Farmacogenómica e células cancerígenas estaminais: Um panorama em evolução?

Transcrição

1 Farmacologia Molecular e Celular (MBQ) Farmacogenómica e células cancerígenas estaminais: Um panorama em evolução? Entrega: 27 Abril 2012 Apresentação: 29 de Maio 2012 Ana Puga Matilde Viegas

2 Índice Resumo. 3 Introdução....3 Células Estaminais Cancerígenas...5 Auto-Renovação das CSCs..9 Vias de Sinalização e o seu papel em carcinogénese WNT/β-Catenina Notch 11 Hedgehog (Hh)...12 Polimorfismos.13 Polimorfismos em enzimas que metabolizam fármacos anticancro.13 Tiopurina e Tiopurina S-metiltransferase (TPTM) Fluoroacil e Dihidropirimidina desidrogenase 14 Agentes anticancro e Glutationa S-Transferases 15 Irinotecan e UDP-glucoruniltransferase.16 Polimorfismos que podem influenciar o efeito dos fármacos anticancro.16 Glicoproteína T (ABCB1) Transportador ABCC1..17 Transportador ABCG2 (BCRP).. 18 Outras proteínas associadas a resistência a fármacos..18 Farmacogenómica das CSCs 19 Possíveis melhoramentos dos estudos farmacogenómicos 21 Conclusão...24 Referências Bibliográficas 25 2

3 Resumo As Cancer Stem Cells (CSCs) são agora reconhecidas como uma importante e problemática população celular da massa tumoral. Constituem apenas 0,1% da mesma e ainda assim são responsáveis pela reincidência de carcinogénese pós-terapia devido às suas capacidades de auto-renovação e de geração de outras células tumorais diferenciadas e sem capacidades estaminais. Nesta monografia pretende-se descrever com maior pormenor algumas vias de sinalização bem como mecanismos e transportadores envolvidos na quimioresistência destas CSCs para que, com base em técnicas inovadoras, se possam desenhar novos fármacos direccionados para estas mesmas vias. Esta nova abordagem baseada num design de fármacos direcionado para o genoma individual do paciente encontra-se num ramo da farmacologia (farmacogenómica) ainda pouco desenvolvido no que diz respeito ao combate do cancro. Deste modo, pretende-se dar um panorama do que é já actualmente feito e do que se pode vir a fazer, agora que as CSCs são parte central deste problema que afecta todos os dias milhões de pessoas em todo o mundo. Introdução A ideia de que o cancro é uma doença em que se observa uma proliferação celular descontrolada e anormal governou a investigação feita sobre o cancro durante mais de 7 décadas. Uma vez que os tecidos normais passam por processos naturais de renovação (cada órgão ao seu ritmo), toda a investigação de terapias anti-cancro tem sido assente em bloquear a proliferação neoplásica. Para atingir este objectivo foi preferencial a utilização de drogas em doses suficientemente agressivas para induzir morte celular sem que fossem ultrapassados os níveis de citoxicidade dos tecidos normais. Devido a uma maior compreensão dos mecanismos moleculares da carcinogénese, as terapias escolhidas nos dias de hoje têm como alvo principal a inibição dos potenciadores moleculares do cancro tendo também em conta outros factores microambientais exteriores (Clayton and Mousa, 2011) que poderão suportar o crescimento tumoral como, por exemplo, a angiogénese. É importante notar que estas estratégias, quer as mais antigas quer as mais recentes, têm em comum a ideia de que o cancro é uma entidade amorfa e homogénea. Assim, as drogas aplicadas contra os potenciadores moleculares do cancro deveriam ser eficientes contra todo o tipo de tumores, desprezando a ideia da existência de sub-populações diferentes. O objectivo tem sido administrar uma quantidade suficiente de fármaco(s) tendo como alvo a via molecular primária em combinação com outras drogas que tenham como alvo outras vias moleculares secundárias relevantes ou compensatórias de modo a erradicar os 3

4 tumores. Na realidade, um tumor deve ser considerado como uma entidade heterogénea, com uma hierarquia definida por um processo de maturação, tal como ocorre num tecido normal em desenvolvimento. Existem dois modelos mutuamente exclusivos que tentam explicar a heterogeneidade tumoral (Dick, 2008). O modelo estocástico prevê que um tumor tem uma estrutura biologicamente homogénea, no entanto, o comportamento das células constituintes desta estrutura é controlado e influenciado por factores intrínsecos, entre os quais níveis de factores de transcrição e vias de sinalização molecular, mas também por factores extrínsecos, como o próprio hospedeiro, a resposta imune, etc. Como as influências exercidas sobre estas células são aleatórias e imprevisíveis daqui resulta uma elevada heterogeneidade celular. Estas novas características são expressas pela presença de diferentes marcadores celulares e marcadores de maturação, por anormalidades na entrada da célula no ciclo normal ou em casos mais extremos, as células podem desenvolver a capacidade de iniciação tumoral. A ideia base deste modelo é a de que todas as células do tumor são igualmente sensíveis às pressões supracitadas e que as células tumorais conseguem reverter de um estado de diferenciação para estados menos diferenciados, e vice-versa, uma vez que estas influências não são permanentes. (Dick, 2008; Dick, 2009). Por outro lado, o modelo hierárquico prevê que o tumor é semelhante a um tecido normal em desenvolvimento, no qual as células estaminais mantêm a organização hierárquica dos tecidos (pele, intestinos, sangue). Neste modelo existe uma população de células biologicamente distintas, as quais possuem capacidade de auto-renovação, de maturação e de dar origem a outras populações celulares sem estas mesmas propriedades (Dick, 2008; Dick, 2009). Em suma, apesar de ambos os modelos admitirem a existência de células com características de células estaminais, o modelo estocástico defende que virtualmente todas as células presentes no tumor podem dar origem a estas, pois todas estão sujeitas às mesmas pressões, ao passo que o modelo hierárquico aponta para a presença de uma população distinta e especial de células, as CSCs (CSCS, do inglês cancer stem cells). No entanto, apesar de aceite a hipótese da existência de CSCs não é aplicada a todos os tipos de tumores (Prestegarden, Svendsen et al., 2010). O modelo estocástico foi amplamente utilizado para explicar os fenómenos de metastização, de evasão e de resistência a drogas por parte dos tumores (Hanahan and Weinberg, 2000). 4

