Interação de Alquilfosfolipídios de atividade anti-neoplásica com membranas modelos. Resumo

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1 Interação de Alquilfosfolipídios de atividade anti-neoplásica com membranas modelos. Resumo Tem sido demonstrado recentemente na literatura que a interação de alquilfosfolipidios (ALPs) com membranas pode levar à morte celular, e o mecanismo de ação difere de quimioterápicos clássicos que atuam em DNA. Tem sido proposto que os domínios lipídicos podem estar relacionados como porta de entrada dos ALPs favorecendo a internalização celular para posterior inibição da síntese de fosfatidilcolina em diferentes níveis. Para entendermos melhor o mecanismo de ação do alquilfosfolipídio 10-(octiloxi) decil-2-(trimetilamonia) etil fosfato (ODPC), realizamos um primeiro trabalho focalizando a ação de ODPC em membranas modelo constituídas por vesículas unilamelares gigantes, GUVs, compostas por DOPC:SM:Col na razão molar 1:1:1 que apresentam coexistência de fases liquido ordenada Lo liquido desordenada Ld (conhecida como rafts lipidicos). Observações de microscopia de fluorescência e de contraste de fase evidenciaram que ODPC promove a destestabilização da separação de fases favorecendo a mistura homogênea de lipideos (trabalho recentemente publicado na BBActa: Biomembrane, 2013 doi: /j.bbamem ). Entretanto, tal reorganização é termodinâmicamente instável, provavelmente porque a composição lipídica estudada está próxima da fronteira de coexistência de fase homogênea Lo e coexistência Lo-Ld. Visando melhor compreender o mecanismo de ação dos APLs em função do parâmetro termodinâmico temperatura, da composição lipídica e das propriedades biofísicas das membranas lipídicas como fluidez, no presente projeto pretendemos investigar como as moléculas de ODPC alteram o diagrama de fases ternário DOPC:SM:Chol, a temperatura ambiente e a 37 C, por microscopia óptica (MO) de contraste de fase e fluorescência e ressonância paramagnética eletrônica (EPR). Enquanto MO é capaz de detectar dominios lipídicos maiores que 1 m, EPR é sensível a diferentes graus de empacotamento da membrana evidenciando, assim, a formação de dominios na escala nanométrica, associados a mudanças na fluidez da membrana. Neste caso, serão estudadas vesículas unilamelares grandes (LUVs) com a mesma composição lipídica das GUVs, em ambas temperaturas. Os resultados também serão complementados com a ação de outro ALP, perifosine, o qual foi demonstrado ter um efeito citotóxico maior que o de ODPC.

2 Introdução Alquilfosfolipídios (ALP) são moléculas estruturalmente relacionadas com um fosfolípido de ocorrência natural, 2-lisofosfatidilcolina (lisolecitina, LPC), e apresentam efeitos promissores citotóxicos em diferentes linhas de células neoplásicas. A ação de ALPs é preferencialmente via a membrana celular [1]. Há um interesse crescente na sua atividade biológica, porque eles induzem a apoptose em células tumorais e podem servir para complementar as quimioterapias anticancerígenas já existentes [2]. Entre os ALPs mais conhecidos estão a edelfosina [3], a miltefosina [4], e a perifosina [5]. Tem sido mostrado que os ALPs se acumulam em membranas celulares, resistem à lipase celular, interferem com a base de lipídios de transdução de sinal bem como com a biossíntese de fosfolipídios [6], o que leva à apoptose, inibe a neovascularização, evita a invasão e induz a diferenciação das células tumorais [7]. Edelfosina pode exercer o seu efeito pró-apoptótico através da ativação de Fas/CD95 [8] enquanto que a perifosina pode induzir a interrupção do ciclo celular e levar à apoptose de linhas celulares de carcinoma humano através do bloqueio da fosforilação de AKT [9]. Também tem sido proposto que edelfosina afeta a composição proteíca de lipídios com domínios de leveduras [10] e células leucêmicas [8,11], em que a quantidade de colesterol desempenha um papel importante. De maneira interessante, foi proposto que os domínios lipídicos podem estar relacionados como porta de entrada dos ALPs favorecendo a internalização celular para posterior inibição da síntese de fosfatidilcolina em diferentes graus, e induzir apoptose em linfomas e células leucemicas [12,13]. É bem conhecido que os domínios lipídicos são enriquecidos em colesterol, esfingolipídios e proteínas que participam em diversos processos celulares, tais como a transdução de sinal e de tráfico lipídico [14]. Os domínios lipídicos apresentam uma coexistência de fases no plano da membrana liquido-ordenada (Lo) e liquido-desordenada (Ld) da ordem de centenas de nanômetros em células vivas [15]. Eles também podem ser observados como domínios microscópicos em sistemas de membranas isoladas [16,17]. Certamente, moléculas que afetam a separação de fases lipídica podem ter efeitos importantes nas respostas fisiológicas. O alquilfosfolipídio 10-(octiloxi) decil-2-(trimetilamônio) etil fosfato, ODPC, originalmente sintetizado por Agresta e col. [18], mostrou efeitos citotóxicos em algumas linhas de células cancerígenas comparável com os outros ALPs, mas com menor atividade hemolítica e citotoxicidade. Em particular, os grupos do prof. Pietro Ciancaglini (FFCLRP-USP) e do prof.

