INSTITUTO OSWALDO CRUZ. Construção de uma biblioteca de módulos para utilização na composição de workflows para filogenia

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1 Ministério da Saúde Fiocruz Fundação Oswaldo Cruz INSTITUTO OSWALDO CRUZ Pós-Graduação em Biologia Computacional e Sistemas Fábio Bernardo da Silva Construção de uma biblioteca de módulos para utilização na composição de workflows para filogenia Dissertação apresentada ao Instituto Oswaldo Cruz como parte dos requisitos para obtenção do título de Mestre em Biologia Computacional e Sistemas Orientador (es): Prof a. Dra. Maria Luiza Campos Prof. Dr. Alberto Martín Rivera Dávila RIO DE JANEIRO 2010 i

2 xxxx xxx Bernardo, Fábio da Silva Construção de uma biblioteca de módulos para utilização na composição de workflows para filogenia./ Fábio Bernardo da Silva Rio de Janeiro: p.; il. Dissertação (Mestrado) Instituto Oswaldo Cruz, Biologia Computacional e Sistemas, Bioinformática; 2. Experimentos; 3. Workflows Científicos; 4. Sistema de Gerenciamento de Workflow Científico; 5. Árvores Filogenéticas CDD **** ii

3 Ministério da Saúde Fiocruz Fundação Oswaldo Cruz INSTITUTO OSWALDO CRUZ Pós-Graduação em Biologia Computacional e Sistemas Fábio Bernardo da Silva Construção de uma biblioteca de módulos para utilização na composição de workflows para filogenia. ORIENTADOR (es): Prof. Dra. Maria Luiza Machado Campos Prof. Dr. Alberto Martín Rivera Dávila Aprovada em: / / EXAMINADORES: Prof. Dr. Antônio Basílio de Miranda (FIOCRUZ) Presidente Prof. Dra. Ana Carolina Paulo Vicente (FIOCRUZ) Membro Prof. Dra. Maria Claudia Reis Cavalcante (UFRJ) - Membro Prof. Dr. André Nóbrega Pitaluga (FIOCRUZ) - Suplente Prof. Dra. Vanessa Braganholo Murta (UFRJ) - Suplente Rio de Janeiro, 22 de Junho de iii

4 À Deus, que tornou tudo isto possível. À minha esposa Cátia Marques e à minha filha Thamirys, que muito contribuíram para a conclusão deste trabalho. iv

5 AGRADECIMENTOS Aos meus orientadores, Drª. Maria Luiza Campos e Alberto Martín Rivera Dávila, por toda a atenção dada durante o desenvolvimento deste trabalho e pelas orientações fornecidas para a correta condução do mesmo. Aos professores Maria Cláudia Reis Cavalcante, Antônio Basílio de Miranda e Ana Carolina Paulo Vicente pela presença em minha banca de avaliação. Ao coordenador do curso de Biologia Computacional e Sistemas da Fundação Oswaldo Cruz, Dr. Alberto Martín Rivera Dávila, por ter confiado no meu trabalho e fornecido as informações necessárias ao cumprimento das minhas atividades como aluno. Aos professores do curso de Biologia Computacional e Sistemas pelos conhecimentos repassados e pela excelente didática de ensino durante o meu período como aluno. Aos meus pais, Vanderlei Ramos da Silva e Maria de Fátima Bernardo da Silva, por tudo que representam na minha vida e que sem eles, este trabalho seria apenas um desejo inalcançável. Aos amigos Marcelo Pontes, Adriana Froes, Felipe, Monete Rajão Gomes, Franklin Souza da Silva, Diogo Antônio Tschoeke, Márcia Bezerra, Felipe Figueiredo, Gilberto, Raphael Cuadrat e Milene Pereira Guimarães os meus sinceros agradecimentos pela convivência diária e pelas informações transmitidas. Aos amigos Rodrigo Jardim, Kari Ocãna, Monete Rajão Gomes, Fábio Mota, Franklin Souza da Silva e Diogo Antônio Tschoeke, pela parceria nos conhecimentos biológicos repassados, pela ajuda nas dificuldades, pelas atividades realizadas em conjunto e que certamente contribuíram bastante para a realização deste trabalho. Ao Professor Sérgio Serra Manuel da Cruz e o aluno Fernando Seabra Chirigate, ambos da UFRJ, pelos conhecimentos transmitidos sobre workflows e desenvolvimentos de módulos para o SGWfC VisTrails, um dos principais conhecimentos para consolidação desta dissertação. Ao amigo Marcelo Cunha que sempre me apoiou nos momentos mais difíceis desta jornada. A todos os amigos que contribuíram direta ou indiretamente nesta dissertação e a amizade feita durante a caminhada da pós-graduação. v

