MAPEAMENTO FÍSICO DO DNA: UM ALGORITMO UTILIZADO NA INDÚSTRIA DO CORTE E EMPACOTAMENTO

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1 FACULDADE DE TECNOLOGIA DE SÃO JOSÉ DOS CAMPOS FATEC PROFESSOR JESSEN VIDAL DIEGO FERNANDES CARRARO DE MENDONÇA MAPEAMENTO FÍSICO DO DNA: UM ALGORITMO UTILIZADO NA INDÚSTRIA DO CORTE E EMPACOTAMENTO São José dos Campos 2011

2 DIEGO FERNANDES CARRARO DE MENDONÇA MAPEAMENTO FÍSICO DO DNA: UM ALGORITMO UTILIZADO NA INDÚSTRIA DO CORTE E EMPACOTAMENTO Trabalho de Graduação apresentado à Faculdade de Tecnologia São José dos Campos, como parte dos requisitos necessários para a obtenção do título de Tecnólogo em Informática com Ênfase em Banco de Dados. Orientador: ME Fernando Masanori Ashikaga São José dos Campos 2011

3 Dados Internacionais de Catalogação-na-Publicação (CIP) Divisão de Informação e Documentação MENDONÇA, Diego F. M. Mapeamento Físico do DNA: Um algoritmo utilizado na indústria do corte e empacotamento. São José dos Campos, f. Trabalho de Graduação Curso de Tecnologia em Informática com Ênfase em Banco de Dados, FATEC de São José dos Campos: Professor Jessen Vidal, Orientador: ME Fernando Masanori Ashikaga. 1. Áreas de conhecimento. I. Faculdade de Tecnologia. FATEC de São José dos Campos: Professor Jessen Vidal. Divisão de Informação e Documentação. II. Título REFERÊNCIA BIBLIOGRÁFICA MENDONÇA, Diego, F.M. Mapeamento Físico do DNA: Um algoritmo utilizado na indústria do corte e empacotamento f. Trabalho de Graduação - FATEC de São José dos Campos: Professor Jessen Vidal. CESSÃO DE DIREITOS NOME DO AUTOR: Diego Fernandes Carraro de Mendonça TÍTULO DO TRABALHO: Mapeamento Físico do DNA: Um algoritmo utilizado na indústria do corte e empacotamento TIPO DO TRABALHO/ANO: Trabalho de Graduação / É concedida à FATEC de São José dos Campos: Professor Jessen Vidal permissão para reproduzir cópias deste Trabalho e para emprestar ou vender cópias somente para propósitos acadêmicos e científicos. O autor reserva outros direitos de publicação e nenhuma parte deste Trabalho pode ser reproduzida sem a autorização do autor. Diego Fernandes Carraro de Mendonça Avenida Juscelino Kubistschek, Nº 6701, Bloco 61 Apartamento 22 CEP São José dos Campos São Paulo

4 iii DIEGO FERNANDES CARRARO DE MENDONÇA MAPEAMENTO FÍSICO DO DNA: UM ALGORITMO UTILIZADO NA INDÚSTRIA DO CORTE E EMPACOTAMENTO Trabalho de Graduação apresentado à Faculdade de Tecnologia São José dos Campos, como parte dos requisitos necessários para a obtenção do título de Tecnólogo em Informática com Ênfase em Banco de Dados. Adriana da Silva Jacinto, ME Anderson Viçoso de Araújo, ME Fernando Masanori Ashikaga, ME / / DATA DA APROVAÇÃO

5 iv Dedico este trabalho a todos que batalharam a vida inteira para que eu pudesse chegar a esse momento! Obrigado Mãe, Pai e Avós!

6 v AGRADECIMENTOS Agradeço ao professor Fernando Masanori por ter aceitado ser meu orientador, pelo esforço, empenho e tempo gasto comigo para a elaboração deste trabalho. Também agradeço ao professor Giuliano Bertoti pela orientação quanto à estrutura do trabalho e também por ter conversado comigo em um momento muito difícil do semestre. Agradeço a professora Daniele Santini Jacinto por ter mostrado um site no qual foi possível encontrar os dados deste trabalho. Finalmente agradeço aos meus pais, irmãos e família pela força, incentivo, apoio, e também a Deus por sempre me dar força.

7 vi "O importante não é justificar o erro, mas impedir que ele se repita." Ernesto Rafael Guevara de La Serna

8 vii RESUMO Atualmente o estudo do projeto genoma vem ganhando bastante destaque, pois acreditasse que é a possível cura de várias doenças ou até mesmo a prevenção das mesmas podem estar diretamente ligado ao conhecimento sobre o DNA. Esse trabalho apresenta uma solução alternativa para o problema do seqüenciamento de DNA utilizando o algoritmo desenvolvido por Ashikaga, (Ashikaga, 2001) juntamente com conceitos da Teoria dos Grafos, como vértices, arestas, caminhos hamiltonianos, clique maximal entre outros. Como o problema de mapeamento é NP-difícil justifica-se o estudo de heurísticas de aproximação como a que apresentamos. Palavras-Chave: DNA, Sonda, Clone, Vértice, Aresta, Sequenciamento, C1P

9 viii ABSTRACT Currently the study of the Genome Project has gained more attention, that researches believed that the possible cure of various diseases or even their prevent can be directly connected to DNA. This work presents an alternative solution to the DNA sequencing problem using the algorithm developed by Ashikaga (Ashikaga, 2001) along with concepts of graph theory, such as vertices, edges, Hamiltonian paths, maximal clique and others. At the end of the study interesting results presented. As the mapping problem is NP-hard it justify the study of heuristics like the one presented here. Keywords: DNA, Probe, Clone, Vertex, Edge, Sequencing, C1P

