, pode ser considerado fator independente relacionado a lesões cervicais precursoras e câncer invasivo. (BOSCH et al., 1992; SARDANA et al., 1994; MURTA et al., 1998; DERCHAIN et al., 1999; MUÑOZ et al., 2001). Pacientes que apresentam apenas alterações citológicas por HPV mostram um percentual de regressão de aproximadamente de 85% (MITCHELL et al., 1986; MURTA et al., 1999). A infecção inicia-se nas células basais da zona de transformação cervical e a maioria das infecções são controladas pela resposta imune celular. Somente em aproximadamente metade dos expostos há soroconversão, e não se sabe o grau em que a infecção natural protege contra infecções recorrentes ou facilita o controle imunológico das mesmas(almonte et al., 2010). Há mais de cem

17 16 genótipos de HPV descritos, aproximadamente quarenta têm tropismo pela mucosa anogenital, os quais são divididos em baixo risco e alto risco. Estes estão envolvidos no desenvolvimento de carcinomas cervicais e lesões precursoras. A maioria das infecções por HPV, independente do status de baixo ou alto risco, são transitórias e assintomáticas, entretanto, a infecção persistente com o mesmo genótipo de HPV de alto risco aumenta a chance de desenvolvimento de displasia de alto grau e, ultimamente, câncer cervical (UM et al., 2011). Como sua variabilidade genética se relaciona com sua carcinogenicidade, os tipos 16 e 18 causam cerca de 60-70% de todas lesões precursoras e cânceres invasores a nível mundial (UM et al., 2011; ALMONTE et al., 2010). Ao infectar a camada germinativa da célula hospedeira, haverá integração do genoma viral com o genoma humano. Com isso, o vírus rompe seu principal gene de regulação, o E2, havendo a expressão de oncoproteínas (E6 e E7), que conduzirão à imortalização celular. A E6 inibe a p53 (proteína supressora de tumor: nas células saudáveis, ativa o reparo de DNA diante de um erro na síntese genômica). Se essas não conseguirem ativar o reparo pela p53, acontece a apoptose (morte celular programada), para impedir que uma mutação se transforme em fenótipo (figura 1). Porém a E6 do HPV 16, por exemplo, que é uma proteína ligadora de DNA, interage com a p53 e com outros fatores celulares, o que leva a um bloqueio da apoptose e outras alterações no ciclo de vida das células, e assim pode contribuir para a transformação maligna. A E7 pode-se ligar a outra proteína supressora de tumor, a prb (proteína de retinoblastoma, em células saudáveis controla o processo de transcrição e tradução de proteínas), com isso há um estímulo mitogênico, com multiplicação desordenada e manutenção de células mutadas. Conclui-se que o HPV induz o câncer ao limitar a capacidade imune do organismo humano à infecção (PASSOS et al., 2008). Figura 1: HPV Modelo E6 - p RASTREAMENTO DO CÂNCER DE COLO UTERINO

18 17 O esfregaço de Papanicolaou, introduzido há mais de cinquenta anos como rastreamento do câncer de colo, foi uma intervenção bem sucedida na saúde pública, alcançando redução na incidência do câncer de colo acima de oitenta por cento, onde praticado efetivamente (OGILVIE et al., 2010). Em 1988 foi proposta a classificação de Bethesda (revisada em 1991) que reflete o comportamento biológico das lesões intraepiteliais escamosas do colo, subdividindo as células epiteliais escamosas anormais em quatro grupos: (1) células atípicas de significado indeterminado (ASCUS); (2) lesões intraepiteliais escamosas de baixo grau (LSIL), envolvendo displasia leve/ Neoplasia Intraepitelial Cervical I (NIC I) assim como alterações celulares associadas ao HPV; (3) lesões intraepiteliais escamosas de alto grau (HSIL), incluindo displasia moderada/nic II, displasia severa e carcinoma in situ/nic III; (4) carcinoma de células escamosas (BARCELOS et al., 2011). A categoria ASCUS está relacionada a células escamosas com anormalidades que são mais acentuadas do que as atribuídas às mudanças reativas, porém quantitativa ou qualitativamente fica aquém de um diagnóstico definitivo de lesão intraepitelial escamosa (SOLOMON et al., 2002). Em 2001, o sistema Bethesda reclassificou a categoria ASCUS subdividindo-a em duas categorias: ASC-US (células atípicas escamosas de significado indeterminado), que reflete a dificuldade em distinguir entre alterações reativas e LSIL, e ASC-H (células atípicas escamosas, não podendo excluir lesão de alto grau), o que reflete um diagnóstico diferencial entre metaplasia imatura reativa e HSIL (BARCELOS et al., 2011; KAYGUSUZ et al., 2011). Para o diagnóstico de infecção por HPV à citologia, utilizam-se os critérios descritos por Schneider e colaboradores (1987): presença de coilocitose clássica e outros sinais secundários que são coilocitose leve, disceratose leve, núcleo hipercromático, bi e multinucleação e clareamento citoplasmático. Apesar de o exame histológico de biópsias guiadas por colposcopia ser ainda considerado o padrão ouro para a avaliação de lesões cervicais, é limitado pela interpretação da morfologia com pouca ou nenhuma informação a respeito do risco de persistência, progressão ou regressão das lesões. Além disso, tem a variabilidade interobservador. As principais categorias interpretativas incluem distinguir normal de displasias de qualquer grau e lesões de baixo grau de lesões de alto grau. Eventos moleculares relacionados ao ciclo de vida do HPV têm focalizado potenciais biomarcadores que podem