6 Ministério da Saúde Fiocruz Fundação Oswaldo Cruz INSTITUTO OSWALDO CRUZ Construção de uma biblioteca de módulos para utilização na composição de workflows para Filogenia. RESUMO DISSERTAÇÃO DE MESTRADO Fábio Bernardo da Silva Com o advento da era pós-genômica, ocorreu uma explosão de informações onde inúmeras descobertas geraram grande quantidade de dados biológicos, que para serem analisados, necessitavam da cooperação de várias áreas de conhecimento. Inicialmente, as atividades de análises destes dados são suportadas por programas que constituem um fluxo de trabalho, baseado em scripts, que normalmente são executados por linha de comando, obrigando os seus usuários a terem domínio de algoritmos e lógica de programação. Tais scripts auxiliam muito na entrada, processamento e resultado final da análise, mas ainda apresentam dificuldades em interferir, coletar e armazenar dados ao longo de sua execução. Além disso, dependendo da especificidade do script, o seu uso pode ser muito complexo, em função da dificuldade da implementação, manutenção e reuso. Também, neste tipo de ambiente, o registro de execução das atividades do fluxo, da origem dos dados utilizados e das transformações aplicadas aos dados, geralmente, não são mantidos. Para tanto, tem havido o crescente uso de workflows científicos na execução e condução de experimentos científicos. Os workflows científicos pressupõem a resolução de problemas científicos através das técnicas de composição do fluxo de atividades, onde os passos normalmente são compostos por programas de bioinformática que recebem, processam e geram um conjunto de dados que podem ser repassados aos demais passos do workflow. Toda a estrutura de desenvolvimento e execução desses workflows é apoiada por sistemas específicos, conhecidos como Sistemas de Gerenciamento de Workflows Científicos (SGWfC), que possuem seus próprios mecanismos de gerência e linguagem. Considerando as vantagens de uso dos SGWfC no cenário da Bioinformática, este trabalho apresenta o workflow científico para reconstrução filogenética denominado PHYLO. Como contribuições deste trabalho, podemos citar a flexibilidade de composição de novos workflows científicos a partir dos módulos existentes no PHYLO e os vários programas de bioinformática disponibilizados em um ambiente de fácil utilização pelo usuário, permitindo a intervenção do mesmo durante toda a execução do experimento, além da visualização das árvores filogenéticas geradas. Palavras-chaves: Bioinformática; experimentos; workflows científicos; Sistemas Gerenciadores de Workflow Científico; árvores filogenéticas. vi

7 Ministério da Saúde Fiocruz Fundação Oswaldo Cruz INSTITUTO OSWALDO CRUZ Construction of a library of modules for use in the composition of workflows for phylogeny. ABSTRACT DISSERTAÇÃO DE MESTRADO Fábio Bernardo da Silva With the advent of post-genomic era, there was an explosion of information where many discoveries have generated large amounts of biological data, which, to be analyzed, needed the cooperation of various fields of knowledge. Initially, the to industrial activities of analysis of these data are supported by programs that constitute the workflow, based on scripts, that normally run from command line, forcing users to algorithms and programming logic. Such scripts help much the input, processing and outcome of the analysis, but still present difficulties for users to interfere, collect and store data throughout their implementation. Also, according to the specific use of the script, it can be very complex, depending on the difficulty of implementation, maintenance and reuse. Also, in this type of environment, the registration of the execution of the activities of the flow, the source of data used and the transformations applied to the data are generally not retained. For these, there has been the growing use of scientific workflows for the implementation and execution of scientific experiments. Scientific workflows assume scientific problems solving through techniques of composition of the flow of activities, where the steps are usually composed of bioinformatics programs that receive, process and generate a data set that can be passed on to other steps of the workflow. The structure of development and implementation of these workflows is supported by specific systems, known as Scientific Workflows Management Systems (SGWfC), which have their own management mechanisms and language. Considering the advantages of using the scenario SWfMS in the scientific bioinformatics, this work presents the scientific workflow PHYLO for phylogenetic reconstruction. As contributions of this work, we can cite the flexibility for composing new scientific workflows from existing modules in PHYLO and the various bioinformatics programs made available in a user-friendly environment, supporting user intervention throughout the execution of the experiment, besides the visualization of the generated phylogenetic trees. Keywords: Bioinformatics; experiments, scientific workflows, Scientific Workflow Management Systems; phylogenetic trees. vi