10 ix LISTA DE FIGURAS Figura 1 - Número de mortes por doença no mundo (WHO, 2004) Figura 2 - Preço do sequenciamento do DNA (GENOME, 2011) Figura 3 - Exemplo de proteína: Threonine (Meidanis, 1997) Figura 4 - Ligação entre as bases nitrogenadas (MEIDANIS, 1997) Figura 5 - Fita de DNA com as ligações entre as bases nitrogenadas Figura 6 - Fita de RNA com as bases nitrogenadas Figura 7 - Trecho do sequenciamento de um gene (MEINDANIS, 1997) Figura 8 - Imagem dos Cromossomos humanos (CRV, 2011) Figura 9 - Cromossomo mitótico (ALMEIDA, 2005) Figura 10 - Exemplo de Matriz Hibridizada Binária (YANAMOTO, 2004) Figura 11 - Exemplo de fila Figura 12 - Exemplo de pilha Figura 13 - Exemplo de grafo Figura 14- Exemplo de uma árvore Figura 15 - Exemplo de grafo com caminhos hamiltonianos Figura 16 - Grafo com clique maximal nos vértices 1, 3, 7, 6 e 2 (ASHIKAGA, 2001) Figura 17 - Se P NP (FONSECA, 2009) Figura 18 - Exemplo de Matriz utilizado no trabalho Figura 19 - Formato dos dados obtidos no site (FUNGAL GENOME, 2011) Figura 20 - Algoritmo para formatar a matriz (APÊNDICE 6.1) Figura 21 - Saída do algoritmo de Ashikaga Figura 22 - Desperdício de peças na indústria do corte Figura 23 - Sequenciamento de 10 peças com 10 padrões (ASHIKAGA, 2001) Figura 24 - Grafo com sua representação em matriz (ASHIKAGA, 2001) Figura 25 - União de cliques que formam o grafo (ASHIKAGA, 2001) Figura 26 - Matriz Binária com representação em um grafo (ASHIKAGA, 2001) Figura 27 - Efeito do extenção rotação para encontrar o caminho hamiltoniano (ASHIKAGA, 2001) Figura 28 - Clones e Probes (YANAMOTO, 2004) Figura 29 - Representação de Clones e Probes através de Matriz Binária (YANAMOTO, 2004) Figura 30 - Matriz Binária de Clones e Probes com representação através de um grafo Figura 31 - Grafo "quebrado" por clones... 53

11 x LISTA DE TABELAS Tabela 1 - Combinações entre os Amino Ácidos (MEIDANIS, 1997) Tabela 2 - Matriz Binária com 3 clones e 8 sondas Tabela 3 - L1 já com os 1s consecutivos Tabela 4 - Realizado o sequenciamento de L Tabela 5 - Matriz final após o sequenciamento das 3 linhas Tabela 6 - Resultados dos Cromossomos Tabela 7 - Comparação dos resultados finais... 57

12 xi SUMÁRIO 1 INTRODUÇÃO Motivação Objetivos Objetivo Geral Objetivos Específicos Metodologia BIOLOGIA MOLECULAR COMPUTACIONAL Biologia Molecular Proteína Ácidos Nucléicos Gene Código Genético Cromossomo Mapeamento Físico Processo de clonagem Neurospora crassa Mapeamento Físico Usando Hibridização Hibridização Conceitos Computacionais Estrutura de dados Fila Pilha Grafo Grafo Denso Grafo Esparso Árvores Caminho Hamiltoniano Clique Maximal C1P NP-Difícil Considerações Finais METODOLOGIA Materiais Linguagens de Programação IDE - Integrated Development Environmet Dados Modelo dos Dados Considerações Finais A HEURÍSTICA DE ASHIKAGA ESCOLHA DA ABORDAGEM MOSP EXTENSÃO-ROTAÇÃO FUNCIONAMENTO DO ALGORITMO DE EXTENSÃO-ROTAÇÃO MAPEAMENTO FISICO DO DNA USO DO ALGORITMO DE EXTENSÃO-ROTAÇÃO NO SEQUENCIAMENTO DE DNA... 52

13 4.7 Considerações Finais RESULTADOS OBTIDOS Tempo dos sequenciamentos de cada cromossomo Resumo dos tempos CONSIDERAÇÕES FINAIS Contribuições e Conclusões Trabalhos Futuros REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS APÊNDICE Código para formatação dos dados xii

14 13 1 INTRODUÇÃO Nesse capitulo são apresentados a motivação e os objetivos deste trabalho. 1.1 Motivação Os genes, que estão localizados dentro dos núcleos das nossas células do corpo têm funções importantes como os fatores hereditários que passam de pais para filhos, o funcionamento do nosso corpo através do controle das células e a reprodução celular. Nos genes também estão contidos informações necessárias para a construção de uma nova proteína, estas são as substancias em maior quantidade no nosso corpo. (GUYTON, 2006) As pesquisas sobre o sequenciamento do DNA estão sendo realizadas de maneira rápida, pois o DNA pode responder várias questões desde a evolução da humanidade como a possíveis soluções a problemas/doenças genéticas. (MEIDANIS, 1997) Um exemplo de doença genética é a Síndrome de Down, que está condicionada a presença de trissomia do cromossomo 21 em células do corpo humano. (MOREIRA, 2000) Outra doença bastante conhecida que também tem causa genética é o câncer. Durante o ano trilhões de novas células são criadas. Antes que a mitose ocorra há um processo de revisão que corta e repara qualquer filamento anormal de DNA. Apesar desse filtro, ainda assim, alguma célula mutante significativa pode passar. Para o surgimento do câncer também existem os fatores externos (químicos, físicos ou biológicos) que facilitam seu aparecimento, como: raios X, substâncias radioativas, luz ultravioleta, partículas radiantes. (GUYTON, 2006)

15 Doenças Câncer Isquemia Cardíaca AVC Infecções respiratórias Aids Doença Pulmonar Obstrutiva Crônica Doenças diarréicas Tuberculose Malária Diabetes Figura 1 - Número de mortes por doença no mundo (WHO, 2004) Como podemos ver na Figura 1, 7.6 milhões de pessoas no mundo ou 13% das pessoas morrem de câncer. Outro dado também contundente é que entre 3% a 7% da população mundial sofrem de alguma doença genética, isso torna o mapeamento físico do DNA algo de extrema importância, pois com avanço das pesquisas nessa área, poderá ser encontradas explicações e soluções para problemas genéticos. (WHO, 2004) Outra informação muito interessante é o custo do sequenciamento de DNA, que vem abaixando ano a ano. No ano de 2001 o sequenciamento custava 95 milhões de dólares. Já a partir de 2008 o preço saiu da casa dos milhões e passou a custar cerca de 350 mil dólares. Atualmente para se fazer um seqüenciamento completo do genoma gasta-se cerca de 20 mil dólares, um preço ainda inacessível. (GENOME, 2011)

16 15 Figura 2 - Preço do sequenciamento do DNA (GENOME, 2011) Um fato ocorrido em 2010 também chama a atenção: o caso do garoto Nicholas Volker. Desde o seu nascimento ele tem o intestino muito inflamado o que ocasionou várias cirurgias. Com três anos de idade ele já havia passado por mais de 100 cirurgias incluindo a remoção do colon e seu estado de saúde continuava piorando. Foi então que um médico do Medical College of Wisconsin e Children's Hospital of Wisconsin resolveu procurar por problemas genéticos O médico encontrou uma grande quantidade de problemas no sistema imunológico, mas nada relacionado a doença. Ainda não satisfeito com o resultado ele resolveu sequenciar inteiramente o seu DNA e analisando todos os 20 mil genes do garoto a procura da causa da rara doença. (EUREKALERT, 2011) Após três meses estudando o seqüenciamento, foi encontrado um gene modificado o que se confirmou como sendo a causa da doença intestinal. Foi então realizado um transplante de medula óssea, o que curou a doença de Nicholas, tendo ele de seguir somente o tratamento para o transplante, que requer alguns cuidados especiais. (EUREKALERT, 2011)

