DESENVOLVIMENTO DE PRODUTO LÁCTEO PROBIÓTICO A BASE DE KEFIR

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1 UNIVERSIDADE TIRADENTES UNIT PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM ENGENHARIA DE PROCESSOS - PEP DESENVOLVIMENTO DE PRODUTO LÁCTEO PROBIÓTICO A BASE DE KEFIR Autor: Jackeline Andrade Gama Orientadores: Dr. Álvaro Silva Lima Dr a. Cleide Mara Faria Soares ARACAJU, SE - BRASIL JUNHO DE 2011

2 DESENVOLVIMENTO DE PRODUTO LÁCTEO PROBIÓTICO A BASE DE KEFIR Jackeline Andrade Gama DISSERTAÇÃO SUBMETIDA AO PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM ENGENHARIA DE PROCESSOS DA UNIVERSIDADE TIRADENTES COMO PARTE DOS REQUISITOS NECESSÁRIOS PARA A OBTENÇÃO DO GRAU DE MESTRE EM ENGENHARIA DE PROCESSOS Aprovado por: Prof. Dr. Álvaro Silva Lima Universidade Tiradentes Profa. Dra. Cleide Mara Faria Soares Universidade Tiradentes Profa. Dra. Luciana Cristina Lima de Aquino Universidade Federal de Sergipe Prof. Dr. Daniel Pereira da Silva Universidade Tiradentes ARACAJU, SE - BRASIL JUNHO DE 2011

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4 UNIVERSIDADE TIRADENTES UNIT PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM ENGENHARIA DE PROCESSOS - PEP DESENVOLVIMENTO DE PRODUTO LÁCTEO PROBIÓTICO A BA DE KEFIR Autor: Jackeline Andrade Gama Orientadores: Dr. Álvaro Silva Lima Dr a. Cleide Mara Faria Soares ARACAJU, SE - BRASIL JUNHO DE 2011

5 FICHA CATALOGRÁFICA

6 Ninguém pode ser escravo de sua identidade: quando surge uma possibilidade de mudança é preciso mudar. Elliot Gould vi

7 Agradecimentos Aos professores Álvaro Silva Lima e Cleide Mara Faria Soares, por ter propiciado todas as condições para realização deste projeto e pela competente orientação no seu desenvolvimento. A todos os funcionários e professores do ITP que, de um modo ou de outro, são parte deste trabalho em especial Rone, Alisson e Arthur por todo o apoio. Aos colegas conquistados durante esses dois anos de conhecimento. Aos meus pais, Paulo e Nide, e minhas irmãs Ju e Keylla e meu irmão Thiago, pelo incentivo, pela confiança e pelo entusiasmo de sempre. Ao meu noivo Alexandre, por todo incentivo e companheirismo. A DEUS, razão de nossa existência e força essencial para a caminhada da vida, sem nada seria possível. A Universidade Tiradentes e ao Órgão de fomento FINEP/SEBRAE, pelo apoio ao tema desta dissertação. vii

8 Resumo da Dissertação apresentada ao Programa de Pós-graduação em Engenharia de Processos da Universidade Tiradentes como parte dos requisitos necessários para a obtenção do grau de Mestre em Engenharia de Processos. DESENVOLVIMENTO DE PRODUTO LÁCTEO PROBIÓTICO A BASE DE KEFIR Jackeline Andrade Gama Neste trabalho foram determinadas as condições de processo para obtenção de um produto lácteo probiótico e funcional, utilizando como cultura starter, os grãos de kefir. Aplicou-se a metodologia de planejamento de experimentos para otimizar o processo. Foram realizados dois planejamentos fatoriais completos 2³ com três pontos centrais. No primeiro delineamento experimental a variável resposta foi a viscosidade utilizando os seguintes parâmetros: influência da concentração do leite em pó (X 1 ), da temperatura (X 2 ) e da concentração dos grãos de kefir (X 3 ) no processo de fermentação de leite de vaca utilizando grãos de kefir. No segundo planejamento experimental foram mantidas as variáveis independentes em condições experimentais similares; e foram expandidas as variáveis dependentes (viscosidade, células lácticas viáveis, ph e acidez). Após a seleção da melhor região do processo foi realizada a análise sensorial para os atributos aparência, aroma, sabor, textura e impressão global, bem como a intenção de compra do produto desenvolvido. A melhor condição de processo obtida para a produção de um produto com alta viscosidade e com alto potencial probiótico foi: 12,5% de leite em pó, 10% de grãos de kefir a 45 C, obtendo uma viscosidade de cp, ph 3,53 e 1,83x10 9 UFC/mL de bactérias láticas em 24 h de fermentação. Palavras-Chave: Kefir; produto lácteo fermentado; leite; planejamento de experimento. viii

9 Abstract of Dissertation presented to the Process Engineering Graduate Program of Universidade Tiradentes as a partial fulfillment of the requirements for the degree of Master of Science (M.Sc.) DAIRY PRODUCT DEVELOPMENT BASED PROBIOTIC KEFIR GRAINS This work were determined the process conditions for obtainment of the probiotic milk product and functional, using as starter culture, kefir grains. The tool used to select the best region of the process was the methodology of experimental design. Two factorial design with three full 2³ central points were performed. In the first experiment the response variable was the viscosity using the following parameters: the influence of the concentration of milk powder (X 1 ), temperature (X 2 ) and the concentration of kefir grains (X 3 ) in the process of fermentation of cow milk using kefir grains. In the second experimental design were maintained the independent variables in similar or others conditions, and expanded to the dependent variable, such as: viscosity, lactic viable cells, monitoring the ph value and acidity of the medium in the different experiments. After to select the best region of the process was sensory evaluation was conducted with intent of the purchase and acceptance of the following parameters: appearance, aroma, flavor, texture, the best process condition obtained for the production of a product with high viscosity and high potential probiotic was: 12.5% milk powder, 10% kefir grains at temperature of 45 C, obtained has viscosity of 2840 cp, ph 3.53 and 1.83 x10 9 CFU / ml of lactic acid bacteria in 24 h fermentation. Keywords: Kefir, fermented milk product, milk, experimental design. ix

10 SUMÁRIO 1. INTRODUÇÃO REVISÃO BIBLIOGRÁFICA... ERRO! INDICADOR NÃO DEFINIDO. 2.1 EMULSÃO... ERRO! INDICADOR NÃO DEFINIDO Tipos de emulsões... Erro! Indicador não definido Mecanismos envolvidos na estabilização das emulsões... Erro! Indicador não definido. Repulsão Eletrostática...Erro! Indicador não definido. Estabilização Estérica...Erro! Indicador não definido. Efeito de Gibbs-Marangoni...Erro! Indicador não definido. 3. MATERIAIS E MÉTODOS EXPERIMENTAIS RESULTADOS E DISCUSSÕES ANÁLISES E ENSAIOS EXPERIMENTAIS... ERRO! INDICADOR NÃO DEFINIDO Caracterização do petróleo e água produzida... Erro! Indicador não definido. 5. CONCLUSÕES E PERSPECTIVAS REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICA x

11 LISTA DE FIGURAS Figura Fotografia eletrônica de bifidobactérias...20 Figura Aspecto dos grãos de Kefir...22 Figuras Fluxograma geral da fabricação de produtos lácteos...24 Figura Molécula do kefiran...29 Figura Fluxograma do processo tradicional de fabricação de kefir...34 Figura Fluxograma do processo industrial de fabricação de kefir...35 Figura Produtos a base de grãos de kefir comercializados por uma única empresa, a DMJ...41 Figura Ficha de avaliação pelo método da aceitação...46 Figura Perfil de viscosidade nas diferentes velocidades angulares testadas...51 Figura Diagrama de Pareto no tempo de 6 h para a viscosidade...54 Figura Perfil do crescimento relativo de células láticas (N/No) para ensaios contendo 10% de grãos de kefir; temperatura de 25ºC (Exp 1 e 2) e 45ºC (Exp 3 e 4) e diferentes concentrações de leite em pó...59 Figura Perfil do crescimento relativo de células láticas (N/No) para ensaios contendo 10% de grãos de kefir; temperatura de 25ºC (Exp 5 e 6) e 45ºC (Exp 7 e 8) e diferentes concentrações de leite em pó...59 Figura Perfil do crescimento relativo de células láticas (N/No) para as condições do ponto central contendo 7,5% de grãos de kefir; temperatura de 35ºC e concentração de leite em pó de 6,25%...60 Figura Diagrama de Pareto no tempo de 24 h para o crescimento de bactérias láticas...63 Figura Perfil da viscosidade para ensaios contendo 10% de grãos de kefir; temperatura de 25ºC (Exp 1 e 2) e 45ºC (Exp 3 e 4) e diferentes concentrações de leite em pó...66 Figura Perfil da viscosidade para ensaios contendo 10% de grãos de kefir; temperatura de 25ºC (Exp 5 e 6) e 45ºC (Exp 7 e 8) e diferentes concentrações de leite em pó...66 Figura Perfil da viscosidade para as condições do ponto central contendo 7,5% de grãos de kefir; temperatura de 35ºC e concentração de leite em pó de 6,25%...67 Figura Perfil de ph para ensaios contendo 5% de grãos de kefir; temperatura de 25ºC (Exp 1 e 2) e 45ºC (Exp 3 e 4) e diferentes concentrações de leite em pó...68 Figura Perfil de ph para ensaios contendo 10% de grãos de kefir; temperatura de 25ºC (Exp 5 e 6) e 45ºC (Exp 7 e 8) e diferentes concentrações de leite em pó...69 xi