19 18 ser usados como testes adjuntos para melhorar a acurácia diagnóstica de lesões cervicais, assim como identificar aquelas pacientes com risco para evolução para câncer (HWANG; SHROYER, 2012). 1.4 TESTES BIOMOLECULARES PARA HPV Os biomarcadores mais utilizados e amplamente investigados na doença cervical são os testes biomoleculares para HPV. Há várias técnicas utilizadas, incluindo a captura híbrida, que foi o primeiro teste licenciado pelo United States Food and Drug Administration (FDA) e o PCR (Reação em cadeia de polimerase). A captura híbrida consiste na hibridização de DNA viral de filamento único com dois coquetéis de sondas de RNA que reconhecem 13 tipos de HPV de alto risco e 5 tipos de HPV de baixo risco. Uma de suas vantagens é que um resultado negativo exclui o risco de uma doença relacionada ao HPV em anos subsequentes, e intervalos para rastreamento podem seguramente ser aumentados para 3 a 5 anos. Além disso, tem uma boa reprodutibilidade interlaboratorial e é de fácil uso. Uma desvantagem é que não dá informação individual sobre o tipo de HPV (HWANG; SHROYER, 2012; NOMELINI et al., 2007). A técnica de PCR permite a amplificação de sequências de ácido nucléico específico. Para amplificar a fita de DNA viral, a sequência de nucleotídeos deve ser reconhecida. Com primers apropriados e condições de temperatura, a síntese de uma fita complementar procede automaticamente por ligação de nucleotídeos livres usando a enzima DNA-polimerase. Após suficiente tempo de elongação para gerar a fita complementar, a mistura pode ser quebrada a altas temperaturas (> 93 C) para separar a fita sintetizada do molde, então completando o primeiro ciclo. Cada ciclo sucessivo dobrará a quantidade de DNA, produzindo 2 30 vezes DNA após 30 ciclos. Após poucas horas, pequenas quantidades de DNA (nanogramas) podem ser transformadas em grandes quantidades (miligramas), que podem ser facilmente manipuladas. No estudo de Söderlund-Strand e colaboradores (2005), em que compararam a especificidade e sensibilidade do PCR e captura híbrida na detecção de Neoplasia Intraepitelial Cervical (NIC) e na recorrência de NIC após tratamento, concluíram que a sensibilidade de ambos métodos são altas e similares, sugerindo que ambos são adequados para detecção e seguimento pós tratamento de NIC II- III. Entretanto, as especificidades são baixas (estas referem-se às especificidades em um ambiente de

20 19 triagem clínica secundário, onde todas as mulheres tiveram um esfregaço anormal; as especificidades em um ambiente de rastreamento primário, provavelmente seriam substancialmente melhores). Tsiodras e colaboradores (2010) também avaliaram a captura híbrida e PCR no rastreio de infecção por HPV e, das 1270 mulheres avaliadas, 241 (18,5%) tinham citologia anormal. PCR detectou HPV em 397 (31,3%) amostras, e a captura híbrida em 260 (20,4%). Ambos os testes biomoleculares exibiram alta reprodutibilidade (Kappa 0,691, 95% IC: 0,664 0,718). O extremamente elevado valor preditivo negativo de ambos os testes moleculares é a base da sua importância no rastreamento de lesões de alto grau. O teste de Papanicolaou constitui uma triagem primária, barata e rápida, porém apresenta algumas limitações na detecção de lesões precursoras do câncer cervical, como amostras inadequadas que constituem cerca de 5% a 10% do material recebido pelos laboratórios citopatologistas, além da subjetividade na interpretação dos resultados. Têm sido descritas altas taxas de falso-positivo e falsonegativo, variando de 20-30% (MAGALHÃES et al., 2008; MOYSÉS et al., 2008). Metanálises indicam que a sensibilidade de um simples teste de Papanicolaou para detectar Neoplasia Intraepitelial Cervical ou câncer invasivo é menor que 60% (OGILVIE et al., 2010). Com isso, tem-se tentado encontrar outros métodos para o rastreio primário, como adjunto da citologia, no manejo do ASCUS e no seguimento pós-tratamento. 1.5 MANEJO DO ASCUS O diagnóstico de ASCUS, por ser inconclusivo e não justificar tratamento por si só, pois não necessariamente representa uma entidade patológica, ainda gera um dilema quanto à conduta clínica. Na tentativa de esclarecer essa situação, foi criado um estudo, o ASCUS-LSIL Triage Study (ALTS), conduzido pelo Instituto Nacional de Câncer, dos Estados Unidos (LÓPEZ et al., 2011). O ALTS é um grande ensaio randomizado, multicêntrico, que compara estratégias para mulheres com resultado citológico de ASCUS ou LSIL: colposcopia imediata, repetir a citologia e teste biomolecular para HPV para a detecção oportuna de NIC 3 (SOLOMON et al., 2001). Esse estudo concluiu que como em uma grande porcentagem de mulheres com diagnóstico citológico de LSIL foi detectado DNA de HPV pela captura híbrida, esse teste seria limitado para esse grupo, já que evitaria o encaminhamento para a colposcopia em somente 20%-27% das mulheres. Entre as participantes com