5 Figura 1 Esquema dos modelos de heterogeneidade do cancro: modelo estocástico e modelo hierárquico (Dick, 2008). A quimioterapia pode resultar numa selecção de células mais resistentes à terapia, à medida que as restantes são eliminadas. Para melhor compreensão, Goldie e Coldman, na década de 80, desenvolveram um modelo matemático que descreve o crescimento do tumor após o tratamento com quimioterapia. Com base nele, prevê-se que o momento em que o tumor se encontra fragilizado (permitindo ultrapassar a resistência adquirida) é após a administração das primeiras doses de fármacos quimioterapêuticos. No entanto, para tumores que apresentem mutações que lhes confiram resistência intrínseca, o prognóstico não é tão optimista, sendo uma das soluções o design de novos fármacos anti-cancro com base na farmacogenómica (Crea, Duhagon et al., 2011). A farmacogenómica é um ramo da farmacologia que lida com a influência da variação genética na resposta a fármacos pelos pacientes pois correlaciona a expressão genética e a existência polimorfismos com a eficácia e a toxicidade da droga em estudo. Assim, existe a possibilidade de um design inteligente de drogas específicas para pacientes com determinados genomas, de modo a assegurar uma maior eficácia e efeitos adversos diminuídos (Petros and Evans, 2004). Como muitas doenças, tais como o cancro, podem resultar da alteração da expressão de genes, a farmacogenómica pode ser 5

6 uma ferramenta bastante útil para a identificação de quais os genes envolvidos na resposta a uma determinada droga. A variabilidade de resposta a drogas anti-cancro entre pacientes é um factor de preocupação associado a inúmeros fármacos, particularmente em agentes anti-. A relevância clínica da variabilidade é muito evidente em casos em que os fármacos apresentam baixos índices terapêuticos, ou seja, quando a dose utilizada para produzir efeito se encontra muito próxima da dose tóxica para a maioria dos indivíduos. De um modo geral, os fármacos anti-tumorais utilizados possuem baixos índices terapêuticos são citotóxicos inespecíficos, a dose necessária para eliminar as células tumorais é muito próxima da dose tóxica para as células normais (Petros and Evans, 2004). Apesar do perfil genético do paciente ser algo a ter em conta, muitos outros factores ambientais e sociais podem influenciar a dinâmica do fármaco em uso, como a idade, o sexo, interacções com outras drogas, tabagismo, etc. Actualmente, os estudos farmacogenómicos têm como objectivo a identificação de polimorfismos, mutações específicas associadas a tumores e padrões de expressão genética que poderão prever a eficácia e a tolerância dos pacientes aos tratamentos (Crea, Duhagon et al., 2011). Contudo, um problema dos estudos de farmacogenómica tem sido a análise de tumores como uma massa geneticamente homogénea, desprezando a importância da contribuição das células estaminais cancerígenas. Células Estaminais Cancerígenas A renovação perpétua de tecidos e órgãos é levada a cabo por uma população de células estaminais e progenitoras; estas células garantem a manutenção e renovação após danos. As células estaminais estão posicionadas no topo da hierarquia celular e dão origem a outras células com um menor potencial estaminal. Estas conseguem dividir-se e auto renovar-se de modo a formar células estaminais filhas ou então diferenciar numa variedade de células maduras (Groner, Vafaizadeh et al., 2009). Devido a estas propriedades especiais, na última década têm sido vistas como potencialmente vantajosas no estudo de muitas doenças humanas. Actualmente, considera-se que estas células possuem um papel central na origem, disseminação e resistência dos tumores humanos. A ideia de que estes estão organizados segundo uma hierarquia é aceite pela comunidade científica, uma vez que possuem populações de células distintas que 6

7 apresentam diferentes características e potencialidades (Nicolini, Ferrari et al., 2011). Os tumores podem ser vistos como um órgão anormal e amorfo, no qual o crescimento tumoral é potenciado por uma população de células com propriedades estaminais: as CSCs. A caracterização das primeiras CSCs data de 1994, quando foram identificadas com sucesso as primeiras CSCS a partir de Leucemia Mielóide Aguda. Essas células apresentavam um perfil CD34+CD38- e, ao contrário da população de células maturas (CD34+CD38+), eram as únicas capazes de diferenciar-se com a heterogeneidade semelhante à do cancro parental, fonte das células transplantadas num rato NOD/SCID (Lapidot, Sirard et al., 1994; Crea, Mathews et al., 2009). Assim, estas células são responsáveis não só pela manutenção e renovação do tumor mas também pela origem de todas as outras células constituintes, incluindo clones de CSCS e células sem capacidade de iniciação tumoral. Este tipo de observação tem implicações na compreensão dos mecanismos de carcinogénese e também no diagnóstico e desenvolvimento de novas terapias. É necessário manter em mente que, para tratar o cancro de forma eficiente, as CSCs têm que ser eliminadas, caso contrário o tumor continuará a regenerar-se rápida e facilmente mesmo após a remoção das células sem capacidades tumorigénicas Reconhecida então a importância das CSCs no decorrer da doença cancerígena e como a presença de biomarcadores nas CSCs varia consoante o cancro em estudo, foi necessário desenvolver metodologias de identificação das mesmas. Um método amplamente utilizado para este efeito reside na aplicação do corante de Hoechst 33342, uma vez que as células que não o incorporam são designadas de células SP (do inglês, Side Population). Esta população celular expressa nas suas membranas ABCG2 (posteriormente explorado neste trabalho), um transportador da superfamília ABC, cuja expressão na membrana celular permite regular a saída do corante Hoechst do interior da célula (Wu and Alman, 2008). A presença do ABCG2 permite que estas células transportem diversos fármacos hidrofóbicos, como o doxorubicin, para o ambiente intracelular (Tiwari, Sodani et al., 2011). É importante salientar que, além do ABCG2, as células SP sobre-expressam outros transportadores da família ABC, conferindo-lhes resistência a um maior espectro de fármacos (Ho, Ng et al., 2007). Pensa-se que o padrão de expressão de transportadores ABC nas membranas das células cancerígenas pode variar consoante o tipo de tumor (Crea, Duhagon et al., 2011), o que poderá ser relevante para os clínicos na altura da escolha da terapia mais adequada. 7