12 Figura Perfil de ph para as condições do ponto central contendo 7,5% de grãos de kefir; temperatura de 35ºC e concentração de leite em pó de 6,25%...69 Figura Percentual de intenção de compra para os fermentados formulados e o comercial. A eu certamente compraria, B eu provavelmente compraria, C não sei se compraria, D provavelmente não compraria e E certamente não compraria...75 xii

13 LISTA DE TABELAS Tabela Composição do leite bovino...17 Tabela Características fisiológicas e bioquímicas das bifidobactérias e dos lactobacillus...21 Tabela Principais grupos e espécies de microorganismos presentes nos grãos de kefir..23 Tabela Características do iogurte e do Kefir...28 Tabela Composição do Kefir...31 Tabela Diversos modos de obtenção de produtos lácteos...37 Tabela Condições para o planejamento de experimento prévio...43 Tabela Condições para a segunda matriz de planejamento...44 Tabela Composição centesimal do leite fornecido pela empresa e alguns disponíveis no mercado...48 Tabela Resultados do planejamento fatorial 2 3 com três pontos centrais empregando os parâmetros para os tratamentos analisados no tempo de 6h...50 Tabela Efeitos principais e secundários dos fatores leite em pó, temperatura e kefir sobre a viscosidade...52 Tabela Análise de variância para a viscosidade do iogurte obtida pelo processo fermentativo...53 Tabela Composição centesimal do fermentado do ensaio Tabela 5.6 Resultados do planejamento fatorial 2 3 com três pontos centrais empregando os parâmetros concentração de leite em pó, temperatura e concentração de grãos de kefir em fermentação de 24h e variáveis respostas concentração de células viáveis e viscosidade...56 Tabela Resultados do planejamento fatorial 2 3 com três pontos centrais empregando os parâmetros para os tratamentos analisados em diferentes tempos, cuja variável resposta são células viáveis...57 Tabela Valores para a cinética de crescimento de células láticas no processo de fermentação utilizando grãos de kefir...60 Tabela Efeitos calculados para avaliação do perfil de crescimento das bactérias láticas...61 Tabela Resultados do planejamento fatorial 2 3 com três pontos centrais empregando os parâmetros para os tratamentos analisados para a viscosidade no tempo 24 horas...64 xiii

14 Tabela Efeitos principais e secundários dos fatores leite em pó, temperatura e kefir sobre a viscosidade...64 Tabela Análise de Variância para ajuste do modelo proposto que representa a viscosidade...65 Tabela Perfil de ph para o desenvolvimento de um produto para os tratamentos analisados em diferentes tempos...68 Tabela Comparação da composição centesimal da bebida kefir formulada (12,5% de leite em pó, 10% grãos de kefir e 45 C) com a literatura...71 Tabela Teores de colesterol do leite e da bebida láctea...71 Tabela Composição mineral dos produtos láteos produzidos...72 Tabela Composição mineral dos produtos láteos encontrados na literatura...73 Tabela Notas sensoriais de aceitação para a bebida kefir e o iogurte comercial...74 xiv

15 Capítulo 1 1. INTRODUÇÃO Há uma nova tendência das indústrias de alimentos em produzirem iogurte e leites fermentados funcionais. A aceitação destes produtos pela população é motivada pelo excelente valor nutritivo, o que provoca um crescimento potencial, dos produtos probióticos. A indústria de laticínios está empenhada em aumentar a sua competitividade no segmento de produtos funcionais, pois necessita se adaptar as tendências de mudanças em um mercado consumidor exigente, que se modifica rapidamente, além de ter que manter a liderança tecnológica nas indústrias (THAMER; PENNA, 2005). De acordo com a Associação Brasileira das Indústrias de Alimentos (ABIA, 2009), o mercado mundial de alimentos funcionais movimentou, em 2005, em torno de US$ 60 bilhões, tendo como principais mercados a Europa, Japão e Estados Unidos. Estima-se que só nos Estados Unidos a movimentação financeira foi de US$ 15 bilhões. No Brasil, em 2005, o mercado de funcionais foi avaliado em US$ 600 milhões. Os produtos light e diet, disponíveis no mercado desde o início de 1990, atingiram vendas anuais ao redor de US$ 4 bilhões, em Deste montante, o mercado de produtos funcionais representou 14% e na indústria de alimentos 0,8%. Deste modo, juntos esses produtos (diet, light e funcionais) somam 6,3% do volume de vendas da indústria brasileira de alimentação. Essa explosão de interesse dos consumidores em consumir alimentos ou componentes alimentares fisiologicamente ativos, também denominados alimentos funcionais, é justificada pela necessidade de melhoria da saúde. No tocante aos produtos lácteos funcionais, o Estado de Sergipe apresenta apenas uma pequena parcela destes produtos diferenciados, apesar de uma significativa bacia leiteira, com uma produção anual de aproximadamente de 252 mil litros de leite em 2007 (IBGE, 2009). Há atualmente 22 laticínios instalados na região, sendo realizados diversos projetos de investimentos em desenvolvimento de tecnologias em processos produtivos de derivados de leite. Alimentos funcionais, são aqueles produtos alimentícios ou ingredientes que, além das funções nutricionais básicas, quando consumidos como parte da dieta, produzem efeitos metabólicos, fisiológicos e/ou benéficos à saúde. Estes alimentos devem ser seguros para o consumo sem que haja a necessidade de supervisão médica. E sua eficácia e segurança devem 10

16 ser asseguradas por estudos científicos. Já os alimentos probióticos são alimentos que contém microorganismos vivos que beneficiam o organismo, melhorando a microflora intestinal. Os probióticos têm sido usados por algum tempo e estão disponíveis em alguns produtos alimentares, como leites fermentados e alguns tipos de iogurtes (ANTUNES, 2007; GOMES e MALCATA, 1999). Os principais microorganismos utilizados para a produção de produtos lácteos probióticos são: Lactobacillus acidophillus, Bifidobacterium spp., Lac. casei subespécie casei biovar shirota, Lac. GG straim e os grãos de Kefir que é um consórcio microbiano de bactérias láticas acéticas e leveduras (ZACARCHENCO e MASSAGUER-ROIG, 2006). Esses micro-oganismos utilizados para a elaboração de probióticos utilizam em sua maioria como substrato os constituintes do leite (vaca, cabra, búfala, soja, etc.), podendo ser utilizado alguns tipos de aditivos como espessante (leite em pó, amido, goma xantana), aromatizantes, saborizantes, corante. Na padronização do leite para produção dos produtos lácteos são normalmente adicionados os seguintes espessantes para aumentar o teor de sólidos totais no leite: leite em pó: leite concentrado, proteínas lácteas, amidos ou amidos modificados. O uso destes espessantes é regulamentado pelo Ministério da Agricultura no Regulamento Técnico de Padrão Identidade e Qualidade para Leites Fermentados. Neste contexto, a fermentação é o processo no qual os micro-organismos são inseridos em biorreatores em batelada para obtenção do produto lácteo (iogurte, bebida láctea, kefir, queijo). De acordo com a literatura, o alimento denominado probióticos para diferentes derivados do leite deve conter no mínimo 10 7 células viáveis/ grama ou por ml. A dose terapêutica mínima diária recomendada é de 10 5 células viáveis/ grama ou ml (HAULY et al., 2005). Atualmente, dentre as bebidas lácteas comercializadas mundialmente o consórcio microbiano kefir é bastante utilizada nos países da Europa Oriental e Ocidental. A bebida láctea nestes países é comercializada como o mesmo nome que o consócio microbiano, kefir. Portnto, kefir é também definido como o produto resultante da fermentação do leite por grãos de kefir (ORDONEZ, 2005). Contudo, no Brasil e nos demais países da América Latina ainda não são comercializados em grande escala a bebida láctea kefir. Apesar da potencialidade de mercado deste produto, possivelmente devido às condições climáticas a padronização do processo ainda não foi realizada para atender as boas práticas de fabricação na indústria. Por 11

17 fim, a proposta deste trabalho foi à avaliação das condições do processo fermentativo para a produção de kefir. 12

18 Capítulo 2 2 OJETIVOS 2.1. Objetivo Geral O presente trabalho teve como objetivo o desenvolvimento do processo fermentativo para a obtenção de um produto lácteo probiótico utilizando grãos de kefir Objetivos Específicos Os objetivos específicos foram: (i) (ii) (iii) (iv) Caracterizar o leite a ser utilizado como matéria prima; Otimizar as condições de fermentação para a produção da bebida láctea utilizando grãos de kefir; Caracterizar físico-químicamente o leite a bebida láctea obtida no processo fermentativo, e; Realizar a análise sensorial das bebidas lácteas obtidas na região otimizada no processo fermentativo. 13