3 Lewis Joel Greene (FMRP-USP) observaram que ODPC (10 50 µm) induz a apoptose e inibe a proliferação de células leucemicas, poupando as células hematopoiéticas e epiteliais normais [19]. Além disso, uma perda precoce de Lat2, um adaptador protéico associado com os domínios lipídicos na sua forma palmitoilada, se dá na fração das células leucêmicas que é rica em domínios lipídicos dentro de 3 horas após o tratamento com 25 µm de ODPC [20]. Entretanto, o papel dos domínios lipídicos não é claro e bem compreendido. A fim de melhor compreendermos o mecanismo de ação da molécula de ODPC via coexistência de fases Ld-Lo, realizamos um primeiro estudo utilizando membranas modelo constituídas por vesículas unilamelares gigantes, GUVs, aonde investigamos como a membrana lipídica responde à adição de ODPC na solução externa às membranas. Verificamos que o principal efeito da molécula de ODPC, em concentrações inferiores a CMC (200 M [19]), é promover o rompimento da membrana ao longo de uma hora de observação em sistemas binários compostos de um lipídio insaturado, DOPC, e colesterol (Col) ou DOPC e esfingomielina (SM), em menor ou maior grau, dependendo da composição da membrana. Os resultados mostram que membranas compostas de SM ficam mais protegidas que as formadas com colesterol. Por outro lado, ODPC não afeta a integridade da membrana para GUVs compostas por uma mistura homogênea de DOPC:Col:SM (1:1:1), mas é de fato capaz de perturbar os domínios lipídicos favorecendo, em poucos minutos de contato, uma reorganização dos lipídios levando a um mistura homogênea. Entretanto, após cerca de 20 minutos de interação da molécula de ODPC com a bicamada lipídica os domínios voltam a aparecer sobre a superfície da membrana, seguido de um rompimento da mesma com total destruição da membranam (Figura 1). Figura 1 a) imagem da vesícula composta de DOPC:SM:Chol (1:1:1) sem adição de ODPC, mostrando que há domínios da membrana. b) 3 minutos após adição de 100 µm de ODPC, vesícula já sem separação de fase, Lo-Ld. c) 30 minutos de interação a membrana volta a ter separação de fase, Lo-Ld. d) vesícula desestabiliza e estoura.

4 Além do mais, esse surpreendente efeito foi comparado com o promovido pela perifosina na coexistência de fase Ld-Lo cujos resultados mostraram que a interação da perifosina com a membrana é mais forte, pois é observada uma sutil reorganização dos lipídios entre 17 e 20 minutos de incubação da perifosina, seguido por uma diminuição da membrana e logo uma ruptura. Isto é, não houve tempo suficiente para que tivesse uma reorganização dos lipídios para haver uma separação de fase Ld-Lo como ocorreu com a molécula de ODPC. Esse trabalho foi recentemente publicado na Biochimica et Biophysica Acta Biomembranes (janeiro de 2013) [21]. Notamos, entretanto, que a composição lipídica estudada está no limite do domínio de coexistência de fases, como podemos observar no diagrama de fases da Figura 2 [22], à temperatura ambiente no qual os experimentos foram realizados. Provavelmente, a inserção de ODPC na membrana altera os limites de fases das misturas de DOPC, SM e Col, diminuindo a temperatura de transição de fases [22]; os lipídios segregam subsequentemente para domínios lipídicos, refletindo que a fase homogênea deve ser termodinamicamente instável. Assim, a fase ternária pseudo-homogênea de ser muito próxima do limite de uma fase líquida para coexistência de transição de fases liquida. A redistribuição de lipídios na membrana conduz à ruptura das GUVs.