8 Segundo o estudo de 2005 de Prawala et al, não existe uma relação linear entre a presença do ABCG2 e a tumorigenicidade. Os autores utilizaram células cancerígenas ABCG2+ e ABGC-2 para pesquisar a sua tumorigenicidade in vivo e os seus resultados indicaram que: a população de células SP é enriquecida em CSCs; que as células ABCG2 são progenitoras de novas células tumorais a um ritmo mais acelerado que as ABCG2-, no entanto, verifica-se que as células ABCG2+ dão origem a células ABGC2- e vice-versa; e, finalmente, que a população ABCG-2 contém CSCS primitivas (Patrawala, Calhoun et al., 2005). Em alguns tumores, como gioblastomas multiformes, as populações SP e CSCS são distintas, como foi demonstrado num estudo em que a população de células SP do glioblastoma não contribuía nem para a auto-renovação e nem para a iniciação tumoral (Broadley, Hunn et al., 2011). Estes estudos mostram que, apesar de existir uma relação muito íntima entre estas duas populações celulares, há excepções e que cada caso é um caso. Como tal, são necessários mais estudos para podermos afirmar com certeza qual o grau de relação entre células SP e CSCS, sendo que é importante ter em conta o tipo de tumor em estudo e quais as condições em que as experiências foram elaboradas. Além do método do corante Hoechst 33342, existe um método alternativo para a caracterização da população SP que reside na selecção de DRCs (do inglês, drug resistance clones), e pesquisa por características das células CSCs como, por exemplo, marcadores CSCSc específicos de tecidos como CD44, CD24 e ESA (do inglês, epithelial-specific antigen) expressos em células resistentes. A produção de factores angiogénicos e de citocinas também pode ser uma metodologia para a identificação destas células (Crea, Duhagon et al., 2011). A recorrência de cancro após a quimioterapia pode ter como chave as CSCs. Muitos pacientes morrem de cancro após a falha das terapias utilizadas para eliminar a doença residual e, devido a todas as propriedades descritas até ao momento, pensa-se que as CSCs podem ser responsáveis por este problema. Um estudo publicado em 2008 utilizou uma subpopulação de células tumorais colorrectais, com o fenótipo ESA+CD44+ (específicos de CSCs), capazes de iniciar tumores com características heterogéneas, semelhantes ao parental após terem sido inoculadas em ratos (Dylla, Beviglia et al., 2008). Os resultados mostraram que os tumores no cólon, após a quimioterapia, se encontravam enriquecidos em CSCs, com rápida capacidade de regeneração. Este estudo é mais um passo na compreensão de que o genoma do 8

9 hospedeiro pode ter um papel principal na resposta às terapias utilizadas no controlo das neoplasias. Auto-renovação das CSCs A partir de experiências embriológicas, tornou-se evidente que o processo de diferenciação de células e a sua restrição a linhagens celulares é um processo feito em vários passos e definido por uma série de factores, incluindo reguladores de transcrição, que controlam os vários estádios da diferenciação. In vivo, estes sinais e o microambiente envolvente constituem um nicho que rodeia as células, as quais competem por uma concentração limitadas de factores de crescimento, permitindo assim balancear entre o estudo de diferenciação e auto-renovação das células estaminais (Nusse, 2008). Figura 2 Modelo do nicho (camada celular apical) que mantêm as CSCs (verde) em estado de autorenovação. Células que não possuam contacto directo com o nicho irão diferenciar-se (Nusse, 2008). As cascatas de sinalização WNT, FGF, Notch, TGFβ/BMP e Hedgehog (Hh) orientam a morfogénese do tecido fetal, a homeostasia de tecidos adultos e a carcinogénese em mamíferos através da regulação da auto-renovação, proliferação e diferenciação de células estaminais ou células progenitoras. A rede de sinalização das células estaminais está desregulada em cancro humano devido a mudanças no padrão epigenético bem como alteração nos genes codificantes de componentes envolvidos na sinalização pelas cascatas, anteriormente mencionadas, WNT, FGF, Notch, TGFβ/BMP e Hedgehog (Katoh, 2007; Katoh, 2011) 9

10 Figura 3 Visão geral das vias de sinalização WNT, FGF, Notch, Hedgehog e TGFβ/BMP, as quais constituem a rede de sinalização existente nas células estaminais e necessárias para a regulação de morfogénese de tecido-fetal, homeostasia de tecido adulto e carcinogénese. Os sinais WNT são transmitidos por receptores Frizzled; os sinais FGF são-no por receptores FGR com actividade intrínseca da tirosina cinase; os sinais DLL/JAG são traduzidos por receptores NOTCH; sinais TNFβ/BMP estão dependentes de receptores com actividade de cinase serina/treonina intrínseca; os sinais Hedgehog são transmitidos por receptores PTCH e transdutores de sinal SMO (Katoh, 2011). Vias de sinalização e o seu papel em carcinogénese WNT/β-catenina Esta via parácrina é extremamente conservada ao longo da evolução e o seu pico de actividade é durante o desenvolvimento. A sua activação resulta no aumento de proliferação e renovação tanto de células estaminais saudáveis como de cancerígenas. As moléculas Wnt são enviadas para células adjacentes e mediante a ligação simultânea a receptores Frizzled e moléculas Lrp5/6, da família dos receptores LDL, é iniciada a cascata de sinalização intracelular. (Reya and Clevers, 2005). O transporte das Wnt entre as células é feito com o envolvimento de lipoproteínas e, até à data, julgase que para a sua inserção nas lipoproteínas só é feita mediante a palmoilação da molécula Wnt (Willert, Brown et al., 2003). Após a ligação da proteína Wnt aos receptores Frizzled, a molécula Dishevelled (DSH) é a primeira a ser activada e irá inibir um segundo complexo de proteínas 10