17 16 Desta forma nota-se a importância do estudo do sequenciamento de DNA, pois poderá trazer muitos benefícios para a população. Soluções alternativas poderão baratear o custo economicamente e trazer resultados interessantes computacionalmente. 1.2 Objetivos Os objetivos deste trabalho serão apresentados nas subseções a seguir Objetivo Geral O objetivo desse trabalho é mostrar o desempenho do algoritmo extensão rotação que foi aperfeiçoado por Ashikaga no seqüenciamento de DNA. (ASHIKAGA, 2006) Para facilitar o entendimento do texto a partir deste ponto todas as vezes que se referenciar ASHIKAGA, 2006 será usado a expressão AS Objetivos Específicos Os objetivos específicos deste Trabalho são: Solucionar o problema do sequenciamento de DNA utilizando o algoritmo de Ashikaga Analisar os resultados obtidos 1.3 Metodologia

18 17 Para o desenvolvimento desse trabalho, será utilizado o algoritmo utilizado pelo Ms Professor Fernando Masanori Ashikaga em sua tese de mestrado, no qual há alguns modificações que aperfeiçoaram o algoritmo extensão rotação para a indústria do vidro. Os dados foram obtidos através de sites que contenham bancos de dados genômicos nas quais há informações sobre DNA de diversos seres vivos. Após a obtenção do dos dados será necessário tratá-los para se adequarem ao formato esperado pelo algoritmo de Ashikaga. Para isso será utilizada a Linguagem de Programação Java para formatar os dados. Após os dados estarem formatados e serem executados no algoritmo então teremos os resultados finais analisados.

19 18 2 BIOLOGIA MOLECULAR COMPUTACIONAL O capítulo dois apresentará os principais conceitos de biologia molecular e estrutura de dados utilizada no desenvolvimento desse trabalho. Foi subdividido nas seguintes seções: a Seção 2.1 apresenta os conceitos de Biologia Molecular. A Seção 2.2 apresenta os conceitos de Biologia Molecular Computacional. Na Seção 2.3 é explicado o conceito de consecutive one property Finalmente na Seção 2.4 são realizadas as considerações finais desse capitulo. 2.1 Biologia Molecular Biologia molecular é a Ciência que procura entender as estruturas e as funções das Proteínas e Ácidos Nucléicos. (MEIDANIS, 1997) Outra definição diz que ela é reducionista, isto é, se diminuirmos o todo em pequenas partes, poderemos entender as características do todo. (GERALD, 2005) Proteína A maioria das substâncias em nosso corpo são Proteínas, elas possuem diferentes funções, alguns exemplos de proteínas são: Enzimáticas: são proteínas capazes de acelerar reações químicas que poderiam levar até mesmo dias. (MEIDANIS, 1997) Defesa: Mais conhecidos como anticorpos, essas proteínas tem a função de realizar a defesa do organismo contra vírus, bactérias e outras substancias. Existem também as proteínas trombina e fibrinogênio que, em caso de corte realizam a coagulação do sangue. (BRANDEN, 1996)

20 19 As proteínas são compostas por Amino Ácidos que por sua vez são substâncias compostas por um carbono alpha central (Cα). Preso a ele está um grupo Carboxílico (COOH), um Amino grupo (NH 2 ), um átomo de Hidrogênio (H) e um substituinte característico de cada Amino Ácido. (MEIDANIS, 1997) Figura 3 - Exemplo de proteína: Threonine (Meidanis, 1997) Ácidos Nucléicos Existem dois tipos de Ácidos Nucléicos nos organismos vivos, os RNA e o DNA DNA A palavra DNA significa Ácido Desoxirribonucléico que nada mais é do que uma cadeia de simples moléculas, sua estrutura é constituída por duas fitas (duplo filamento) descobertas por James Watson e Francis Crick em 1953, que são ligadas por meio de bases nitrogenadas. (MEIDANIS, 1997)

21 20 A estrutura do DNA armazena informações, todas elas codificadas (código genético). Essas informações podem ser sobre os nossos antepassados, como: doenças genéticas, características físicas. Também podem ter dados sobre as células, quais tipos de substâncias são necessárias para formar uma nova célula, proteína, onde está localizada essa célula. (ALBERTS, 2002) Como dito anteriormente, as duas fitas de DNA estão ligadas por meio de bases nitrogenadas. Existem quatro diferentes bases nitrogenadas, são elas: Adenina, Guanina, Citosina e Timina. Essas bases são classificadas da seguinte forma: purinas e pirimidinas: (MEIDANIS, 1997) Purinas: Adenina e Guanina Pirimidinas: Citosina e Timina 1997) As bases nitrogenadas também podem ser representadas por letras: (MEIDANIS, A : Adenina C : Citosina G : Guanina T : Timina Cada base nitrogenada liga-se a outra base nitrogenada e somente a ela. A Base Adenina (A) é sempre ligada à base Timina (T), assim como a base Guanina (G) somente é ligada a base Citosina (C). Desta forma Adenina e Timina são bases complementares, assim como Citosina e Guanina. (MEIDANIS, 1997)

22 21 Figura 4 - Ligação entre as bases nitrogenadas (MEIDANIS, 1997) A quantidade de pares de bases corresponde as unidades de medidas de uma molécula de DNA, cuja abreviatura é bp (base pairs). (MEIDANIS, 1997) Figura 5 - Fita de DNA com as ligações entre as bases nitrogenadas

23 RNA É uma molécula similar com o DNA, mas com algumas diferenças. Uma molécula de RNA é constituída por uma cadeia simples de bases nitrogenadas, em que de uma cadeia dupla de bases como no DNA. (GRIFFITHS, 2009) Outra diferença entre o DNA e o RNA está na sua estrutura. No RNA há uma molécula de ribose, diferentemente do DNA que contém uma molécula de deoxirribose. O restante da estrutura do RNA é a mesma do DNA. (GRIFFITHS, 2009) As bases nitrogenadas presentes na estrutura do RNA, também podem ser chamados de ribonucleotídeos. Elas são a Adenina (A), Citosina(C), Guanina (G) e a Uracila (U) substituindo a Timina encontrada no DNA. (GRIFFITHS, 2009) Outra importante diferença entre o RNA e o DNA é que diferente do DNA, no qual há unicamente e exclusivamente uma função, codificar informações, o RNA pode executar diferentes tipos de funções, dependendo de sua classe, um tipo de RNA é o mensageiro que faz parte de um processo chamado transcrição que será descrita mais adiante. (MEIDANIS, 1997) Figura 6 - Fita de RNA com as bases nitrogenadas

