Amanda Brondani Mucellini, Ariel Brasil, Raul Moreira Oliveira & Tiago Caetano Edruziane

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1 Página12 AVALIAÇÃO DO EFEITO PROTETOR DE DUAS DIFERENTES MARCAS DE BLOQUEADORES SOLARES NA VIABILIDADE CELULAR E NO DANO DE DNA DE UMA AMOSTRA EX-VIVO DE LEUCÓCITOS HUMANOS Amanda Brondani Mucellini, Ariel Brasil, Raul Moreira Oliveira & Tiago Caetano Edruziane Trabalho realizado, no ano de 2010, pelos acadêmicos do primeiro semestre do curso de Ciências Biológicas Núcleo Comum/ UFSM, na disciplina de Biologia Celular. RESUMO A radiação ultravioleta (UV) pode induzir a danos e à morte celulares. Existem vários agentes artificiais que atuam como fotoprotetores. O uso de loções para pele com filtro solar nas partes expostas do corpo é amplamente divulgado como uma eficiente medida de fotoproteção. No mercado, existem muitas marcas comerciais de protetores solares para o acesso dos consumidores. Uma pesquisa divulgada mostra que o teste feito pela Associação Brasileira de Defesa do Consumidor (ProTeste) avaliou dez marcas e reprovou oito delas com a pior nota. Neste experimento, buscou-se analisar a viabilidade celular e o dano de DNA de leucócitos humanos em exposição à UV, comparando-se o efeito protetor de duas diferentes marcas de bloqueadores solares distribuídos no mercado, baseando--se na classificação da ProTeste. Apesar das significativas limitações deste experimento, pode-se observar que a marca de bloqueador solar B parece não ter a melhor proteção contra a radiação UV em amostras de leucócitos ex-vivo, quando comparada à marca A, sendo um resultado compatível com o divulgado pela ProTeste. Palavras-chave: proteção solar; radiação UV; viabilidade celular; dano de DNA; leucócitos; bloqueador solar. Introdução A radiação ultravioleta (UV) é uma onda eletromagnética não-ionizante presente na natureza terrestre que, além de muitos outros efeitos, promove danos em todos os seres vivos, inclusive no ser humano (SILVA, 2008). Ela pode provocar mudanças bioquímicas e alterar a expressão gênica, comprometendo a integridade da epiderme, as propriedades da imunidade inata e predispondo o aparecimento de processos patológicos (GODAR, 1996). A UV promove a formação de diversos tipos de lesões de DNA, nas quais possuem diferentes propriedades mutagênicas (SCHUCH, 2009). Há danos que ocorrem pela direta absorção dos fótons de menores comprimentos de onda pelas bases nitrogenadas do DNA, resultando principalmente em reações de dimerização entre bases de pirimidina que estão dispostas lado a lado. Porém, há ainda danos no DNA induzidos pela UV de forma indireta (PIETTE, 1986). A energia da UV pode ser transferida para o oxigênio molecular, gerando as espécies reativas de oxigênio (EROs) que também têm capacidade de danificar a molécula de DNA, além de outras estruturas celulares. A oxidação de bases também é indicada como um tipo de lesão mutagênica, onde a sua produção indireta via EROs é

