TESTES DE ÁCIDOS NUCLEICOS EM DADORES DE SANGUE AVALIAÇÃO DO SISTEMA ROCHE COBAS S 201 EXPERIÊNCIA DO CENTRO REGIONAL DE SANGUE DO PORTO
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- Valdomiro Van Der Vinne Aveiro
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1 AVALIAÇÃO DO SISTEMA ROCHE COBAS S 201 EXPERIÊNCIA DO CENTRO REGIONAL DE SANGUE DO PORTO Lucinda Queirós Alzira Tender Ana Aguiar Joana Azevedo RESUMO ABSTRACT CONTEXTO: A realização de testes de amplificação de ácidos nucleicos contribuem para a diminuição do risco de transmissão de agentes virais através de componentes sanguíneos, durante o período de janela. Este artigo descreve a avaliação da plataforma Roche cobas s 201 e os resultados obtidos na mesma, para a sua aplicação na rotina do rastreio genómico dos virus da Hepatite C, VIH e Virus da Hepatite B, em dadores de sangue. PLANO DE ESTUDO: A primeira parte do estudo incluía a qualificação dos operadores, que consistiu na realização de um painel constituído por 6 membros testados 4 vezes individualmente. Em seguida procedeu-se a avaliação da reprodutibilidade e ao limite de detecção e por ultimo foram testadas 5508 amostras individuais de dadores de sangue. RESULTADOS: Na qualificação de ambos os operadores todos os resultados obtidos estavam de acordo com o esperado. Em relação à reprodutibilidade do teste as amostras positivas deram positivas e as amostras negativas deram negativas. Os limites de detecção a 95% foram calculados por Análise Probit, tendo sido de 12.1 para o VHC, 36,7 para o VIH1 e de 4.6 para o VHB. Para avaliação da especificidade do teste e do desempenho da plataforma foram testadas 5508 amostras de dadores, das quais 5016 deram resultados válidos (91.1%) Foram realizadas 56 series, 52 das quais foram válidas (92,9 %). Foram testadas 885 pools, 835 foram válidas (94.4%).Obtiveram-se 2 amostras inicialmente reactivas; Na primeira pool, todos os membros quando testados individualmente eram não reactivos, pelo que se concluiu tratar-se de uma falsa reactividade. Na segunda pool,uma das amostras foi reactiva e apresentava AgHBs positivo, teste de neutralização positivo e uma carga viral ADN do VHB de 332. A especificidade calculada foi de 99,9 %. CONCLUSÃO: Não houve resultados discrepantes entre o teste MPX e o teste TAN da rotina do nosso laboratório (CO- CONTEXT: Nucleic acid tests contribute to the reduction of the risk of transmission of viral infections through the transfusion of blood and blood products, during the window period. This article evaluates the Roche cobas s 201 system (cobas TaqScreen MPX Test) and the results obtained, for application as routine in the screening of the HIV-1 group M, HIV-1 group O, HIV2, HCV RNA and HBV in blood donors. STUDY DESIGN: The first part of the study includes a qualification procedure for each operator, which consists of a 6 member panel, individually tested 4 times. Then reproducibility and detection limit are evaluated and finally, 5508 plasma specimens from individual blood donors are tested. RESULTS: In the qualification procedure for operators all the results obtained were as we expected. Concerning the reproducibility study, positive samples gave positive and negative samples gave negative. For the LOD study serial half Log10 dilutions were prepared from WHO International Standards. Twenty-four (24) replicates of each dilution were tested and the 95% detection limits were calculated by Probit Analysis. For the specificity evaluation and the performance of the platform, 5508 plasma specimens from individual blood donors were tested in pools of six donations, 5016 with valid results (91.1%). 56 batches were tested, 52 of which were valid (92.9%). 885 pools were performed, 835 having valid results (94.4%). There were 2 initially reactive pools: The six members of the first pool were all non-reactive. A single reactive sample was detected in the second pool, and this was shown to be HBsAg positive with a positive neutralization test, and HBV DNA reactive by a Real-Time PCR assay using the Rotorgene system. The calculated specificity in true negative samples was 99.9%. CONCLUSION: There were no discrepant NAT results between the MPX test, the NAT test of record (COBAS Ampliscreen VIH-1 Test, version 1.5 e COBAS Ampliscreen VHC Test, version 2.0) and the routine serology (HBsAg, anti- HBc, anti-hcv, anti-hiv-1/2 and anti-htlv-1/2). 31
