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1 (21)PI A2 (22) Data de Depósito: 11/08/2008 (43) Data da Publicação: 26/04/2011 (RPI 2103) 11B (51) Int.CI.: A61 K 39/08 A61P 31/04 (54) Título: VACINA CONTRA O CARBÚNCULO SINTOMÁTICO, GANGRENA GASOSA, ENTEROTOXEMIA, EDEMA MALIGNO, TÉTANO E BOTULISMO (73) Titular(es): Vetnil Indústria e Comércio de Produtos Veterin LTDA (72) Inventor(es): Vera Maria Laurinda de Godoy Moreira e Costa Ribeiro (57) Resumo: VACINA CONTRA O CARBÚNCULO SINTOMÁTICO, GANGRENA GASOSA, ENTEROTOXEMIA, EDEMA MALIGNO, TÉTANO E BOTULISMO. Não existem disponíveis no mercado atualmente, vacinas multi-valentes contra o carbúnculo sintomático, gangrena gasosa, enterotoxemia, edema maligno, tétano e botulismo simultaneamente. A presente invenção consiste de tal composição vacinai, com eficácia comprovada, que além de reduzir o estresse das múltiplas vacinações, ainda reduz os custos operacionais.

2 1 / P "VACINA CONTRA O CARBÚNCULO SINTOMÁTICO, GANGRENA GASOSA, ENTEROTOXEMIA, EDEMA MALIGNO, TÉTANO E BOTULISMO". 5 A presente invenção descreve uma vacina multi-valente para imunização de bovinos, ovinos, caprinos e suínos contra o carbúnculo sintomático, a gangrena gasosa, enterotoxemia, edema maligno, tétano e botulismo. As principais clostridioses prevalentes no Brasil são: 10 1) Carbúnculo sintomático: causada por Clostridium chauvoei, uma bactéria formadora de esporos (forma filamentosa) é uma causa de perda econõmica grave para criadores de bovinos em muitas partes do mundo. Os esporos são extremamente resistentes a mudanças ambientais e desinfetantes e persistem no solo por muitos 15 anos. A taxa de letalidade no carbúnculo é aproximadamente 100%, porém, em sua maioria, os surtos podem ser prevenidos pela vacinação, única forma atualmente. 2) Gangrena gasosa: causada principalmente pelo C. septicum, também uma bactéria formadora de esporos, e se apresenta 20 clinicamente como uma mionecrose de evolução aguda, com letalidade de cerca de 100%. O tratamento existente é dispendioso e, como no

3 2/8 caso do carbúnculo sintomático, a vacinação é a única forma de prevenção. A gangrena gasosa é uma infecção exógena, produzida por um ou mais dos seguintes microorganismos: C. septicum, C. chauvoei, C. novyi tipo A, C. sordellii e C. perfringens tipo A. Estes 5 microorganismos encontram sua via de infecção através de feridas na pele e membranas mucosas ocasionadas por castração, tosquias, partos, procedimentos vacinais, punções venosas, entre outros. A doença pode ser resultado da infecção por uma das espécies citadas ou por uma associação de mais de uma espécie. io 3) Botulismo: é uma das principais doenças de bovinos adultos podendo acometer outras espécies como os ovinos e caprinos, sendo responsável por levar um grande número de animais à morte. Em relação aos bovinos, a principal categoria afetada é a de vacas em gestação e/ou lactação criadas em pastagens deficientes em fósforo, as 15 quais passam a desenvolverem o hábito da osteofagia ou sarcofagia (forma endêmica), podendo ingerir as neurotoxinas Cl e D produzidas pelo C. botulinum tipos C e D (Lobato & Almeida, 1997). A intoxicação pode também ocorrer após a ingestão de toxinas presentes em suplementos alimentares, matéria orgânica em putrefação e água 20 estagnada (forma esporádica). No Brasil, foram descritos diversos surtos de botulismo, tendo como fonte de intoxicação a cama de frango

