Mutações bases moleculares; point mutation; rearrangements; Troca Genética entre Bactérias recombinação; Sequênciação e síntese de DNA

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1 Conteúdos Mutações bases moleculares; point mutation; rearrangements; mutações induzidas; taxa de mutação Troca Genética entre Bactérias recombinação; transformação; transdução; conjugação; complementação Sequênciação e síntese de DNA Clonagem Molecular

2 Mutações Mutação - Qualquer alteração permanente no material genético Selvagem - Estirpe portadora do genótipo anterior à mutação Mutante - Estripe portadora de uma mutação Erros de replicação durante a divisão celular; Causas Exposição a radiação; Exposição a agentes químicos; Vírus; Deliberadamente sobe controlo celular em processos como a meiose ou hipermutação;

3 Mutações Auxotróficos para Leucina Auxotróficos para Leucina tratados com nitrosoguanina ou U.V. -LEU +LEU -LEU +LEU Apenas os mutantes crescem Genótipo- set de genes Fenótipo- aparência

4 Mutações Selectiva (p.e. resitência a antibióticos) Confere qualquer tipo de vantagem ao organismo portador; Mutação Não Selectiva (p.e. pigmento) Apesar de apresentarem um fenótipo diferente, não possuem qualquer vantagem; Espontânea Radiação Natural, Recombinação e Replicação; Frequência muito baixa Mutação Induzida (Mutagénicos) Agentes químicos, físicos e biológicos aumentam a frequência de mutação

5 Bases Moleculares das Mutações Mutação Espontânea Point Mutation (Replicação) Alterações subtis, que envolvem 1 ou poucos nucleótidos; Rearrangements (Recombinação) Alterações mais extensas que envolvem segmentos de centenas ou milhões de nucleótido;

6 Point Mutation Substituição de pares de bases Transições- Substituição entre purinas ou entre pirimidinas; Transversões- Substituição entre uma purina e uma pirimidina, ou vice-versa; Frameshift Mutation Microdelecção- delecção de uma base; Microinsersão- insersão de uma base;

7 Point Mutation Substituição de pares de bases O efeito de uma mutação depende do seu contexto genético Substituição fora de um gene Dentro de um gene Mutação silenciosa Missense Protein sickle-cell disease Nonsense Protein Fibrose cistica

8 Point Mutation Substituição de pares de bases Mutation 5 T A C A T G 5 Normal Replication A A G T T C T A G A T C T A T A T A T A C A T G Transcription A A C Asparagine codon U A G STOP codon U A T Tyrosin codon U A C Tyrosin codon Translation Faulty protein Missenese mutation Incomplete protein Nonsense mutation Normal protein Silent mutation Normal protein Wild type

9 Point Mutation Open Reading Frame ORF TATA Box RBS AGAGTATCTATATAATGGACATACAATATAAGCTTTTATAATAAAGGGAATTTCAAATGATATTATACA

10 Point Mutation Operon An operon is a group of key nucleotide sequences including an operator, a common promoter, and one or more structural genes that are controlled as a unit to produce messenger RNA (mrna). Operons occur primarily in prokaryotes and nematodes

11 Point Mutation Frameshift Mutation Val Pro Cys Val Pro Val Val Leu Missense Protein As microinserções ou as microdelecções só são mutações frameshift se ocorrerem numa região codificante, ou seja, dentro de uma Open Reading Frame.

12 Rearrangements Delecções Regiões do DNA que são eliminadas, podendo levar à perda de informação. Papel muito importante na diversidade bacteriana. 5 T A G C T G C A T C 5 T A T C Infertilidade Distrofia muscular Duchenne

13 Rearrangements Inserções Novas bases são adicionadas ao DNA, inactivando o gene no qual são inseridas. Transposões, sequências de pb 5 T A G C T G C A T C 5 T A G C T T C A G G G C A T C

14 Rearrangements Translocações Grandes porções de um cromossama são colocados num outro. 5 T A G C T T C A G G G C A T C 5 G C T A C G A A T C 5 G C T A C T C A G G G A A T C

15 Rearrangements Inversões A orientação de um dado segmento de DNA é invertida, em relação ao DNA vizinho. 5 T A G C T T C A G G G C A T C 5 T A G C T G G A C T G C A T C

16 Taxa de Mutação Replicação de DNA /base durante um ciclo de replicação (DNA polimerase) Gene /geração Cultura de 10 8 células/ml vários mutantes/ml Transposições 10-4 (mais frequentes) Mutações Non-sense Sequências de DNA short repeat hot spots

17 Mutações Induzidas Agentes químicos e biológicos mutagénicos ROS Análogos de bases Agentes intercalares Intercalam-se entre 2 bases Microinserções/Microdelecções Brometo de etídeo Análogos a purinas e pirimidinas, mas com diferentes propriedades de ligação Agentes alquilantes Actuam directamente no DNA, alterando o emparelhamento das bases Mitomicina, Nitosoguanidine.

