PERFIL SDS-PAGE DO PLASMA SEMINAL E AVALIAÇÃO MORFOFISIOLÓGICA DOS ESPERMATOZÓIDES DE EJACULADOS DE TOUROS MESTIÇOS

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1 CONVÊNIOS CNPq/UFU & FAPEMIG/UFU Universidade Federal de Uberlândia Pró-Reitoria de Pesquisa e Pós-Graduação DIRETORIA DE PESQUISA COMISSÃO INSTITUCIONAL DE INICIAÇÃO CIENTÍFICA 2008 UFU 30 anos PERFIL SDS-PAGE DO PLASMA SEMINAL E AVALIAÇÃO MORFOFISIOLÓGICA DOS ESPERMATOZÓIDES DE EJACULADOS DE TOUROS MESTIÇOS Eurípedes Vilela da Silva 1 Universidade Federal de Uberlândia, Faculdade de Medicina Veterinária, Av. Pará, euripedes_vilela@hotmail.com Patrícia Soares 1 psoares.vet@hotmail.com Mário José dos Santos Junior 2 mariojsj@hotmail.com Fábio de Oliveira 3 fdeoliveira@umuarama.ufu.br José Octávio Jacomini 3 jojacomini@ufu.br Resumo: O objetivo desse trabalho foi relacionar o perfil eletroforético das proteínas e as características morfofuncionais do sêmen de touros mestiços. Foram avaliadas características morfofisiológicas de 10 touros mestiços com idades entre 24 e 33 meses, sendo estas características e seus respectivos resultados médios: circunferência escrotal (CE) 33,65 cm ± 5,45; volume de ejaculado (VOL) 4,65 ml ± 2,00; turbilhonamento (TURB) 2,8 ± 2,16; motilidade (MOT) 68 ± 8,10; vigor (VIG) 3,7 ± 0,41; concentração espermática (CONC) 447,6 espermatozóides ± 104,53; e patologias espermáticas (defeitos maiores 6,79 ± 9,78; defeitos menores 4,35 ± 2,43 e defeitos totais 11,15 ± 17,57). Os resultados das análises dos géis de eletroforese em SDS-PAGE a 14% revelaram uma grande diversidade de proteínas em cada animal e entre os indivíduos, constatando a presença de 26 polipeptídios principais, variação de 14 a 21 bandas individualmente e na média geral 17 por amostra. As bandas B3, B11, B17 e B26 apresentam relação negativa com as características morfofuncionais do plasma seminal de touros mestiços, ou seja, quando estão presentes imprimem características não-desejáveis ao ejaculado. As bandas B9, B19, B24 apresentam relação positiva com as características morfofuncionais do plasma seminal e podem, futuramente, atuar como marcadores moleculares para predizer a qualidade seminal e a fertilidade de touros. A banda B4 quando presente em altas concentrações tem relação negativa com a concentração seminal, porém imprime ao sêmen maior quantidade de espermatozóides normais, pois apresenta uma relação positiva com defeitos totais. Palavras-chave: Perfil eletroforético, plasma seminal, touros mestiços, características morfofuncionais. 1. INTRODUÇÃO O uso de reprodutores testados e com alta capacidade fertilizante é de grande importância para garantir boa eficiência reprodutiva e produção de bovinos. Desse modo, a busca por indicadores da fertilidade de reprodutores tem sido o alvo de diversos estudos nos últimos anos.

2 A motilidade e morfologia espermática, junto com a circunferência escrotal são as características mais freqüentemente utilizadas para avaliar o potencial reprodutivo (Godfrey et al., 1990; Correa et al., 1997). Contudo, Smith et al. (1981) não encontraram relação entre nenhum parâmetro de avaliação da qualidade seminal individualmente e a fertilidade, indicando que esta deveria ser estimada pela combinação dos vários parâmetros. Mesmo técnicas sofisticadas, como a análise computadorizada da motilidade e o teste de integridade acrossômica, embora auxiliem a avaliação do sêmen, não apresentam alta correlação com os índices de fertilidade (Januskauskas et al., 2000ab; Kjaestad et al., 1993). Rotineiramente, a técnica para avaliação da fertilidade de reprodutores inclui exames clínicos e da biometria testicular, das características espermáticas (aspectos físicos e morfológicos do sêmen) o que pode ser insuficiente para predizer o potencial reprodutivo desses animais (Welter et. al., 2007). Uma das maneiras utilizadas para avaliar a fertilidade do sêmen de touros é por meio da avaliação in vitro. Os ensaios in vitro são capazes de demonstrar quais os aspectos da função espermática estão alterados. Várias técnicas têm sido descritas para avaliar o sêmen, porém a combinação de diferentes ensaios mostrou resultados mais reais quando comparados a um único teste, na tentativa de predizer a fertilidade in vivo (Amann, 1989; Zhang et. al., 1999). A principal forma de se avaliar a célula espermática in vitro é determinar suas características morfofuncionais. A avaliação da motilidade espermática é a mais comum e pode ser analisada