11 presentes que interior da célula e que incluí axina, GSK-3 e APC. Este complexo, quando activo, promove a degradação da proteína β-catenina, a qual é responsável pela sinalização dentro da célula, logo, se inibirmos o complexo (por ligação da Wnt aos receptores Frizzled), a β-catenina não é destruída e irá entrar no núcleo para induzir a expressão dos genes alvo e assim promover a proliferação celular (Reya and Clevers, 2005). Um caso flagrante da importância desta via para a carcinogénese é o facto de mutações que inactivem o gene APC (supressor de tumores) estão na base do cancro colorrectal (Morin, Sparks et al., 1997; Crea, Duhagon et al., 2011). Outra hipótese de alterações nesta via são mutações que afectem outros componentes da via como a β- catenina. Nestas situações ocorrerá um aumento excessivo de células estaminais saudáveis bem como CSCs (Bienz and Clevers, 2000; Willert, Brown et al., 2003; Nusse, 2008). Notch A via Notch é uma cascata de sinalização conservada e baseada na interacção ligando-receptor. Possui um papel fundamental na proliferação, diferenciação e apoptose celular. Os seus efeitos são dependentes do contexto onde se encontram e podem resultar tanto em actividade oncogénica como anti-proliferativa (Miele and Osborne, 1999; Wang, Li et al., 2010). Foram já identificados 4 receptores Notch em mamíferos: Notch-1, Notch-2, Notch-3 e Notch-4. Como ilustrado na figura 3, os ligandos são ou Delta-like (Dll) ou Serrate-like (os quais são ou Jagged-1 ou Jagged-2) (Miele, 2006; Wang, Li et al., 2010). A sinalização Notch é iniciada quando o ligando interage com um receptor Notch de uma célula vizinha. Após a activação, a proteína γ-secretase irá clivar a molécula Notch, libertando o domínio levando à expressão génica dos seus genes alvo. Caso a γ- Secretase não exerça a sua função, a transcrição dos genes alvo permanece inactiva. A sinalização pela via Notch possui, em alguns casos, um carácter mais antiproliferativo que propriamente oncogénico (Dotto, 2008; Rizzo, Osipo et al., 2008; Wang, Li et al., 2010), no entanto, existem outros estudos que remetem exactamente para o contrário, apontando a via Notch como elemento oncogénico no desenvolvimento de muitos carcinomas humanos devido à sobre-expressão dos seus receptores e ligandos em diversos tipos de cancro (Wang, Li et al., 2010). 11

12 Com o crescendo de literatura publicada que aponta a desregulação da via Notch como um factor chave para o desenvolvimento de cancro humano, esta poderá figurarse como alvo terapêutico: tentando diminuir a actividade da via Notch, há possibilidade de impacto na remissão do cancro. Aliás, a via Notch é fundamental para as CSCS e como as actuais terapêuticas anti-cancro focalizam-se unicamente no cancro como um todo e matam apenas as células já diferenciadas deixando as CSCs, uma terapêutica cujo alvo seria a via Notch teria resultados promissores na cura e numa possível erradicação total do cancro. Contudo, como já foi dito, a actividade da via Notch depende em muito do contexto em que esta se insere tendo resultados distintos em diferentes tipos celulares, e como tal, a inibição sistémica da mesma poderá não só afectar o desenvolvimento carcinogénico como, simultaneamente, comprometer alguns tipo celulares resultando em toxicidade sistémica (Rizzo, Osipo et al., 2008; Wang, Li et al., 2010). Hedgehog (Hh) A via Hh está implicada na manutenção de células estaminais ou células progenitoras em tecidos adultos, incluindo o epitélio de vários órgãos internos e cérebro (Beachy, Karhadkar et al., 2004; Jiang and Hui, 2008). Danos e mutações nos componentes desta cascata em alguns tecidos estão associados a tumorogénese. Por exemplo, alterações nos componentes Ptc1 e Smo que resultam na activação da via estão associadas ao desenvolvimento do carcinoma basocelular e meduloblastoma (Wicking, Smyth et al., 1999; Jiang and Hui, 2008). Uma característica destes tumores é a activação constitutiva desta via na ausência de ligando Hh. Em contraste, a activação dependente do ligando é também importante para o crescimento, sobrevivência ou para ambos numa série de cancros como gastrointestinal, próstata, condições hematológicas malignas e gliomas. Estes tumores não originam mutações na cascata Hh e o seu crescimento pode ser reduzido através de inibidores como anticorpos neutralizantes de proteínas Hh e/ou antagonistas Smo. Foi também já verificado que a activação da via Hh é necessária para o crescimento do ambiente estromal em volta, funcionando de forma parácrina e não apenas no próprio tumor. No seguimento destas observações pode-se inferir que as proteínas Hh produzidas por estes tumores, bem como o ambiente estromal envolvente, mantêm as células estaminais num estado indiferenciado e proliferativo (Jiang and Hui, 2008; Yauch, Gould et al., 2008). 12

13 Polimorfismos A quantidade de polimorfismos existentes na população humana é algo para se ter em conta quando é aplicado ou desenvolvido um novo fármaco. (Danesi, de Braud et al., 2003). A farmacogenética no tratamento de pacientes com tumores ainda se encontra numa fase de investigação, estando principalmente direccionada para o mapeamento genético individual do paciente de modo a perceber se há presença de polimorfismos que possam interferir com o metabolismo de drogas e que possam estar associados a casos severos de toxicidade e de intolerância ao tratamento (Danesi, de Braud et al., 2003). Figura 4 - Locais de interacção genética com fármacos anti-cancro - Variações genéticas quer em tecidos normais, quer em tecidos tumorais podem influenciar toda a rede de efeitos após a administração de um fármaco anti-cancro (Petros and Evans, 2004). Polimorfismos em enzimas que metabolizam fármacos anti-cancro Até aos dias de hoje foram feitos inúmeros estudos que demonstram as relações entre a farmacocinética das drogas anti-cancro, tendo como foco principal a sua toxicidade. Isto indica-nos que os polimorfismos nos genes que codificam enzimas que metabolizam estas drogas podem ser de elevada importância clínica. Assim sendo, vão ser ilustrados a título de exemplo alguns dos polimorfismos mais estudados. Tiopurina e Tiopurina S-metiltransferase (TPTM) O polimorfismo no gene que codifica a TPTM (do inglês thiopurine S- methyltransferase) é um dos exemplos farmacogenómicos melhor elucidados (Petros and Evans, 2004). A identificação deste polimorfismo (em 1980) foi devida ao 13