2 BAS Ampliscreen VIH-1 Test, version 1.5 e COBAS Ampliscreen VHC Test, version 2.0) nem com os resultados da serologia virica (AgHBs, AcHBc, anti-vhc, anti-vih1/2) O sistema Roche cobas s 201 é de mais fácil utilização e manutenção e providencia resultados TAN em menos tempo que o método usado actualmente na rotina, o que permite libertar os componentes mais cedo, sobretudo as plaquetas. In conclusion, we can say that the cobas s 201 system is faster and easier than our routine methodology. We can get results sooner, which allows the release of components, mainly platelets, sooner. The cobas s 201 TaqScreen MPX Test allows the detection of HIV2 RNA which was not possible with the Ampliscreen HIV-1 version 1.5 and also has the capability of screening the HBV DNA. O teste MPX apresenta a possibilidade de detecção do VIH2 o que não acontecia com o teste Ampliscreen HIV-1 version 1.5 e inclui a possibilidade de rastrear os ácidos nucleicos referentes à Hepatite B. 32 ABSTRACT INTRODUÇÃO CONTEXT: Nucleic acid tests contributes in reducing the As risk metodologias of transmission de of detecção viral infections de ácidos by transfusion nucleicos of blood intro- duzidas and blood nos products, bancos during de sangue, the window têm period. como This finalidade article detectar describes infecções the evaluation viricas of the agudas, Roche cobas contribuindo s 201 system para ( a diminuição cobas TaqScreen drástica MPX da Test transmissão ) and the results dos agentes obtained, viricos for envolvidos e aumentar a segurança biológica dos com- ponentes the application usados in em the transfusão. routine in the screening of the HIV-1 group M, HIV-1 group O, HIV2, HCV RNA and HBV in blood Desde donors. 1 de Julho de 1999 que, sob a recomendação da EMEA (European Medical Evaluation Agency) todo o plasma usado no fraccionamento industrial passou a ser analisado para o RNA do vírus da Hepatite C (VHC). Para dar cumprimento a esta recomendação todos os serviços de sangue europeus procuraram modernizar os seus serviços no sentido de procederem à realização das metodologias de biologia molecular, que impunham infra-estruturas próprias como áreas distintas para a extracção, amplificação e detecção de ácidos nucleicos. Posteriormente, devido à preocupação cada vez maior quanto à segurança máxima dos componentes sanguíneos (concentrados eritrocitários, plaquetas, crioprecipitado e plasma fresco congelado) foram implementadas outras metodologias que permitiam a detecção em simultâneo dos vírus da Hepatite C e do VIH1. Em Portugal, embora a pesquisa de ácidos nucleicos não seja por lei obrigatória, cerca de 90% do sangue colhido é analisado para o RNA do VIH1 e do VHC ou por metodologias que permitem a detecção de antigénios. Desde Abril de 2004 que o Laboratório de Agentes Transmissíveis do Centro Regional de Sangue do Porto (CRSP) realiza de forma sistemática a pesquisa destes dois vírus. Actualmente os testes de ácidos nucleicos (TAN ) implementados na rotina do nosso laboratório, consistem numa cadeia modular semi-automática constituída por um pipetador Tecan RSP (Tecan) que realiza pools de 16 unidades, pelo extractor Nuclisens (Biomerieux) para extracção dos ácidos nucleicos e pelo equipamento CO- BAS AMPLICOR para amplificação e detecção (Roche).Os testes utilizados incluem o Multiprep Specimen Preparation (Roche), Isolation kit (Biomerieux), COBAS Ampliscreen HIV-1 Test, version 1.5 e o COBAS Ampliscreen HCV Test, version 2.0 (Roche). Este artigo descreve a avaliação da plataforma Roche cobas s 201 que realiza o teste qualitativo COBAS TaqScreen MPX para detecção simultânea de ácidos nucleicos do VIH1 (grupos M e O), VIH2, VHC e do VHB em plasma humano. Este estudo decorreu no âmbito de um estudo multicêntrico que incluiu vários laboratórios a nível Europeu (Escócia, França, Itália e Espanha) e um laboratório na Austrália, pertencentes a centros de colheita de sangue. Apresentam-se os resultados obtidos na avaliação da reprodutibilidade, limite de detecção a 95%, especificidade do teste COBAS TaqScreen MPX assim como a comparação com o ensaio de ácidos nucleicos implementado na nossa rotina. MATERIAL E MÉTODOS O sistema Roche cobas s 201 (Roche Diagnostics) consiste numa cadeia modular automatizada constituída por um pipetador HAMILTON Microlab STAR IVD, pelo equipamento COBAS AmpliPrep para extracção dos ácidos nucleicos e pelo analisador COBAS TaqMan para a am- plificação e detecção de ácidos nucleicos por PCR em Tempo Real. O s 201 irá permitir uma flexibilização do número de amostras a ser utilizado em cada pool (desde unitário até 96).