4 3/8 empregada como suplemento alimentar, levando alguns milhares de animais ao óbito (Dõbereiner & Dutra, 2004 Comunicado Técnico 72, EMBRAPA). Podemos contar com o tratamento para o botulismo com o soro Botulin CD, mas em áreas de risco, indica-se a vacinação e a 5 retirada de possíveis fontes de toxinas como principais formas de prevenção. 4) Tétano: é uma toxi-infecção letal que acomete todos os mamíferos, através da contaminação de feridas pelos esporos de C. tetani (bacilo de Nicolaier), embora existam relatos de surtos de tétano io em bovinos em que nenhuma ferida foi observada, sendo denominado de tétano idiopático. A bactéria é encontrada no solo, mais freqüentemente naqueles adubados com fezes de animais domésticos, e seus esporos do microrganismo podem se manter infectantes no solo por períodos superiores à 40 anos. O bacilo C. tetani produz duas 15 potentes neurotoxinas: tetanospasmina e tetanolisina. Em bovinos, o corte e cura de umbigo de forma inadequada e a castração são uma importante causa de infecção. 5) Hemoglobinúria bacilar: infecção causada por C. haemolyticum (C. novyi tipo D). Ocorre usualmente em bovinos, apesar 20 de poder também acometer ovinos. É geralmente de localização geográfica limitada e está associada a áreas úmidas. Esporos de C.

5 4/8 haemolyticum são ingeridos com alimentos contaminados e alcançam o fígado através da circulação portal, onde permanecem por vários anos, até que se produza condições de anaerobiose necessárias para a germinação do agente. O principal fator predisponente está relacionado 5 à migração de vermes trematódeos pelo parênquima hepático, principalmente por larvas da Fasciola hepática que causam danos ao tecido permitindo condições de anaerobiose para germinação dos esporos. C. haemolyticum produz uma potente lecitinase denominada toxina alfa, que é responsável por uma hemólise maciça. io 6) Enterotoxemias: são afecções nas quais os agentes C. perfringens tipos A-E, C. sordellii, C. septicum e C. difficile multiplicam no trato intestinal dos animais e as exotoxinas por eles produzidas são responsáveis pelos quadros entéricos e sistêmicos. A enterotoxemia causada pela toxina épsilon de C. perfringens tipo D é a de maior 15 importância econômica, sendo uma enfermidade comumente conhecida como doença da superalimentação ou do rim pulposo. Como os demais tipos de C. perfringens, pelo fato do tipo D ser um comensal do trato gastrointestinal, o diagnóstico confirmatório desta enfermidade está na dependência direta da detecção de altas concentrações de toxina 20 épsilon produzida pelo agente. A doença é causada pela rápida multiplicação do agente no intestino delgado decorrente principalmente

6 5/8 devido à mudanças bruscas na alimentação, como por exemplo, dietas ricas em carboidratos e proteínas. A toxina épsilon atua sobre o epitélio intestinal, aumentando a permeabilidade vascular. Ao ganhar a circulação geral, chega ao cérebro, rins, pulmões, fígado e coração. 5 Nestes órgãos, a toxina gera um aumento da permeabilidade vascular, culminando em edema. As clostridioses são doenças epidêmicas no Brasil e causam imensos prejuízos a pecuária nacional. O tratamento das clostridioses bovinas é demasiadamente caro e, muitas vezes, fadado ao fracasso. io Como a maioria das clostridioses têm caráter ubíquo, a única maneira de prevenção é através da vacinação. Vacinas polivalentes mostraram ter uma eficácia satisfatória em testes e a campo mantêm uma eficácia indiscutível, prevenindo de maneira eficiente rebanhos contra as clostridioses (ver patente 15 GB947912A, GB901433A). A vacina que está presente no mercado é a Exceli-8, desenvolvida para proteção contra o carbúnculo sintomático, gangrena gasosa, enterotoxemia, edema maligno e tétano. Tal vacina não possui a associação de antígenos contra o 20 botulismo, clostridiose de extrema importância na epidemiologia

7 6/8 pecuária nacional, o que encarece ainda mais o processo de vacinação dos animais. Com o objetivo de minimizar não apenas o custo de vacinação como também o estresse a qual os animais são submetidos 5 durante o processo, a presente invenção refere-se ao desenvolvimento de uma nova associação imunogênica onde antígenos contra tétano, botulismo, gangrena gasosa, carbúnculo sintomático, enterotoxemia, hemoglobinúria bacilar encontram-se em uma única vacina, oferecendo dessa maneira proteção completa contra as clostridioses bovinas de io maior importância para a economia nacional. A presente invenção consiste de uma suspensão estéril (ver composição na tabela 1), obtida através da mistura de cultivos, produzidos em meio líquido, de Clostridium chauvoei (anacultura inativada), Clostridium perfringens (welchii) tipos B, C e D (toxóide), 15 Clostridium septicum (toxóide), Clostridium novyi (Clostridium oedematiens) (toxóide), Clostridium tetani (toxóide), Clostridium sordellii (toxóide/anacultura inativada) e Clostridium botulinum tipos C e D (toxóide) mortos pela adição de formaldeído e adsorvidos em gel de hidróxido de alumínio como adjuvante. 20 Para a preparação da vacina, as cepas são inoculadas em meio Tarozzi, incubadas em condições de anaerobiose por período de 2