24 Gene Um gene é um fragmento do DNA codificado através de uma sequencia de bases, no qual há informações necessárias para a criação de uma nova proteína. (Genética, Tompson). Um gene contém informações sobre a construção de uma proteína ou não. Para cada tipo de proteína existe um único gene, o tamanho de um gene varia muito de gene para gene, nos seres humanos os genes tem em media bp ou 10kbp e mesmo o gene sendo algo tão grande o nosso mecanismo celular é capaz de identificar em um fita de DNA o início e o fim de um gene. (MEIDANIS, 1997) Uma proteína é uma cadeia de Amino Ácidos, como dito anteriormente, um gene é uma sequencia de Amino Ácidos, onde uma combinação entre três bases nitrogenadas formam um Amino Ácidos. O nome dado a essa combinação entre três bases nitrogenadas é Códon. (MEIDANIS, 1997) Figura 7 - Trecho do sequenciamento de um gene (MEINDANIS, 1997) A Tabela 1 mostra o significado da das letras do seqüenciamento Código Genético O código genético é o significado de um Códon, por exemplo, o códon GAC (Guanina Adenina - Citosina), durante um processo chamado de transição, os dois filamentos do DNA se separam por determinado período de tempo, um desses filamentos irá

25 24 servir de molde para o RNA, que irá moldar as bases complementares desse Códon, formando um novo códon CUG (Citosina Uracila - Guanina), então formando um Amino Ácido chamado Leucina. (GUYTON, 2006) A tabela 1 mostra um códon e o seu respectivo Amino Ácido, o código genético. Primeiro Segundo Elemento Terceiro Elemento G A C U Elemento Glicina Acido Glutâmico Alanina Valina G G Glicina Acido Glutâmico Alanina Valina A Glicina Acido aspártico Alanina Valina C Glicina Acido aspártico Alanina Valina U Arginina Lisina Treonina Metionina G A Arginina Lisina Treonina Isoleucina A Serina Asparagina Treonina Isoleucina C Serina Asparagina Treonina Isoleucina U Arginina Glutamina Prolina Leucina G C Arginina Glutamina Prolina Leucina A Arginina Histidina Prolina Leucina C Arginina Histidina Prolina Leucina U Triptofano STOP Serina Leucina G U STOP STOP Serina Leucina A Cisteína Tirosina Serina Fenilalanina C Cisteína Tirosina Serina Fenilalanina U Tabela 1 - Combinações entre os Amino Ácidos (MEIDANIS, 1997) Existem 64 possíveis sequencias triplas, mas somente 20 Amino Ácidos para especificar. Por causa disso existe mais de uma sequencia tripla para cada Amino Ácidos. Também existem sequencias triplas. Que sinalizam o final de um gene, que são as sequencias que indicam a palavra STOP. (MEIDANIS, 1997) Cromossomo

26 25 Uma molécula de DNA tem o seu tamanho físico muito grande algo em torno de 6 cm linearmente. O cromossomo tem basicamente a função de encapsular essa molécula de DNA dentro de uma célula. (GUYTON, 2006) O número de cromossomos dentro de uma célula varia de acordo com o ser vivo. Os seres humanos possuem 46 cromossomos dispostos em 23 pares em cada célula humana. Para o nascimento de um novo individuo é necessário 23 cromossomos do pai mais 23 cromossomos da mãe. Assim é possível criar uma nova célula, o que caracteriza um novo individuo. (MEIDANIS, 1997) Figura 8 - Imagem dos Cromossomos humanos (CRV, 2011) No cromossomo, além do DNA, também estão contidos muitas proteínas, sendo elas chamadas de histonas, carregadas de cargas positivas. (GUYTON, 2006)

27 26 Figura 9 - Cromossomo mitótico (ALMEIDA, 2005) Mapeamento Físico Mapeamento físico nada mais é do que dividir um cromossomo em pequenos fragmentos de maneira que esses fragmentos possam ser seqüenciados. Depois ordenar esses fragmentos de acordo com a sonda correspondente Processo de clonagem Para fazer experimentos (estudos) com DNA, é necessária uma quantidade razoável do mesmo material, a fim de se obter uma maior confiança nos resultados dos experimentos. Por isso, a necessidade de se clonar várias vezes as sequências de DNA. (YANAMOTO, 2004) Neurospora crassa Neurospora crassa é uma espécie de fungo pertencente ao filo Ascomycota. Estudos genéticos e bioquímicos com Neurospora contribuíram com informações básicas uma

28 27 abundância de evidências estabeleceram a semelhança básica dos mecanismos genéticos em fungos, pois com seu genoma de DNA pequeno, para aqueles de eucariotos superiores. Passou a ser classificado como um organismo modelo, devido também à suas características de fácil manuseio e ciclo de vida haplóide. (PERKINS, 1982) Mapeamento Físico Usando Hibridização No mapeamento físico usando hibridização são utilizadas as informações de sobreposição entre os fragmentos. Os fragmentos são replicados, usando-se a técnica de clonagem. Depois de copiados, os clones da sequência de DNA original são quebrados com diferentes técnicas (processo de clivagem). As informações dos clones são obtidas através de experimentos de hibridização. Nestes experimentos tenta-se verificar se pequenas sequências, chamadas de sondas (probes), hibridizam o clone isto é, se a sonda está presente no clone. (YANAMOTO, 2004) Figura 10 - Exemplo de Matriz Hibridizada Binária (YANAMOTO, 2004)

29 Hibridização A hibridação é um processo fulcral na área da engenharia genética. A utilização de sondas permite caracterizar e identificar DNA, baseando-se nas propriedades do mesmo, destacando-se o emparelhamento de bases por pontes de hidrogênio e a desnaturação e renaturação das cadeias complementares. (PACHECO, 2012) A hibridização pode ocorrer entre duas sequências complementares de DNA, entre DNA de fita simples e um RNA complementar, ou entre duas sequências de RNA. A técnica é usada para detectar e isolar sequências específicas, medir homologia, ou definir outras características de uma ou ambas as cadeias. (PACHECO, 2012) Técnica amplamente usada que explora a capacidade de sequências complementares de DNAs ou RNAs de fita simples para parear entre si formando uma dupla hélice (KENDREW, 1994), sendo importante para analisar genes expressos assim como genes não expressos. A visualização destes genes de interesse dá-se pelo emparelhamento das sondas que se encontram marcadas por radioatividade, por quimiluminescência ou por um anticorpo. São várias as técnicas de biotecnologia que utilizam a hibridação como princípio do método, como Northern Blot, Southern Blot e Colony Blot. (PACHECO, 2012) 2.2 Conceitos Computacionais Nessa seção serão descritas técnicas computacionais que auxiliam na solução de problemas de Biologia Molecular Estrutura de dados Estrutura de dados é a forma manipulação e de disposição e armazenamento dos dados de modo em que os dados possam ser usados da melhor maneira possível e de modo eficiente. (TENEMBAUM, 1995)