5 Figura 2 Diagrama de fases de uma mistura ternária de lipídios, DOPC:PSM:Col. A região em que é observada a transição da miscibilidade é identificada pelos círculos negros e a superfície colorida corresponde ao ajuste extrapolado dos valores medidos da T mix. Os círculos abertos indicam que somente uma fase líquida está presente abaixo de 10 C. E os quadrados cinzas indicam que núcleos de domínios sólidos se formam a partir de uma fase líquida uniforme quando a temperatura é abaixada. (extraído de Veatch e col. [22]) Portanto, a fase inicial de ruptura dos domínios lipídicos por duas moléculas, ODPC e perifosina, e talvez outros ALPs, através da promoção da mistura de lipídios, pode ser correlacionados com a sua toxicidade sobre as células neoplásicas, desde sua seletiva (des)associação de proteínas essenciais dentro dos microdomínios lipídicos devem ser levados em conta na membrana plasmática. Esses efeitos de ruptura de membranas com domínios também tem sido recentemente reportado para os derivados de colesterol [23] e da vitamina E [24]. Neste último caso, Muddana e col. [24] mostraram por simulação de dinâmica molecular que vitamina E atua como linactante particionando preferencialmente nos limites do domínio e diminuindo a tendência para a formação de domínio. Por outro lado, Carrer e col. [23] mediu o coeficiente de difusão de alguns derivados do colesterol por espectroscopia de correlação de fluorescência e demonstrou que esses análogos de colesterol contribuem para um aumento dos coeficientes de difusão favorecendo uma mistura de lipídios dentro da membrana. Além disso, os experimentos realizados com monocamada lipídica de SM:Col contendo domínios lipídicos semelhantes demonstraram que a edelfosina tem um efeito de fluidificação do

6 sistema misto [25]. Com base nessas constatações, pode-se pensar que a ODPC pode ter um efeito similar sobre as bicamadas lipídicas, de tal forma que a molécula de ODPC pode promover alterações na fluidez da membrana, como foi anteriormente revelado por DSC para a interação de ODPC com membranas de DPPC [19]. Portanto, é de extrema importância a continuidade dos estudos de ALPS em membranas modelo, visando compreender o mecanismo de ação destas moléculas em função de parâmetros termodinâmicos e propriedades biofísicas das membranas lipídicas como fluidez. Neste contexto, pretendemos no presente projeto investigar como as moléculas ODPC e perifosine agem em membranas explorando outras composições lipídicas do diagrama de fases (Figura 2), a temperatura ambiente e a 37 C, por video-microscopia de contraste de fase e fluorescência. Além disso, em paralelo, investigaremos como os ALPs afetam o empacotamento de bicamadas lipídicas por ressonância paramagnética eletrônica (EPR). Neste caso, serão estudadas vesículas unilamelares grandes (LUVs) com a mesma composição lipídica das GUVs, para inferirmos se e como os ALPs alteram a fluidez da membrana. No caso de membranas contendo domínios lipídicos, a técnica de EPR pode complementar as informações obtidas por MO sobre a ação dos ALPs na membrana, uma vez que a técnica é sensível a variações de fluidez e empacotamento [26]. Trabalhos de F. Goni e D. Marsh mostram que é possível analisar diferentes espectros de EPR em função de composição lipidica e formação de domínios da ordem de 1 a 2 nm [26,27,28]. Objetivos: Geral: Investigar a ação de ALPs, em particular ODPC e perifosine, em membranas modelo de diferentes composições lipídicas, visando entender como a presença de fases Ld-Lo (domínios lipídicos), ou o dominio de fases ordenadas, influencia no mecanismo de ação destas moléculas. Especifico: Explorar o diagrama de fases (Fig. 2) variando temperatura e composição das GUVs utilizando a técnica de microscopia ótica (MO) de contraste de fase e fluorescência.