18 Mutações Induzidas Radiação Mutagénica Não Ionizante Radiação U.V. Dímeros de piridimidinas Ionizante Raios X, raios cósmicos, radiação gama Ioniza água produzindo ROS OH.

19 Troca Genética entre Bactérias As bactérias não têm reprodução sexuada como os eucariótas A essência do sexo nas bactérias é a Recombinação Quanto + distantes se encontram 2 bactérias + difícil é a ocorrência de Recombinação Transferência de genes Horizontal ou lateral (não sexual) Vertical (sexual)

20 Mecanismos de evolução de genomas Erros na replicação de DNA Danos provocados no DNA por stress físico ou químico Transferência horizontal de genes (HGT ou LGT) que inclui: vírus que integram o seu genoma num hospedeiro (transdução) elementos genéticos (transposões) aquisição de genes do ambiente (transformação) transferência de material genético entre indivíduos (conjugação, sexo) A composição dos genomas bacterianos pode ser alterada rapida e drasticamente num processo de HGT ou LGT por incorporação de DNA transferido de outro organismo directamente para o genoma

21 Recombinação Homóloga ou Geral Troca física de material genético (DNA) entre sequências homólogas, num mesmo cromossoma, ou entre cromossomas distintos Essa troca é precisa, sem que ocorra adição ou delecção de nucleótidos, e pode ocorrer em qualquer porção de DNA Fragmentos de DNA homologo são transferidos de um cromossoma dador para um receptor Conjugação Transformação Transducção Recombinação

22 Mecanismos Moleculares Pairing sequências homologas Trocas de segmentos homologos DNA recombinante Nuclease SSB RecA Complexo Helicase Qt a distância 2 genes probabilidade de ocorrer recombinação Formação de novos genótipos

23 Detecção de Recombinantes Recombinantes Fenótipo Resistência a antibióticos, requisitos nutricionais

24 Conjugação É um processo no qual um plasmídeo ou um elemento genético é transferido de célula dadora para célula receptora por contacto directo, normalmente mediada por um pilus sexual pb Pode ocorrer conjugação entre bactérias da mesma espécie, de espécies distintas, e mesmo entre bactérias e plantas.

25 Conjugação Sendo um processo replicativo, ambas as células ficam com uma cópia do plasmídeo Alguns plasmídeos controlam o processo de conjugação - conjugativos, sendo regulado por um conjunto de genes presentes no plasmídeo tra. Estes genes também permitem a integração do plasmídeo no cromossoma, podendo o plasmídeo mobilizar a transferência de DNA cromossómico entre células. Estirpes Hfr (high frequency of recombination)

26 Conjugação Macho Fêmea Para ocorrer transferência de DNA é necessário haver síntese Uma das cadeias é derivada da célula dadora e a outra é sintetizada de novo pela célula receptora O processo de transferência de plasmídeos é muito eficiente Importância ecológica

27 Conjugação

28 Conjugação Estirpes Hfr plasmídeo F Integração cromossoma (insert sequences) Hfr Síntese do pili Como o plasmídeo está integrado, alguns segmentos do cromossoma são transferidos

29 Conjugação Hfr Selecção Para seleccionar durante o processo de conjugação o dador e o receptor

30 Conjugação Estirpes Hfr A transferência de genes do cromossoma numa estirpe Hfr ocorre sempre na mesma ordem a partir de uma origem definida Interrupted matting Thr + Leu + Gal + Trp + Os genes que se encontram + próximos da origem entram + depressa na estirpe F - Método para determinar a ordem dos genes num cromossoma mapa genético

31 Transformação É um processo no qual DNA livre é incorporado e assimilado por uma célula receptora, sendo posteriormente expresso. Transformação é uma alteração genética de uma célula como resultado da introdução, uptake e expressão de material genético estranho. É uma técnica frequentemente utilizada em biologia molecular. Por exemplo, a produção de milho trangénico requer a inserção de nova informação genética no genoma do milho, utilizando mecanismo.