30 29 Existem várias estruturas de dados disponíveis, que servem como padrões para futuras implementações, alguns exemplos de estruturas de dados são apresentadas nas subseções seguintes: Fila Na estrutura de dados Fila, o primeiro elemento a entrar na Fila, será o primeiro elemento a sair. (TENEMBAUM, 1995) Figura 11 - Exemplo de fila Pilha É a estrutura de dados, na qual sempre o elemento de cima da fila é o primeiro a sair da mesma. (TENEMBAUM, 1995)

31 30 Figura 12 - Exemplo de pilha Grafo A estrutura de dados Grafo é constituída de várias arestas (ou arcos) e nós, no qual cada aresta é ligada a dois nós e um nó pode conter uma ou mais arestas. (TENEMBAUM, 1995) Figura 13 - Exemplo de grafo Grafo Denso

32 31 Um grafo simples G é dito denso: se a quantidade de arestas se aproxima do limitante definido nas propriedades anteriores. (ICMC, 2011) Grafo Esparso (ICMC, 2011) Um grafo G é esparso: se a quantidade de arestas é muito menor do que o limitante Árvores É uma estrutura de dados em que um elemento tem sempre um nó pai, com exceção do nó raiz que não há elemento pai e não há circuitos. Toda árvore sempre é um grafo. (TENEMBAUM, 1995) Figura 14- Exemplo de uma árvore Caminho Hamiltoniano

33 32 Um caminho hamiltoniano é um caminho que passa exatamente uma vez por cada vértice de um grafo. (FEOFILOFF, 2009) Se o caminho tem como início e fim o mesmo vértice então dá se o nome de ciclo (circuito) hamiltoniano, um grafo que contém um ciclo hamiltoniano também pode ser chamado de grafo hamiltoniano. (FEOFILOFF, 2009) Figura 15 - Exemplo de grafo com caminhos hamiltonianos Na figura 15 temos um grafo com vários caminhos hamiltonianos, um deles pode ser a seguinte sequencia: a, d, c, e, b, a. FEOFILOFF, 2009) Clique Maximal Clique maximal é um conjunto vértices totalmente interligados entre si. Na figura 16 é apresentado um grafo que contém um conjunto de clique maximal nos vértices 1, 3, 7, 6 e 2. (BONDY, 1976)

34 33 Figura 16 - Grafo com clique maximal nos vértices 1, 3, 7, 6 e 2 (ASHIKAGA, 2001) 2.3 C1P C1P também conhecido como Consecutives Ones Property é a propriedade atribuída a uma matriz binária caso essa matriz possa fazer a permutação das colunas de modo a deixar todos os 1 s de forma consecutivas em todas as linhas. É importante ressaltar que não há como garantir que a permutação encontrada seja a real, visto que não podemos garantir que a ordem das sondas esteja correta. (HAJIAGHAYI, 2000) Essa propriedade contém várias aplicações um deles é na área de Biologia Molecular Computacional, no qual a meta é verificar todas as sondas que compõe um clone, ou seja, todas as sondas que hibridizam com um clone. (HAJIAGHAYI, 2000) Outra aplicação dessa propriedade se deve no problema denominado MOSP, no qual há a necessidade de minimizar o número de pilhas abertas de peças ao redor de uma máquina, AS06 obteve um grande resultado em seu estudo utilizando esse conceito. (ASHIKAGA, 2001)

35 NP-Difícil Na teoria de algoritmos, os problemas tratáveis pertencem à classe P (polinomiais), enquanto os intratáveis pertencem à classe NP (não-polinomiais). Então, os problemas NP- Difícil são tão difíceis quanto os problemas mais difíceis em NP. Tais problemas não precisam estar em NP, na verdade, eles não podem sequer ser problemas de decisão. Pode se dizer que um problema Y é NP-Difícil se, para todo problema X em NP, existe redução polinomial de X para Y. Por exemplo, dizer que uma máquina de Turing termina dizendo sim, é NP-Difícil porém não está em NP. Se um problema está em NP e NP-Difícil, então este se chama NP-Completo, que são os mais interessantes, pois não se conhece uma solução determinística capaz de ser executada em tempo polinomial. Um exemplo de NP-Difícil e NP- Completo é o problema de decisão da Soma de Subconjuntos. O Problema de Satisfatibilidade Booleana pode ser reduzido ao Problema da Parada, transformando-o em uma descrição de uma máquina de Turing, portanto o Problema de Parada acaba sendo somente um NP-Difícil não estando na classe NP já que esta tem problemas decidíveis em um número finito de operações, enquanto o Problema da Parada, em geral, não é. (FONSECA, 2009) Figura 17 - Se P NP (FONSECA, 2009)

36 Considerações Finais Este capítulo introduziu conceitos básicos, porém importantes sobre Biologia, Biologia Molecular, Biologia Molecular Computacional e Estrutura de Dados. Foram descritos os conceitos utilizados neste trabalho, assim como as principais estrutura de dados existentes.

37 36 3 METODOLOGIA Nesse capítulo serão apresentados os procedimentos e os prés requisitos utilizados para a execução deste trabalho. Este capítulo é subdividido da seguinte forma: A Seção 3.1 apresenta os materiais utilizados no desenvolvimento deste trabalho. Na Seção 3.2 são apresentados os dados utilizados neste trabalho. A Seção 3.3 apresenta o formato de como os dados devem estar para poderem ser executados. Finalmente na seção 3.4 são apresentadas as considerações finais deste capítulo. 3.1 Materiais A seguir serão apresentados os materiais utilizados neste trabalho Linguagens de Programação As linguagens de programação utilizadas foram: Platafoma Java Para formatar a matriz utilizada neste trabalho foi utilizada a tecnologia JSE ( Java Standard Edition), que é uma ferramenta desenvolvida para a plataforma Java, na qual contém todo o ambiente necessário para a criação e execução de aplicações Java para desktop. (DEITEL, 2005)

38 C++ O código fonte desenvolvido pelo Mestre Fernando Masanori Ashikaga que foi utilizado para obter os resultados deste trabalho foi desenvolvido utilizando a tecnologia C++, que na verdade é uma extensão da linguagem C. Ela nasceu na intenção de melhorar o controle e a manutenção de códigos longos. A maior diferença entre a linguagem C e a C++ é que na tecnologia C++ foram implementados conceitos de orientação a objetos. (STROUSTRUP, 2000) IDE - Integrated Development Environmet As IDEs utilizadas neste trabalharam foram: Visual Studio 2010 Para estudar o código proposto pelo Mestre Fernando Masanori Ashikaga foi utilizada a ferramenta Visual Studio 2010, que se trata de uma poderosa IDE desenvolvida pela Microsoft, sua distribuição é paga, mas graças ao projeto da Microsoft chamado ELMS e-academy License Management System, foi possível obter a ferramenta Visual Studio 2010 de forma gratuita. (ELMS, 2011) A escolha da ferramenta Visual Studio se deve-se ao fato de ferramenta possuir uma poderosa opção de debug, o que facilita na hora o entendimento do algoritmo, visto que o algoritmo é extenso e de difícil compreensão Eclipse Indigo