7 Investigar a localização dos ALPs em GUVs cuja composição lipídica formam regiões de coexistência de fases Lo-Ld, por MO, buscando observar se os ALPs se localizam nas fases Lo ou Ld, são homogêneamente distribuídos, ou se localizam nas fronteiras de separação de fases atuando nos defeitos hidrofóbicos. Investigar a variação no grau de empacotamento das bicamadas lipídicas, utilizando a técnica de ressonância paramagnética eletrônica, EPR. Comparar, e complementar, os resultados obtidos com GUVs por MO com os de LUVs por EPR. Materiais e Métodos Materiais Serão utilizados os fosfolipídios 1.2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DOPC), esfingomielina de cérebro (SM), colesterol (Col) e a sonda fluorescente Rodamina-DOPE [1,2- dioleoil-sn-glicerol-3-fosfoetanolamina-n-(lissamine rodamina B sulfonil)] todos obtidos da Avanti Polar Lipids. Glicose, sacarose e os marcadores de spin: metil éstaer ácido esteárico 5- doxil (5-MESL), metil éster ácido esteárico 12-doxil (12-MESL) e metil éster ácido esteárico 16- doxil (16-MESL) adquiridos da Sigma-Aldrich. 1-palmitoil-2-estearoil-(5-doxil)-sn-glicero-3- fosfocolina (5-PCSL), 1-palmitoil-2-estearoil-(12-doxil)-sn-glicero-3-fosfocolina (12-PCSL) e 1- palmitoil-2-estearoil-(16-doxil)-sn-glicero-3-fosfocolina (16-PCSL) adquiridos pela Avanti Polar Lipids. As moléculas ODPC e perifosina serão sintetizadas e fornecidas pelo grupo do Prof. Dr. Greene. Equipamentos Na preparação das vesículas gigantes serão utilizados um gerador de função Minipa MFG- 4201A, um multímetro digital DT-830B e um osmômetro Gonotec Osmomat 030. Para a obtenção das imagens das vesículas gigantes vamos usar o microscópio invertido (Zeiss, Axio Observer D1, Germany) equipado com as objetivas Plan Neo-Fluar 63x Ph2

8 (NA 0.75) e A-plan 10x Ph1 (NA 0.25) e uma com câmera AxioCam MRm acoplada. Além de filtros com excitação em nm e emissão em nm (Zeiss filter set 43 HE) e uma lâmpada de mercúrio HXP-R 120W que serão usados para observar as vesículas marcadas com Rodamina-DOPE. Métodos Preparação da membrana modelo Vesículas Unilamelares Gigantes GUVs A formação de vesículas é realizada pelo método de eletroformação [29]. Para o crescimento das vesículas, ~20 L da solução de lipídio será espalhada sobre duas lâminas de vidro recobertas por uma liga de óxido de índio (III) e óxido de estanho (IV) formando uma superfície condutora (ITO). Um espaçador de teflon de 2 mm de espessura é colocado entre as duas lâminas que são presas com duas presilhas formando uma câmara semifechada. A câmara é preenchida por uma solução de sacarose 0,2 moll -1. Então o gerador de função é conectado em cada uma das lâminas e uma tensão de 2 V é aplicada com uma frequência de 10 Hz em corrente alternada por 2 horas (Figura 3). Figura 3 Aparato para preparação das vesículas gigantes pelo método de eletroformação. Neste esquema são mostradas as lâminas cobertas com ITO com o filme de lipídio formado em sua superfície e o espaçador de teflon formando uma câmara, que é preenchida com a solução de sacarose 0,2 moll -1. Também é mostrado o gerador de função utilizado para aplicar uma tensão de 2 V e 10 Hz.