por método subjetivo, utilizando um microscópio de contraste de fase ou, mais recentemente por programas de computador ( Computer Assisted Semen Analyzer CASA ) (Verstegen et. al., 2002). A motilidade progressiva informa sobre uma das características necessárias ao espermatozóide para a fertilização. Apesar disto, a correlação entre a motilidade e a capacidade da célula espermática para fertilizar o ovócito ainda não é totalmente esclarecida e os achados são conflitantes entre os pesquisadores (England & Allen, 1989; Söderquist et. al., 1991; Kjaestad et. al., 1993; Ivanova- Kicheva et. al., 1997; Sanchez-Partida et. al., 1999; Tardif et. al., 1999). Coetzee et. al. (1998) considera a morfologia espermática como o melhor indicador da fertilidade do macho, pois reflete a competência funcional dos espermatozóides. A determinação dos componentes do plasma seminal pode ser considerada uma forma de avaliação do ejaculado, visto que alguns destes componentes já forma correlacionados com a fertilidade (Aurich et. al., 1996; Rodrigues et. al., 1999). O plasma seminal contém secreções de origem testicular, epididimária e das glândulas sexuais acessórias (Evans & Maxwell, 1987), do qual os espermatozóides adquirem inúmeras proteínas durante o trânsito epididimário e na ejaculação, e que podem influenciar sua capacidade fecundante (Miller et al., 1990; Yanagimachi, 1994; Maxwell et al., 1999). Por muitos anos, o plasma seminal foi considerado apenas um meio de sustentação para células espermáticas. Atualmente, estudos adicionando plasma seminal de machos de alta fertilidade às células espermáticas de machos de baixa fertilidade têm provado a importância deste fluido na fertilidade in vivo (Aurich et. al., 1996; Rodrigues et. al., 1999). Os espermatozóides perdem toda a capacidade de sintetizar e secretar proteínas durante a espermatogênese (Shabanowitz & Killian, 1987). Porém, novas proteínas são aderidas pela interação da célula espermática com o meio (Naaby-Hansen et. al., 1997; Tulsiani et. al., 1997), incluindo as proteínas presentes no fluido epididimal, no ducto deferente e no plasma seminal, durante a ejaculação. Estas proteínas, adicionados aos espermatozóides durante a ejaculação, têm sido correlacionadas à fertilidade. A composição protéica do plasma seminal e da membrana espermática tem despertado o interesse em muitos pesquisadores (Silva et. al., 2003; Roncoletta et al., 1999; Kowalski et al., 2003; Lahnsteiner et al., 2004). Esse fluído complexo contém diversos polipeptídeos, que juntamente com proteínas dos espermatozóides exercem um importante papel na capacidade fertilizante. 2

3 As proteínas têm sido associadas à fertilização, funcionando como elementos chave durante esse processo. Algumas são originárias das glândulas sexuais acessórias, principalmente da vesícula seminal, e se ligam ao espermatozóide durante a ejaculação. Outras são adicionadas à membrana plasmática durante a formação e maturação destas células (Welter et. al., 2007). Estudos indicam que a habilidade do espermatozóide para se ligar à heparina e a outros glicosaminoglicanos está correlacionada com a qualidade do sêmen e fertilidade. O espermatozóide possui a capacidade de ligar-se à heparina e às moléculas semelhantes, como as glicosaminoglicanas (GAGs) da tuba uterina. Esta ligação tem sido associada à presença de proteínas do plasma seminal ligadas à superfície espermática, o que leva a modulação do acrossomo induzida pelas glicosaminoglicanas da zona pelúcida (Miller et. al., 1990). As principais proteínas ligadoras de heparina nos bovinos são denominadas BSPs (Proteínas do plasma seminal bovino) (Chandonnete et. al., 1990), sendo consideradas as principais proteínas presentes no plasma seminal dessa espécie. As BSPs são produtos da vesícula seminal que se ligam ao espermatozóide durante a ejaculação e as GAGs no trato reprodutor feminino (Manjunath et. al., 1993). Lavon (1972), utilizando focalização e gel de eletroforese, identificou 30 e 35 proteínas no plasma seminal de touros, e Bruschi et al. (1979) que determinaram os valores normais de cada componente do plasma seminal de machos de várias espécies, começaram a despertar a curiosidade sobre a existência de proteínas que se prendem à membrana espermática, facilitando a fecundação. Manjunath e Sairam (1987) purificaram e caracterizaram a família de proteínas do plasma seminal de bovinos (BSP). Estes autores as denominaram BSP-A1, BSP-A2, BSP-A3 (com pesos