2 Página13 sugerida como a base da mutagênese e carcinogênese em estudos com luz UV (EPE, 1991). As células são capazes de localizar e reparar este DNA danificado. Se esta alteração for severa e não se pode corrigir, inicia-se a apoptose ou morte celular, que, segundo estudos, são caracterizadas por condensação da cromatina, diminuição do volume celular e extrusão de organelas citoplasmáticas (HOLLMANN, 2008). Estes dois mecanismos (apoptose e morte celular) evitam a transmissão da mutação às células filhas, de modo que, se estes processos de reparação falharem, se produziria uma proliferação celular anormal que poderia desencadear a carcinogênese. A utilização de fotoprotetores favoreceu a diminuição de alguns efeitos não desejados da UV. A eficácia de um fotoprotetor é avaliado geralmente baseando-se na sua capacidade para prevenir o eritema na pele humana, mas o estudo da diminuição do eritema por parte dos fotoprotetores não é capaz de dar suficiente informação sobre outros efeitos da radiação solar, como o câncer de pele ou a imunossupressão. Já que as alterações no DNA produzidas pela radiação UV parecem ser um passo obrigatório no desenvolvimento do câncer da pele, a eficácia de um fotoprotetor poderia ser estudado através da avaliação também da sua capacidade de prevenir ou evitar as referidas alterações (DELGADO, 2005). Existem vários agentes artificiais que atuam como fotoprotetores. O uso de loções para pele com filtro solar (o protetor solar) nas partes expostas do corpo é amplamente divulgado como uma eficiente medida de fotoproteção (SILVA, 2008). O Fator de Proteção Solar (FPS) associado a essas loções mostra a redução da dose eritematosa mediante o uso das mesmas. No mercado, existem muitas marcas comerciais de protetores solares para o acesso dos consumidores. Uma pesquisa divulgada por alguns jornais brasileiros de destaque, como O Estado de São Paulo, mostra que o teste feito pela Associação Brasileira de Defesa do Consumidor (ProTeste) avaliou dez marcas e reprovou oito delas com a pior nota (ODA, 2009). Entretanto, a ProTeste não divulgou o laboratório e a metodologia usados. Além disso, a ProTeste confronta a Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA), que regulamenta a liberação e a comercialização desses produtos no Brasil. A assessoria de imprensa da ANVISA divulgou que não pode avaliar os resultados apresentados sem tomar conhecimento das metodologias empregadas e afirma que, para serem registrados pela ANVISA, as fabricantes precisam apresentar testes de eficácia de uso do produto acabado. A Sociedade Brasileira de Dermatologia, por sua vez, não reconhece os resultados da pesquisa. Diante desta situação, muitas pessoas permaneceram inseguras ao escolher a marca do protetor solar para comprarem e usarem. Neste experimento, buscou-se analisar a viabilidade celular e o dano de DNA de leucócitos humanos em exposição à UV, comparando-se o efeito protetor de duas diferentes marcas de bloqueadores solares distribuídos no mercado, baseando-se na classificação da ProTeste. A ProTeste realizou diversos testes com as diferentes marcas de bloqueador solar. Neste experimento, foi feito o teste de fotoinstabilidade, que mede a resistência à luz e ao calor, com e sem a exposição dos bloqueadores solares a uma temperatura de 40 C antes da exposição à UV. Meteriais e Métodos 1. Amostra