9 Depois desse período de espera tem-se uma solução contendo vesículas gigantes com sacarose dentro e fora da vesícula. Essa solução é então diluída cerca de 10 vezes numa solução de glicose de mesma concentração (0,2 moll -1 ), compondo assim, uma solução de vesículas cujo interior possui sacarose e na parte exterior existe glicose. Essa diferença nas soluções interna e externa permite que haja um contraste, pois o índice de refração da sacarose é diferente do da glicose, possibilitando a observação no microscópio óptico, além de fazer com que as vesículas decantem na lamínula uma vez que a sacarose possui um maior peso molecular, facilitando a observação. Vale ressaltar aqui que as soluções de glicose e sacarose possuem rigorosamente a mesma osmolaridade para evitar problemas de tensão na membrana. Vesículas Multilamelares MLV. Os fosfolipídios usados no preparo das vesículas serão dissolvidos em solvente orgânico, normalmente o clorofórmio. Dessa solução, filmes lipídicos serão obtidos em tubos de ensaio através da evaporação do clorofórmio sob fluxo de N 2 e, em seguida deixados sob vácuo por pelo menos 2 horas para que todo resíduo orgânico seja removido. A próxima etapa é suspender os filmes em solução aquosa levando a obtenção de vesículas multilamelares (MLV). Pode ser que seja necessário colocar em banho de ultrassom por 5 minutos para que todo o filme solte da parede do tubo de ensaio. Para que as membranas se tornem Unilamelares e de tamanho definido, com certa dispersão, a solução deve ser extrusada. Para isso, a solução é colocada em uma seringa e forçada a atravessar uma membrana de policarbonato que tem a função de filtro com diâmetro de poro de 100 nm. Após 30 ciclos, obtém-se uma solução de LUVs, vesículas unilamelares grandes. Para a incorporação dos marcadores de spin, volumes apropriados das soluções clorofórmicas destes serão misturados às soluções orgânicas dos lipídios durante a preparação do filme.

10 Ressonância Paramagnética Eletrônica Para investigar com mais detalhes o efeito das moléculas de alquilfosfolipidios na fluidez da membrana iremos utilizar a técnica de ressonância paramagnética eletrônica (EPR), em colaboração com a Prof a Dr a Shirley Schreier (IQUSP). Para isso usaremos um espectrômetro da Bruker EMX-200 SRC operando em 9 GHz. A análise do espectro de EPR do marcador de spin fornece informações de caráter estrutural e dinâmico da região onde se encontra o marcador (30). Uma das características principais dos espectros de EPR é que, em muitos casos, a posição das linhas no campo magnético (fator g) e os valores de desdobramento hiperfino (A) dependem da direção do campo magnético em relação aos eixos moleculares (anisotropia, [30]). A dependência dos espectros da orientação em relação ao campo magnético é de grande utilidade no estudo de membranas, permitindo o cálculo do parâmetro de ordem, S, que é uma medida da amplitude de movimento do eixo longo molecular de lipídios em uma bicamada ou outras membranas modelo (31). Um aumento em S implica em maior espessura da bicamada e diminuição na flexibilidade da cadeia acil (isto é, aumento da ordem) devido à redução da isomerização trans-gauche. O parâmetro de ordem é calculado utilizando a seguinte equação: S // A ZZ A A A A / 2 XX YY onde Azz, Axx e Ayy são os valores dos componentes principais do tensor de desdobramento hiperfino, os quais são obtidos para o marcador de spin introduzido como impureza sustitucional em um monocristal diamagnético e podem ser encontrados em tabelas [32] e A // e A são os valores de extremos externos e internos, respectivamente, os quais pode ser obtidos para marcadores com movimento axial limitado (por exemplo, marcadores incorporados em bicamadas) (Fig. 4, extraído de Schreier e col. [33]).

11 Figura 4 Espectro de EPR do marcador de spin 5-SASL incorporado em vesículas multilamemar de fosfolipídio (1-palmitoil-2-oleoil-sn-glicero-3-fosfocolina). Mostra como é medido os valores A // e A para o cálculo do parâmetro de ordem, S [33]. A distribuição da nuvem eletrônica ao redor do núcleo de nitrogênio é alterada pela polaridade do meio em que se encontra o radical nitróxido, a qual afeta os tensores g e A. São duas as configurações eletrônicas possíveis para o grupo nitróxido, conforme se vê abaixo (34). Em geral, quando o marcador de spin encontra-se em solventes polares, como a água, o elétron desemparelhado está mais densamente localizado sobre o átomo de nitrogênio (configuração 2), consequentemente o espectro de EPR apresentará um desdobramento hiperfino maior. Assim, as medidas do desdobramento hiperfino isotrópico, a o (e do valor médio do tensor-g, g o ) são sensíveis à polaridade do ambiente. Em sistemas isotrópicos nos quais o marcador tomba rapidamente na escala de tempo do EPR a distância medida entre os picos é o próprio a o. No caso de sistemas que apresentam simetria axial (por exemplo, marcador