moleculares entre 15 e 16,5 kda) e BSP-30 kda (com peso molecular entre 28 e 30 kda). Mattos et al. (2004) identificaram imunologicamente, por meio de anticorpo policlonal específico (anti-bsp A1/A2), proteínas do plasma seminal de bovinos, reconhecendo A1 (16,5 kda, pi 4,7) e A2 (16 kda, pi 4,9 e 5,2), sugerindo que essas proteínas possam ser utilizadas como um marcador para sêmen de alta congelabilidade. Na tentativa de aprimorar o conceito de congelabilidade em touros doadores de sêmen, Roncoletta et al. (1999) sugeriram a existência de uma banda caracterizada pela mobilidade relativa de 20,3 e massa molecular de aproximadamente 61,8 kda, como possível marcador bioquímico para diferenciar o caráter de congelabilidade do sêmen. Marques et al. (2000) analisaram e correlacionaram proteínas do sêmen congelado bovino de diferentes raças, concentração de íons cálcio no plasma seminal e atividade da fosfolipase A2 do espermatozóide com a reação acrossômica, visando encontrar fatores que influenciem no processo de fertilização bovina. Bellin et al. (1998) identificaram no plasma seminal bovino algumas proteínas ligadoras de heparina (HBP) produzidas pelas glândulas acessórias. Reconheceram variantes da HBP, de aproximadamente 31, 24 e 21,5 kda, associadas ao incremento da fertilidade de touros, sendo que, a proteína de peso molecular 31 kda é conhecida como o antígeno associado à fertilidade (FAA). Posteriormente, McCauley et al. (1999) concluíram que a proteína FAA é 78% idêntica à proteína DNAase-like humana, sendo consideradas da mesma família. Killian et al. (1993), utilizando-se da eletroforese estudaram proteínas do plasma seminal de bovinos e acharam correlação entre elas e a fertilidade. Associaram touros com alta fertilidade a duas proteínas do plasma seminal, sendo que, uma apresentou PM de 26 kda e pi 6,2, e a outra PM de 55 kda e pi 4,5. Associaram também animais de baixa fertilidade a outras duas proteínas, a primeira com PM de 16 kda e pi 4,1, e a segunda com PM de 16 kda e pi 6,7. Dentro deste contexto, o presente trabalho teve por objetivo estudar o perfil protéico eletroforético do plasma seminal relacionado com alguns parâmetros morfofuncionais do ejaculado de touros mestiços. 2. MATERIAL E MÉTODOS 3

4 Foram utilizados 10 animais púberes, de 24 a 35 meses de idade, selecionados entre os animais da Fazenda do Glória, de propriedade da Universidade Federal de Uberlândia. Os animais cuja mortalidade progressiva e vigor foram abaixo de 50% e três, respectivamente, foram descartados (Silva et. al., 1993) Os animais foram submetidos às medições da circunferência escrotal (CE), largura e do comprimento dos testículos. Em seguida, foram colhidos os ejaculados por meio de eletroejaculador e imediatamente após a coleta foram registrados o volume, a concentração, a motilidade, o turbilhonameto e o vigor espermáticos. A mensuração da concentração espermática foi realizada segundo Feldman & Nelson (1996). Uma alíquota de 20 µl de sêmen foi adicionada a uma solução de citrato de sódio formolado para avaliação morfológica objetivando a avaliação de defeitos maiores, menores e totais nos espermatozóides de cada ejaculado. Após exames imediatos, realizou-se a centrifugação dos ejaculados a 700 g por 15 min em temperatura ambiente. Com o auxílio de pipetas de Pasteur os sobrenadantes foram coletados e acondicionados em microtubos tipo Eppendorf e congelados a -20ºC. Posteriormente, no Laboratório de Biofísica da Universidade Federal de Uberlândia, os plasmas seminais foram descongelados e recentrifugados ( g) por 30 minutos a 4ºC, com a intenção de precipitar os debris celulares. Para quantificar as proteínas presentes nas amostras de plasma seminal foi utilizado o espectrofotômetro SPEKOL UV VIS (Zeiss ), que realizou a leitura das amostras, contra um branco sem proteína, em absorbância de 280 nm pelo método de absorção no ultravioleta. Posteriormente, todas as amostras foram padronizadas quanto à quantidade de proteína. A eletroforese para estimativa dos pesos moleculares foram realizadas segundo método de Laemmmli (1970), utilizando-se géis de poliacrilamida com agentes desnaturantes na presença de SDS (Dodecil Sulfato de Sódio). Foi utilizado gel de empilhamento a 5% e gel de separação a 14%. A solução TRIS 0,1M, EDTA 7,8mM, glicina 0,77 M e SDS 0,3% (p/v) ph 8,3 foi utilizada como tampão para o cátodo e a mesma solução, porém sem a glicina, para o ânodo. A concentração das amostras foram padronizadas