8 7/8 a 5 dias, a 37 C. A seguir, as cepas são reinoculadas em meio de peptona bacteriológica, extrato de carne, sulfato de manganês, cloreto de cálcio, fosfato de sódio bibásico e glicose ph 7.0 à proporção de 1:20. Os tempos de incubação (37 C ± 0,5 C) são de 48 horas para C. 5 chauvoei, C. sordellii, C. novyi, C. perfringens e C. tetani e de 5 a 7 dias para C. botulinum C e D. A pureza das culturas é verificada utilizandose testes adequados para cada espécie. Os garrafões ou fermentadores são incubados durante 24 horas (C. chauvoei e C. sordellii) e 6 horas a 8 dias (outros Clostridia), a io temperatura de 37 C e, logo a seguir, mantidos à temperatura de 4 C (tempos variam em função das espécies, ver abaixo), para aumento da liberação de toxinas, por lise bacteriana: C. chauvoei 18 a 22 horas C. sordellii 18 a 22 horas 15 C. septicum 18 a 22 horas C. perfringens - 6 a 12 horas C. novyi 18 a 22 horas C. tetani 72 horas C. botulinum C - 8 a 10 dias 20 C. botulinum D - 8 a 10 dias Os antígenos são purificados por:

9 8/8 I) Centrifugação, no caso das anaculturas inativadas, descartando-se o sobrenadante; II) Fitração em membranas com poros de diâmetro de 2pm; 1 iam; 0,51.1m e 0,2gm. O filtrado resultante é concentrado utilizando-se 5 cartucho tipo prep scale, o qual separa as partículas conforme o peso molecular. A vacina é apresentada sobre a forma de suspensão, sendo que a concentração de formaldeído residual entre não deve ultrapassar 0,2mg/mL e a faixa de concetração do adjuvante (hidróxido de alumínio) io é de 4 a 5 mg/ml. O esquema de vacinação dos animais deve ser: I) Aplicação via subcutânea, observando-se os cuidados usuais de assepsia. II) Bovinos: Vacinar os bezerros aos 4 meses de idade, 15 revacinar 30 dias após e anualmente com 1 dose. III) Ovinos e Caprinos: Vacinar os cordeiros ou cabritos aos 30 dias de idade. Revacinar 30 dias após e anualmente com 1 dose. IV) Suínos: Vacinar os leitões aos 30 dias, revacinar 30 dias após e anualmente com 1 dose.

10 1/2 REIVINDICAÇÕES 1) Composição vacinai multi-valente contra carbúnculo sintomático, gangrena gasosa, enterotoxemia, edema maligno, tétano caracterizada por ser ativa contra botulismo; 5 2) Composição vacinai de acordo com a reivindicação 1, caracterizada por apresentar de germes/dose de anaculturas de Clostridium sordellii: 3) Composição vacinai de acordo com as reivindicações 1 e 2, caracterizada por apresentar um mínimo de 10 U.I./dose de toxáide de io Clostridium novyi; 4) Composição vacinai de acordo com as reivindicações 1, 2 e 3, caracterizada por apresentar um mínimo de 10 U.I./dose de toxóide de Clostridium septicum; 5) Composição vacinai de acordo com as reivindicações 1, 2, 3 e 4, 15 caracterizada por apresentar um mínimo de 10 U.I./dose de toxóide de Clostridium perfringens C; 6) Composição vacinai de acordo com as reivindicações 1, 2, 3, 4 e 5, caracterizada por apresentar um mínimo de 10 U.I./dose de toxóide de Clostridium tetani;

11 2/2 7) Composição vacinal de acordo com as reivindicações 1, 2, 3, 4, 5 e 6, caracterizada por apresentar 5 mg/ml do produto de toxóide de Clostridium botulinum D; 8) Composição vacinai de acordo com as reivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6 e 5 7, caracterizada por apresentar no máximo 0,2 mg/ml de formol residual.

12 1/1 RESUMO Patente de Invenção: "VACINA CONTRA O CARBÚNCULO SINTOMÁTICO, GANGRENA GASOSA, ENTEROTOXEMIA, EDEMA MALIGNO, TÉTANO E BOTULISMO", não existem disponíveis no 5 mercado atualmente, vacinas multi-valentes contra o carbúnculo sintomático, gangrena gasosa, enterotoxemia, edema maligno, tétano e botulismo simultaneamente. A presente invenção consiste de tal composição vacinai, com eficácia comprovada, que além de reduzir o estresse das múltiplas vacinações, ainda reduz os custos operacionais.