19 Capítulo 3 3. REVISÃO BIBLIOGRAFICA Nesta revisão bibliográfica será abordado os diferentes temas relacionados ao desenvolvimento de produtos lácteos obtidos a partir do processo fermentativo utilizando kefir Leite O leite é um dos mais completos alimentos, contém uma grande variedade de nutrientes essenciais ao crescimento, desenvolvimento e manutenção de uma vida saudável. Rico em proteínas, energia e minerais, como mostra a Tabela 3.1 para leite bovino. A composição do leite pode variar de acordo com os seguintes fatores: raça, período de lactação, alimentação, saúde, período de cio, idade, características individuais, clima, espaço entre as ordenhas e estação do ano. O leite deve ter o aspecto liquido, homogêneo, formando uma camada de gordura na superfície quando deixado em repouso. Não pode conter substâncias estranhas, devendo este sempre limpo (VERRUMA e SALGADO, 1994). Tabela 3.1: Composição do leite bovino Componentes Composição 1 Composição 2 Composição 3 Água (%) 87,0 87,5 88 Gordura (%) 3,5 5,5 3,6 3,7 Proteínas (%) 3,1 3,9 3,6 3,7 Lactose (%) 4,9 5,0 4,6 4,7 Sais Minerais (%) 0,7 0,7 0,7 Fonte: 1 ORDONEZ, 2005; 2 FIRJAN, 2008; 3 VERRUMA e SALGADO, O leite fresco possui um sabor levemente adocicado e agradável, devido essencialmente a alta quantidade de lactose. Além disso, os outros elementos do leite, inclusive as proteínas que são insípidas, participam de alguma forma, direta ou indireta, na sensação de sabor. Pode ocorrer mudança no sabor do leite devido a várias causas, no qual estas estão relacionadas fundamentalmente ao manejo dos animais e como o leite é processado, pois mesmo depois da pasteurização e embalagem, o leite ainda pode absorver sabores indesejáveis. O teor de 14

20 gordura também influencia no sabor do leite, pois, normalmente, quanto maior o teor de gordura mais saboroso o leite será (VENTURINI et al., 2005). O leite possui odor suave, levemente ácido, e lembra mais ou menos o animal que o produziu e ele recém-ordenhado tem um odor relacionado ao ambiente de ordenha, que desaparecem logo depois. Os principais elementos que influenciam o odor do leite são provenientes de alimentos, meio ambiente, utensílios que entram em contato com o leite e microrganismos (FIRJAN, 2008). Odores desagradáveis do leite podem ser eliminados durante a pasteurização, quando o produto passar por um equipamento denominado aerador. Neste equipamento o leite levemente aquecido é turbilhonado de tal forma que as substâncias voláteis que conferem odor desagradável sejam evaporadas. A cor característica do leite (branco-amarelada opaca) é devido, principalmente, à dispersão da luz pelas micelas de caseína, sendo que glóbulos de gordura dispersam a luz, mas pouco contribui para a cor branca do leite. A cor amarelada do leite e devido a substancias lipossolúveis (caroteno e a riboflavina) (ORDONEZ, 2005). Os produtos lácteos são produtos oriundos do leite como iogurte, leite fermentado, queijo, manteiga entre outros Micro-organismos Utilizados na Fabricação de Produtos Lácteos Probióticos As bactérias são os principais microrganismos utilizados para a fabricação de produtos lácteos dentre elas as Bifidobactérias, os Lactobacillus e os Streptococcus. Destre estas as Bifidobactérias e os Lactobacillus são as mais utilizadas na elaboração de produtos probióticos. Algumas leveduras também são encontradas nos produtos lácteos como é o caso dos grãos de kefir (FERREIRA, 2001). Além dos benefícios nutricionais, as culturas probióticas podem também contribuir para o melhoramento do sabor do produto final, por promover acidificação reduzida durante o tempo de prateleira (GOMES e MALCATA, 1999) Bifidobactérias As bifidobactérias são em geral, caracterizadas por serem microrganismos Grampositivos, não formadores de esporos, desprovidos de flagelos e anaeróbios. Moforlogicamente podem ter várias formas que incluem bacilos curtos e curvados, bacilos com a forma de cacete e bacilos bifurcados. Das 30 espécies conhecidas do gênero Bifidobacterium, uma é utilizada para obtenção de leite fermentado e apresenta uma boa 15

21 tolerância ao oxigênio, ao contrário da maior parte das outras do mesmo gênero. A Figura 3.1 mostra uma imagem das bifidobactérias (FERREIRA, 2001). Possuem um conteúdo elevado de guanina e citosina que varia, em termos molares, de 54 a 67%. São heterofermentativos, ou seja, produzem ácidos acético e lático na proporção molar de 3:2 a partir de 2 moles de hexose, sem produção de CO 2, exceto durante a degradação do gluconato. A enzima chave desta via metabólica fermentativa é a frutose- 6- fosfato fosfocetolase, a qual pode por isso ser usada como marcador taxonômico na identificação do gênero, mas que não permite a diferenciação entre as espécies (GOMES e MALCATA, 1999). Utilizam como fonte de carbono (substrato): glicose, galactose, lactose e frutose. A temperatura de crescimento ótimo dessas bactérias se dá entre os 37 e 41 ºC, ocorrendo máximos e mínimos de crescimento a ºC e ºC, respectivamente. Em relação ao valor do ph, o ponto ótimo é verificado entre 6 e 7, com ausência de crescimento a valores de ph ácidos (4,5-5,0) ou ph alcalinos (8,0-8,5) (GOMES & MALCATA, 1999). Figura 3.1: Fotografia eletrônica de bifidobactérias. Fonte: Lactobacillus Os lactobacilos são geralmente caracterizados como gram-positivos incapazes de formar esporos, desprovidos de flagelos, possuindo forma bacilar ou cocobacilar, e anaeróbios como mostra a Tabela 3.2. O gênero compreende, em torno de 56 espécies oficialmente reconhecidas, as mais utilizadas para fins de aditivo dietético são L. acidophilus, L. rhamnosus e L. casei. O L. acidophilus, o que mais se destaca, é um bacilo gram-positivo com pontas arredondadas, que se encontra na forma de células livres, aos pares ou em cadeias curtas, com tamanho típico de 0,6-0,9 µm de largura e 1,5-6,0 µm de comprimento. Tem como particularidades ser pouco tolerante à salinidade do meio, e ser microaerofílico, com o 16

22 crescimento em meios sólidos favorecido por anaerobiose ou pressão reduzida de oxigênio (GOMES e MALCATA, 1999). As condições ótimas para a sua multiplicação são temperaturas de ºC e valores de ph de 5,5-6,0. O crescimento de L. acidophilu pode ocorrer a 45 ºC, e a sua tolerância em termos de acidez do meio varia entre 0,3 e 1,9 %(v/v) de acidez titulável (GOMES e MALCATA, 1999). Tabela 3.2: Características fisiológicas e bioquímicas das Bifidobactérias e dos lactobacillus. Características Bifidobacterium spp. Lac. acidophilus Fisiologia Anaeróbio Microaerofílico Composição da parede Aminoácido básico tetrapeptídeo Lys-D Asp celular variável, ou omitina ou lisina, vários tipos de transpeptidação Composição fosfolipídio Poliglicerolfosfolipídio e seus lisoderivados, Glicerol alanilfosfatidilglicerol, liso derivados de difosfatidilglicerol Composição base DNA (Mol % guanina + citosina) Configuração ácida lático L D e L Metabolismo de açúcares Heterofermentativo Homofermentativo Fonte: Adaptado de GOMES & MALCATA, Grãos de Kefir Os grãos de Kefir assemelham-se a uma couve-flor, como mostra a Figura 3.2. É um agrupamento gelatinoso polissacarídeo que tem vários micro-organismos em simbiose (leveduras, bactérias ácido láticas, bactérias ácido acético e fungos), e sua complexidade ainda não foi completamente decifrado pela ciência (PLESSAS, et al. 2004; GONCU e ALPKENT, 2005; PRASKEVOPOLOU et al. 2003; GARROTE et al. 1997). 17

23 Figura 3.2: Aspecto dos grãos de Kefir. Fonte: Adaptado de: De acordo com GIACOMELLI (2004) os grãos vistos em microscópio revelam uma estrutura complexa. A composição dos grãos de kefir é formada por: 4,4% de lipídios, 12,1% de cinzas, 45,7% de mucopolissacarídeo, 34,3% de proteínas totais, vitaminas do complexo B, vitamina K, triptofano, cálcio, fósforo e magnésio. Os microrganismos presentes nos grãos de kefir variam de acordo com a sua origem, características da região, processamento, tempo, temperatura e o leite utilizado (FARNWORTH, 2005). Os principais grupos e espécies dos microrganismos encontrados nos grãos de kefir, estão descritos na Tabela 3.3. Estes microrganismos produzem uma grande diversidade de polissacarídeos e carboidratos, como mostra a Tabela 3.4 (SIMOVA, 2002) Produtos Lácteos Leite Fermentado e Iogurte Entende-se por leites fermentados os produtos resultantes da fermentação do leite pasteurizado ou esterilizado, por fermentos lácticos próprios. Já o iogurte, a fermentação se realiza com cultivos protosimbióticos de Streptococcus salivarius subsp. thermophilus e Lactobacillus delbrueckii subsp. Bulgaricus, aos quais pede esta associado, de forma complementar, outras bactérias ácido-lácticas que contribuem para a determinação das características do produto final (AGRICULTURA, IN 46, 2007). O leite acidófilo ou acidofilado é o leite fermentado cuja fermentação se realiza exclusivamente com cultivos de Lactobacillus acidophilus (AGRICULTURA, IN 46, 2007). Os leites fermentados são obtidos por coagulação e diminuição do valor do ph do leite, ou do leite reconstituído, adicionado ou não de outros produtos lácteos. A coagulação ocorre por fermentação láctica, mediante a ação de cultivo de microrganismos específicos. Estes microrganismos devem ser viáveis, ativos e abundantes no produto final, durante o prazo de validade do produto. 18