com 750 µg de proteína total, completado até 100 µl com água deionizada e em seguida foi adicionado 50% de tampão da amostra (Tris-HCl 187 mm ph 6,8, SDS 6%, EDTA 6 mm, azul de bromofenol 1% e glicerol 27%) e 10% de β- mercaptoetanol. Posteriormente, as amostras foram aquecidas e aplicou-se 20 µg de proteína total em cada canaleta do gel de poliacrilamida. Foi utilizado o marcador de peso molecular LWM (Low Weight Molecular) que contém os seguintes elementos: α-lactoalbumina (PM:14,4 kda), inibidor de tripsina (PM: 20,1 kda), anidrase carbônica (PM: 30,0 kda), ovoalbumina (PM: 45,0 kda), soroalbumina bovina (PM: 66,0 kda) e glicogênio fosforilase b (PM: 97,0 kda). A eletroforese foi conduzida por uma corrente constante de 25 ma por aproximadamente 60 minutos. Após a eletroforese, os géis foram retirados da placa e corados por aproximadamente 20 minutos com Coomassie Brilliant Blue R-250 0,1% (m/v) em água metanol - ácido acético (4:5:1 v/v). Em seguida, descorados por uma solução de etanol a 35%. Após, as imagens dos géis foram capturadas com o uso de um Scanner acoplado a um microcomputador e a análise foi realizada com o auxílio do software KODAC 1D. Determinou-se o peso molecular aparente (PMA) e a densitometria relativa das bandas correspondente a cada canaleta. A análise estatística foi descritiva e tentou-se realizar a correlação das proteínas do plasma seminal com as características morfofuncionais espermáticas, com significância de 1 e 5%, utilizando-se o software estatístico S-PLUS RESULTADOS E DISCUSSÃO Na Tabela 1 são apresentados os resultados morfofuncionais de cada touro. 4

5 Tabela 1. Valores individuais da circunferência escrotal (CE), volume (Vol), turbilhonamento (Turb), motilidade (Mot), vigor (Vig), concentração espermática (Conc), defeitos maiores (DM), defeitos menores (Dm) e defeitos totais (DT) de touros mestiços, Uberlândia MG. TOURO CE (cm) Vol (ml) Turb (0-5) Mot (%) Vig (0-5) Conc X 10 6 DM (%) Dm (%) DT (%) 1 34,00 6,00 3,00 45,00 2, ,55 1,52 6, ,50 2,50 0,00 70,00 4, ,83 8,26 9, ,50 4,50 4,00 70,00 4, ,95 3,98 13, ,00 3,50 1,00 60,00 3, ,67 2,86 29, ,00 3,00 4,00 70,00 4, ,73 2,73 5, ,00 4,00 3,00 70,00 4, ,00 8,00 16, ,00 7,50 4,00 70,00 4, ,27 4,55 11, ,50 5,50 1,00 70,00 4, ,60 6,31 9, ,00 5,00 4,00 80,00 4, ,92 3,85 5, ,00 5,00 4,00 75,00 4, ,46 1,48 3,94 Média D.Padrão 33,65 5,45 4,65 2,00 2,8 2, ,10 3,7 0,41 447,6 104,53 6,79 9,78 4,35 2,43 11,15 17,57 Na média, as mensurações testiculares acompanharam o padrão esperado para touros mestiços na faixa etária de 24 a 36 meses, sendo que a média encontrada para circunferência escrotal (33,65 cm) foi superior a encontrada por Pineda et. al. (2000) que foi 32,2 cm. O volume do ejaculado foi semelhante ao descrito por Silva (2002) de 4,0 ml e inferior aos 12 ml citado por Martinez et. al. (2000). Estando esse aspecto quantitativo sujeito a alterações, principalmente frente ao método de coleta por meio de eletroejaculador. A característica motilidade espermática apresentou média superior às relatadas por Silva et. al. (1993) com 65,3% e Sarreiro (2002) com 62,7%. O valor médio para a percentagem de espermatozóides com morfologia normal se mostrou dentro dos limites preconizados pelo Colégio Brasileiro de Reprodução Animal (1998) para animais doadores. Segundo este órgão, os padrões seminais desejáveis para efeito de seleção de reprodutores para monta natural são: motilidade espermática mínima de 70%, vigor mínimo de três (escala de zero a cinco), turbilhonamento de três (escala de 1 a 5) e total de espermatozóides anormais de no máximo 30%. Já para o sêmen de doadores, os padrões desejados são: doses com volume > 0,25 ml, motilidade progressiva > 30%, vigor > 3 e defeitos totais entre 20 e 30% e defeitos maiores entre 10 e 20%, para diferentes raças bovinas, sendo as européias as que apresentam valores doses com número de espermatozóides entre 6 e 10 x 10 6 e acima de 10 x 10 6, respectivamente. Diante da importância dos aspectos morfológicos na qualidade seminal, diferentes critérios têm sido propostos para classificação das anomalias espermáticas em bovinos separando-se os defeitos espermáticos em maiores e menores (Salvador, 2001). Os defeitos maiores, quando em porcentagens elevadas, têm sido associados aos distúrbios da espermatogênese e, em conseqüência, podem causar alterações na fertilidade, ou até mesmo infertilidade. Já em relação aos defeitos menores, relacionam-se principalmente aos defeitos da cauda do espermatozóide ou outras patologias não associadas à espermatogênese. Assim, possuem influência menor sobre a fertilidade dos reprodutores (Fonseca et al., 1992). A concentração de proteínas totais do plasma seminal demonstrou valores que variaram entre 2,63 e 69,44 mg/ml nas diferentes amostras, tendo média 21,36 mg/ml, estando de acordo com Assumpção (2003) e Romitto (2003). O resultado da análise do gel de eletroforese em SDS-PAGE 14% (Figura 1) revelou uma grande diversidade de proteínas em cada animal e entre os indivíduos, constatando a presença de 26 polipeptídios principais, com variação de 14 a 21 bandas individualmente nas amostras e na média 5