21 20 ASCUS, a sensibilidade para detectar NIC 3 ou lesão mais grave através de teste biomolecular para HPV associado a cancer foi 96% com 56% de mulheres encaminhadas à colposcopia. Devido a essa alta sensibilidade para detectar essas lesões e especificidade comparada a um único teste citológico indicando ASCUS ou lesão mais grave, a captura híbrida para DNA de HPV associado ao câncer é uma opção viável no manejo de mulheres com ASCUS (THE ALTS GROUP, 2000; SOLOMON et al., 2001). Estudos têm demonstrado que repetir a citologia com seis meses de intervalo, testes biomoleculares para HPV e uma simples colposcopia são todos seguros e efetivos para o manejo de mulheres com ASC-US (WRIGHT et al., 2007). Com o objetivo de determinar se o teste biomolecular para HPV com o encaminhamento dos casos HPV positivos diretamente à colposcopia seria sensível para detectar HSIL subjacente em mulheres com ASCUS, comparado com repetir a citologia, Manos e colaboradores (1999) encontraram que a triagem baseada em teste biomolecular para HPV somente ou repetir a citologia somente teria encaminhamento semelhante à colposcopia (aproximadamente 39%). Mayrand e colaboradores (2007) encontraram que a maioria de NIC II achado de biópsias de mulheres com testes para HPV negativo não foram confirmados pelo exame excisional da espécie, o que sugere que o teste biomolecular para HPV poderia melhorar a acurácia do diagnóstico patológico. Numa coorte multinacional, sete diferentes estudos em seis países europeus consistentemente encontraram uma baixa taxa de incidência cumulativa de NIC III ou lesões mais graves entre mulheres com HPV negativo, concluindo que estratégias de rastreamento cervical com testes biomoleculares para HPV a cada seis anos é seguro e efetivo (DILLNER et al., 2008). Cuzick e colaboradores (2003) verificaram através do estudo HPV in Addition to Routine Testing (HART) que mulheres HPV positivas com citologia normal ou borderline poderiam ser manejadas com a repetição do teste após doze meses, o que poderia potencialmente melhorar as taxas de detecção de NIC 2 ou lesão mais grave sem aumentar as taxas de encaminhamento para a colposcopia. Além disso, mulheres com teste biomolecular para HPV negativo podem ser asseguradas de que não têm uma lesão significativa (WRIGHT et al., 2002).

22 21 O Ministério da Saúde recomenda a repetição da citologia oncótica seis meses após um diagnóstico inicial de ASCUS, e referência para a colposcopia se um segundo exame citológico identificar lesão igual ou mais grave do que ASCUS (BRASIL,2012). 1.6 SISTEMA ÚNICO DE SAÚDE O Sistema Único de Saúde (SUS) foi criado há pouco mais de 20 anos, e coloca a saúde como direito de todos e dever do Estado. A implementação do conceito de atenção básica na década de 90 gerou um progresso no processo de municipalização e no estabelecimento de novas estratégias para financiar as ações e serviços de saúde. A reorganização lógica assistencial do SUS ocorreu em 1994, operacionalizando o Plano de Saúde da Família (PSF), e o Programa de Agentes Comunitários à Saúde (PACS). Com isso, reforçou-se a necessidade de medidas preventivas, e não somente curativas, para a evolução e entendimento de um conceito ampliado da saúde. No final da década de 90, os municípios foram incentivados a seguir programas destinados ao aumento de suas receitas financeiras. Com isso, houve um estímulo ao governo federal para reforçar a atenção básica na política de saúde. Houve a priorização de despesas de baixo custo. Infelizmente, a associação de métodos biomoleculares ao exame de Papanicolaou esbarra nas limitações financeiras do SUS. Nosso grupo de estudo, em trabalho anterior publicado em 2007 (NOMELINI et al., 2007) demonstrou que para a implantação no SUS de métodos de biologia molecular na conduta de pacientes com ASCUS e LSIL à citologia cérvico-vaginal como prevenção do câncer de colo uterino, deve-se considerar uma possível redução do custo para o uso em grande quantidade, e o PCR deveria ser o método de escolha, por ser mais barato e sensível, e ter um alto valor preditivo negativo. Agora, queremos demonstrar os custos e a eficiência da utilização de um outro tipo de PCR, que utiliza sonda única para HPV de alto risco, o que abrangeria não somente os casos com HPV 16 e 18, mas todos aqueles de alto risco oncogênico, aumentando a possibilidade de detecção de HPV e lesões préneoplásicas em pacientes com ASCUS. O SUS preconiza uma atenção integral à saúde, oferecendo a toda a população ações de prevenção básicas, de média e alta complexidade. São pontos a serem seguidos pelo SUS: predomínio

23 22 das ações preventivas, promoção da saúde em detrimento das ações curativas de média e alta complexidade hospitalares (BODSTEIN, 2002). Em 29 de abril de 2008, foi assinada a Lei nº , que dispõe sobre a efetivação de ações de saúde que assegurem a prevenção, a detecção, o tratamento e o seguimento dos cânceres do colo uterino e de mama, no âmbito do Sistema Único de Saúde/SUS, a partir de 1 ano da sua publicação (DOU de 30/4/08, APL, pág. 1), e refere, em relação ao câncer de colo uterino, que os órgãos do SUS devem assegurar assistência integral à saúde da mulher, incluindo amplo trabalho informativo e educativo sobre a prevenção, a detecção, o tratamento e controle, ou seguimento pós-tratamento do câncer de colo uterino, garantindo a realização de exame citopatológico do colo uterino a todas as mulheres que já tenham iniciado sua vida sexual, independentemente da idade; o encaminhamento a serviços de maior complexidade das mulheres cujos exames citopatológicos ou cuja observação clínica indicarem a necessidade de complementação diagnóstica, tratamento e seguimento pós-tratamento que não puderem ser realizados na unidade que prestou o atendimento; os subsequentes exames citopatológicos do colo uterino segundo a periodicidade que o órgão federal responsável pela efetivação das ações citadas nesta Lei deve instituir. Refere ainda que os exames citopatológicos do colo uterino poderão ser complementados ou substituídos por outros quando o órgão federal responsável pela efetivação das ações citadas nesta Lei assim o determinar (BRASIL, 2008). Existe uma agenda estratégica que inclui um conjunto de ações para o controle do câncer no Brasil, baseado em metas e resultados em áreas prioritárias. O câncer de colo de útero está incluído nessa agenda, bem como a expansão da assistência oncológica. O Sistema de Informação do Câncer do Colo do Útero (SISCOLO) foi desenvolvido pelo INCA em parceria com o Datasus, como ferramenta de gerência das ações do programa de controle do câncer do colo do útero (INSTITUTO NACIONAL DE CÂNCER JOSÉ ALENCAR GOMES DA SILVA(INCA), 2012). Dessa forma, a realização deste estudo se justifica pela importância de uma reavaliação do diagnóstico de infecção por HPV em pacientes com ASCUS a ser realizada pelo SUS, avaliando-se técnicas econômicas e reprodutíveis, já realizadas pelo Instituto de Pesquisa em Oncologia (IPON) da Universidade Federal do Triângulo Mineiro (UFTM).