24 Tabela 3.3: Microrganismos presentes nos grãos de kefir Lactobacilos Acetobacter Leveduras Streptococcos/Lactococcus Lac. acidophilus A. aceti Kluyveromyces lactis Lactococci lactis subsp. Lactis Lac. parakefir SP A.rasens K. marxianus Lc. Lactis var. diacetylactis Nov Lac. lactis - K. bulgaricus Lc lactis subsp Cremoris Lac. casei subsp. Pseudoplantarum - K. fragilis Streptococci salivarius subsp. Thermo. Lac. paracasei - Candida kefir S. lactis subsp. Paracasei Lac. cellobiosus - C. pseudotropicalis Enterococcus cremoris Lac. delbrueckii - C. rancens Leuc. Mesenteroides subsp. Bulgaricus Lac. delbrueckii - C. tenuis - subsp lactis. Lac. fructivorans - Saccharomyces lactis - Lac. helveticus - S. carlsbergensis - subsp. Lactis Lac. hilgardii - S. subsp. Torulopsis - holmil Lac. kefiri - S. cerevisiae - Lac kefiranofaciens Lac. kefirgranum sp. Nov Lac. brevis Lac. casei subsp Rhamnosus Lac. plantarum Fonte: SANTOS e FERREIRA,

25 Tabela 3.4: Polissacarídeos produzidos pelos grãos de kefir Lactobacillus Lac. bulgaricus Lac. bulgaricus Lac. bulgaricus Lac. bulgaricus Lac. helveticus Lac. helveticus Lac. helveticus Lac. helveticus Lac. brevis Lac. brevis Lac. brevis Lac. brevis Lac. thermophilus Lac. thermophilus Lac. thermophilus Lac. thermophilus Lac. Lactis Lac. Lactis Lac. Lactis Lac. Lactis Fonte: Adaptado de SIMOVA, 2002 Polissacarídeo HP d7.02 HP d6.85 HP d4.94 HP d3.97 MP d3.85 MP d3.34 MP12 D MP d1.55 B1 D B2 D B3 D B4 D T d4.71 T d2.93 T12 D T d3.38 C11 D C12 D C13 D C14 D Os leites fermentados envolvem as seguintes categorias de produtos: iogurte, leite acidófilo, kefir, kumys, coalhada e leite fermentado ou cultivado (FERREIRA, 2001). A Figura 3.3 mostra o fluxograma básico para obtenção dos produtos lácteos: iogurte leite fermentado, leite acidófilo, kefir e kumys. Existem duas diferentes tecnologias para a produção de iogurtes: Iogurte Tradicional ou Clássico (iogurte natural integral, fermentado na embalagem), e; Iogurte Batido (fermentado em tanques). O iogurte tradicional tem uma textura mais firme que o iogurte batido, pois no iogurte batido, há a quebra do gel, daí a 20

26 consistência menos firme e cremosa do iogurte batido. O iogurte batido é fermentado na iogurteira em batelada (FERREIRA, 2001). A seguir será descritas as etapas para elaboração de um produto lácteo: Recepção de Matéria-Prima Padronização Pasteurização Açúcar Resfriamento Adição do MO Incubação Agitação / Homogeinização Adição do Aroma / Sabor Resfriamento Análises Figura 3.3: Fluxograma geral da fabricação de produtos lácteos Inicialmente, tem-se a matéria-prima utilizada, o leite, poderá ser em natureza ou reconstituído, pasteurizado ou esterilizado, adicionado ou não de outros produtos de origem láctea, bem como de outras substâncias alimentícias recomendadas pela tecnologia atual de fabricação de leites fermentados, e que não interfiram no processo de fermentação do leite pelos fermentos (cultura starter ) empregados (AGRICULTURA IN 46, 2007; ORDONEZ, 2005). Usualmente, é utilizado o leite de vaca como matéria-prima, no entanto, torna-se cada vez mais comum a utilização de leite de outras espécies (cabra, búfala, ovelha, soja, entre outras), os quais deverão ser, também, passar pelo tratamento térmico de pasteurização (FERREIRA, 2001). 21

27 Na etapa de padronização é realizada em relação ao teor de gordura e ao teor de extrato seco total. Quanto ao teor de gordura, o leite é desnatado até atingir o teor de gordura ideal para a fabricação do produto normalmente de 3,0%. Evaporação de 10-20% do volume do leite provocando um aumento de 1,5-3% de extrato seco. Esta etapa é de extrema importância, especialmente para iogurtes. Um aumento do extrato seco total resulta em um produto mais firme, com menor tendência de separação de soro. Normalmente, utiliza-se leite com extrato seco total de 12-15% (concentrado) e acidez inferior a 20 D (0,2% de ácido láctico). A legislação vigente permite adicionar uma série de produtos considerados como ingredientes opcionais (descritos acima) que podem servir para aumentar o extrato seco do leite e melhorar a textura do iogurte (AGRICULTURA, IN 46, 2007) A pasteurização, a etapa subseqüente, tem como objetivo evitar a competição por bactérias não selecionadas com as bactérias do fermento e, eliminar os microrganismos patogênicos como Salmonella e Campylobacter. O efeito redutor da pasteurização estimula o desenvolvimento do fermento lácteo. Além disso, ele também influi no aumento da viscosidade do iogurte e na obtenção de uma textura adequada. A desnaturação de 80-90% das proteínas do soro (solúveis), obtidas com um binômio de C por 3-5 min, aumenta a firmeza do produto e o rendimento, além de prevenir a separação do soro. Paralelamente, a pasteurização provoca uma redistribuição de íons cálcio, magnésio e fósforo entre as formas solúvel e coloidal, que tende a reduzir o tempo de coagulação (FERREIRA, 2001). É na agitação que ocorre a quebra do gel e a adição do aroma e sabor. Após, o produto é resfriado a uma temperatura inferior a 7 C por 12 a 24 horas antes da comercialização onde ele adquire sabor característico. Em seguida são realizadas análises por uma equipe de controle de qualidade, onde avaliam o produto microbiologicamente e físico-quimicamente. São realizados análises do teor de gordura, ph, acidez, coliformes, fungos e leveduras, contagem de bactérias láticas (ANTUNES, 2007) Kefir A palavra kefir é originada do idioma turco e significa "indolência", estando associada a "sensação boa" ou "prazer". É também conhecida por vários nomes, dependendo da região, tais como quépi, Kippe, kéfir, khaphin, kiaphir, keffir, e kefyr (FERREIRA, 2001). 22

28 De acordo com a Legislação vigente para o Padrão de Identidade Qualidade de Leites Fermentados do Ministério da Agricultura, kefir é o produto resultante da fermentação do leite pasteurizado ou esterilizado por cultivos acidolácticos elaborados com grãos de kefir, Lactobacillus kefir, espécies dos gêneros Leuconostoc, Lactococcus e Acetobacter com produção de ácido lático, etanol e dióxido de carbono (BRITO, 2009). Já a FAO/OMS (2009) define a bebida kefir baseada na composição microbiana dos grãos de kefir (cultura iniciadora ou starter utilizada para produzir kefir): cultura starter preparada de grãos de Kefir, Lactobacillus kefiri e espécies do gênero Leuconostoc, Lacococcus e Acetobacter crescendo em um forte relacionamento específico. Os grãos de kefir constitui de ambas leveduras, as que fermentam a lactose (Kluyveromyces marxianus) e as que não fermentam ( Saccharomyces unisporus, Saccharomyces cerevisiae e Sacharomyces exiguus). Com uma consistência cremosa espessa uniforme, a bebida gerada pela fermentação do leite pelos microrganismos associados aos grãos de kefir, possui um leve gosto ácido que refresca e um aroma moderado de levedura fresca, que se assemelha à bebidas alcoólicas muito leve. Associado à efervescência do gás produzido (CO 2 ), é um produto lácteo sem igual e que possui cerca de 40 combinações aromáticas, podendo ser consumido fresco ou refrigerado (ORDONEZ, 2004). As características sensoriais do kefir diferem daquelas apresentadas pelos iogurte, com relação a presença de uma pequena quantidade de CO 2, álcool e os benefícios do polissacarídeo (kefiran) (OTLES e CAGINDI, 2003). Os números estatísticos da produção e consumo de kefir não são facilmente disponíveis, desde produtos lácteos fermentados, como também não são nem sempre discriminadas em separados por itens como iogurte e kefir (FARNWORTH, 2005). Tanto o kefir quanto o iogurte são produtos lácteos, cultivados de vários tipos de bactérias benéficas. O iogurte contém bactérias benéficas transitórias que mantêm o sistema digestivo limpo, porém o kefir pode colonizar o trato intestinal. O kefir contém diversas bactérias não comumente encontradas nos iogurtes: Lactobacillus, Leuconostoc, Lactococcus, Acetobacter e Streptococcus e contém também leveduras igualmente benéficas, como Saccharomyces, Kluyveromyces Torula. O kefir controla e elimina microrganismos patogênicos destrutivos no corpo (FARNWORTH, 2005; OTLES e CAGINDI, 2003; GARROTE et al. 1997). 23