6 geral 16 por amostra. O peso molecular aparente (PMA) apresentou um intervalo de 11,2 a 124,1 kda, os resultados estão de acordo com os obtidos por Roncoletta (1999). BANDAS B07 (65,0kDa) B11 (50,3kDa) B12 (44,3kDa) B13 (38,6kDa) B18 (26,4kDa) B21 (21,3kDa) B24 (15,2kDa) B25 (13,0kDa) Figura 1 Eletroforese em gel de poliacrilamida a 14% com agentes desnaturantes das proteínas do plasma seminal de touros mestiços (n=10). PM Padrão de Peso Molecular LMW (Low Molecular Weight) e as bandas protéicas presentes em todos os animais (B07, B11, B12, B13, B18, B21, B24 e B25). As bandas B (65 kda), B11 (50,3 kda), B12 (44,3 kda), B13 (38,6 kda), B18 (26,4 kda), B21 (21,3 kda), B24 (15,2 kda) e B25 (13,0 kda) estiveram presentes em todos os animais e as bandas B20 (22,7 kda) e B23 (18,9 kda) em 60% das amostras. Observou-se que 76,4% do total de proteínas das amostras apresentam PMA abaixo de 32,8 kda, senod que as bandas B24 (15,2 kda) e B25 (13,0 kda) estão presentes em maior quantidade e juntas correspondem a 49,0%, provavelmente essas proteínas sejam as BSP- A1/A2 e A3, importantes para o processo de capacitação espermática (Manjunath et. al., 1993). Esses resultados corroboram com os encontrados por Roncoletta et. al. (1999) que observaram a característica do perfil eletroforético exibir fragmentos protéicos de baixo PMA em abundância, caracterizados por PMA aproximado de 13 kda, sendo que esta característica também já havia sido relatada por outros autores (Esch et. al., 1983; Manjunath e Sairam, 1987; Seidath et al., 1987), porém estes as isolaram e identificaram-nas como sendo um conjunto constituído por três proteínas de PMA 12,77 kda. Duas delas fazem parte do PDC-109 (proteínas idênticas, somente com tempo de eluição do HPCL diferentes), e a outra denominada BSP A3. Os resultados das correlações entre a densitometria das bandas protéicas e as características físicas e morfológicas do sêmen estão dispostos na Tabela 2. A B1 (124,1 kda), B (105,8 kda), B8 (61,3 kda) e B15 (32,8 kda) demonstraram correlações positivas com defeitos maiores e defeitos totais, sendo que a B4 (96,6 kda) apresentou uma correlação negativa com defeitos totais. a presença de espermatozóides com alterações poderia interferir na interação entre a membrana e as proteínas originárias do testículo, epidídimo e glândulas acessórias. cornwall et al. (1990) observaram o aumento, diminuição e até o desaparecimento de diversas proteínas no decorrer do trato epididimário. para estes autores a saturação de sítios de ligação na membrana do espermatozóide impedindo mãos interações, a degradação ou modificações das proteínas, justificaria esse fenômeno. 6

7 Tabela 2. Correlação entre os valores médios da densitometria das bandas e as características físicas e morfológicas do sêmen de touros mestiços, Uberlândia-MG. BD Turb Mot Vig Conc Dm DM DT B1 0,02 0,08 0,17 0,29 0,03 0,49** 0,43** B2 0,09 0,04 0,06 0,16-0,12-0,12-0,16 B3 0,01 0,03 0,12 0,34* -0,07 0,54** 0,41* B4 0,22 0,28 0,22 0,31* -0,29-0,28-0,37* B5-0,08-0,14 0,03-0,11-0,06-0,18-0,18 B6-0,02 0,17 0,05-0,04-0,11-0,09-0,13 B7 0,21 0,05 0,18 0,27-0,20 0,27 0,12 B8-0,02-0,11-0,01 0,11 0,21 0,39*** 0,43** B9 0,11 0,24 0,28 0,07-0,35* -0,15-0,29 B10-0,07 0,03-0,01-0,09 0,01 0,00 0,01 B11 0,11 0,09-0,04 0,38* -0,08-0,17-0,18 B12 0,09-0,02 0,17-0,10 0,24-0,05 0,08 B13-0,08-0,06 0,02-0,07 0,05 0,09 0,10 B14 0,26 0,21 0,29-0,08-0,07-0,03-0,06 B15 0,16 0,11 0,23 0,24 0,11 0,41** 0,40** B16 0,29 0,19 0,15 0,21-0,16-0,23-0,27 B17-0,05-0,43** -0,35* -0,06-0,21-0,14-0,23 B18-0,18-0,02-0,16-0,13-0,05 0,06 0,03 B19 0,40** 0,43** 0,47** 0,50** 0,12 0,10 0,14 B20 0,09 0,12 0,13 0,20 0,50** 0,33* 0,52** B21 0,08-0,21-0,10 0,14-0,08-0,21-0,21 B22-0,25-0,16-0,26-0,17-0,04-0,06-0,07 B23-0,05 0,10 0,17 0,02-0,12-0,19-0,21 B24-0,11-0,09-0,23-0,34* 0,02-0,26-0,21 B25 0,01 0,22 0,08 0,19 0,00 0,16 0,14 B26-0,23-0,35* -0,31* -0,29 0,14 0,04 0,11 Nota: *p<0,05 e ** p<0,01; BD= banda; Turb.