3 O COBAS TaqScreen MPX é um teste qualitativo in vitro, para a detecção simultânea de ácidos nucleicos do VIH1 (grupos M e O), VIH2, VHC e do VHB em plasma humano. Em cada série são testados 5 controlos positivos (VIH1, VIH1-M, VIH1-0, VIH2, VHC e VHB) e um controlo negativo. O sistema utiliza dois sistemas informáticos, o Roche Pooling and Data Management (PDM) que gere o funcionamento do pipetador HAMILTON Microlab STAR e permite aceder ao estado analítico do dador, e o Roche Amplilink que permite operar simultaneamente o equipamento de extracção (COBAS AmpliPrep) e o de detecção (COBAS TaqMan). O estudo decorreu entre Novembro de 2005 e Abril de Foi efectuada a formação e a qualificação de dois operadores (Técnicos de Analises Clinicas e Saúde Pública) para a realização da metodologia, que consistiu na realização de um painel constituído por 6 membros (Acrometrix Corporation ), que foram testados 4 vezes individualmente. Um operador procedeu à avaliação da reprodutibilidade testando um painel de 6 membros (Acrometrix Corporation ) 4 vezes, procedendo como o descrito para a qualificação do operador. Em simultâneo foram efectuados a todas as amostras os testes serológicos de rastreio (AgHBs, AcHBc, anti-vhc, anti-vih1/2 e anti-htlvi/ii), bem como os testes de amplificação de ácidos nucleicos em pool de 16. RESULTADOS Os critérios de aceitação dos resultados foram os especificados pelo fabricante (Quadro n.º 1) Para o painel de qualificação todos os resultados obtidos estavam de acordo com o esperado, o que permitiu a qualificação de ambos os operadores. Em relação à reprodutibilidade do teste foram obtidos os resultados esperados; i.e. as amostras positivas deram positivas e as amostras negativas deram negativas. Os limites de detecção a 95% foram calculados por Análise Probit, tendo sido de 12.1 para o VHC, 36.7 para o VIH1 e de 4.6 para o VHB (Quadro n.º 2) Para avaliação da especificidade do teste e do desempenho da plataforma foram testadas 5508 amostras de dadores, das quais 5016 deram resultados válidos (91.1%). Foram realizadas 56 series, 52 das quais foram válidas (92,9 %) (Quadro n.º2). Para o estudo do limite de detecção a 95 % foram testadas diluições seriadas semi logarítmicas na base 10, em plasma humano negativo, dos Padrões Internacionais: 96/798 para o VHC, 97/746 para o VHB e 97/650 para o VIH1. Foram efectuados 8 replicados de cada diluição em 3 dias diferentes e testadas 24 vezes cada uma. Testaram-se 5508 amostras de dadores em pools de 6, de forma a avaliar a especificidade e o desempenho da plataforma. QUADRO N.º. 1 CRITÉRIOS DE ACEITAÇÃO DE RESULTADOS Obtiveram-se duas pools inicialmente reactivas (Quadro n.º 3) Na primeira pool, todos os membros quando testados individualmente eram não reactivos, pelo que se concluiu tratar-se de uma falsa reactividade. Na segunda pool,uma das amostras foi reactiva e apre- sentava AgHBs positivo, teste de neutralização positivo e uma carga viral ADN do VHB de 332. A especificidade calculada foi de 99,9 %. 33 Amostra Controlo de qualidade interno Individual e/ou pool Resultado Controlo Negativo : Resultado válido (Não reactivo) para o alvo e válido para o controlo interno (IC) Controlos Positivos: Resultado válido (reactivo) para o alvo e válido para o controlo interno (IC) Resultado para o alvo Não reactivo e válido para o IC Ou Resultado para o alvo Reactivo e válido ou inválido para o IC
4 QUADRO N.º 2 RESULTADOS OBTIDOS PARA OS LIMITES DE DETECÇÃO A 95% VHB VHC VIH-1 CRSPorto 4.6 ( ) 12.1 ( ) 36.7 ( ) Roche 3.7 ( ) 10.7 ( ) 49.0 ( ) QUADRO N.º 3 RESUMO DO ESTUDO Total Válidos % Series realizadas ,9 % Pools realizados ,4 % N.º total de testes N.º total de amostras individuais testadas ,1 % N.º Dadores re-testados em relação ao n.º total de testes N.º Dadores c/ resultados inválidos em relação ao n.