24 23 2 HIPÓTESE

25 24 A utilização de PCR sonda única para HPV de alto risco oncogênico em colpocitologia oncótica com ASCUS possui bom desempenho na detecção de lesões de alto grau, tendo aceitável custoefetividade para a utilização no Sistema Único de Saúde.

26 25 3 OBJETIVOS

27 26 1. Avaliar o desempenho do PCR para HPV 16 e 18 em relação ao PCR sonda única para HPV de alto risco oncogênico na detecção do papilomavírus humano e verificar a concordância entre esses métodos de biologia molecular para o diagnóstico de HPV. 2. Avaliar o desempenho do PCR sonda única para HPV de alto risco e PCR para HPV 16 e 18 na detecção de lesões intraepiteliais cervicais no seguimento em 12 meses em pacientes com ASCUS. 3. Avaliar e comparar os custos da citologia oncótica, PCR sonda única para HPV de alto risco, PCR para HPV 16 e 18, colposcopia e biópsia no Sistema Único de Saúde SUS.

28 27 4 MATERIAL E MÉTODOS

29 MATERIAL Um estudo prospectivo foi realizado na Universidade Federal do Triângulo Mineiro (UFTM) de março de 2009 a julho de 2010; foram incluídas mulheres entre 17 e 60 anos (n = 81), submetidas a exame ginecológico de rotina no Ambulatório de Ginecologia Geral da UFTM com diagnóstico de ASCUS (atipia de células escamosas de significado indeterminado). Foram obtidas informações sobre idade, hábitos e condições de vida (tabagismo), métodos contraceptivos, paridade. Após a anamnese e assinatura do consentimento, todas as mulheres com diagnóstico citológico de ASCUS foram submetidas a PCR para HPV 16 e 18 e PCR sonda única para subtipos de alto risco oncogênico. O presente estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa da UFTM. Consentimento por escrito foi obtido de todas as pacientes incluídas no estudo. Critérios de inclusão Mulheres entre 15 e 60 anos com ASCUS. Critérios de exclusão 1. Imunodepressão 2. Gestação 3. Alteração citológica anterior 4.2 MÉTODOS Técnica Citológica O esfregaço citológico foi constituído de duas amostras, representativas do raspado da ectocérvice e do escovado da endocérvice. As lâminas foram coradas pelo método de Papanicolaou e avaliadas com base no Sistema de Bethesda. Os resultados citológicos foram classificados em: (1) alterações inflamatórias; lesões escamosas pré-invasoras, incluindo atipias de células escamosas de origem indeterminada (ASCUS); (3) lesões escamosas de baixo grau (NIC 1 e HPV); (4) lesões escamosas de alto grau (NIC 2 e 3); (5) atipias glandulares pré-invasoras, incluindo atipias glandulares

30 29 de origem indeterminada (AGUS) e adenocarcinoma in situ; e finalmente (6) carcinoma invasor escamoso ou glandular. O esfregaço citológico foi avaliado segundo critérios morfológicos: anfofilia, halo perinuclear, disqueratose, critérios nucleares (binucleação, multinucleação), aumento da relação núcleo/citoplasma, anisocariose, hipercromasia, atipias nucleares, cariorrexe, além da realização da técnica de Papanicolaou, conhecida e difundida mundialmente Colposcopia Todas as pacientes com ASCUS foram submetidas à colposcopia. A classificação utilizada para descrição dos achados foi a de Barcelona, proposta em 2002 (STAFL et al., 1991) que os dividia em: achados colposcópicos normais (epitélio escamoso original, epitélio colunar e zona de transformação normal) e anormais (epitélio aceto-branco, pontilhado, mosaico, leucoplasia, zona iodo-negativa e vasos atípicos), sendo esta última subdividida em alterações menores ou maiores dependendo da intensidade da alteração. Para a realização da colposcopia foram utilizados os seguintes reagentes: solução aquosa de ácido acético glacial a 3%, solução de lugol e bissulfito de sódio. Na presença de alterações maiores, as pacientes foram submetidas à biópsia dirigida utilizando pinça de Gaylor Reação em Cadeia de Polimerase (PCR) Para a obtenção do DNA, o material coletado foi estocado em TRIZOL -20 C e descongelado somente no momento da extração do DNA, no qual foi adicionado de 200μl de clorofórmio para cada 1,0 ml de TRIZOL coletado. Após a agitação em vórtex por 15 segundos, incubação a temperatura ambiente por 3 minutos, o material foi centrifugado a x g por 15 minutos a 4 C. Após centrifugação, a mistura se separa numa fase vermelho-fenol-clorofórmio e em outra incolor aquosa. O DNA se encontra na fase vermelha (fenol-clorofórmio). À fase fenólica, foi adicionado 300 μl de etanol 100%, com posterior agitação em vórtex por 15 segundos, incubação a temperatura ambiente por cerca de 2-3 minutos e centrifugação a x g por 5 minutos a 4 C. Após a centrifugação, será observada a separação da amostra em duas fases, sendo que o DNA é encontrado na fase sólida do tubo; o