39 38 Para formatar a matriz utilizada para obter os resultados de trabalho, foi utilizada a ferramenta Eclipse Indigo versão 3.7, que se trata-se de um ambiente de programação em Java que possui a licença, EPL, Eclipse Public License. (ECLIPSE, 2011) O motivo da escolha desse ambiente foi devido à facilidade de uso por parte do autor do trabalho deste trabalho, que se encontra muito mais familiarizado com essa ferramenta e também pela ótima opção de Debug apresentado por essa IDE. 3.2 Dados Os dados utilizados para a execução desse trabalho foram obtidos através do projeto genoma chamado Fungal Genome Resource financiado pela Universidade de Georgia, localizada nos Estados Unidos. (FUNGAL GENOME, 2011) O projeto genoma Fungal Genome Resource contém um repositório online com informações e serviços para auxiliar e servir a comunidade do projeto. Nesse repositório há informações do DNA de diversos seres vivos, inclusive sobre o mapeamento físico do DNA. (FUNGAL GENOME, 2011) 3.3 Modelo dos Dados O algoritmo utilizado neste trabalho necessitava que a matriz binária atendesse aos seguintes requisitos: Não haver colunas vazias, ou seja, colunas compostas por 0 (zero); Não haver linhas vazias, ou seja, linhas compostas por 0 (zero); A matriz só deve conter números e espaços em branco;

40 39 A primeira linha do arquivo deve ser composta pelo número de linhas e colunas da matriz a ser processada; O arquivo deve ser no formato txt; Deve haver um espaço em branco entre cada número da matriz; Ao final de cada linha deve haver um espaço em branco; Com exceção da primeira linha as demais só deve conter o número 0 (zero) ou 1 (um). Dessa forma a matriz esperada deve ser parecida com a matriz da figura 17 Figura 18 - Exemplo de Matriz utilizado no trabalho Na figura 17 a primeira linha contém dois números: o primeiro corresponde ao número de linhas 9 (nove) e o segundo número corresponde ao número de colunas 10 (dez). Os números 9 e 10 estão separados por um espaço em branco. As demais linhas representam a matriz binária, no qual, só há os números 0 (zero) e 1 (um) e eles estão separados por um espaço em branco, assim como ao final de cada linha também há um espaço em branco.

41 40 A matriz da figura 17 é uma matriz válida e de teste para comprovar o funcionamento do algoritmo de Ashikaga, atendendo a todos os prés requisitos. Já os dados obtidos no site não vieram no formato esperado pelo algoritmo, pois além da matriz binária, também continham mais informações relacionadas ao sequenciamento de DNA, por esse motivo foi necessário formatar a matriz para que pudesse ser usada no algoritmo. Figura 19 - Formato dos dados obtidos no site (FUNGAL GENOME, 2011) Como podemos ver na figura 18 há uma primeira coluna com um código (na linha 1 o código é H027H04) esse código não pode estar contido na matriz que será passado ao algoritmo. Nessa mesma matriz no local onde deveria conter 0 (zero) há ponto (.). Por esse motivo foi necessário alterar essa matriz para deixá-la no padrão do algoritmo utilizado. Para fazer essas modificações foi utilizado um algoritmo desenvolvido na linguagem Java. Esse algoritmo é simples, no qual o objetivo é ler um arquivo txt retirar os campos desnecessários para a leitura do arquivo, substituir o caracteres. (ponto) por 0 (zero) e adicionar 1 espaço em branco entre cada número.

42 41 Figura 20 - Algoritmo para formatar a matriz (APÊNDICE 6.1) Para realizar as funções do algoritmo foram utilizadas as bibliotecas Java do pacote java.io. As classes utilizadas foram: BufferedReader, FileReader, FileWriter. BufferedReader: Classe utilizada para bufferizar o texto e consequentemente poder ler cada linha de maneira separada. (BUFFERED READER, 2010) FileReader: Classe utilizada para leitura de arquivos de carácter. Os construtores desta classe assumem que a codificação de caracteres padrão e o tamanho padrão do buffer-byte são adequados. (FILE READER, 2010) File Writer: Classe utilizada para a gravação de arquivos de caráter. Os construtores desta classe assumem que a codificação de caracteres padrão e o tamanho padrão do buffer-byte são aceitáveis. (FILE WRITER, 2010)

43 42 O fungo Neurospora crassa contém 7 cromossomos, cada cromossomo contendo um número diferente de sondas e clones. Para poder sequenciar o DNA do fungo foi necessário passar cada cromossomo no algoritmo de Ashikaga, além disso, também foi necessário repetir 10 vezes esse mesmo procedimento para cada cromossomo, pois há uma pequena variação de tempo para cada uma das vezes. Os resultados apresentados como saída pelo código de Ashikaga vieram com várias informações adicionais, mas para o estudo deste trabalho somente a informação de tempo era de importância. Os demais dados foram utilizados para apresentar os resultados na indústria do corte, desta forma os demais dados não são necessários para o entendimento deste trabalho. A figura 20 ilustra uma saída apresentada por Ashikaga. É possível ver que há vários dados, mas como dito anteriormente somente o tempo é necessário para este trabalho. Figura 21 - Saída do algoritmo de Ashikaga Na figura 20 o primeiro dado é o nome do arquivo que foi usado e o tempo é o 5º dado apresentado que começa com a variável t. No caso da imagem o tempo marcado é de segundos. Para facilitar o estudo não será usado a matriz original disponibilizada pelo algoritmo AS06, mas será realizada uma tabela somente com os dados úteis a essa pesquisa. Após a obtenção dos resultados, eles são apresentados e é retirada uma média dos tempos das 10 tentativas de sequenciamento e assim apresentados neste trabalho.

44 43 Infelizmente não foi encontrado nenhum trabalho com esse tipo de dado para termos uma comparação efetiva do desempenho. 3.4 Considerações Finais Este capítulo apresentou as ferramentas utilizadas neste trabalho, assim como porque foram escolhidas. Também foram apresentados os dados aqui utilizados, assim como a formatação em que eles deveriam estar antes de serem submetido ao algoritmo.