= turbilhonamento; Mot.= motilidade; Vig.= vigor; Conc.= concentração espermática; Dm= defeitos menores; DM= defeitos maiores; DT= defeitos totais. A concentração espermática apresentou correlação positiva com as bandas B3 (105,8 kda), B4 (96,6 kda) e B11 (50,3 kda) e negativa com a B24 (15,2 kda) que possivelmente é o conjunto de proteínas BSP A1/A2 e A3, produzidas pelas vesículas seminais (Manjunath et al., 1993). Assim, quanto maior a concentração, menores são os níveis de B24 (15,2 kda), pois um ejaculado mais concentrado possuiria menos secreção oriunda de glândulas anexas e mais conteúdo dos testículos e epidídimo. Esse fato explicaria a correlação da B3 (105,8 kda) e B4 (96,6 kda) com defeitos maiores e totais, pois os animais com alta concentração, mas com elevadas alterações morfológicas, expressariam mais essas proteínas de origem testicular e epididimária, possivelmente o local dos problemas. A banda B9 (57,1 kda) apresentou uma correlação negativa com defeitos menores, ou seja, quanto maior a quantidade dessa proteína menor a quantidade de defeitos. Esse polipeptídio apresentou OMA próximo ao as osteopontin (55kDa) que foi associada a fertilidade por Killian et al. (1993). Observou-se uma correlação positiva entre a banda 20 (22,7 kda) com defeitos menores, defeitos maiores e defeitos totais. Romitto (2003) encontrou relação entre uma proteína com peso molecular de 22 kda com defeitos maiores em touro da raça Simental. Com relação às características físicas do sêmen, a proteína B19 (24,3 kda) apresentou uma correlação positiva com turbilhonamento, motilidade, vigor e concentração. Essa proteína possui PMA semelhante a lipocalin prostaglandina D sintetase (PGDS) de 26 kda, uma das proteínas 7

8 mais prevalentes em touros de alta fertilidade, com potencial atuação tanto no desenvolvimento quanto maturação dos espermatozóides (Genera et al., 1998). Porém, não existem relatos da sua correlação com as características físicas do sêmen. As bandas B17 (28,2 kda) e B26 (11,2 kda) mostraram correlação negativa com motilidade e vigor. Em estudos é descrita a spermadhesin (aspd), uma proteína com peso molecular de 13 kda e que possui isoforma de 28 kda (Moura et al., 2006), sendo uma proteína que exerce a função sobre o metabolismo espermático, proteção contra danos oxidativos e motilidade, onde altas quantias dessa proteína provocam diminuição da motilidade (Schõneck et al., 1995). Nesse estudo, quanto maior a quantidade de B17 (28,2 kda) e B26 (11,2 kda), menor é a motilidade e vigor, reforçando a possibilidade de ser a aspd. 4. CONCLUSÕES As bandas B3, B11, B17 e B26 apresentam relação negativa com as características morfofuncionais do plasma seminal de touros mestiços, ou seja, quando estão presentes imprimem características não-desejáveis ao ejaculado. As bandas B9, B19, B24 apresentam relação positiva com as características morfofuncionais do plasma seminal e podem, futuramente, atuar como marcadores moleculares para predizer a qualidade seminal e a fertilidade de touros. A banda B4 quando presente em altas concentrações tem relação negativa com a concentração seminal, porém imprime ao sêmen maior quantidade de espermatozóides normais, pois apresenta uma relação positiva com defeitos totais. 5. REFERÊNCIAS AMANN, R.P. Can the fertility potential of a seminal sample be predicted accurately? Journal of Andrology, v. 10, p , AURICH, J.E.; KÜHNE, A.; HOPPE, H.; AURICH, C. Seminal plasma affects membrane integrity and motility of equine spermatozoa after cryopreservation. Theriogenology, v.46, p , BELLIN, M.; HAWKINGS, E.; OYARZO, J.; VANDEBOOM, R.; AX, R. Monoclonal antibody detectition of heprin-binding proteins on sperm corresponds to increased fertility of bulls. Journal of Animal Science, v. 7, p , BERKELMAN, T.; STENSTEDT, T. 2D- electrophoresis: using immobilized ph gradients, principles & methods. Piscataway: Amershan Pharmacia Biotech, p. BRADFORD, M.M. A rapid and sensitive method for a quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry, v. 72, p , BRUSCHI, J.H.; MENDES, M.C.; VIANA, E.S; ABREU, J.J.; MEGALE, F. Teores de ácido cítrico, frutose, proteína total e seu fracionamento eletroforético no sêmen do cão pastor alemão normal. Arquivos da Escola Veterinária da UFMG, v.31, n. 1, p , CHACUR, M. G. M; MACHADO NETO, N. B; CRISTANCHO, D. R. Season influence upon seminal plasma proteins in bulls. In: 15 th International Congress on Animal Reproduction. Abstracts. v.1, p.193,