31 30 sobrenadante foi removido, e realizada a lavagem do DNA por duas vezes, adicionando 1,0ml de Citrato de Sódio 0,1M a 10% de etanol, com posterior homogeneização em vórtex por 15 segundos, incubação a temperatura ambiente por 30 minutos e centrifugação a x g por 5 minutos a 4 C. Após as duas lavagens, adicionou-se á 1,5 ml de etanol 75%, incubou-se por 20 minutos a temperatura ambiente e foi centrifugado a x g por 5 minutos a 4 C. Posteriormente, foi realizado o protocolo de PCR. Para as reações de PCR, o DNA foi adicionado a uma solução de amplificação, seguindo o protocolo sugerido pelo fabricante (Invitrogen, Carlsbad, California, USA). Depois, foi realizado o ciclo de amplificação do DNA, com desnaturação, anelamento e polimerização, seguidos de 30 ciclos. A reação foi amplificada utilizando um termociclador eppendorff com 64 orifícios. Após a reação de PCR, os produtos da amplificação foram submetidos à eletroforese em géis de poliacrilamida a 14% e corados com prata. Foi utilizado um padrão como controle positivo Trackit TM 1kb DNA ladder da Invitrogen. Foi homogeneizado 10,0 μl de amostra amplificada e 3,0 μl de buffer adicionando em cada orifício do gel de poliacrilamida 14%. A corrida foi realizada com corrente de 90 volts por aproximadamente 1 hora. Posteriormente à corrida eletroforética, o gel foi colocado em solução fixadora por 15 minutos, esta solução foi desprezada e adicionada solução de Prata por 15 minutos, seguido de uma lavagem em H 2 O MILLI-Q e incubação em solução reveladora por aproximadamente 15 minutos, retornando o gel para a solução fixadora por 15 minutos e observando-se as bandas presentes no gel. Nome do oligonucleotídeo HPV 18 F HPV 18 R HPV 16 F HPV 16 R HPV alto risco F HPV alto risco R Sequência CGACAGGAACGACTCCAACGA GCTGGTAAATGTTGATGATTAACT CCCAGCTGTAATCATGCATGGAGA GTGTGCCCATTAACAGGTCTTCCA TTTGTTACTGTGGTAGATACTAC GAAAAATAAACTGTAAATCATATTC A sequência iniciadora do HPV de alto risco amplifica os subtipos 16, 18, 31, 33 e 35 de HPV.

32 Análise Estatística Os resultados foram analisados estatisticamente. Foram elaboradas tabelas com resultado do desempenho da colposcopia, PCR para HPV de alto risco oncogênico, PCR para HPV 16 e 18 na detecção de HPV e de lesões cervicais. O desempenho dos testes para NIC no seguimento foi calculado tendo como padrão-ouro a citologia mais colposcopia com ou sem biópsia. O desempenho dos exames incluiu o cálculo da sensibilidade, especificidade, valor preditivo positivo (VPP), valor preditivo negativo (VPN), utilizando-se IC de 95%. Os custos do uso desses métodos no SUS foram representados por organograma simulando-se o custo de cada método utilizado. Ressalta-se que os custos do PCR por paciente foram calculados após a padronização do método, já que houve um gasto maior de reagentes até que se obteve a padronização do PCR para HPV 16 e 18 e PCR sonda única para HPV de alto risco oncogênico no laboratório. Nas tabelas de cálculo de desempenho do PCR para NIC, as mulheres com colposcopia negativa (e, portanto não submetidas à biópsia), somadas àquelas com biópsia mostrando metaplasia escamosa, cervicite ou apenas alterações sugestivas de HPV foram consideradas como diagnóstico negativo, e as mulheres com diagnóstico de NIC à citologia oncótica mais colposcopia com ou sem biópsia foram consideradas como diagnóstico positivo. Foi calculada a concordância entre os dois tipos de PCR, seguindo a seguinte classificação: kappa < 0,4: concordância leve; 0,4 kappa < 0,8: concordância moderada; 0,8 kappa < 1: concordância forte; kappa > 1: concordância perfeita.

33 32 5 RESULTADOS

34 33 Foram avaliadas 81 pacientes. A média de idade foi de 36 ± 12,9 anos (variação de 17 a 60 anos). O tabagismo foi encontrado em 20 (24,7%) pacientes. Em relação ao método contraceptivo, a anticoncepção hormonal era utilizada por 32 (39,5%) mulheres, nenhuma na pós-menopausa utilizava terapia hormonal sistêmica. A média de paridade foi de 1,95±1,83 (variação de 0 a 10). O gráfico 1 ilustra a frequência de diagnósticos de HPV 16 e 18 pelo PCR em cada faixa etária. Observa-se que 49% dos casos ocorrem em pacientes com 30 anos ou menos de idade , ,8 21,2 14,9 14,9 até 20a 21-30a 31-40a 41-50a mais que 50a 0 Idade Gráfico 1: Percentagem de diagnóstico de HPV de alto risco pelo PCR por faixa etária. Em relação aos casos de DNA de HPV de alto risco diagnosticados pelo PCR (para HPV 16 e 18) e utilizando-se PCR sonda única para HPV alto risco oncogênico, observa-se que o PCR (para HPV 16 e 18) diagnosticou 41 (50,6%) pacientes com HPV 16 ou 18, enquanto que o sonda única para HPV alto risco oncogênico diagnosticou 47 (58,02%) casos positivos. O gráfico 2 ilustra a distribuição dos casos de acordo com o tipo de HPV 16 e 18 diagnosticado pela técnica de PCR. Observa-se que, das 41 pacientes com positividade, 27 (65,8%) apresentaram somente o HPV 16 positivo, 4 (9,8%) apresentaram somente o HPV 18 positivo, e 10 (24,4%) pacientes apresentaram os dois tipos concomitantemente.