14 reconhecimento da actividade polimórfica da TPTM em indivíduos normais (em regime voluntário). Posteriormente, estudos familiares mostraram que os fenótipos TPTM apresentavam co-dominância autossómica e as mutações genéticas responsáveis foram então identificadas. A deficiência na TPTM é uma característica autossómica recessiva, e é herdada geneticamente em 1/300 dos casos (McLeod, Krynetski et al., 2000). Estas descobertas foram muito importantes para aplicação de diagnósticos moleculares na prática clínica. A TPTM catalisa a s-metilação de agentes de tiopurina como a azatiopurina, a 6- mercaptopurina e a tioguanina (fármacos utilizados na quimioterapia contra leucemias), actuando como mecanismo primário da eliminação destes compostos em humanos (McLeod, Krynetski et al., 2000). O principal mecanismo citotóxico destes agentes é geralmente a incorporação de nucleótidos de tioguanina (resultantes do metabolismo) nos ácidos nucleicos, quer DNA quer RNA. Pacientes com deficiência na TPTM acumulam quantidades excessivas de nucleótidos de tioguanina nos tecidos hematopoéticos, levando a níveis de toxicidade fatais. A base molecular para o polimorfismo da TPMT foi identificada para a maioria dos pacientes. Até ao momento, foram encontrados pelo menos oito alelos, três dos quais (TPMT*2, TPMT*3A e TPMT*3) são responsáveis por aproximadamente 90% dos casos identificados de actividade enzimática baixa ou intermédia (McLeod, Krynetski et al., 2000). Estes estudos são de grande interesse para a prática clínica uma vez que, ao terem sido identificados os genes responsáveis pelos polimorfismos da TPMT, podem-se adequar as doses de fármacos (para doses mais baixas do que as convencionais) aos pacientes, de modo a não correrem riscos de intoxicação nos tecidos hematopoéticos. 5-Fluoroacil e Dihidropirimidina desidrogenase O 5-Fluoroacil (5FU) é um dos agentes mais amplamente utilizados em quimioterapias para o tratamento de cancros metastizados com origem no trato gastrointestinal (van Kuilenburg, Meinsma et al., 2004). Foi mostrado que a dihidropirimidina desidrogenase (DPD) tem um papel chave no metabolismo do 5FU. Mais de 80% do 5FU administrado é catabolizado pela DPD e os pacientes que apresentem uma deficiência completa ou parcial em DPD têm reduzidas capacidades para degradar este fármaco, podendo sofrer de intoxicações severas a nível gastroinestinal, hematopoético e cerebral (van Kuilenburg, Klumpen et al., 2008). O gene que codifica a DPD (DPYD) exibe um polimorfismo em aproximadamente 3% dos 14

15 indivíduos heterozigóticos, sendo que 1 em 1000 herda duas variantes diferentes de alelos para o gene DPYD. Uma ausência total em DPD leva à manifestação de uma deficiência no metabolismo de pirimidinas usualmente associado a condições patológicas como a timidina-uracilúria e a doenças neurológicas, para os quais os heterozigóticos na ausência de tratamento com 5FU não apresentam um fenótipo tão demarcado. Aproximadamente 50% dos alelos não funcionais de DPYD apresentam uma transição G-A no exão 14, o que leva a produção de uma proteína truncada, não funcional, sendo posteriormente degradada pelo sistema ubiquitina-proteossoma. Até 2004, eram conhecidas 32 mutações e polimorfismos para o gene DPYD resultantes na perda da actividade da DPD ou na redução da mesma (van Kuilenburg, Meinsma et al., 2004). Apesar de todo o trabalho desenvolvido até ao presente, ainda não existe um consenso entre o genótipo de DPYD e o respectivo fenótipo DYPD, sendo necessária a realização de mais estudos para uma optimização da terapia com 5FU. Agentes anti-cancro e glutationa s-transferases Nos humanos a família da glutationa s-transferases (GSTs), catalisa a conjugação da glutationa a vários compostos potencialmente perigosos para o organismo entre os quais: electrófilos endógenos e xenobióticos e os respectivos produtos resultantes do seu metabolismo. Os genes que codificam estas proteínas exibem elevados níveis de polimorfismos, com uma incidência de aproximadamente 50% e 25% de delecções homozigóticas na maioria das populações para os genes GSTM1 e GSTT1, respectivamente. Outros polimorfismos são encontrados nas GSTs, nomeadamente a GST-P1 e a GST-A, estando associados a resistência a fármacos utilizados no combate a tumores (Petros and Evans, 2004). Polimorfismos nesta família de enzimas podem conferir maior resistência ao doente face ao cancro, como por exemplo, a substituição Ile105Val em GST-P1. Doentes de cancro da mama que apresentem este polimorfismo têm uma maior capacidade de sobrevivência, quando comparados com doentes com pelo menos um alelo normal (Sweeney, 2000). No entanto, também se pode verificar o caso oposto: desenvolverem maiores riscos de toxicidade face ao tratamento, tornando-se maior o risco de fatalidade. Tal verifica-se no caso de uma dupla delecção de GSTT1, pois a enzima não está presente para desempenhar a sua função de destoxificação (Davies, Robison et al., 2001). Em suma, estes dois exemplos mostram que os polimorfismos genéticos no 15

16 metabolismo de fármacos são muito importantes para adequar a intensidade e a natureza do tratamento prescrito (Petros and Evans, 2004). Irinotecan e UDP-glucoruniltransferase O Irinotecan é um fármaco utilizado no tratamento do cancro, nomeadamente no cancro do cólon, actuando sobre a topoisomerase 1, inibindo-a de desenrolar o DNA. Uma vez dentro do organismo, o Irinotecan é convertido pela carboxilesterase a SN38 que apresenta um potencial de inibição 1000 vezes superior da topoisomerase 1 quando comparado com o Irinotecan. A UDP-glucoruniltransferase 1A1 (UGT1A1) é a enzima responsável pela reacção de conjugação do SN38 com glicuronídeo, da qual resulta uma forma relativamente inactiva de SN38 que é eliminado de forma mais eficiente pela urina do que quando se encontra dissociado (Petros and Evans, 2004). A dose máxima antes de provocar toxicidade do Irinotecan (manifestada por diarreia) está relacionada com concentrações elevadas de SN38 (Ando, Saka et al., 2000). Polimorfismos directamente relacionados com o metabolismo do Irinotecan foram identificados, entre os quais: polimorfismos nos genes codificantes das carboxilesterase (Humerickhouse, Lohrbach et al., 2000; Khanna, Morton et al., 2000) e para membros da superfamília dos citocromos CYP3A4 (Santos, Zanetta et al., 2000) e CYP3A5. Mutações presentes na região codificante da proteína UGT1A1 e diferenças do número de repetições TA na região promotora do mesmo gene podem têm implicações clínicas. Na realidade, o metabolismo incompleto de SN38 está correlacionado com sete repetições TA, sendo que 12 a 16% dos pacientes são homozigóticos para sete repetições TA em ambos os alelos (Ando, Saka et al., 2000). Pacientes tanto homozigóticos como heterozigóticos para este padrão de repetições, apresentam uma maior pré-disposição para desenvolver sintomatologia de intoxicação pelo Irinotecan, manifestada por diarreia, quando comparados com pacientes wild-type (seis repetições) (Ando, Saka et al., 2000; Petros and Evans, 2004). Polimorfismos que podem influenciar o efeito dos fármacos anti-cancro Estudos farmacogenómicos e farmacogenéticos recentes mostraram que as proteínas transportadoras de membrana têm um papel muito importante nos humanos. Mudanças nestes transportadores devidas a polimorfismos genéticos estão associadas a perturbações nos perfis farmacocinéticos, o que poderá levar a diferenças da eficiência do fármaco ou efeitos adversos mais acentuados (Ieiri, 2012). O transporte intracelular de fármacos na terapia anti-cancro é ainda uma área pouco estudada e necessita de uma 16