45 44 4 A HEURÍSTICA DE ASHIKAGA Neste capítulo será apresentada a abordagem utilizada por Ashikaga para resolver o problema de número de pilhas abertas, assim como a adaptação necessária para o mesmo algoritmo ser usado no sequenciamento de DNA. Este capítulo é subdividido da seguinte forma: Na Seção 4.1 é explicado o porquê da escolha de uma abordagem de aproximação. Na seção 4.2, é abordado o problema da indústria do corte que foi o problema atacado por Ashikaga. Na Seção 4.3 é apresentado o algoritmo de extensão rotação que faz com que os resultados deste trabalho sejam interessantes do ponto de vista computacional. Na Seção 4.4 é apresentado o funcionamento do algoritmo de extensão rotação. Na Seção 4.5 há uma explicação sobre o mapeamento físico do DNA. Na Seção 4.6 é mostrado como usar o algoritmo de extensão rotação no seqüenciamento de DNA. Por fim na Seção 4.7 são apresentadas as considerações finais deste capítulo. 4.1 ESCOLHA DA ABORDAGEM O problema do sequenciamento de DNA é um problema da família NP-Dificil, assim como o problema MOSP. (MEIDANIS, 1997) Algoritmos de aproximação costumam ser bons algoritmos para problemas da família NP-Dificil, pois encontram rapidamente. Essa solução, essa solução não necessariamente é a melhor, entretanto esta solução é dentro de um intervalo de erro plausível. (MEIDANIS, 1997) Esse é o motivo de ser utilizado um algoritmo de aproximação para o problema do sequenciamento de DNA, pois o mesmo é um problema NP-Dificil.

46 MOSP O algoritmo utilizado nesse trabalho a principio foi proposto por Ashikaga para resolver um problema da indústria do corte que basicamente consistia em ter o menor número possível de pilhas de peças ao redor da máquina e também para evitar o desperdício de matéria prima, a figura 21 ilustra o desperdício dessa matéria prima, na qual as partes hachuradas são o desperdício de matéria-prima. (ASHIKAGA, 2001) Figura 22 - Desperdício de peças na indústria do corte No entanto o foco da dissertação de Ashikaga é somente o de minimizar o número de pilhas abertas, também conhecido como MOSP (Minimization of Open Stack Problem). Após o corte de cada peça é realizado uma pilha com essas peças ao redor da máquina de corte, dessa forma quanto mais peças diferentes estiverem sendo produzidas, maior é a quantidade de pilhas abertas ao redor da máquina, essa é a explicação para o nome MOSP. Desta forma há a necessidade de remover pilhas temporariamente, quando essa pilha voltar a ter peça produzida, então essa pilha deve voltar ao seu lugar original, ao redor da máquina. A figura 22 representa um possível sequenciamento para 10 padrões com 10 peças.

47 46 Figura 23 - Sequenciamento de 10 peças com 10 padrões (ASHIKAGA, 2001) Na figura 22 é possível verificar que a imagem da esquerda mostra os padrões sendo cortados em ordem sequencial sendo que quando o padrão três é cortado, temos o número máximo de pilhas abertas ao redor da máquina, oito, sendo que as pilhas 1, 3, 5, 6, 7, 8, 9 e 10 estão abertas nesse instante. Já na imagem da direita temos o número máximo de pilhas abertas quando o padrão dois é cortado, no qual temos as pilhas 2, 3, 5, 6 e 9 abertas, totalizando 5 pilhas abertas, que representam um notavel progresso. Repare que na imagem da direita temos uma alteração na ordem dos padrões o que diminui número de pilhas abertas. (ASHIKAGA, 2001) Para a resolução do MOSP foi utilizado a Teoria dos Grafos, com aproximações, pois há uma enorme quantidade de soluções tanto exatas como aproximações para o problema do MOSP, mas todas elas são computacionalmente intensas, já a abordagem utilizando a Teoria dos Grafos, utilizada pela primeira vez, e mostrou um resultado de ótima qualidade para o problema. (BECCENERI, 1999) Ashikaga iniciou os estudos modelando o MOSP utilizando a Teoria dos Grafos, no qual, ele descobriu que o grafo complementar do grafo MOSP é muito esparso, dessa forma o grafo MOSP é denso, com isso é possível identificar um bom clique maximal. (ASHIKAGA, 2001) Um exemplo de um grafo MOSP pode ser visto na tabela dá direita da figura 23, no qual há 10 padrões de corte, com no máximo 4 peças por padrão. Na tabela ao lado do grafo

48 47 cada linha representa um padrão, cada número dentro do padrão representa uma peça. Já no grafo cada peça é representada por um vértice, e há uma aresta que une duas peças se um padrão contiver estas peças. (ASHIKAGA, 2001) Os vértices 1, 3, 7, 6, 2 formam o clique maximal. Figura 24 - Grafo com sua representação em matriz (ASHIKAGA, 2001) Para formar o grafo dá figura 23 foi utilizada uma união de cliques, no qual cada clique pode ser considerado um padrão. A figura 24 representa os cliques. (YANASSE, 1999)

49 48 Figura 25 - União de cliques que formam o grafo (ASHIKAGA, 2001) Utilizando uma matriz binária para representar os padrões e peças, temos uma matriz e um grafo MOSP como na figura 25. Figura 26 - Matriz Binária com representação em um grafo (ASHIKAGA, 2001)

50 EXTENSÃO-ROTAÇÃO Para o funcionamento do algoritmo de extensão-rotação é necessário a identificação de cliqueis grandes, também conhecidos ou até mesmo de clique maximal. (YANASSE, 1999) Segundo Ashikaga em grafos MOSP o tamanho dos cliques maximais aumenta muito rápido de acordo com o número máximo de peças permitas por padrão. (ASHIKAGA, 2011) O problema de detecção de cliques maximais é um problema da família NP-dificil (GAREY, 1979). Apesar desse fato, Johnson desenvolveu uma heurística gulosa por vértice de grau mínimo (Minimum-Degree Greedy) para a descoberta de cliques independentes com um excelente desempenho para grafos MOSP complementar. Assim obtendo o clique maximal do grafo MOSP original. (JOHNSON, 1974) 4.4 FUNCIONAMENTO DO ALGORITMO DE EXTENSÃO-ROTAÇÃO Os vértices que constituem o clique obtido através do algoritmo de Minimum- Degree Greedy são adicionados em ordem a um caminho. Desta forma, montando um grafo. Seguindo a ordem de inserção o algoritmo de extensão rotação de Pósa (PÓSA, 1976) que encontra circuito hamiltonianos em um grafo. (CARVALHO, 2011) O algoritmo extensão rotação vai percorrendo o caminho hamiltoniano até não ser mais possível e ainda houver vértices a serem percorridos no grafo. Quando isso ocorre o final do caminho é rotacionado (altera a ordem dos vértices) fazendo com o algoritmo possa percorrer novos vértices adicionados. No entanto há algumas restrições impostas por Ashikaga, como a quantidade de rotações executadas. (ASHIKAGA, 2011) A figura 26 mostra o comportamento do algoritmo de extensão-rotação, no qual podemos notar que o grafo da esquerda mostra o primeiro caminho encontrado no qual fazem