32 Transformação É um processo no qual DNA livre é incorporado e assimilado por uma célula receptora, sendo posteriormente expresso. Ligação do DNA de dupla cadeia à membrana externa por uma DNA binding protein Entrada de uma das cadeias e degradação da outra por uma nuclease A cadeia de DNA é ligada a proteínas específicas, e ocorre recombinação entre regiões homologas do cromossoma, mediada por RecA. Célula transformada

33 Transformação Célula incapaz de crescer em Ampicilina Gene Amp r DNA Cromossómico Célula Competente Amp Célula capaz de crescer em Ampicilina Amp

34 Transformação

35 Transformação Transfecção Bactérias podem ser transformadas com DNA extraído de vírus que infectam bactérias Utilizada para estudar os mecanismos de transformação e recombinação Algumas espécies de procariotas são naturalmente transformáveis. Frequência de transformação é de 10-3 para a maioria das espécies Competência induzida artificialmente Tratamento das células com soluções concentradas de cálcio que tornam as membranas mais permeáveis ao DNA de dupla cadeia plasmídeos (biotecnologia) Na electroporação as células são sujeitas a um campo eléctrico que induz a abertura de pequenos poros nas membranas. Quando moléculas de DNA estão na proximidade desses poros são assimiladas.

36 Transducção É um processo no qual DNA é transferido de célula para célula utilizando um vírus como veículo transportador -Bacteriófago Lisogénico Lítico

37 Transducção Generalizada O DNA derivado de qualquer porção do genoma do hospedeiro substitui o DNA viral, virtualmente qualquer gene pode ser transferido. Síntese de DNA e proteínas virais temperate ou virulente Vírus DNA do hospedeiro incorporado

38 Transducção Generalizada A qt de DNA transportado depende do tamanho do capsídeo: p.e. o fago P11 de Samonella typhymurium transporta em média 1% do genoma da bactéria

39 Transducção Especializada Ocorre apenas em vírus temperate, na qual genes do hospedeiro localizados nas vizinhanças dos locais de ligação dos vírus são transferidos. Quando uma célula é infectada pelo fago lambda, o seu genoma é integrado num local específico do genoma do hospedeiro.

40 Transducção Especializada

41 Transposable elements Transposões são elementos móveis do genoma que não possuem a capa protéica que os vírus possuem, sendo dependentes da célula hospedeira e confinados a multiplicarem-se dentro do limite da mesma célula. Estes transposões foram observados pela primeira vez em milho por Barbara McClintock, pelo qual recebeu o prémio Nobel em 1983.

42 Transposable elements Durante esse processo podem causar mutações e alterar a quantidade de DNA no genoma. Transposões são também chamados de "jumping genes" ou "mobile genetic elements". Transposição é o processo pelo qual um gene se move num cromossoma (considerado um evento raro, sendo os genes de um organismo relativamente estáveis)

43 Transposable elements As suas extremidades são constituídas por sequencias identicas, não codificantes, mas em ordem reversa uma em relação à outra. Essas repetições invertidas servem para marcar as extremidades da sequência a ser transposta (sinais para as transposases) e também funcionam no processo de transposição. Na presença da enzima transposase, deslocam-se no cromossomo ou muda de cromossomo numa mesma célula. Transposases são as integrase que iniciam a transposição

44 Transposable elements Transposable elements (elementos genéticos especiais) insertion sequences transposões vírus Transposase Inverted terminal repeats + simples, não transportam informação genética para além da necessária para se moverem insertion sequences Transportam genes, resistência, conjugativos transposão

45 Transposable elements Mecanismos Transposase- reconhece, corta e liga o DNA Transposable elements Alvo

46 Transposon Mutagenesis inserção de um Transposable element dentro de um gene - Mutação

47 Plasmídeos Plasmids are (typically) circular double-stranded DNA molecules that are separate from the chromosomal DNA. They usually occur in bacteria, sometimes in eukaryotic organisms (e.g., the 2- micrometre-ring in Saccharomyces cerevisiae). Their size varies from 1 to over 400 kilobase pairs (kbp). There are anywhere from one copy, for large plasmids, to hundreds of copies of the same plasmid present in a single cell.

48 Plasmídeos São elementos genéticos que se replicam independentemente do cromossoma do hospedeiro Codificam genes não essenciais Muito mais pequenos que cromossomas e podem mover-se horizontalmente dentro e entre espécies A maioria é de cadeia dupla circular com 1/20 do tamanho de um cromossoma Uma célula pode ter + do que 1 cópia de um mesmo plasmídeo Uma célula pode ter + do que 1 tipo de plasmídeo copy number Moléculas de plasmídeo/célula

49 Plasmídeos Replicação Bidireccional semelhante ao mecanismo de replicação dos cromossomas (origem de replicação, formação de uma bolha de replicação, replicação bidireccional) Unidireccional Rolling circle mechanism idêntico ao mecanismo de replicação do fago φx174 (gera-se um intermediário de cadeia simples, sendo por x designados por plasmídeos de cadeia simples)

50 Plasmídeos Incompatibilidade Plasmídeos incompativeis existem grupos de plasmídeos incompatíveis entre si, mas que convivem com outros grupos. Plasmídeos incompativeis entre si, possuem mecanismo de regulação da replicação muito semelhantes, sendo parentes entre si. Uma célula pode possuir vários tipos de plasmídeos, mas estes não podem ser semelhantes entre si, já que têm que ser compatíveis.