17 maior atenção uma vez que esta passagem é facilitada muitas vezes pelo transporte activo de proteínas de membrana, sendo um processo importante em todos os tecidos, normais e tumorais (Petros and Evans, 2004). Aqui vão ser apresentados alguns exemplos de proteínas importantes na resistência a drogas anti-cancro. Glicoproteína-P (ABCB1) Foi o primeiro transportador ABC a ser identificado (Juliano and Ling, 1976). A glicoproteína-p é um elemento da superfamília dos transportadores ABC, codificada pelo gene ABCB1, responsável pela resistência a múltiplas drogas (MDR, do inglês Multi-Drug Resistance). Esta proteína é um importante transportador de muitos compostos lipofílicos, entre os quais inúmeros fármacos anti-cancro. Funcionalmente esta proteína está envolvida na protecção das células contra a citoxicidade de determinados xenobióticos (Tiwari, Sodani et al., 2011). Altos níveis de expressão desta proteína estão associados com um pior prognóstico de tratamento em neoplasias gástricas (Petros and Evans, 2004). Apesar de terem sido identificados variadíssimos polimorfismos associados ao gene ABCB1, estes parecem apenas originam um número reduzido de haplótipos. Alguns destes polimorfismos parecem ter interesse clínico, por influenciarem a farmacocinética (Hoffmeyer, 2000). Indivíduos que apresentem polimorfismos no exão 26 do gene codificante da glicoproteína-p apresentam dificuldades na absorção e na metabolização de fármacos a nível do duodeno. Em 2000, num estudo levado a cabo por Hoffmeyer e seus colaboradores foi amostrado que na amostra da população caucasiana utilizada (n=5188), aproximadamente 24% dos indivíduos eram homozigóticos para este polimorfismo (Hoffmeyer, 2000). Em 2003, foi encontrado um novo polimorfismo no codão 12 do gene ABCB1 associado com a farmacocinética do Irinotecan (Mathijssen, Marsh et al., 2003). Transportador ABCC1 Este transportador é codificado pelo gene ABCC1, e está presente na superfície basolateral das membranas dos epitélios e de modo semelhante aos outros transportadores ABC encontra-se envolvido no efluxo dependente de ATP de xenobióticos através das membranas celulares. O papel fisiológico deste transportador reside no efluxo de conjugados de glutationa, de drogas anti-neoplásicas. Esta sub- 17

18 família de transportadores foi identificada por conferir a resistência multi-drogas a variados cancros, como pulmão, bexiga e mama. Ao contrário do ABCB1, este transportador tem uma grande afinidade para compostos hidrofílicos carregados negativamente (Tiwari, Sodani et al., 2011). No entanto, o ABCC1 tem em comum vários substratos com o ABCB1, sendo que proteínas codificadas pelos genes ABCB1 e ABCC1 estão associadas com a resposta à quimioterapia em leucemia mielóide aguda (van der Kolk, de Vries et al., 2000). Transportador ABCG2 (BCRP) Codificado pelo gene ABCG2, este transportador necessita de se encontrar na forma de dímero ou de tetrámero de modo a exercer de forma correcta a sua função de exportar o seu substrato através da membrana celular. Este transportador é encontrado numa grande variedade de tecidos incluindo a placenta, a parte apical das membranas dos epitélios, pâncreas, etc. Tal como os transportadores ABC mencionados anteriormente, fisiologicamente tem um papel importante em proteger as células dos efeitos citotóxicos de xenobióticos (como fármacos anti-cancro) e de produtos endógenos. Estudos em ratos knockout para o ABCG2 mostraram que estes apresentavam susceptibilidade acrescida a variados compostos farmacêuticos, e que esta era manifestada por uma redução demarcada das populações de células estaminais estaminais (Mathijssen, Marsh et al., 2003). O ABCG2 é muitas das vezes encontrado em níveis de sobre-expressão em diversas linhas celulares malignas. Existem também numerosas provas de que a sobre-expressão deste transportador pode dar origem a resistência multi-drogas tanto em tumores sólidos como em leucemias (Tiwari, Sodani et al., 2011), no entanto, o padrão de resistência é diferente dos transportadores ABCB1 e ABCC1 (Litman, Brangi et al., 2000; Ross, Karp et al., 2000). Como foi referido anteriormente, este transportador encontra-se presente na população celular SP e é o responsável por esta designação uma vez que exporta o corante Hoescht33342 para fora da célula. Outras proteínas associadas a resistência a fármacos Além dos transportadores ABC mencionados, ABCB1, ABCC1 e ABCG2, outros transportadores ABC foram mencionados por conferir resistência in vivo a fármacos anti-neoplásicos, particularmente os da sub-família ABCC, também designados por MRPs (do inglês, multi drug resistance associated proteins) (Tiwari, 18