35 ,8 24,4 9, /18 Tipo de HPV Gráfico 2: Percentagem de pacientes com positividade para o HPV 16, HPV 18, e HPV 16 e 18, pela técnica de PCR. Das 81 citologias alteradas, a colposcopia foi normal em 41 (50,6%) pacientes, insatisfatória em 15 (18,5%) e apresentou alterações em 25 (30,9%) pacientes (gráfico 3). As biópsias foram realizadas em 6 pacientes. Dessas, 2 (33,3%) foram negativas para HPV, em 3 (50%) havia alterações compatíveis com HPV, e em 1 (16,7%) havia alterações suspeitas, porém não conclusivas para HPV. Não houve nenhuma NIC na amostra inicial. 30,9 50,6 Normal Insatisfatória Alterada 18,5 Gráfico 3: Resultados das colposcopias realizadas, em percentagem. A tabela 1 demonstra a análise dos 81 casos pelo PCR para HPV 16 e 18 comparados ao PCR sonda única para HPV de alto risco oncogênico para o diagnóstico de HPV de alto risco oncogênico. Avaliando-se os casos, observa-se que 31 (38,3%) são verdadeiros positivos e, 24 (29,6%) são verdadeiros negativos. A sensibilidade do PCR para HPV 16 e 18 em relação ao PCR sonda única para HPV de alto risco foi de ( a , 95% IC), a especificidade foi de 0,7059 (0,5252 a

36 35 0,8488, 95% IC), o valor preditivo positivo foi de 0,7561 (0,5970 a 0,8964, 95% IC) e o valor preditivo negativo foi de 0,6000 (0,4331 a 0,7513, 95% IC). A eficiência (acurácia) foi de 67,9%. Ou seja, utilizando-se PCR para HPV 16 e 18, tem-se 16 pacientes que deixaram de ser diagnosticadas, sugerindo que estava presente outro subtipo de HPV de alto risco oncogênico. Para cálculo da concordância, tem-se um kappa de 0,36, o que é considerado uma concordância leve. Tabela 1: Resultado do diagnóstico de HPV pelo PCR para HPV 16 e 18 comparados ao PCR sonda única para HPV de alto risco. PCR alto PCR alto Total risco positivo risco negativo PCR 16/18 positivo PCR 16/18 negativo Total A tabela 2 demonstra a análise do desempenho da colposcopia em relação ao PCR sonda única de alto risco para o diagnóstico de HPV de alto risco oncogênico. Avaliando-se os 66 casos que apresentaram colposcopias satisfatórias, observa-se que 13 (19,7%) são verdadeiros positivos e, 16 (24,2%) são verdadeiros negativos. A sensibilidade da colposcopia em relação ao PCR sonda única para HPV de alto risco foi de 0,3421 (0,1966 a 0,5138, 95% IC), a especificidade foi de 0,5714 (0,3715 a 0,7557, 95% IC), o valor preditivo positivo foi de 0,5200 (0,3133 a 0,7217, 95% IC) e o valor preditivo negativo foi de 0,3902 (0,2422 a 0,5547, 95% IC). Observa-se uma acurácia de 43,9%. Tabela 2: Resultado da sugestão de diagnóstico de HPV por colposcopia comparados ao PCR sonda única para HPV de alto risco. PCR alto PCR alto Total risco positivo risco negativo Colposcopia positiva Colposcopia negativa Total

37 36 A tabela 3 mostra a evolução das pacientes em um seguimento de 12 meses para lesão intraepitelial cervical (SIL). Tabela 3: Achados citológicos de SIL na evolução em 12 meses das pacientes avaliadas. Citologia n % LSIL HSIL ,6 2,5 No acompanhamento das pacientes durante pelo menos 12 meses, 15 (18,5%) delas perderam o seguimento, não retornando nesse período, sendo que 66 (81,5%) mantiveram seguimento regular a cada 6 meses. Nas próximas tabelas, foram excluídas as pacientes que não fizeram regularmente o seguimento. A tabela 4 demonstra a análise dos 66 casos pelo PCR para HPV 16 e 18 para o diagnóstico de NIC em 12 meses de seguimento. Avaliando-se os casos, observa-se que 6 (9,1%) são verdadeiros positivos e, 23 (34,8%) são verdadeiros negativos. A sensibilidade do PCR para HPV 16 e 18 para a detecção de NIC em um seguimento de 12 meses foi de 0,4615 (0,1922 a 0,7488, 95% IC), a especificidade foi de 0,4853 (0,3623 a 0,6093, 95% IC), o valor preditivo positivo foi de 0,1463 (0,05572 a 0,2916, 95% IC) e o valor preditivo negativo foi de (0,6722 a 0,9266, 95% IC). Tabela 4: Resultado do diagnóstico de NIC no seguimento de 12 meses pelo PCR para HPV 16 e 18. NIC positivo NIC negativo Total PCR 16/18 positivo PCR 16/18 negativo Total A tabela 5 demonstra a análise dos 81 casos pelo PCR sonda única de alto risco para o diagnóstico de NIC em 12 meses de seguimento. Avaliando-se os casos, observa-se que 7 (10,6%) são verdadeiros positivos e, 22 (33,3%) são verdadeiros negativos. A sensibilidade do PCR sonda única