12 incorporado em bicamadas) o desdobramento hiperfino é obitido indiretamente pelos valores de A // e A. 1 ( A 3 a eff 0 // 2A No caso de composições lipídicas que apresentam separação de fases Lo-Ld, trabalho recente do grupo do Prof. D. Marsh do Instituto Max-Planch de Biofísica Química em Göttingen, Alemanha, mostra que é possível observar 3 componnetes espectrais. Uma das componentes é bem imobilizada com separação hiperfina exterior de 2 mt, isto é,, o que é atribuido à fase L β (fase gel), o que caracteriza um regime de movimento rápido, que surge a partir das fases Ld e Lo. A componente L β é identificada na região de campo baixo como um ombro ou um alargamento da linha de campo baixo. Na região de campo alto, a componente L β aparece como um aumento da amplitude de campo na posição correspondente à linha hiperfina,. Normalmente, as componentes Ld e Lo não são totalmente resolvidos, mas podem ser identificadas pelas formas das linhas nas regiões de baixo e de alto campo que surgem a partir da sobreposião de diferentes frações desses dois componentes do fluido [26]. Neste projeto, pretendemos seguir a metodologia de análise reportada na literatura (ref), e investigar mais em detalhes as mudanças das propriedades biofísicas que ocorrem na membrana pela ação de ALPs. Este projeto será desenvolvido em colaboração com os grupos do Prof. Dr. Pietro Ciancaglini e Lewis J. Greene que desenvolvem estudos in vivo; e Profa. Dra.Shirley Schreier para medidas de EPR. )

13 Cronograma: Plano de Trabalho Atividades Explorar o diagrama de fase variando composição das GUVs e investigar a interação com a molécula de ODPC utilizando a técnica de microscopia ótica. Explorar o diagrama de fase variando composição das GUVs e investigar a interação com a Perifosina utilizando a técnica de microscopia ótica. Variar temperatura das GUVs e investigar a ação das moléculas de ODPC e perifosina nas membranas Estudo das propriedades conforrmacionais da molécula de ODPC utilizando a técnica espectroscópica, EPR. Estudo das propriedades conforrmacionais da molécula de perifosina utilizando a técnica espectroscópica, EPR. Bimestres x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x Redação de artigos x x x x Referências 1 W.J. van Blitterswijk, M. Verheij, Anticancer alkylphospholipids: mechanisms of action, cellular sensitivity and resistance, and clinical prospects. Curr Pharm Des 14 (2008) J.M Jiménez-López, P. Ríos-Marco, C. Marco, J.L Segovia, M.P Carrasco, Alterations in the homeostasis of phospholipids and cholesterol by antitumor alkylphospholipids, Lipids in Health and Disease 9:33 (2010) M.R. Berger, P.G. Munder, D. Schmahl, O. Westphal, Influence of the alkyllysophospholipid ET-18-OCH3 on methylnitrosourea-induced rat mammary carcinomas. Oncology, 41 (1984) L. Lucas, R. Hernandez-Alcoceba, V. Penalva, J.C. Lacal, Modulation of phospholipase D by hexadecylphosphorylcholine: a putative novel mechanism for its antitumoral activity, Oncogene 20 (2001) P. Hilgard, T. Klenner, J. Stekar, C. Unger, Alkylphosphocholines: a new class of membrane-active anticancer agents. Cancer Chemother Pharmacol 32 (1993) W.J. van Blitterswijk, J.B. Klarenbeek, A.H. van der Luit, M.C. Alderliesten, M. van Lummel, M. Verheij, Fas/CD95 down-regulation in lymphoma cells through acquired alkyllysophospholipid resistance: partial role of associated sphingomyelin deficiency, Biochem J England 425 (2010) S.R. Vink, J.H. Schellens, W.J.van Blitterswijk, M. Verheij, Tumor and normal tissue pharmacokinetics of perifosine, an oral anti-cancer alkylphospholipid, Invest New Drugs 23 (2005)

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