19 Sodani et al., 2011). Funcionalmente transportam uma panóplia de toxinas para fora das células e são também encontrados em tumores, nas vias respiratórias e no trato gastroinestinal (Petros and Evans, 2004). Apesar de já ter sido descrita variabilidade genética nos genes que codificam estas proteínas, as suas implicações funcionais ainda não foram descritas (Saito, Iida et al., 2002; Petros and Evans, 2004). Farmacogenómica das CSCs A abordagem farmacogenómica tradicional assenta em estudos genómicos para correlacionar variante genéticas e resposta à terapêutica. Tanto os polimorfismos germinativos como as mutações somáticas em células cancerígenas podem afectar vias envolvidas em resistência a drogas, por isso, quando a farmacogenómica é aplicada ao cancro, realiza-se o mapeamento genómico de CSCs. Como dito anteriormente, as CSCs estão no topo da hierarquia do cancro e são, por norma, as células mais resistentes à terapia. Fazendo uso da genómica, proteómica e bioinformática é possível tanto aumentar o conhecimento acerca do funcionamento de um determinado fármaco ao actuar num doente com determinado perfil genético (Danesi, de Braud et al., 2003) bem como a determinação de biomarcadores em CSCs associado a estudos de eficiência de drogas (Crea, Duhagon et al., 2011). Este último permitirá encontrar factores preditivos e de prognóstico para que seja possível aperfeiçoar a terapia anti-cancerígena. Os factores de prognóstico indicam o resultado provável de uma doença num indivíduo, independentemente do tratamento a que este foi submetido. Já os biomarcadores preditivos preveem o efeito do tratamento num determinado doente com determinada patologia. Aliás, um verdadeiro marcador preditivo deverá estar associado a resultados clínicos apenas em doentes que foram submetidos a uma terapia específica. Um biomarcador preditivo pode ser também alvo de terapia como, por exemplo, a proteína de fusão BCR-ABL em leucemia mielóide crónica (Oldenhuis, Oosting et al., 2008; Crea, Duhagon et al., 2011). Até recentemente, foram identificados vários genes/vias metabólicas de CSCs que funcionam como factores preditivos do resultado clínico de determinado tratamento. Por exemplo, a detecção do biomarcador CD133, associado a cancro colorrectal (Ong, Kim et al., 2010), cancro rectal (Yasuda, Tanaka et al., 2009) e NSCLC (do inglês Non Small Cell Lung Cancer) (Salnikov, Gladkich et al., 2010), permite a previsão de resultados clínicos com determinado tratamento para estas 19

20 patologias. Estas previsões vão desde alta expressão de genes de resistência de drogas até probabilidade de reincidência do tumor (Yasuda, Tanaka et al., 2009; Ong, Kim et al., 2010; Salnikov, Gladkich et al., 2010; Crea, Duhagon et al., 2011). Assim, torna-se evidente como a presença de um biomarcador no perfil genético poderá ser uma excelente ferramenta para estudos de farmacogenómica pois irá permitir um melhor direcionamento da terapêutica no futuro. A ocorrência de polimorfismos e mutações em células cancerígenas pode desregular as vias de sinalização previamente citadas: WNT, Hedgehog e Notch, e que estão envolvidas na auto-renovação e sobrevivência de CSCs face à quimioterapia. Tentando modelar a actividade destas vias, é possível levar à remissão do cancro. O uso de moléculas inovadoras como SiRNA específico ou inibidores para a γ-secretase (GSIs), proteína chave na via Notch envolvida na proteólise e libertação do domínio intracelular Nocth, levou à diminuição de taxas proliferativas, aumento de apoptose, redução de migração e diminuição de propriedades invasores de células do cancro pancreático (Wang, Banerjee et al., 2006; Wang, Zhang et al., 2006; Wang, Li et al., 2010) entre outros. As GSIs estão em ensaios clínicos de fase II e, por isso, estão entre as primeiras drogas a serem dirigidas especificamente para vias chave das CSCs. Mesmo com resultados animadores, as GSIs nem sempre são eficientes. No caso de leucemias linfoides aguda, 60% das células T apresentavam o gene do receptor Notch-1 mutado, por isso, havia grandes esperanças que as GSIs apresentariam bons resultados após a sua inserção na terapêutica destes casos. Contudo, os resultados foram desanimadores: a taxa de resposta foi bastante baixa associada à limitação da dose administrada devido à agressividade gastro-intestinal das GSIs (Palomero and Ferrando, 2009; Crea, Duhagon et al., 2011). São este tipo de situações, de bons e maus resultados associados a determinada terapêutica e tipo de cancro, que sublinham a importância de estudos farmacogenómicos no desenvolvimento inicial de novas drogas para tratamento farmacogenómico bem como na administração das mesmas ao paciente cujo mapeamento genómico das suas CSCs foi já realizado. É também importante notar que ainda mais importante que o mapeamento genómico das CSCs é a compreensão das vias metabólicas que asseguram a sua persistência no organismo do hospedeiro bem como uma análise genética exaustiva para identificação desta minoria de células, as CSCs, no contexto do tumor.(crea, Duhagon et al., 2011). 20

21 Possíveis melhoramentos de estudos farmacogenómicos Actualmente, estamos na transição entre modelos que explicam a forma como o cancro se propaga e se mantém resistente. Primeiramente julgava-se que o tumor era uma entidade homogénea e que todas as células teriam a mesma capacidade de originar clones cancerígenos (modelo estocástico), no entanto, está agora a ser aceite o modelo hierárquico com as CSCs no topo da pirâmide pois o seu papel central em todo o desenvolvimento tumoral atribui-lhes a responsabilidade de serem o centro de propagação, de auto-renovação e de resistência a diferentes drogas anti-tumorais. O método mais utilizado actualmente para acompanhar a evolução do tumor é RECIST (do inglês Response Evaluation Criteria in Solid Tumors) que assenta no modelo estocástico. O RECIST avalia o volume do tumor após administração do tratamento mas esta avaliação pode tanto induzir o clínico em erro acerca da verdadeira actividade do fármaco. Pensemos que estamos a tratar o cancro, considerando que este contém um aglomerado central de CSCs que, muitas vezes, perfaz apenas 0,1% do número total de células do tumor. Se após da administração de terapêutica cujo principal alvo de acção são as células não CSCs, então haverá efectivamente uma diminuição do volume do tumor mas as hipóteses de reaparecimento do mesmo continuam altas devido à resistência das células CSCs. Aliás, estudos já comprovaram que este tipo de terapia não focalizada nas CSCs pode selecionar estas células e favorecer a sua proliferação. (Yu, Yao et al., 2007; Crea, Duhagon et al., 2011). Dado a baixa fiabilidade de métodos como o RECIST é importante a reinvenção dos estudos farmacogenómicos, direccionando-os para estratégias de identificação, de caracterização e de isolamento de CSCs. Um exemplo destes métodos de identificação é a utilização de técnicas sofisticadas de imagiologia (Hart, 2008), como PET (do inglês positron emission tomography) e MRI (do inglês, Magnetic Ressonance Imaging), principalmente para tumores com localização interna, devido ao seu elevado potencial de resolução, sem esquecer a obrigatória utilização de contrastantes ou de sondas radioactivamente marcadas especificas para CSCs (Crea, Duhagon et al., 2011). Para tumores mais superficiais (cancro da mama, por exemplo), técnicas normais de imagiologia podem continuar a ser utilizadas. Apesar de já existirem estudos animais neste sentido (Heyn, 2006), ainda existe muito trabalho no desenvolvimento de sondas específicas para CSCs pois, para alguns tipos de tumores sólidos, o fenótipo das CSCs 21

