INFLUÊNCIA DA TEMPERATURA E ph NA EXTRAÇÃO DE PROTEÍNAS SOLÚVEIS DE MICÉLIO DE Trichoderma atroviride

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1 INFLUÊNCIA DA TEMPERATURA E ph NA EXTRAÇÃO DE PROTEÍNAS SOLÚVEIS DE MICÉLIO DE Trichoderma atroviride Cantuária, A. L. A.*; Ribeiro, D. P.*; Pedrollo, D. G.**; Castro-Gómez, R. J. H.**; Ueno, C. T.* *COALM/UTFPR Londrina, Brasil **DCTA/UEL, Londrina, Brasil Resumo/Abstract The antimicrobial properties of Trichoderma atroviride metabolites have shown satisfactory results in agriculture application. The mycelia residue can also provide economic interesting biomolecules, reducing its ambient pollution. This research aimed to study the effects of ph and temperature on T. atroviride mycelium autolysis as a process for soluble proteins extraction. Soluble proteins determination was performed using Lowry technique and the effects of ph and temperature were studied applying a factorial design 2 2. The amount of soluble proteins was not significatively affected (p<0.05) by this parameters. The best results were obtained 40 C and ph 6.5. Keywords: Trichoderma. Soluble proteins. Autolysis. Introdução O Trichoderma atroviride é um fungo com propriedades antimicrobianas muito utilizadas em pesquisas nesta área. Pode ser utilizado como antagonista de alguns fitopatógenos de importância econômica, na melhoria da germinação de sementes e no aumento do crescimento de plantas [1]. Papavizas [2] relata que micélios de Trichoderma spp resistentes podem ser utilizados em conjunto com fungicidas para tratamento de sementes, pulverizações foliares ou aplicações no solo, uma vez que este fungo apresenta um comportamento variável em relação aos fungicidas. O estudo das proteínas presentes pode auxiliar no entendimento dos possíveis mecanismos de antagonismo deste fungo, bem como as possibilidades de descobrir biomoléculas de interesse biotecnológico. A extração protéica do micélio pode ser realizada pela autólise, onde em condições adversas de temperatura e ph ocorre uma desordem no sistema enzimático levando ao ataque indiscriminado das enzimas degradativas, resultando na alteração da integridade da parede celular, permitindo a solubilização e liberação dos componentes intracelulares ao meio externo [3]. A utilização do ph ácido ou alcalino para acelerar processos de autólise de micélios de fungos é estudada há décadas, com o objetivo de obter biomoléculas, principalmente 1/5

2 aminoácidos, porém alguns processos de autólise requerem tempo [4] [5]. A quitina e outros polissacarídeos representam 90% da parede celular em fungos filamentosos, conferindo proteção contra fatores ambientais, dissecação e pressão osmótica [6]. Entre esses polissacarídeos está a β-glucana que tem sido utilizada nas indústrias de alimentos como estabilizante de espumas [7]. Estudos mais recentes têm utilizado enzimas para a autólise, porém ainda de custo relativamente elevado [8]. Desta forma, o presente trabalho teve como objetivo verificar os efeitos de ph e temperatura na autólise do micélio de T. atroviride para extração de proteína solúveis, e posteriormente verificar possíveis aplicações. Preparo do inoculo de Trichoderma atroviride A partir de tubo de ensaio com meio Agar Dextrose Batata (ABD) com T. atroviride, pequenos fragmentos foram inoculados com alça de platina no centro de placas de Petri contendo ABD estéril. O fungo foi incubado por quatro dias a 25 C em estufa tipo B.O.D. Após crescimento, os fungos foram armazenados a 5 C por 4 dias até momento de uso. Produção de micélios A produção de micélios foi realizada segundo metodologia de Bonnarme et al. [9] modificada, para tal, o meio foi constituído por solução de sais adicionada de glucose e extrato de levedura, conforme tabela 1. Material e Métodos Microrganismos O fungo T. atroviride, cepa IMI , foi gentilmente cedido pelo Dr. Enrique Galindo do Instituto de Biotecnologia da Universidade Nacional Autônoma de México. O fungo foi armazenado em meio de cultura ágar batata dextrose (ABD) até momento de uso. Meios de cultura Agar Dextrose Batata (ABD) esterilizado em autoclave 121 ºC /15min. e vertidos a quente em placas de Petri de 10 cm de diâmetro, para obtenção de micélio para extração proteica. Tabela 1: Meio de cultura para produção de micélios Glicose 30,0g.L -1 NaNO3 0,6g.L -1 KH2PO4 1,0g.L -1 KCl 0,5g.L -1 MgSO4.7H2O 0,5g.L -1 CaCl2.6H2O 0,008g.L -1 ZnSO4.7H2O 0,001g.L -1 FeSO4.7H2O 0,01g.L -1 Peptona bacteriológica 2,0g.L -1 Extrato de Levedura 1,0g.L -1 Fonte: Bonnarme et al. (2007). O meio foi ajustado a ph 6,0 (HCl/ NaOH). Posteriormente, alíquotas foram transferidas para recipientes onde ocorreu a incubação para produção de micélios, respeitando a relação volume total do recipiente/volume de trabalho de 1:2. Seguiu- se com autoclavagem por 15 min a 121 C e 1 atm. A cada 100 ml de 2/5