3 Página14 A amostra de sangue foi coletada de um voluntário do sexo feminino, com vinte e oito anos de idade. Os 10 ml de sangue total coletados foram rapidamente transferidos para tubos Vacutainer com heparina (BD Diagnostics, Plymouth, UK) e centrifugados a 3000 RPM por 10 minutos. Logo após, foi feita a retirada dos leucócitos, a lavagem destes com solução lisante e a sua ressuspensão em solução de Hanks (Martin-Comin et al, 2002). Em seguida, foi feita a contagem de células na Câmara de Neubauer, para se estimar a quantidade de células que deveriam ser distribuídas em cada tratamento. 2. Tratamento Foram utilizadas duas marcas de protetores solares, com FPS igual a 30, conforme a pesquisa da ProTeste (ODA, 2009): Protetor A, que recebeu nota geral como Bom, sendo Muito bom no teste de fotoinstabilidade; e o Protetor B, com nota geral Ruim, sendo Ruim no teste de fotoinstabilidade. Cerca de 10 ml de bloqueador solar de cada marca foram colocados em uma estufa a 40 C durante uma hora antes de serem distribuídos no plástico de PVC. As placas de petri utilizadas possuíam divisão em três campos. Cada campo recebeu 5 ml de solução de Hanks e 150 µl da suspensão de leucócitos em Hanks. As placas foram vedadas por um filme plástico de PVC e os campos que foram cobertos por bloqueador solar foram secos com um secador de cabelo para que a superfície se tornasse transparente, antes de serem tratadas com a radiação UV (SARTORI et al., 2008). O experimento consistiu em cinco amostras, sendo uma controle, sem protetor solar sobre o filme de PVC, e as outras quatro com protetor solar das diferentes marcas sobre o filme de PVC (dois campos cobertos pelos bloqueadores a temperatura ambiente e dois campos cobertos pelos bloqueadores expostos a 40ºC por 60 minutos antes do tratamento). As amostras foram expostas durante 30 minutos à radiação ultravioleta de 300nm. 3. Análise da Viabilidade Celular Para ser verificada a perda da integridade da membrana decorrente dos efeitos da radiação UV, foi utilizada o método de exclusão do corante Trypan Blue, técnica que permite diferenciar as células vivas das mortas. A viabilidade celular foi expressada como uma percentagem do valor da amostra controle. 4. Análise do Dano no DNA Para ser determinado o dano no DNA, foi feito o Ensaio Cometa Alcalino, que pode detectar os fragmentos de DNA originados diretamente pela radiação UV e os sítios alcalino labiles (mutações no DNA sensíveis a quebrar em condições alcalinas). Os dímeros de pirimidina são detectados indiretamente quando as células iniciam o processo de reparação, no qual, ao substituí-los, são gerados fragmentos de DNA (HARTMANN, 1999). Este teste permite avaliar as lesões no DNA em nível de células individuais imersas em agarose (SINGH, 1995). Depois da ruptura das membranas celulares, a solução alcalina desenrola e separa as duas linhas de DNA. Durante a eletroforese posterior, os fragmentos gerados deslocam-se mais rapidamente desde o núcleo celular originando a cauda do cometa, assim a quantidade de DNA e/ou dimensão da cauda permitem avaliar o dano provocado pela radiação UV. Cinquenta células foram selecionadas e analisadas (lâminas em duplicata de cada amostra). As células foram visualmente classificadas de acordo com o comprimento da cauda. A classificação variou de dano 0

4 Página15 (sem migração) a dano 4 (máxima migração) (Fig. 1). Tabela 1. Migração do DNA no Ensaio cometa pela avaliação do dano da exposição à radiação UV em leucócitos humanos (Tratamentos: T1 controle sem exposição à UV, sem bloqueador solar no PVC ; T2 controle, com exposição à UV, sem bloqueador solar no PVC; T3 Com bloqueador da marca A a temperatura ambiente; T4 Com bloqueador da marca A a 40ºC; T5 Com bloqueador da marca B a temperatura ambiente; T6 Com bloqueador da marca B a 40ºC) Figura 1. Classificação visual proposta por Collins et al. Imagens de cometas a partir de linfócitos coradas com DAPI Resultados e Discussão No presente estudo, não foram observadas diferenças na viabilidade celular entre a amostra controle e as amostras cobertas com bloqueadores solares. Uma razão para isso seria que o tempo de exposição à UV (trinta minutos) foi maior do que as células poderiam suportar vivas. Segundo um teste prévio feito por Montagner (2010), quinze minutos é o tempo ideal para que sejam evidentes os danos causados pelo estresse oxidativo pela presença de EROs induzido pela radiação UV (alta peroxidação lipídica e o decréscimo dos níveis de catalase e superóxido dismutase) sem que haja morte celular. O dano de DNA induzido pela exposição à radiação UV nos diferentes tratamentos é mostrado na Tabela 1 e na Figura 2. Observa-se um maior índice de dano nas células expostas à UV com bloqueador solar da marca B (tratamentos 5 e 6) que com bloqueador da marca A (tratamentos 3 e 4). Pode-se verificar também que os bloqueadores de ambas as marcas parecem conservar melhor a característica protetora contra a radiação a temperatura ambiente (tratamento 3 e 5) que a temperatura de 40ºC (tratamento 4 e 6). Notou-se que após a exposição à UV, os leucócitos formaram pellets, o que dificultou a pipetagem das células, tanto para análise da viabilidade celular na Câmara de Neubauer, quanto para análise de dano de DNA no Ensaio Cometa. Possivelmente, as células sofreram alguma alteração na estrutura da membrana celular com a radiação UV e aderiram-se umas às outras (peroxidação lipídica). Para um possível futuro estudo, poderia ser contornada esta limitação adicionando-se o quelante EDTA (ácido etilenodiamino tetra-acético) nas placas. Apesar das significativas limitações deste experimento, pode-se observar que a marca de bloqueador solar B parece não ter a melhor proteção contra a radiação UV em amostras de leucócitos ex-vivo, quando comparada à marca A, sendo um resultado compatível com o divulgado pela ProTeste.