29 A vantagem mais notável do kefir em relação ao iogurte é a presença do polissacarídeo chamado kefiran que possuem propriedades antiinflamatório e anti-tumoral (GIACOMELLI, 2004; OTES & CAGINDI, 2003; ORDONEZ, 2005).. A Tabela 3.5 faz um comparativo entre o Iogurte e o kefir. Tabela 3.5: Características do Iogurte e do Kefir Característica Kefir Iogurte Microrganismos Grãos de kefir Bactérias ácido láticas Temperatura ótima ( o C) Tempo de fermentação (h) ~ 5 Produto Leite fermentado ácido-álcool, Leite fermentado ácido CO 2, kefiran Origem Cáucaso Bulgária O Kefiran é composto de duas moléculas de monossacarídeos, D-glicose e D- galactose, em proporções iguais. A Figura 2.4 mostra a molécula do kefiran. Kefiran tem demonstrado ter certas qualidades medicinais, sendo útil como alimento funcional para evitar ou controlar algumas doenças comuns do trato intestinal que ocorrem (DMJ Biotech Corp, 2009). Figura 3.4: Molécula do kefiran. Fonte: Os grãos de kefir possui uma dinâmica e complexa microbiota que não foi inicialmente propícia para a produção comercial de um produto uniforme e padronizado, o que levou grupos de pesquisadores, tentar produzir kefir de uma mistura de culturas puras combinada com uma cultura de iogurte de bactérias ácido lácticas e Saccharomyces cerevisiae (um fermento não-lactose) para produzir um leite fermentado com características de kefir (que produzem CO 2 e etanol) sob uma variedade de condições (FARNWORTH, 2005). 24

30 FARNWORTH, (2005) citou também que cientistas produziram uma cultura multistarter com quatro bactérias e duas leveduras isoladas dos grãos de kefir, com o intuito de fabricar a bebida em um processo contínuo. Uma cultura starter foi formada por duas bactérias (Lactobacillus helveticus e Lactococcus lactis subsp. lactis,) e uma levedura (S. cerevisiae) também isoladas dos grãos de kefir e combinado com duas cepas de iogurte (Lactobacillus delbrueckii subsp. Bulgaricus e Streptococcus thermophilus) também foi produzida. A levedura foi acrescentada ao composto da cultura starter com sacarose, quer no início, ou após a fermentação ácido láctica. Ambos os kefirs produzidos, foram encontrados com um elevado número de cocos e lactobacilos viáveis e tinham propriedades químicas e organolépticas semelhantes ao do kefir tradicional. Um kefir comercial também está sendo produzido nos Estados Unidos, utilizando uma mistura de microrganismos definidos em vez de grãos de kefir. Esta mistura da cultura starter, contém: Streptococcus lactis, L. plantarum, Streptococcus cremoris, L. casei, Streptococcus diacetylactis, Leuconostoc cremoris e Saccharomyces florentinus (HERTZLER e CLANCY, 2003). Fermentos em pó contendo bactérias lácticas e leveduras congeladas de grãos de kefir estão disponíveis comercialmente; alguns são complementadas com outros microrganismos para transmitir as características desejáveis do Kefir no produto (FARNWORTH, 2005). É evidente que o produto final, como são produzidos a partir de grãos de kefir, terão um maior número e variedades de microrganismos que a bebida produzida a partir de uma mistura de um pequeno número de culturas puras. O sabor típico do kefir resulta da presença de vários compostos que são produzidos durante a fermentação (BESHKOVA et al. 2003). Kefir produzido a partir de culturas puras não foi bem aceito no Canadá, através de uma análise sensorial exceto as bebidas que possuiam edulcorantes, cerca de 40% das pessoas que degustaram kefir pela primeira vez deulhe uma classificação positiva com relação ao sabor. A adição do sabor, ou modificação do processo de fermentação (por exemplo, além de lactococci, lactobacilos e leveduras) aumentou a aceitabilidade de kefir, em comparação com o Kefir feito tradicionalmente. Compostos como o acetaldeído e acetoína têm recebido uma atenção especial a respeito do seu papel durante a fabricação de kefir devido à contribuição para as características organolépticas, pricipalmente o sabor (GIACOMELLI, 2004; FERREIRA, 2001). 25

31 Tanto o sabor, a viscosidade, a composição microbiológica e físico-químca do kefir podem ser influenciados pela origem e tamanho do inóculo adicionado ao leite, pela agitação, temperatura de processo e a duração do arrefecimento e amadurecimento das fases que suscede a fermentação. (OTLES e CAGINDI, 2003; GARROTE, 1997; ATHANASIADIS, et al. 2004). O kefir é rico em ácido lático, acético e glicônico, álcool etílico, gás carbônico, vitamina B 12 e polissacarídeos. O ácido lático é o princupal metabólito produzido durante a fermentação do kefir, esse processo é capaz de converter de 20 a 50% da lactose em ácido lático, tornando o kefir uma bebida que pode ser consumida por pessoas com tolerancia a lactose A Tabela 3.6 demostra a composição do Kefir (GIACOMELLI, 2004). O ácido lático é considerado um conservante natural, o que torna o kefir um produto biologicamente seguro (GIACOMELLI, 2004). Tabela 3.6: Composição do Kefir Costituinte Valores médios Água 87 Acidez em graus Dornic ( D) 80 (no final da incubação) Proteínas totais (%) 3,4-4,2 Sacarose (%) Mínimo de 4,4 Gordura (%) 0,5 3,0 Matérias albuminóides (%) 3,1 ph 4,2 4,5 Acidez Volátil (ml de NaOH 3,9 Caseína (%) 2,8 Albumina (%) 0,2 Lactose (%) 2,6 3,75 Peptonas (%) 0,06 Ácido Lático (%) 0,7 Álcool (%) 0,23 1 Gás Carbônico (%. v/v) Minerais (%) 0,74 0,8 Diacetil (mg/l) 0,49 Acetoaldeído (mg/l) 1,30 Fonte: GIACOMELLI, 2004 Os benefícios do consumo de kefir são inúmeros, mas os principais são descritos abaixo (OTLES e CAGIDI, 2003; PARASKEVOPOULOU et al., 2003; SAAD et al., 2006): incrementa o valor biológico das proteínas do leite - as proteínas do kefir são parcialmente digeridas e, assim, mais facilmente utilizadas pelo organismo. 26

32 O triptofano, um dos aminoácidos essenciais abundantes no kefir, é conhecido pelo seu efeito relaxante do sistema nervoso; sintetiza ácido láctico, o que diminui a intolerância a lactose e favorece a digestibilidade do leite mesmo para pessoas que sejam sensíveis ao leite de vaca; sintetiza vitaminas do complexo B; aumenta a resistência à infecções; ativa o sistema imunológico - e já foi usado, com sucesso, para ajudar pessoas que sofrem de aids, síndrome de fadiga crónica e herpes; efeito tranquilizador do sistema nervoso beneficia muitas pessoas que sofrem de depressão, distúrbios do sono, entre outras; restabelece e equilibra a flora intestinal - elimina do intestino as bactérias e leveduras prejudiciais, e aumenta a população bacteriana benéfica e protectora; regulador da flora intestinal, podendo ser usado tanto em casos de obstipação quanto diarreia, reduz a flatulência e melhora de uma forma geral todo o sistema digestivo; o efeito de limpeza que exerce em todo o corpo, ajuda a estabelecer o equilíbrio do ecossistema interno, permitindo uma ótima saúde e aumento da longevidade; diminui o risco de câncer, principalmente de cólon; diminui a fração do colesteril LDL. Kefir é o único produto lácteo fermentado produzido a partir de uma mistura de bactérias láticas e leveduras. Apesar de sua antiga origem e consumo em algumas regiões, no Brasil, o consumo é recente e existem poucos estudos brasileiros a respeito dos grãos de kefir e seus derivados. Sabe-se, que um número cada vez maior de benefícios tem sido vinculados a esse alimento e o fato de ser probiótico, pode aumentar ainda mais seu valor agregado. Um produto referido como simbiótico é aquele no qual um prebiótico e um probiótico estão combinados. (OTLES e CAGIDI, 2003; GIACOMELLI, 2004; FARNWORTH, 2005; PARASKEVOPOULOU, 2003; SAAD, 2006; GARROTE, et al. 1997). As embalagens que são utilizadas para o acondicionamento da bebida kefir, devem ser forte suficientes para resistir a qualquer pressão que possa criar (por exemplo, vidro), ou 27