9 CHANDONNETE, L.; ROBERTS, K.D.; CHAPDELAINE, A.; MANJUNATH, P. Identification of heparin-binding proteins in bovine seminal plasma. Molecular Reproduction Development, v. 26, p , COETZEE, K.; KRUGE, T.F.; LOMBARD, C.J. Predictive value normal sperm morphology: a structure literature review. Human Reproduction Update, v., n.1, p , ENGLAND, G.C.W.; ALLEN, W.E. Seminal characteristics and fertility in dogs. The Veterinary Record, v. 125, n.7, p. 399, ITZHAKI, R. F.; GILL, D. M. A microbiuret method for stimating proteins.analitical Biochemistry, v.9, p ,1964. IVANOVA-KICHEVA, M.G.; BOBADOV, N.D.; SOMLEV, B. Cryopreservation of canine semen in pellets and in 5-mL aluminum tubes using three extenders. Theriogenology, v.48, p , JEYENDRAN, R., H. VAN DER VEN, M. PEREZ-PELAES, B. CRABO, L. ZANEVELD. Development of an assay to asses the functional integrity of the human sperm membrane and its relationship to other semen characteristics. Journal of Reproduction and Fertility, v. 70, p , KIKUCHI, K.; NAGAI, T.; KASHIWAZAKI, N. et al. Cryopreservation and ensuing in vitro fertilization ability of boar spermatozoa from epididymis stored at 4 C. Theriogenology, v.50, p , KILLIAN, G. J; CHAPMAN, D. A; ROGODWSKI, L.A. Fertility-associated proteins in Holstein bull seminal plasma. Biology of Reproduction, v.49, p , KJAESTAD, H.; ROPSTAD, E.; ANDERSEN BERGER, K. Evaluation of sprematological parameters used to predict to fertility of frozen bull semen. Acta Veterinaria Scandinavica, v. 34, p , LAEMMLI, U.K. Cleavage of structura proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature, v. 227, p LAVON, U.: Characterization of boar, bull, ram and rabbit seminal plasma proteins by gel disc electrophoresis and isoelectric focusing on polyacrylamide. Journal of Reproduction and Fertility, v. 31, p , MANJUNATH, P.; SAIRAM, M. R. Purification and biochemical characterization of tree major acidic proteins (BSP-A1, BSP-A2, BSP-A3) from bovine seminal plasma. Biochemical Journal, v.241, p , MANJUNATH, P; CHANDONNET, L; LEBLOND, E. et al. Major proteins of bovine seminal vesicles bind to spermatozoa. Biology of Reproduction, v.48, p MANN, T.; MANN, C.L. Vas deferens and vasectomy. In: Male Reproduction function and semen. New York: Springer Verlag, 1981, p MARQUES, A.L.; GOULART, L.R.; FELICIANO SILVA, A.E.D. Variations of protein profiles and calcium and phospholipase A2 concentrations in thawed bovine sêmen and their relation to acrossome reaction. Genetical Molecular Biology, v.23, n.4, p ,

10 MARTINS, C.F.; SILVA, A.E.D.F.; MATARAZZO, R. et al. Evaluation of the quality of cryopreserved bovine epididimal spermatozoa by analysis of motility, acrossomal status, penetration ability in oocytes and integrity of sperm chromatin. Biology of Reproduction, v.62, Supl.1, p.156, MATTOS, R. C; JOBIM, M. I. M; OBERST, E. R et al. BSP A1/A2: a seminal plasma marker of high semen freezability. In: 15 th International Congress on Animal Reproduction. Abstracts. v.2, p.462, McCAULEY, T.C.; ZHANG, H.; BELLIN, M.E.; AX, R.L. Purification and characterization of fertility-associated antigen (FAA) in bovine seminal fluid. Molecular & Reproduction Development, v. 54, p , MILLER, D.J.; WINER, M.A.; AX, R.L. Heparin-binding proteins from seminal plasma bind to bovine spermatozoa and modulate capacitation by heparin. Biology of Reproduction, v.42, p , NAABY HANSEN, S.; FLICKINGER, C.J.; HERR, J.C. Two-dimensional gel electrophoretic analysis of vectorially labeled surface proteins of human spermatozoa. Biology of Reproduction, v.56, p , RODRIGUES, B.A.; DONÁ, A.V.; RODRIGUES, J.L. Influência da secreção prostática autóloga sobre a viabilidade dos espermatozóides caninos no pós-descongelamento. Brazilian Journal of Veterinary Research and Animal Science, v. 36, n. 6, p , RONCOLETTA, M; FRANCESCHINI, P. H; LIMA, V. F. M. H. et al. Perfil em SDS-PAGE das proteínas do plasma seminal e sua relação com a congelabilidade do sêmen de touros doadores da raça Gir. Brazilian Journal of Veterinary Research and Animal Science, v.36, n.2, RONCOLETTA, M; MORANI, E. S. C; RODRIGUES, L. H. et al. Sperm membrane and seminal plasma 2D protein profiles and their relation with bulls fertility. In: 15 th International Congress on Animal Reproduction. Abstracts, v.1, p.187, SALVADOR, F.D; ANDRADE, V.J; FILHO, V.R.V. Potencial das