38 37 para a detecção de NIC em um seguimento de 12 meses foi de 0,5385 (0,2512 a 0,8078, 95% IC), a especificidade foi de 0,4151 (0,2816 a 0,5588, 95% IC), o valor preditivo positivo foi de 0,1842 (0,07746 a 0,3435, 95% IC) e o valor preditivo negativo foi de 0,7857 (0,5900 a 0,9171, 95% IC). Tabela 5: Resultado do diagnóstico de NIC n seguimento de 12 meses pelo PCR sonda única para HPV de alto risco. NIC positivo NIC negativo Total PCR HPV alto risco positivo PCR HPV alto risco negativo Total A tabela 6 demonstra a análise dos 66 casos pelo PCR para HPV 16 e 18 para o diagnóstico de NIC de alto grau em 12 meses de seguimento. Avaliando-se os casos, observa-se que o valor preditivo negativo foi de 93,75% (0,7918 a 0,9923, 95% IC). Tabela 6: Resultado do diagnóstico de HSIL no seguimento de 12 meses pelo PCR para HPV 16 e 18. NIC de alto NIC de alto Total grau positivo grau negativo PCR 16/18 positivo PCR 16/18 negativo Total A tabela 7 demonstra a análise dos 81 casos pelo PCR sonda única de alto risco para o diagnóstico de NIC em 12 meses de seguimento. Avaliando-se os casos, observa-se que valor preditivo negativo foi de 100% (0,8766 a 1,0000, 95% IC).

39 38 Tabela 7: Resultado do diagnóstico de NIC no seguimento de 12 meses pelo PCR sonda única para HPV de alto risco. NIC de alto grau positivo PCR HPV alto risco positivo 2 PCR HPV alto risco negativo 0 NIC de alto Total grau negativo Total A tabela 8 compara o custo dos métodos diagnósticos para HPV e lesões do trato genital inferior. Os custos da consulta ginecológica, citologia cérvico-vaginal, colposcopia e biópsia estão disponíveis na tabela do SUS (BRASIL, 2011), e os custos do PCR e captura híbrida foram calculados de acordo com o somatório dos gastos dos reagentes e materiais por paciente, após a padronização dos métodos. Tabela 8: Custo, em reais, dos métodos diagnósticos para HPV e lesões do trato genital inferior, por paciente. Método diagnóstico Código do procedimento Custo (em reais) Consulta ginecológica* Citologia cérvico-vaginal* Colposcopia* Coleta da biópsia* Biópsia* PCR para HPV 16 e 18** PCR sonda única HPV alto risco oncogênico** R$ 10,00 R$ 6,64 R$ 3,38 R$18,33 R$ 43,21 R$ 65,00 R$ 32,00 *BRASIL. Ministério da Saúde. Tabela de procedimentos do SIA/SIH-SUS. ** Somatório dos gastos dos reagentes e materiais por paciente

40 39 Os organogramas 1, 2 e 3 mostram o custo anual destas 81 pacientes para a realização de colposcopia imediata em citologias com ASCUS, e se, hipoteticamente, fossem realizados PCR para HPV 16 e 18, ou PCR para HPV de alto risco oncogênico inicialmente para as pacientes com estas alterações citológicas e, somente se positivos, encaminhadas à colposcopia. ASCUS Colposcopia 81x 3,38 = R$ 273,78 Normal Alterada Citol + colp em 6 meses 75 (10+6,64+3,38)=R$ 1.501,50 Biópsia 6 x (18, ,21) = R$ 369,24 TOTAL: R$ 2.144,52 Organograma 1: Custo anual para o SUS das 81 pacientes, seguindo o protocolo de encaminhar todas as pacientes com ASCUS à citologia para a colposcopia.

41 40 ASCUS PCR 81x 65 =R$ 5.265,00 Positivo Negativo Colposcopia 41x 3,38 = R$ 138,58 Citologia oncótica anual Negativa Citol + colp em 6 meses 39(10+6,64+3,38)=R$ 780,78 Positiva TOTAL: R$ 6.307,44 Biópsia 2 x (18, ,21) =R$ 123,08 Organograma 2: Custo anual para o SUS das 81 pacientes, seguindo o protocolo hipotético de encaminhar para a colposcopia somente as pacientes com ASCUS à citologia e PCR positivo para HPV 16 e/ou 18.

42 41 ASCUS PCR 81x 32 = R$ 2.592,00 Positivo Negativo Colposcopia 47 x 3,38 = R$ 158,86 Citologia oncótica anual Negativo Citol + colp em 6 meses 47(10+6,64+3,38) = R$940,94 Positive TOTAL: R$ 3691,80 Biopsy 0 x (18, ,21) = 0,00 Organograma 3: Custo anual para o SUS das 81 pacientes, seguindo o protocolo hipotético de encaminhar para a colposcopia somente as pacientes com ASCUS à citologia com PCR sonda única positiva para HPV de alto risco.