33 flexível o suficiente para conter o volume de gás produzido (por exemplo, de plástico com uma folha de alumínio superior (WITTHUN et al, 2004). Durante o armazenamento prolongado do kefir a baixas temperaturas, a fermentação ácida e o desdobramento de proteínas em aminoácidos cessam, enquanto que a formação de CO 2, álccol e aroma continua a ocorrer (FERREIRA, 2001) Processos Fermentativos Tradicionalmente, o kefir é produzido adicionando grãos de kefir (uma massa de proteínas, polissacarídeos, mesofílica, homofermentativa e heterofermentativa, ácido láctico, estreptococos, lactobacilos termófilos e mesofílicos, ácido acético, bactérias e leveduras) para uma quantidade de leite de 2 a 10%, geralmente 5%, a temperatura ambiente.o processo de fermentação varia de 18 a 24 horas, após esse período os grãos são peneirados e refrigerados para serem utilizados para ouitra inoculação e a bebida é acondicionada 4 C até ser consumida, esse processo de fabricação está descrito na Figura 3.5 (OTLES & CAGINDI, 2003). Leite Cru Arrefecimento (20-25ºC) Inoculação Fermentação h Separação dos Grãos Maturação e Resfriamento 4ºC Estocagem Figura 3.5: Fluxograma do processo Tradicional de fabricação de kefir. Fonte: Adaptado de OTLES e CAGINDI, Há diferentes métodos para obtenção do kefir industrialmente, mas seguem todos os mesmo princípios. Faz-se homogeinização do leite, em seguida, a pasteurização e 28

34 resfriamento do leite e a inoculação com os grãos de kefir que podem variar de 2 a 8%, o tempo de fermentação é de em média 24 horas. A bebida é filtrada e acondicionada em embalagens apropriadas, onde são mantidas por 24 horas a uma temperatura em torno de C (onde vai adquirir as caracteristicas sensoriais) para depois ser estocada (4 C) e comercializada (OTLES e CAGINDI, 2003, FERREIRA, 2001). O fluxograma do processo industrial de fabicação de kefir é demonstrado na Figura 3.6. Durante o período de fermentação do leite pelos grãos de kefir os microrganismos homofermentativos, ácido láctico e estreptococos crescem rapidamente, provocando inicialmente uma queda do ph. Esta queda do ph favorece o crescimento dos lactobacilos, provocando, a diminuição dos estreptococos. A presença de leveduras na mistura, juntamente com a temperatura de processo (21-23,8 C), incentiva o crescimento da produção de aroma pelos microrganismos heterofermentativos, estreptococos (TRANSEK; GORSEK, 2007). Leite Cru Homogeinização Pasteurização Resfriamento Inoculação (2-8%) Fermentação h Separação dos Grãos Embalagem Maturação 12-14ºC, 24h Estocagem 4ºC Figura 3.6: Fluxograma do processo Industrial de fabricação de kefir. Fonte: Adaptado de OTLES & CAGINDI,

35 As espécies que integram o gênero Bifidobacterium conseguem proliferar num meio semi-sintético contendo apenas lactose, aminoácidos, vitaminas, nucleotídeos e alguns minerais. Um dos fatores limitantes para o crescimento dessas bactérias, é a fonte de azoto, que para algumas estirpes poderá estar na forma de amônia enquanto para outras, deverá ser uma fonte orgânica. No que diz respeito ao L. acidophilus, os requisitos em nutrientes necessários para a exibição de taxas razoáveis de crescimento são semelhantes aos das Bifidobacterium: hidratos de carbono como fonte de energia, proteínas e respectivos produtos de degradação, vitaminas do complexo B, derivados dos ácidos nucléicos e minerais. A presença do grupo sulfidrilo em leites enriquecidos com proteínas do soro favorece o crescimento de L.acidophilus. (GOMES & MALCATA, 1999) Durante a produção de kefir, ocorrem quatro modificações importantes: formação de ácido lático, formação de álcool, formação do flavor pelas leveduras, desdobramento parcial da proteína para peptonas e aminoácidos. Essas modificações são ocasionadas devido a temperatura. A formação de CO 2 se dá a temperatura de 5 a15 C, enquanto a fermentação lática se dá de maneira lenta. Ao invés de se escolher uma temperatura média, acidifica-se o meio, mantendo a temperatura de C e em seguida retorna-se para a temperatura de 5-15 C para que haja a produção de álcool e CO 2. As proteínas se desdobram em aminoácidos durante a fermentação lática (TRAMSEK; GORSEK, 2008). A Tabela 3.8 mostra os diversos métos de produção dos produtos lácteos. Nosta-se que apenas um artigo cita a fermentação contínua num bioreator CSTR, pois tradicionalmente a produçãos desses produtos é feita em bioreator por batelada. Para o uso do método contínuohá a necessidade de estudos sobre o sistema desse bioreator na produção de produtos lácteos. 30

36 Tabela: 3.8: Diversos modos de obtenção de produtos lácteos Micro-organismos Condições de Processo Tipo de Reator Produto Fonte Grãos de kefir Fermentação a T=24 C por 24 h, com rotação de 90 rpm, adição de 20 g/l de glucose Bioreator CSTR e bioreator em batelada Kefir Streptococcus thermophilus, Lactobacillus delbruecki subsp. Bulgaricus,Bifidobacterium e Lactobacillus acidophyllus Grãos de kefir Grãos de kefir, Lac. dekbruekii spp bulgaricus, Streptococcus salivarius spp. thermophillus, Lac. lactis spp. lactis, Lac. lactis spp. cremoris Fermentação a T= 42 C até atingir o ph 4,7 4,8, com adição de leite empó, soro de leite em pó, açúcar e fritoligossacarídeos Fermentação a T=30 C por 120 minutos e fabricação de pão tradicional. Fermentação a T=32 C por 90 minutos em seguida fabricação padrão de queijo branco Grãos de kefir Fermentação a T= 30 C por 7 horas ou até o ph atingir entre 3 4,7, em condições aeróbicas Grãos de kefir Fermentação aeróbica T=30 até o ph atingir 4,0. Bioreator em batelada Bebida láctea probiótica GORSEK e TRAMSEK (2008) THAMER e PENNA (2005) Bioreator em batelada Pão PLESSAS et al. (2005) Bioreator em batelada Queijo GONCU e ALPKENT (2005) Bioreator em batelada Bebida láctea ATHANASIADIS et al. (2004) Bioreator em batelada Bebida láctea PARASKEVOPOULOU et al. (2003) 31

37 Continuação da Tabela 3.6 Micro-organismos Condições de Processo Tipo de Reator Produto Fonte Grãos de kefir Fermentação a temperatura Bioreator em batelada Kefir WITTHUHN et al. (2005) ambiente (25 C) por 36 horas. Grãos de kefir Fermentação a uma Bioreator em batelada Bebida láctea OTLES e CAGINDI, (2003) T=30 C até o Ph atingir 4,0, com adição de frutose. Grãos de kefir Fermentação a T=23 C por Bioreator em batelada Kefir ERGÖNÜL et al. (2004). 18 horas com adição de polda de morango Grãos de kefir Fermentanção a Temperatura entre 20 e 25 C por horas Bioreator em batelada Kefir PARASKEVOPOULOU et al. (2003) Bifidobacterium animalis subsp. Lactis (BB12, Madri/Espanha) e Mesophilic Aromatic Culture (MAC CHN-22, Horsholm/Dinamarca), composta por mistura de linhagens contendo Lactococcus lactis subsp. Cremoris, L. lactis subsp. Lactis, Lactococcus lactis subsp. Lactis biovar. Diacetylactis e Leuconostoc mesentoroides subsp. Cremoris Fermentação a T= 21 C por 15 a 20 horas, com adição de sacarose e cucralose. Bioreator em batelada Buttermilk probiótico ANTUNES et al. (2006) 32

38 Continuação da Tabela 3.6 Micro-organismos Condições de Processo Tipo de Reator Produto Fonte Streptococcus thermophilus, Bifidobacterium longum, Lac. acidophilus Fermentação a T= 45 C até o ph atingir 4,7. Streptococcus thermophilus, Lac. Acidophilus, Lac. delbrueckii subsp. bulgaricus Grãos de kefir Fermentação a T=42 C até o ph atingir a 4,7-4,8. Fermentação a temperatura ambiente por 7 dias Bioreator em batelada Iogurte probiótico ZACARCHENCO e MASSAGUER-ROIG (2006) Bioreator em batelada Bebida láctea probiótica THAMER e PENNA. (2006) Bioreator em batelada Bebida fermentada SILVA et al. (2005) 33

39 3.6. Potencial de Mercado No mercado de produtos lácteos, os alimentos funcionais estão se tornando uma realidade, onde muitas empresas estão desenvolvendo linhas de produtos tendo a promoção de benefícios à saúde. Isso se dá ao fato dos consumidores estarem em contínua busca da melhor qualidade de vida com uma alimentação saudável e a prática de atividades físicas (FARNWORTH, 2005). O consumo de kefir no Brasil se dá de maneira artesanal, pois esse produto não é industrializado nem comercializado. Muito popular na Rússia, Hungria, Polônia por muitos anos. Na Rússia, o kefir corresponde a mais de 80% do montante total do leite fermentado consumidos. Também é bem conhecida na Suécia, Noruega, Finlândia e Alemanha, Grécia, Áustria, Israel. Está atualmente disponível nos Estados Unidos, principalmente como uma bebida étnica, e está crescendo em popularidade no Japão. Hoje, o kefir é cada vez mais popular devido aos seus efeitos benéficos (ERGÖNÜL, 2004). Kefir é ainda mais familiar para os consumidores na Europa Oriental, embora a produção comercial ocorra agora na América do Norte. No entanto, podem ser encontradas várias patentes relativas a produção comercial mundial de kefir (; GIACOMELLI, 2004). No mercado internacional, se destacam o Actívia Kefir, comercializado na Rússia e Kefir Liberte, no Canadá e França (SANTOS e FERREIRA, 2008). Na Figura 3.7 podemos ver a gama de produtos comercializados por uma única empresa a DMJ Biotech Corp. adiconando os grãos de kefir entre eles temos: requeijão cremoso, kefir dediversos sabores, leite de kefir, fermento, queijo etc. Figura 3.7: Prodtos a base de grãos de kefir comercializados por uma única empresa a DMJ. Fonte: WW :// 1