51 Plasmídeos Epissomas Curing Plasmídeos que possuem a capacidade de se integrarem no cromossoma, e nessa condição a sua replicação é controlada pelo cromossoma Por x os plasmídeos podem ser eliminados das células hospedeiras, por inibição da sua replicação Transposons Plasmídeo F Fertility É uma molécula de DNA circular com 99,159 pb Pode funcionar como um epissoma tra - conjugação Replicação e segregação

52 Plasmídeos Significado Biológico Pode ter uma profunda influência no fenótipo celular Por x codificam propriedades fundamentais para a célula (p.e. interacção entre Rhizobium e plantas) Podem transportam qualquer tipo de genes, desde que não interfiram com a sua replicação

53 Plasmídeos Significado Biológico Sulfonamida Streptomicina Plasmídeos que conferem resistência a antibióticos ou a inibidores de crescimento Mercúrio Importante significado em termos médicos, já que estirpes resistentes a antibióticos constituem um risco agravado em casos de doença, e transmitem muito facilmente essa resistência a estirpes sensíveis, por contacto directo. Origem replicação conjugativa Tetraciclina Cloranfenicol Estes genes codificam proteínas que inactivam o antibiótico ou o seu efeito, ou o seu uptake pela célula.

54 Plasmídeos Significado Biológico Toxinas e virulência Capacidade de um microrganismo aderir e colonizar locais específicos no hospedeiro Formação de substâncias que causem danos ao hospedeiro (p.e. toxinas, enzimas,etc) Transportadas em plasmídeos p.e. E. coli, Yersinia Bactericidas São agentes produzidos por muitas bactérias que inibem ou matam espécies próximas ou mesmo estirpes da mesma espécie

55 Plasmídeos vectores de clonagem Pequeno tamanho (facilita o isolamento e manipulação) Origem de replicação independente Múltiplo copy number Marcadores selectivos (resistência a antibióticos) Multiple cloning site Insertional inactivation

56 Probably the greatest strength of molecular biology is the ability to manipulate genetic material, commonly called genetic engineering. Specific fragments of DNA may be isolated, cut into discrete pieces by the action of restriction endonucleases, and rejoined by the action of DNA ligase to create novel genes and other genetic constructs. This technology allows scientists to study the activity of genes to understand their function. One of the applications of this technology is the potential to treat genetic diseases, such as cancers, by gene replacement

57 Enzimas de restricção Reconhecem sequências específicas de DNA, de 4 a 6 pb e clivamnas Endonucleases do tipo II que cortam ambas as cadeias de DNA Engenharia Genética Função: proteger a célula destruindo o DNA de fagos após a sua entrada.

58 Enzimas de restricção EcoRI Qd as duas cadeias são separadas contêm ssdna complementares Produção de moléculas de DNA recombinates Palindrómicas Annealing das extremidades complementares e ligação covalente ligase

59 Enzimas de restricção

60 Enzimas de restricção Restricção Electroforese Purificação de fragmentos Clonagem Hibridação

61 Clonagem Molecular Isolar grandes quantidades de um gene específico, ou de um fragmento de cromossoma, na forma pura Deslocar o gene, ou a região, desejado do grande e complexo genoma para um menor e mais simples Isolamento e fragmentação do DNA DNA genómico enzimas de restricção mistura de fragmentos; Ligação dos fragmentos a um vector de clonagem - ligação por uma ligase das extremidades complementares; Transformação do vector num hospedeiro replicação do vector Biblioteca genómica

62 Clonagem Molecular GPF GPGS GPGP GGH/GPGH DNA clivado por enzimas de restricção GPF GPGP GGH/GPGH Vector clivado por enzimas de restricção Annealing e ligação das sequências complementares de DNA

63 Sequênciação de DNA The DNA to be sequenced is prepared as a single strand. This template DNA is supplied with a mixture of all four normal (deoxy) nucleotides in ample quantities datp dgtp dctp dttp a mixture of all four dideoxynucleotides, each present in limiting quantities and each labeled with a "tag" that fluoresces a different color: ddatp ddgtp ddctp ddttp DNA polymerase I

64 Sequênciação de DNA

65 Sequênciação de DNA Geram fragmentos de DNA que terminam em cada uma das 4 bases que são radioactivas. Electroforese dos fragmentos Fragmentos com uma base de diferença são separados Autorradiografia Maxam e Gilbert Químicos que quebram o DNA preferencialmente em cada um dos nucleótidos Sanger A sequência é determinada pela produção de uma cópia de cadeia simples, utilizando uma DNA polimerase

66 Sequênciação de DNA Maxam e Gilbert

67 Sequênciação de DNA Sanger

68 Síntese de DNA primers