º total de testes Pools inicialmente reactivas 2 * - - Pools repetidamente reactivas Pool 1 Inicialmente reactiva; repetidamente reactiva, VHB positiva Pool 2 Inicialmente reactiva; Não repetidamente reactiva; resultado falso positivo Especificidade 99,9% Controlos inválidos 1 CN e 4 CP Nota: *1 dador VHB TAN reactivo/aghbs positivo 34 Todas as amostras foram testadas para os marcadores serológicos da rotina; não foi detectada nenhuma amostra com resultados negativos na serologia e positivos no MPX Test; sete (7) foram positivas para o anti-vhc, cinco (5) das quais foram negativas por RIBA e duas (2) Indeterminadas. Cinco (5) amostras foram anti-vih1/2 positivas, quatro (4) das quais foram negativas por Western Blot e uma (1) Indeterminada. Duas (2) amostras foram AgHBs positivas, uma (1) correspondia à amostra repetidamente reactiva nos TAN e a outra (1) tinha um teste de neutralização negativo e AcHBc negativo. (Quadro n.º 4). As principais causas de invalidação das amostras e os principais erros encontrados estão descritos no Quadro n.º 4. Foi observada uma elevada percentagem de resultados inválidos, devido ao facto de ao ser invalidada uma serie isso corresponder a invalidar 108 amostras. CONCLUSÃO Não houve resultados discrepantes entre o teste MPX e o teste TAN da rotina do nosso laboratório (COBAS Ampliscreen VIH-1 Test, version 1.5 e COBAS Ampliscreen VHC Test, version 2.0) nem com os resultados da serologia virica (AgHBs, AcHBc, anti-vhc, anti-vih1/2). O sistema Roche cobas s 201 é de mais fácil utilização e manutenção e providencia resultados TAN em menos tempo que o método usado actualmente na rotina, o que permite libertar os componentes mais cedo, sobretudo as plaquetas. O teste MPX apresenta a possibilidade de detecção do VIH2 o que não acontecia com o teste Ampliscreen HIV-
5 QUADRO N.º4 AMOSTRAS COM SEROLOGIA POSITIVA Amostras positivas (n) Anti-VHC 7 RIBA WB Agp24 5 NEG 2 IND* Teste de Neutralização do AgHBs Anti-VIH1/2 5 4 NEG 1 IND** 5 NEG AgHBs 2 *Amostra 1 c33+1 ; Amostra 2 c **p25+2, p POS 1 NEG QUADRO N.º 5 ERROS E CAUSAS DE INVALIDAÇÃO Causa Amostras inválidas n % Hamilton - Primary pooling (ex: coágulo, volume insuficiente, erro fatal software / hardware) 333 6,0 COBAS AmpliPrep (ex: erro dispensação, erro nos consumiveis) 330 6,0 COBAS TaqMan 0 0 Controlo positivo e/ou Controlo negativo inválidos 60 1,09 1 version 1.5 e inclui a possibilidade de rastrear os ácidos nucleicos referentes à Hepatite B. Contudo foram encontrados alguns problemas de software, hardware e suporte técnico durante o período de avaliação pelo que foram sugeridas algumas modificações nomeadamente: Não obrigatoriedade para pipetar todas as amostras para seroteca; Possibilidade de repetir 2 vezes uma pool inicialmente reactiva; Melhorar a versatilidade para a resolução de uma pool reactiva com serologia positiva ( ); Disponibilizar teste discriminatório para determinar a especificidade viral nas amostras individuais reactivas. Esperamos que os resultados desta avaliação contribuam para o desenvolvimento de um sistema mais eficiente e que a rotina e o treino dos operadores contribua para o melhoramento do desempenho global do teste. AGRADECIMENTOS A equipa de avaliação agradece a J.Saldanha responsável cientifico pelo estudo e ao Peter Matthiesen, todo o apoio logístico prestado. BIBLIOGRAFIA 1. Camacho, R., Araújo, F., Sargento,C., Queirós,L., Pereira,J. Utilização de Técnicas de Ácidos Nucleicos no rastreio das colheitas de sangue. ABO Revista de Medicina Transfusional 2000; nº 2: Kleinman SH., Westat, V., Canad BC., Stramer SL., Mimms L., Phelps BH., Fang C, Busch MP. Comparison of preliminary observed yield of HCV and HIV minipool nucleic acid testing with predictions from the incidence/window period (INC/WP) model. Retrovirus Epidemiology Donor Study Group. Transfusion 2000: vol 40,suppl:S6-030A (Abstract). 3. Evaluation of Limit of Detection, Reproducibility and Blood donor study of the cobas TaqScreen MPX Test for Simultaneous Detection of HCV, HBV,HIV1 Group M, HIV1 Group O, and HIV2 Scientific Affairs Protocol MPX European Pharmacopeia; 3rd Ed Supplement 2001 AUTORES: 1 Lucinda Queirós, 2 Alzira Tender, 3 Ana Aguiar, 3 Joana Azevedo 1 Chefe de Serviço de Imunohemoterapia, CRSP 2 Técnica Superior de Saúde Assessora Superior, CRSP 3 Técnica de Analises Clinicas e Saúde Publica,CRSP Correspondência: Dra. Lucinda Queirós, Centro Regional de Sangue do Porto, Rua de Bolama, 133, Porto (Portugal) 35
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