proteínas do plasma seminal ou ligadas à membrana espermática como indicadores da fertilidade de touros. Cadernos técnicos de veterinária e zootecnia. n. 35, p.61-71, SALVADOR, D. F; OLIVEIRA, J. S; SANTORO, M. M. et al. Gel filtrate chromatographic profile of seminal plasma protein in Nelore Bulls and its correlation of andrologic and freezing sêmen parameters. In: 15 th International Congress on Animal Reproduction. Abstracts. v.1, p.193, SANCHEZ- PARTIDA, L.G.; WINDSOR, D.P.; EPPLESTON, J.; SETCHELL, B.P.; MAXWELL, W.M. Fertility and its relationship to motility characteristics of spermatozoa in ewes after cervical, transcervical, and intrauterine insemination with frozen-thawed ram semen. Journal of Andrology, v. 20, p , SHABANOWWITZ, R.B.; KILLIAN, G.J. Two-dimensional electrophoresis of protein in principal cells, spermatozoa and fluid associated with the rat epididymis. Biology of Reproduction, v.36, p ,

11 SILVA, A.E.D.F.; DODE, M.A.N.; UNANIAN, M.M. Capa - cidade reprodutiva do touro de corte: funções, anormalidades e fatores que a influenciam. Campo Grande: CNPGC, p. (Documentos, 10) SÖDERQUIST, L. RODRIGUEZ- MARTINÉZ, H.; JANSON, L. Post-thaw motility, ATP content and cytochrome C oxidase activity of Al bull spermatozoa in relation to fertility. Journal Of American Veterinary Medical Association, v. 38, p , SOUZA, F. F. Caracterização eletroforética do perfil protéico e análise bioquímica do plasma seminal canino. Botucatu, SP: Universidade Estadual de São Paulo, p. Dissertação (Mestrado em Medicina Veterinária) - Universidade Estadual de São Paulo, TARDIF, S.; LAFOREST, J. P.; CORMIER, N.; BAILEY, J. L. The importance of porcine sperm parameters on fertility in vivo. Theriogenology, v.52, p , TULSIANI, D. R. P.; YOSHIDA-KOMIYA, H.; ARAKI, Y. Mammalian fertilization: a carbohydrate-mediated event. Biology of Reproduction, v.57, p , VERSTEGEN, J.; IGUER-OUADA, M.; OCLIN, K. Computer assisted sêmen analyzers in andrology research and veterinary practice. Theriogenology, v. 57, p , ZHANG, B. R.; LARSSON, B.; LUNDEHEIM, N.; HÁÁR, M. G. H.; RODRIGUEZ- MARTINÉZ, H. Prediction of bull fertility by combined in vitro assessments of frozen-thawed semen from Young dairy bulls entering na Al-program. Journal of Andrology, v. 22, p , AGRADECIMENTOS Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) pela bolsa de Iniciação Científica concedida (projeto E- 012/2007). PROFILE SDS-PAGE OF SEMINAL PLASMA MORPHOFUNCTIONAL AND EVALUATION OF SPERMATOZOIDS OF EJACULATES OF CROSSBRED BULLS Eurípedes Vilela da Silva 1 Universidade Federal de Uberlândia, Faculdade de Medicina Veterinária, Av. Pará, euripedes_vilela@hotmail.com Patrícia Soares 1 psoares.vet@hotmail.com Mário José dos Santos Junior 2 mariojsj@hotmail.com Fábio de Oliveira 3 fdeoliveira@umuarama.ufu.br José Octávio Jacomini 3 jojacomini@ufu.br 11

12 Abstract: The objective of this work was to relate the eletrophoresis of proteins and characteristics of the sperm of morphfunctional crossbred bulls. Morphfunctional characteristics were evaluated by 10 crossbred bulls aged 24 and 33 months, and these characteristics and their results: scrotal circumference (CE) ± 5.45 cm; volume of ejaculate (VOL) 4.65 ml ± 2.00; mass motility (TURB) 2.8 ± 2.16; motility (MOT) 68 ± 8.10; force (VIG) 3.7 ± 0.41; sperm concentration (CONC) 447, 6 spermatozoids ± , and sperm pathologies (defects higher 6.79 ± 9.78; minor defects 4.35 ± 2.43 and defects showing total ± 17.57). The results of analyses of the electrophoresis gels in SDS-PAGE to 14% revealed a wide variety of proteins in each animal and between individuals, noting the presence of 26 major polypeptides, range from 14 to 21 bands individually and in the overall average 17 per sample. The bands B3, B11, B17 and B26 have negative relationship with the characteristics of morphofunctional seminal plasma of crossbred bulls, or are present when print-desirable characteristics not to ejaculate. The bands B9, B19, B24 have positive relationship with the characteristics of morphofunctional seminal plasma and may, in future, act as molecular markers to predict the quality of bull semen and fertility. The band B4 when present in high concentrations have negative relationship with the seminal concentration, but prints the largest amount of semen normal sperm, because presents a positive relationship with defects total. Keywords: Profile electrophoresis, seminal plasma, crossbred bulls, morphofunctional characteristics. 12