40 Capítulo 4 4. MATERIAIS E MÉTODOS Nesta seção são apresentados os materiais e a metodologia utilizada neste trabalho visando o desenvolvimento de um produto lácteo probiótico, bem como os métodos analíticos empregados na caracterização do leite fermentado Materiais Os materiais empregados encontram-se especificados a seguir Grãos de kefir Os grãos de kefir, utilizados no desenvolvimento do produto lácteo, foram adquiridos junto à Pastoral da Criança, em Aracaju-Sergipe, e mantidos no Laboratório de Pesquisa em Alimentos do Instituto de Tecnologia e Pesquisa (ITP) em Aracaju-Sergipe Leite e iogurte O leite pasteurizado utilizado como matéria-prima para a produção do produto lácteo fermentado foi proveniente do Laticínio Nativille, em Nossa Senhora da Glória-Sergipe e do Laticínio Coopeagrio, em Porto da Folha-Sergipe Metodologia Experimental O procedimento experimental para o cultivo do grão de kefir, para a preparação do leite fermentado, assim como para a sua caracterização por meio de análise físico-química, microbiológicas e sensorial é apresentado nesta seção. 2

41 Delineamento experimental Para a avaliação das condições do processo fermentativo foi adotada a metodologia do planejamento experimental empregando duas matrizes de 2 3 com 3 repetições no ponto central. O primeiro planejamento avaliou as condições experimentais do processo fermentativo com base nas informações da literatura. As variáveis independentes avaliadas foram: concentração do leite em pó (X 1 ), temperatura (X 2 ) e os grãos de kefir (X 3 ), conforme descrito na Tabela 4.1. Os ensaios foram conduzidos, e a variável resposta selecionada foi a viscosidade do leite fermentado produzido. Os experimentos foram efetuados de maneira randômica por um período máximo de 6h, conforme descritos na literatura para a obtenção convencional do iogurte. Tabela 4.1: Condições para o planejamento de experimento prévio Fatores X 1 : Leite em pó (%) X 2 : Temperatura ( C) X 3 : Grãos de kefir (%) Baseando-se nos resultados obtidos na primeira análise, verificou-se a viabilidade de aplicar uma segunda matriz experimental, neste caso os níveis máximo e mínimo foram modificados (Tabela 4.2). Essa segunda matriz de planejamento experimental, como dito anteriormente, baseou-se no melhor resultado do planejamento preliminar, e expandiu as variáveis respostas para: viscosidade, potencial probiótico, acidez e ph. O processo fermentativo foi conduzido por 24h com amostragem a 0, 6, 18 e 24h como descrito por TRANSEK (2008). 3

42 Tabela 4.2: Condições para a segunda matriz de planejamento Fatores X 1 : Leite em pó (%) 0 6,25 1 2,5 X 2 : Temperatura ( C) X 3 : Grãos de kefir (%) 5 7,5 1 0 Na análise dos resultados do planejamento experimental foi utilizado o programa STATISTICA Processo fermentativo O meio de cultura foi formulado com leite de vaca e espessante (leite em pó), misturados na proporção de cada experimento, pasteurizado (aquecimento a 80 o C por 10 min., e esfriamento rápido). Variaram-se as concentrações de espessante, de grãos de kefir e a temperatura. As fermentações foram realizadas em frascos Erlenmeyers de 500 ml contendo 300 ml de meio, em processo estático Métodos de Análise Os métodos de análise físico-químicas, microbiológicas e sensoriais são descritos de forma suscinta nesse item Caracterização do leite, do kefir e do iogurte As análises físico-químicas foram realizadas segundo a metodologia do Instituto Adolfo Lutz (2005) e constaram dos seguintes métodos: ph (potenciometria), acidez (titulação potenciométrica), lipídios (obtido após hidrólise ácida ácido clorídrico 60%, secagem e extração com éter de petróleo), proteínas (Método de Kjedall), e carboidratos totais calculados em glicose (Método de Lane-Eynon, após a hidrólise em meio ácido sob refluxo por 3h e 30 minutos), cinzas (determinado em forno - mufla a 550ºC) Análise microbiana: qualidade higiênico-sanitária 4

43 A análise microbiológica do leite e do fermentado foi através da utilização do método de determinação do Número Mais Provável (NMP) de coliformes totais e termotolerantes, de cada diluição (10-1 a 10-6) do alimento em estudo. Utilizando cinco tubos contendo 6 ml de caldo lauril sulfato triptose contendo um tubo de Durham invertido, para obter seis séries de cinco tubos. Foi utilizado um tubo controle do meio de cultura e outro do diluente, em seguida a incubação em estufa a C, por 24-48h. Considerando positivos os tubos que apresentarem turvação do meio e/ou produção de gás. A contagem das bactérias foi obtida no produto final utilizando a metodologia descrita por SILVA et al. (1997). Foram realizadas diluições em tubos contendo amostras em água peptonada, em seguida realizou-se o plaqueamento de 1 ml de produto lácteo em placas de petri em Agar de Man Rogosa & Sharpe (MRS), as quais foram incubadas a 30 C por 48 a 72 horas em atmosfera microaerófila Viscosidade As curvas reológicas foram determinadas em viscosímetro Visco Star-r, Modelo v10002, com adaptador para amostras de pequeno volume (200 ml). Utilizando-se spindle número R2 e utilizando a velocidade angular entre 0,5 e 100 rpm permanecendo em torno de 2 min na velocidade sem controle de temperatura. A temperatura inicial das amostras foi de aproximadamente 10 C (TELES e FLORES, 2007) Análise sensorial Os produtos lácteos produzidos foram analisados quanto aos parâmetros sensoriais. A equipe da analise sensorial foi composta por no mínimo por 30 provadores selecionados ao acaso, o que representa o mercado alvo. Foi realizada uma analise sensorial pelo método da aceitação, na qual foram avaliados os parâmetros sensoriais aparência, aroma, sabor, textura e impressão global. Cada provador atribuiu uma nota de acordo com as características dos parâmetros sensoriais analisados. As amostras foram servidas em cabines individuais, os provadores atribuíram uma nota a cada parâmetro analisado de acordo com uma escala hedônica estruturada de 9 pontos, indicando a intenção de compra, como mostra a ficha de avaliação apresentada na Figura

44 Figura 4.1: Ficha de avaliação pelo método da aceitação Análise de colesterol Para a dosagem de colesterol do leite e das bebidas lácteas, foi necessário a derivatização das amostras, da seguinte forma: colocou-se 10 gramas da amostra da bebida láctea a uma solução contendo KOH e etanol, deixando-as por mais 10 minutos a 60ºC e depois adicionou água destilada. Após o resfriamento da amostra, extraiu o sobrenadante com hexano depois da separação das fases. A secagem da amostra foi realizada na presença de atmosfera inerte. A amostra foi dissolvida em fase móvel (acetonitrila:isopropanol 90:10). A curva de calibração (Apêndice A) e a dosagem de colesterol foram realizadas por cromatografia líquida de alta eficiência utilizando o cromatógrafo Pro Star (Varian), detector UV-visível (SPD-10 AVvp) e software (Programa Star Integrator Varian versão 4.5) para o processamento dos dados. A coluna analítica utilizada foi a C18 (150 x 4,6mm x5μ) (Gemini, Phenomenex), mantida a 40ºC em forno com temperatura controlada. As amostras derivatizadas foram injetadas no equipamento. A fase-móvel utilizada foi composta de 90% de acetonitrila e 10% de isopropanol em fluxo de 1,5 ml por minuto, sendo o tempo de análise de 20 minutos. Os cromatogramas foram processados com o comprimento de onda de 210 nm. 6

45 Análise estatística Os dados foram analisados utilizando o STATISTICA 6.0. A análise de ANOVA foi usada para detectar a diferença significativa (p 0,05) entre as amostras. Foram utilizados os testes de Tukey e o de Dunnet para determinar os valores médios significativos. 7