3 meio estéril foram inoculados aproximadamente 15 fragmentos de dimensões 0,5 cm x 0,5 cm de meio ABD contendo micélios de T. atroviride, sem presença de esporos, sendo em seguida incubados por 72 horas a 25 C e agitação a 100 rpm. Após o período de incubação, o meio contendo micélios foi filtrado sob vácuo utilizando kitassato e funil de büchner com papel de filtro comum. O micélio extraído foi utilizado para determinação de proteínas solúveis. células não rompidas. Em seguida, no sobrenadante, foi determinado o teor de proteínas solúveis de acordo com o método de Lowry et al. [10], com leitura espectrofotométrica a 660nm, contra um branco de reagentes. O valor protéico foi determinado por meio da relação entre a leitura obtida com a equação da reta desenvolvida com a proteína padrão de albumina bovina. Os resultados obtidos foram transformados e apresentados em µg de proteínas solúveis por ml. Determinação de proteínas solúveis Os micélios de T. atroviride utilizados foram secos em estufa a 80 C com circulação de ar, para determinação de proteínas solúveis em base seca. Para determinar a melhor condição de autólise e produção de proteínas solúveis, foi realizado experimento fatorial 2 2. Os fatores e seus níveis utilizados foram: ph 4,5 (-1) e 6,5 (+1) e temperatura 30 C (-1) e 40 C (+1). Cada corrida foi composta de erlenmeyer com 2,5 g de micélio de T. atroviride adicionados de 8 ml de água destilada estéril com ph correspondente. Os recipientes foram armazenados em estufas reguladas às temperaturas determinadas por 48 horas. Posteriormente os valores obtidos foram transformados em base seca. A amostra autolisada foi vertida em tubos de Falcon e centrifugadas a rpm/7min. a 25 C, objetivando separação das paredes e/ou Resultados A quantidade de proteína solúvel nos extratos líquidos dos autolisados em 48 horas é apresentada na Tabela 2. Tabela 2. Produção de proteínas solúveis/ml Níveis Corrida ph (-1) Temperatura (+1) Proteínas/mL (µg/ml) 1 4,5 30 C 1245, ,5 30 C 1330, ,5 40 C 1895, ,5 40 C 2763,288 O experimento mostrou que na corrida 4 a temperatura e ph elevados foram fatores importantes para uma maior eficiência em extração de proteínas solúveis. Por outro lado, é observado na equação (1) que o coeficiente da temperatura (520,62) é mais que duas vezes maior que o do ph (238,12) e da interação deles (195). 3/5