22 ainda não foi estabelecido e as sondas não deverão ser tóxicas e deverão possuir alta capacidade de difusão em todo o aglomerado de células cancerígenas. A ideia de que se poderão isolar CSCs de sangue periférico, é algo que também se encontra sobre o olhar atento de inúmeros clínicos, uma vez que é algo funcional que poderia ser aplicado em prática clínica (Riethdorf, Wikman et al., 2008). Em doentes com cancros metastizados, existe uma população de células tumorais circulantes (CTC, do inglês, circulating tumor cells). As CTCs têm características em comum com outra população celular identificada no sangue e na medula óssea de doentes com cancro, as DTCs (do inglês, disseminated tumor cells). Tanto as CTCs como as DTCs têm marcadores em comum com as CSCs, o que nos leva a pensar que existe uma subpopulação de CSCs em CTC/DTCs (Crea, Duhagon et al., 2011), ou seja, o isolamento de CTC/DTCs poderia ser implementado para estudos farmacogenómicos. O único senão, tanto para as técnicas de imagiologia supracitadas, como para as técnicas de isolamento do sangue periférico reside na baixa frequência de CSCs. Isto poderia levar a falsos negativos, ou a falsos positivos se os sinais de amplificação fossem exagerados, levando a um mau diagnóstico e consequentemente a uma terapia desadequada. Como estas técnicas mais sofisticadas de imagiologia ainda não foram introduzidas no contexto clínico corrente, surge a necessidade de recorrer a outras formas de detecção de presença de CSCs. Uma dessas hipóteses são marcadores substitutos (surrogate markers) que sugiram a presença de CSCs nas imediações. Um exemplo seriam factores solúveis derivados de CSCs como as citoquinas pro e anti inflamatórias, necessárias para o balancear da progressão do tumor. Assim, em casos de cancro, é recorrente o aumento da concentração sanguínea da IL-6, a qual é produzida no ambiente estromal circundante do tumor e, sendo uma citoquina pro-inflamatória, produz sintomas característicos de cancro como fadiga crónica, depressão e dificuldades cognitivas. Tsavaris et al. estudou as alterações no sistema imune de mulheres com cancro da mama avançado e verificou que células cancerígenas expostas a/ que secretam IL-6 demonstram características malignas tais como capacidades de invasão melhoradas e aumento de resistência a drogas. Assim, no caso de cancro da mama, a presença de IL- 6 fornece um mau prognóstico (Tsavaris, Kosmas et al., 2002). No entanto, a radioterapia e quimioterapia induzem, por si só, a libertação de citoquinas que resultam também em sintomas associados a estas terapêuticas (Muller and Meineke, 2007; Seruga, Zhang et al., 2008). É necessário ter em atenção qual o tipo de tumor bem como 22

23 a terapêutica aplicada, e outros factores, para que estes marcadores substitutos, como a IL-6, não nos induzam em erro. Como tem sido falado ao longo deste trabalho, a aceitação das CSCs enquanto chave de tumorogénese obriga a uma reformulação dos estudos farmacogenómicos efectuados. Como a farmacogenómica pretende detectar as mutações 1) somáticas e 2) germinativas, serão precisos diferentes metodologias para essas mesmas detecções. No 1º caso, uma simples amostra de sangue e análise de células sanguíneas permite-nos detectar algumas variações genéticas que afectam o metabolismo de drogas. Quanto às mutações somáticas, uma biopsia de tecido cancerígeno servirá para detectar mutações específicas de cancro ou perfis genéticos do mesmo (Danesi, de Braud et al., 2003; Crea, Duhagon et al., 2011). No entanto, este tipo de análise pode não oferecer resultados fiáveis pois continua a prevalecer a importância e dificuldade de detecção das CSCs. Outros métodos, mais precisos que uma simples biópsia, começam a ser utilizados. Recorrendo a anticorpos específicos para marcadores de CSCs, é possível detectar esta população no tecido do tumor; com a microdissecção a laser (LMD do inglês laser microdissection) é possível realizar a extração de um número de células bastante reduzido permitindo obter um perfil genómico melhorado e específico das CSCs (Funel, Giovannetti et al., 2008; Crea, Duhagon et al., 2011). Outra forma de estudar a quimioresistência das células é através da observação do seu comportamento quando propagadas in vitro. Tanto as células estaminais normais como as cancerígenas possuem a capacidade de crescer como esferas capazes de autorenovação e como tal, num meio adequado à cultura de células estaminais, estas são pode-se estudar os vários marcadores CSCS bem como, recorrendo a microarrays, perceber um pouco mais as vias metabólicas envolvidas na resistência à quimioterapia (Duhagon, Hurt et al., 2010). Após a realização de estudos de genómica e proteómica, torna-se possível um design mais direcionado de drogas para as diferentes populações celulares, e com estas culturas de CSCs pode-se inferir acerca da eficiência de determinadas terapias antes de as administrar aos doentes, diminuindo assim as hipóteses de efeitos secundários não esperados. Contudo, como é usual na ciência, é necessário manter-se o cepticismo pois a expansão celular e expressão de marcadores à sua superfície pode variar consoante as condições em que estas são cultivadas (Duhagon, Hurt et al., 2010). 23