51 50 parte os vértices 6, 7, 3, 1 e 2. Nele não há como percorrer os demais vértices. Já no grafo central nota-se que houve a rotação e o caminho dos vértices passa-se a ser 6, 7, 3, 2 e 1 e na imagem da direita o grafo percorre o restante dos vértices e assim tem um caminho hamiltoniano para o grafo MOSP. Figura 27 - Efeito do extenção rotação para encontrar o caminho hamiltoniano (ASHIKAGA, 2001) 4.5 MAPEAMENTO FISICO DO DNA Para realizar o mapeamento físico do DNA são utilizadas informações de sobreposição entre os fragmentos. Os fragmentos são replicados utilizando técnicas de clonagem, após o termino da cópia dos clones, estes são clivados com diferentes técnicas (processo de clivagem). As informações dos clones são obtidas através do processo de Hibridização, nesses processos verificam se pequenos segmentos do DNA chamados de sondas (probes), hibridizam o clone, isto quer dizer, se uma sonda está presente em um clone. A figura 27 ilustra um conjunto de clones e probes clivados.

52 51 Figura 28 - Clones e Probes (YANAMOTO, 2004) matriz binária. A figura 28 mostra a representação de um conjunto de probes e clones em uma Figura 29 - Representação de Clones e Probes através de Matriz Binária (YANAMOTO, 2004) Na figura 28 nota que: O clone 1 contém os probes 2, 3 e 5;

53 52 O clone 2 contém as probes 1, 3 e 5; O clone 3 contém as probes 1, 5 e 6; O clone 4 contém a probe 2; O clone 5 contém as probes 1 e 6; O clone 6 contém as probes 1 e 3; O clone 7 contém as probes 4 e 6; 4.6 USO DO ALGORITMO DE EXTENSÃO-ROTAÇÃO NO SEQUENCIAMENTO DE DNA A montagem do grafo utilizando uma matriz binária de um DNA acontece da mesma forma como na indústria do vidro. Mas no mapeamento físico do DNA, trocamos os padrões por clones e as peças por sondas. Na figura 29 temos uma tabela de hibridização de DNA juntamente com um grafo que representa essa tabela.

54 53 Figura 30 - Matriz Binária de Clones e Probes com representação através de um grafo Já na figura 30 temos a representação de cada clone do grafo da figura 29. Figura 31 - Grafo "quebrado" por clones A matriz binária que representa o sequenciamento de DNA (mapeamento físico) é igual à matriz da indústria do corte, o objetivo de juntar (colocar todos os uns (1s) juntos é o mesmo), a tabela 02 ilustra uma matriz com 3 clones e 8 sondas. (MEIDANIS, 1997)

55 54 A tabela 08 ilustra um trecho de uma matriz binária de um seqüenciamento de DNA, no qual há três linhas nota-se que os números 1s estão separados, em l1 há1 nas colunas c2, c7 e c8, na l2 c2, c5 e c7 já em l3 os uns (1s) estão na c1, c4, c7 e c8. c1 c2 c3 c4 c5 c6 c7 c8 l l l Tabela 2 - Matriz Binária com 3 clones e 8 sondas Analisando somente a linha l1 vemos que para permutar as colunas e deixar os 1s consecutivos temos três alternativas 2, 7, 8, ou 7, 2, 8, ou 2, 8,7, a tabela 03 ilustra esse comportamento. {2, 7, 8} {2, 7, 8} {2, 7, 8} c1 c2 c3 c4 c5 c6 c7 c8 l Tabela 3 - L1 já com os 1s consecutivos Agora olhando para l2, notamos que há alguns 1s consecutivos iguais em l1, que são c2 e c7. Desta forma basta escolher em qual lado colocar a coluna c5, a direita dos 1s consecutivos ou à esquerda. Na tabela 04 foi colocado a esquerda.

56 55 {5} {2, 7, 8} {2, 7, 8} {2, 7, 8} c1 c2 c3 c4 c5 c6 c7 c8 l l Tabela 4 - Realizado o sequenciamento de L2 Em l3 também temos algumas colunas em comum com l1 e l2 que são as colunas c7 e c8, dessa forma também há a necessidade de se escolher onde colocar as colunas sem intersecção com l1 e l2, que no caso é a coluna c4. A tabela 05 representa a matriz final após os 1s estarem consecutivos. {5} {2} {7} { 8} {1, 4} {1, 4} c1 c2 c3 c4 c5 c6 c7 c8 l l l Tabela 5 - Matriz final após o sequenciamento das 3 linhas 4.7 Considerações Finais Neste capítulo foi apresentado o principal algoritmo para o desenvolvimento deste trabalho, chamado de extensão rotação. Nele também foi abordada a utilização no seqüenciamento de DNA.

57 56 5 RESULTADOS OBTIDOS Os tempos aqui apresentados são resultados de um sequenciamento realizado nos cromossomos do organismo vivo Neurospora crassa. Esse organismo vivo contém 7 cromossomos, cada um deles contendo um número diferente de clones e sondas. Para apresentar o tempo do cromossomo, cada cromossomo foi sequenciado 10 vezes, pois há uma pequena variação no tempo de sequenciamento entre cada uma das vezes. 5.1 Tempo dos sequenciamentos de cada cromossomo A tabela a seguir mostra os resultados dos 10 testes de sequenciamento (S) dada em tempo (ms) de cada um dos 7 cromossomos. Cromossomo S S S S S S S S S S Tabela 6 - Resultados dos Cromossomos

58 57 Nota-se que há uma pequena variação entre cada tempo do sequenciamento, obtendo-se uma média de sequenciamento de cada cromossomo. 5.2 Resumo dos tempos Cromossomo Tempo Médio Quantidade de Quantidade de (ms) Clones Sondas Tabela 7 - Comparação dos resultados finais Como se pode notar o DNA do Neurospora crassa, que contém 7 cromossomos, 4542 clones e 882 sondas foi sequenciado com um tempo médio de 36,6 ms, sendo que cada cromossomo levou em média 6.1 ms para ser sequenciado. O cromossomo com maior tempo médio de sequenciamento foi o 5, é possível observar que ele possuiu o maior número de clones (1031) e sondas (166) do que os outros cromossomos. Já o cromossomo de menor tempo de sequenciamento foi o 7, pois o mesmo possui o menor número de clones (418) e sondas (98) dentre todos os cromossomos. Como dito anteriormente não foram encontrados dados publicados sobre o tempo de sequenciamento do DNA, por isso não é possível saber a qualidade da aproximação, mas nota se que o tempo de sequenciamento é muito interessante do ponto de vista computacional.