4 (Eq. 1): Y=1808,91+238,12.X ph +520,62.X T+ 195.X ph.x T Onde: Y = resposta em proteínas/ml; X ph = valor de ph; X T = valor de temperatura; X ph.x T = valor da interação Ou seja, a obtenção de proteínas/ml depende muito mais da temperatura que do ph e da interação entre eles nas condições do experimento em questão, que pode ser observado na Figura 1, onde a região em vermelho representa o efeito intenso da temperatura sobre a extração de proteinas. Figura 1. Efeito da temperatura e ph sobre o teor de proteínas solúveis, no extrato líquido com 48 horas de autólise. Discussão temperatura de 40ºC e ph de 6,5. Em análises realizadas por Oliveira e Gómez [11], as melhores condições para extração de proteínas solúveis da levedura Saccharomyces cerevisiae apresentam uma faixa de temperatura entre 49,0 e 51,0ºC e ph 3,8 a 5,0. É importante ressaltar que processos de otimização de autólise variam de acordo com a fonte de obtenção de proteínas. Conclusão Estudos atuais mostram que tem crescido o interesse de Trichoderma atroviride como fonte de pesquisa por sua propriedade antogonista, bem como o estudo de obtenção de biomoléculas a partir de biomassa de fungos e leveduras. Contudo, o presente estudo constatou que há presença de proteínas solúveis no micélio de T. atroviride nas variáveis estudadas, demonstrando que é possível a obtenção de proteínas a partir do micélio de T. atroviride. A partir destes dados obtidos, pretende-se quantificar proteínas presentes, principalmente enzimas como quitinase e β-glucanases que possuem grande importância comercial, bem como polissacarídeos que possam estar presentes em frações do micélio após autólise. De acordo com os resultados obtidos neste trabalho, verificou-se que as melhores condições para a extração de proteínas solúveis do micélio T. atroviride, foi em 4/5

5 Agradecimentos Agradecemos à Fundação Araucária Programa Ações Afirmativas, pelo apoio sob a forma de bolsas. Referências [1] RESENDE, M.L.; OLIVEIRA, J.A.; GUIMARÃES, R.M.; PINHO, R.G.V.; VIEIRA, A.R. Inoculação de sementes de milho utilizando o Trichoderma harzianum como promotor de crescimento. Ciênc. agrotec., Lavras, v.28, n.4, p , [2] PAPAVIZAS, G. C. Survival of Trichoderma harzianumin soil and pea and bean rhizospheres. Phytopathology, Saint Paul, v. 72, n. 1, p , Jan K.; JAE-HYUK, Y., (2009) Differential roles of the ChinB chitnase in autolysis and cell death of Aspergillus nidulans. Eukaryotic cell, May, p [9] BONNARME, P.; DJIAN, A.; LATRASSE, A.; FÉRON, G.; GINIÈS, C.; DURAND, A.; LEQUÉRÉ, J.-L. Production of 6-pentyl- -pyrone by Trichoderma sp. From vegetable oils. Journal of Biotechnology., v.56, p , [10] LOWRY, O.H.; ROSEMBROUGH, J.J.; FARR, A.L.; RANDALL, R.J. Protein measurement with the fenol reagent. J. Biol. Chem., v.193, p , [11] OLIVEIRA, A.M.; GÓMEZ, R.J.C. (2005) Otimização da extração de proteínas da levedura Saccharomyces cerevisiae. SEMINA. Universidade Estadual de Londrina. v.26, n. 4, p [3] REED, G.; NAGODAWITHANA, T.W. Yeast technology. 2.ed. New York: Van Nostrand Reinhold. p , [4] LAHOZ, R..; REYES, F.; BELTRÁ, R.; GARCIA-TAPIA, C., (1967) The autolysis of Aspergillus terreus in a physiologically acid medium. J. Gen. Microbiol. v. 49 p [5] LAHOZ, R.; IBEAS, J., G., (1968) The autolysis of Aspergillus flavus in an alcaline medium. J. Gen. Microbiol., v. 53 p [6] LATGÉ, J.P. The cell wall: a carbohydrate armour for the fungal cell. Molecular microbiology, v.66, p , [7] BORGES, V.C. Alimentos funcionais: prebióticos, probióticos, fitoquímicos e simbióticos. In: WAITZBERG, D.L. Nutrição oral, enteral e parenteral na prática cllínica. São Paulo: Atheneu, cap.96, p , [8] KAWANG-SOO, S.; NAK-JUNG, K.; YOUNG, H., K.; HEE-SOO, P.; GI-SEOK, 5/5

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