46 Capítulo 5 5. RESULTADOS E DISCUSSÕES Neste capítulo são apresentados e analisados os principais resultados obtidos durante o desenvolvimento do trabalho Caracterização do Leite Neste item são apresentados e descritos os resultados da etapa de caracterização da matéria-prima utilizada na fabricação do fermentado lácteo, o leite. A Tabela 5.1 compara os resultados da composição centesimal do leite fornecido pelas empresas com os dados de composição de leite apresentado pela literatura. O leite utilizado apresentou uma acidez maior do que aquela do leite encontrado comercialmente, e um teor de proteínas inferior ao leite comercial (TORRES et al., 2000). A diferença dos resultados encontrados deve-se possivelmente a raça, idade, período de lactação e alimentação do animal. Tabela 5.1: Composição centesimal do leite fornecido pela empresa e alguns disponíveis no mercado. Constituintes Leite utilizado Leite comercial a ph 6,62 ± 0,00 6,6-6,8 Acidez T.T (mg NaOH) 3,63 ± 0,15 1,82 Umidade (%) 89,06 ± 0,02 87,95 Cinzas (%) 0,69 ± 0,02 0,54 Proteína (%) 1,05 ± 0,03 3,24 Lipídios (%) 0,94 ± 0,03 3,10 Açúcares Redutores (%) 2,17 ± 0,15 - Açúcares Totais (%) 3,6 ± 0,1 2,00 Carboidrato (%) 8,27 5,17 Energia (Kcal/ 100g) 45,74 62 Fonte: a Torres et al. (2000) 8

47 No conteúdo mineral, a porcentagem de cinzas do leite fornecido é cerca de 22% comparado ao leite comercial da literatura. De acordo com Torres (2000), os valores energéticos para o leite comercial são de cerca de 62Kcal/100g. Entretanto, o valor para o leite utilizado neste trabalho fornecido foi inferior em cerca de 26%. As variações observadas foram ocasionadas possivelmente pela composição bromatológica das pastagens dos pontos de referência, considerando que a variação ocasiona direta ou indiretamente desequilíbrio na relação energia/proteína na alimentação do gado e por fim no produto final (GOMES e MALCATA, 1999) Produção de Bebida Láctea Fermentada Nesta seção é apresentada a região ótima dos parâmetros para o processo de fermentação de leite de vaca utilizando grãos de kefir como iniciador do processo. A influência da concentração do leite em pó (X 1 ), da temperatura (X 2 ) e da concentração dos grãos de kefir (X 3 ), foram primeiramente estudada por meio de um planejamento fatorial completo 2³ com três repetições no ponto central, adotando como variável resposta a viscosidade da bebida láctea obtida. A viscosidade foi selecionada como variável resposta, devido ao direcionamento do mercado da região nordeste, onde se supõe que as maiores sensibilidades gustativas do mercado regional, são para produtos lácteos com maior consistência. Na Tabela 5.2 são apresentados os níveis selecionados para cada variável. As variáveis quantitativas foram representadas da seguinte forma: o sinal (+) representa o nível máximo, o sinal (-) o nível mínimo e o sinal (0) o ponto central. Desta forma, a matriz utilizada foi constituída por 11 ensaios, no qual três foram referentes aos pontos centrais. A velocidade angular de 30 rpm aplicada ao spindle do viscosímetro propiciou a melhor determinação da viscosidade do leite, conforme descrito na Figura 5.1 e, por esta razão, foi escolhida para as determinações. A Tabela 5.2 mostra que o aumento da concentração do espessante (leite em pó) propiciou o aumento da viscosidade do leite fermentado, o que esta de acordo com os trabalhos da literatura, que atribui este efeito a compactação da rede de caseína (ÜNAL et al, 2003; KOKSOY e KILICl, 2004). Entretanto, no Experimento 2 que possui a quantidade máxima de leite em pó neste estudo, a viscosidade foi de 45 cp, o que pode ser explicado pelo fato deste ensaio possuir apenas 1% de grãos de kefir. O mesmo ocorre nos experimentos 1 e 3, indicando que a 9

48 concentração de grãos de kefir para a produção da bebida kefir influencia na viscosidade da bebida. Tabela 5.2: Resultados do planejamento fatorial 2 3 com três pontos centrais empregando os parâmetros para os tratamentos analisados no tempo de 6 h Leite em Temperatura Kefir Viscosidade Ordem Experimentos X 1 X 2 X 3 pó (%) ( C) (%) (cp) Cp Ensaio1 Ensaio3 Ensaio4 Ensaio5 Ensaio7 Ensaio9/1 Ensaio9/2 0 0, Rpm Figura 5.1: Perfil de viscosidade nas diferentes velocidades angulares testadas 10

49 A viscosidade do leite fermentado utilizando grãos de kefir variou entre 45 a 187cp, valores superiores com a viscosidade de iogurtes comerciais líquidos (5,38 cp) e consistente (120 cp) encontrados por Teles e Flores (2007). Observa-se que o aumento da concentração de leite em pó e de grãos de kefir no processo fermentativo propicia o aumento da viscosidade do leite fermentado. Já a temperatura tem efeito contrário. A viscosidade aparente dos produtos lácteos diminuiu com o aumento da taxa de deformação (1/s) (Teles e Flores, 2007) indicando comportamento de fluido não Newtoniano, no qual a viscosidade permanece constante com a variação da taxa de deformação (BORWANKAR, 1992). A viscosidade aparente decresce devido ao rearranjo e/ou deformação das partículas, que resulta na diminuição da resistência ao escoamento (RAO, 1994). Alguns autores (PENNA et al., 2001; KOKSOY e KILIC, 2004) observaram que as bebidas lácteas fermentadas apresentam o mesmo tipo de comportamento. Além disso, relataram que o modelo da lei da potência tem sido utilizado na modelagem do comportamento do fluxo desse tipo de produto. A análise dos efeitos principais demonstrou que a concentração de grãos de kefir é significante ao nível de 95% de confiança, pois houve um aumento na viscosidade do produto lácteo. Os demais efeitos, leite em pó e temperatura, foram significantes ao nível de 85% em interação. Os efeitos principais e secundários dos fatores quantidades de leite em pó, temperatura e concentração de grãos kefir sobre a viscosidade estão detalhados na Tabela 5.3 e 5.4, confirmando o que foi apresentado na Figura 5.2 (Diagrama de Pareto), mostrando que a concentração de grãos de kefir é significativa ao nível de 95% de confiança. Tabela 5.3: Efeitos principais e secundários dos fatores leite em pó, temperatura e kefir sobre a viscosidade Variável Independente Estimativa Erro padrão p Média Global 92,90* 6,89* 0,000175* X 1 : Leite em Pó (%) 25,00 16,15 0, X 2 : Temperatura -17,50 16,15 0, X 3 : Kefir (%) 58,00* 16,15* 0,022949* X 1 X ,15 0, X 1 X 3 29,00 16,15** 0,146039** X 2 X 3-28,5** 16,15** 0, ** *Significativo ao nível de 95% de probabilidade. **Significativo ao nível de 85% de probabilidade 11

50 Dentre todos os tratamentos testados, a melhor condição para obter a viscosidade (187cp) foi o ensaio 6, nas seguintes condições: 15g de leite em pó, 35 C e 5% de kefir. Por outro lado, a mínima viscosidade (45 cp) foi obtida no ensaio 2, nas seguintes condições: 15g de leite em pó, 35 C e 1% de kefir, que condiz com a literatura, já que os grãos de kefir crescem melhor à temperatura ambiente e a percentagem normalmente utilizada varia de 8 a 10% de grãos de kefir (FARNWORTH, 2005; FERREIRA, 2001). Tabela 5.4: Análise de variância para a viscosidade do iogurte obtida pelo processo fermentativo Variável Soma Graus de Média Independente quadrática Liberdade Quadrática F** p* X 1 378, ,125 0, , X 2 78, ,125 0, , X ,13* ,125* 9,814688* 0,035089* X 1 X 2 1,12 1 1,125 0, , X 1 X , ,125 3, , X 2 X , ,125 3, , Erro total 3908, ,222 Total SS 20357,64 10 Total (corrigido) = 20357,64. R 2 = 0,80. **F: Teste estatístico de comparação da variância nos ensaios, permitindo a avaliação da qualidade de ajuste. *p: Teste estatístico para estimativa do intervalo de confiança do modelo. 12

51 Figura 5.2: Diagrama de Pareto no tempo de 6 h para a viscosidade De acordo com Teles e Flores (2007), a variável leite em pó apresentou em seus resultados menor influência na viscosidade do iogurte. Embora ambos os ensaios, 6 e 2, contivessem a mesma quantidade de leite em pó, a viscosidade foi diferente Caracterização físico-química e microbiológica da bebida kefir Na Tabela 5.5, encontra-se a composição centesimal do fermentado na melhor condição do planejamento experimental (ensaio 2), considerando que o preferencial do produto obtido é um produto com alta viscosidade, já que se supõe que no estado Sergipe há um maior consumo deste tipo de produto lácteo, ou seja, mais consistente. Segundo a literatura, a produção de ácido lático durante a incubação promove a diminuição do ph do leite de 6,52 (Tabela 5.1) para 5,01 (Tabela 5.5). Porém, não há uma concordância entre os autores, sobre a faixa de ph ideal que o iogurte ou a bebida láctea fermentada deve atingir no final da produção. O valor obtido foi 14% a menos que o obtido por Barbara et al. (2006) no leite fermentado com grãos de kefir. O valor médio de proteína observado foi de 0,62%, cerca de 50% menor do que a quantidade de proteína observada no leite, explicado pela ação dos grãos de kefir no leite, e inferior ao valor mínimo de 1,2%, estabelecido pelo Regulamento Técnico de Identidade e Qualidade de Bebidas Lácteas. 13