43 42 6 DISCUSSÃO

44 43 São fatores epidemiológicos importantes para a infecção por HPV: idade (mais frequente em mulheres jovens), vida sexual ativa, tabagismo e múltiplos parceiros sexuais. O tabagismo é considerado fator independente que possui relação com neoplasias intraepiteliais cervicais e neoplasia maligna invasiva de colo uterino. (MURTA et al., 1998; DERCHAIN et al., 1999; SCHIFFMAN et al., 2000; MUÑOZ et al., 2001). Uma incidência elevada de HPV de alto risco oncogênico foi encontrado em nossa amostra. A maioria das infecções por HPV tem caráter transitório, ou seja, ela é eliminada pelo sistema imune da paciente em alguns meses, não restando lesão. É o que se define como clearance do HPV. Em pacientes mais jovens, em geral com menos de 35 anos de idade, a taxa de remissão espontânea é elevada; com o aumento da idade, a persistência do vírus pode ser mais frequente (HILDESHEIM et al., 1994; HO et al., 1995; ELFGREN et al., 2000). Por isso, a conduta em LSIL pode ser apenas de seguimento, repetindo-se a citologia oncótica e a colposcopia a cada 6 meses. Nosso estudo demonstrou que 65,8% das pacientes apresentaram positividade para o HPV 16 e 24,4% das pacientes apresentaram positividade para subtipos 16 e 18 ao mesmo tempo. A persistência da infecção pelo HPV é importante fator de progressão para o câncer de colo uterino. A positividade do HPV subtipo 16 está relacionado com a persistência viral, podendo levar também a um risco maior de progressão de lesão de alto grau em pacientes com citologias com ASCUS (TANAKA et al., 2004). A sensibilidade do PCR para HPV 16 e 18 em relação ao PCR sonda única para HPV de alto risco foi de 65,96%. Os casos negativos poderiam ser devidos à presença de outros subtipos de HPV de alto risco oncogênico em pacientes com ASCUS, diferentes dos subtipos 16 e 18. Nosso estudo mostrou 50,6% de colposcopias normais. Porras e colaboradores (2012)) encontraram entre mulheres com 30 anos ou mais que a maioria de casos de NIC II ou mais graves detectados ou previstos pelo teste de HPV que foram diagnosticados em 7 anos de estudo não tinha lesões visíveis no recrutamento. Além disso, dados recentes têm demonstrado que, mesmo em colos anormais, tem sido um desafio atingir a pior lesão com biópsia, então a realização de mais biópsias melhoraria a sensibilidade da colposcopia, aumentando a detecção de NIC III. Em nosso estudo, 50,6% dos ASCUS foram positivos para HPV 16 e/ou 18 com a técnica de PCR, e 58,02% foram positivos utilizando-se o PCR com sonda única para HPV de alto risco oncogênico. A conduta no diagnóstico citológico de ASCUS pode seguir vários caminhos. Três condutas podem ser possíveis: colposcopia, repetir a citologia dentro de 4 a 6 meses, ou a realização de

45 44 testes biomoleculares para HPV. Cada um desses métodos tem suas vantagens e desvantagens. Embora repetir a citologia seja extremamente utilizado no manejo de mulheres com ASCUS, a sensibilidade de um simples teste de repetição para detectar NIC II/III é relativamente baixa (0,67-0,85). Com isso, muitos guidelines têm recomendado repetir o teste em intervalos específicos até uma paciente apresentar vários consecutivos negativos para lesão intraepitelial escamosa ou malignidade antes de retornar para o rastreamento de rotina. Além disso, repetir a citologia pode atrasar o diagnóstico de NIC 2,3 ou câncer cervical, e um seguimento com múltiplas visitas pode dificultar a adesão da paciente. Em relação à colposcopia, sua vantagem é que ela informa imediatamente a presença ou ausência de doença significativa. Sua desvantagem é que, para muitas mulheres, é um procedimento desconfortável e pode levantar preocupação quanto à doença cervical, além de ser cara e com potencial para sobrediagnóstico e sobretratamento (WRIGHT et al., 2002). Evidências mostram que somente 5-17% de mulheres com ASCUS e 25% com LSIL foram finalmente diagnosticadas como NIC II ou lesão mais grave em biópsias tissulares, logo, um manejo superior é necessário se todas mulheres forem encaminhadas à colposcopia (YUAN-YING et al., 2011). Para os testes biomoleculares para HPV, sua sensibilidade para a detecção de NIC II e III confirmado por biópsia em mulheres com ASCUS é 0,83 a 1,0 e é maior do que a sensibilidade de repetir um simples teste citológico. Seu valor preditivo negativo para HPV de alto risco é geralmente 0,98 ou maior. Um desconforto seria solicitar que a paciente retorne para tal teste, então uma alternativa seria coletar amostras na visita de rastreio inicial e só realizar o teste se um resultado de ASC-US for obtido (WRIGHT et al., 2002). Muitos estudos têm mostrado a utilidade do p16 (inibidor quinase dependente que regula negativamente a proliferação celular inibindo a hiperfosforilação do prb) para melhorar a verificação em interpretação histológica difícil e identificação do risco para NIC II ou lesão mais grave em ASCUS/LSIL. Porém, é ainda controverso sua superioridade em relação a testes biomoleculares para HPV de alto risco na triagem de ASCUS/LSIL (YUAN-YING et al., 2011; GUO et al., 2010). Durante a evolução em 12 meses, 13,6% tiveram NIC I e 2,5% NIC III. Apesar da baixa especificidade dos testes biomoleculares para HPV, resultando em grande número de mulheres com teste positivo sem nenhuma evidência citológica ou histológica de doença, mulheres com citologia oncótica negativa e teste biomolecular positivo para HPV podem evoluir com citologia anormal em um