5 Página16 Figura 2. A) Índice de dano no DNA das células em todos os tratamentos. B) Comparação dos danos entre as duas marcas de bloqueador solar a temperatura ambiente. C) Comparação dos danos entre as duas marcas de bloqueador solar a 40ºC. Referências COLLINS; AG, M.; SJ, D. The kinetics of repair of oxidative dna damage (strand breaks and oxidised pyrimidine) in human cells. Mutat Res, p , DELGADO, E., RECASENS, MM., TRULLÀS, C., PELEJERO, C Avaliação da eficácia de um fotoprotector através do teste cometa sobre fibroblastos 2005 Crónica ISDIN 95DP36 02/05. EPE, B. Genotoxicity of singlet oxygen. Chem Biol Interact. 1991; 80(3): GODAR, D. E. Preprogrammed and Programmed Cell Death Mechanisms of Apoptosis: UV-Induced Immediate and Delayed Apoptosis Photochemistry and Photobiology, 1996, 63(6): HARTMANN A. Effects in the comet assay: How can you tell a good comet from a bad comet. EEMA. Young Scientist Award Lectute HOLLMANN, G. Avaliação do efeito da radiação ultravioleta a sobre porcentagens de fagocitose em hemócitos e concentração da glicose na hemolinfa do camarão-rosa Farfantepenaeus paulensis Atlântica, Rio Grande, 30(2) , KUCSERA, J. Simple detection method for distinguishing dead and living yeast colonies Journal of Microbiological Methods 41(2000) LORETO, E. L. S. ; SARTORI, P.H.S. ; SEPEL, L. M. N.. Radiações,Moléculas e Genes. Atividades didático-experimentais 1.ed.

6 Página17 Ribeirão Preto, SP: Sociedade Brasileira de Genética - SBG, v p. MARTIN-COMIN, J., CARDOSO, V. N., PLAZA P., ROCA M. Hanks Balanced Salt Solution: an Alternative Resuspension Medium to Label Autologous Leukocytes. Experience in Inflammatory Bowel Disease Braz. arch. biol. Technol. vol.45 no.spe Curitiba Sept Pro Teste reprova oito entre dez protetores solares FPS 30 UOL Ciência e Saúde, 1 dez Disponível em: de/ultnot/2009/12/01/pro-teste-reprovaoito-entre-dez-protetores-solares-fsp-30.jhtm Acessado em 2 de maio de Jornal O Estado de São Paulo, São Paulo, p. A16, 1 dez Disponível em: =36659&nome=301&cliente=301&a=301&c=3 01&m=36659 Acessado em 13 de abril de ODA, F. Só 2 filtros solares passam em testes Jornal O Estado de São Paulo, São Paulo, p. A16, 1 dez Disponível em: =36659&nome=301&cliente=301&a=301&c=3 01&m=36659 Acessado em 13 de abril de SCHUCH, A. P. Avaliação da ação genotóxica induzida pela radiação ultravioleta solar na molécula de DNA f. Tese (Doutorado em Biotecnologia) Universidade de São Paulo, Instituto Butantan, Instituto de Pesquisas Tecnológicas, São Paulo, SINGH, N., MCCOY, M., TICE, R., SCHNEIDER, E., A simple technique for quantification of low level sof DNA damage in individuals cells. Exp. Cell Res , SILVA, A. Medidas de radiação solar ultravioleta em Belo Horizonte e saúde pública. Rev. Bras. Geof. [online]. 2008, vol.26, n.4, pp ISSN X. PIETTE, J., MERVILLE-LOUIS, M. P., DECUYPER, J. Damages induced in nucleic acids by photosensitization. Photochem Photobiol Dec;44(6):

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