8 LISTA DE FIGURAS Figura 1.1 Árvore da vida, baseada em genes ortólogos mostrando as relações filogenéticas entre diversos grupos de organismo. Fonte: (Ciccareli et al.,2006) Figura 1.2 Ferramenta e utilitários do servidor WEB Phylemon. Fonte: (Tarrara et al., 2007). Visão geral da ferramenta Phylemon (A). Visão do Super Phylemon, onde são armazenados os pipelines desenvolvidos pelos usuários (B). Área de visualização e exploração de árvores retangulares, circulares e radiais (C). Arquivos de saída (D). O mapeamento de riscos e topologia dos resultados dos testes TREE-PUZZLE (E). Detalhes de resultados emparelhados entre cinco espécies (F). Visão da área de Armazenamento dos arquivos de entrada e saída em projetos específicos criados pelo usuário (G) Figura Visão geral do sistema ARPA. Fonte: Ocaña e colaboradores, Visão da tela principal do ARPA, para entrada de arquivos no formato (A). Visão área de resultados do pipeline (B). Área de visualização de árvores (C) Figura 1.4 Proteína de aquaporina permitindo a passagem de água e bloqueando a passagem de solutos. Fonte: (Agre e Kozono, 2003) Figura Execuções utilizando o workflow científico PHYLO e reaproveitamento dos módulos comuns a cada experimento Figura 3.2 Diagrama do workflow científico PHYLO, com os seus respectivos programas Figura 3.3 Detalhes da implementação dos módulos do workflow científico PHYLO Figura 4.1 Topologia da árvore filogenética não enraizada das sequências proteicas de aquaporina 1. Método de máxima verossimilhança, com programa PhyML, modelo evolutivo JTT, análise de bootstrap com valor 100, categorias de taxa de substituição com valor 4, distribuição Gama com valor 1 e proporção de sítios invariáveis = Figura Topologia da árvore filogenética não enraizada das sequências proteicas de aquaporina 1. Método de agrupamento de vizinhos, com programa Phylip com bootstrap com valor igual a Figura Topologia da árvore filogenética não enraizada das sequências proteicas de aquaporina 1. Método máxima parcimônia, com programa Phylip com bootstrap com valor igual a Figura 4.4 Topologia da árvore filogenética não enraizada das sequências proteicas de aquaporina 3. Método de máxima verossimilhança, com programa PhyML, modelo evolutivo JTT, análise de bootstrap com valor 100, categorias de taxa de substituição com valor 4, distribuição Gama com valor 1 e proporção de sítios invariáveis = Figura Topologia da árvore filogenética não enraizada das sequências proteicas de aquaporina 3. Método de agrupamento de vizinhos, com programa Phylip com bootstrap com valor igual a Figura Topologia da árvore filogenética não enraizada das sequências proteicas de aquaporina 3. Método máxima parcimônia, com programa Phylip com bootstrap com valor igual a Figura Topologia da árvore filogenética não enraizada das sequências proteicas de aquaporina 9. Método de máxima verossimilhança, com programa PhyML, modelo evolutivo JTT, análise de bootstrap com valor 100, vi

9 categorias de taxa de substituição com valor 4, distribuição Gama com valor 1 e proporção de sítios invariáveis = Figura Topologia da árvore filogenética não enraizada das sequências proteicas de aquaporina 9. Método de agrupamento de vizinhos, com programa Phylip com bootstrap com valor igual a Figura Topologia da árvore filogenética não enraizada das sequências proteicas de aquaporina 9. Método máxima parcimônia, com programa Phylip com bootstrap com valor igual a Figura Topologia da árvore filogenética não enraizada das sequências proteicas de aquaporina 1, 3 e 9. Método de Máxima Verossimilhança, com programa PhyML, modelo evolutivo JTT, análise de bootstrap com valor 100, categorias de taxa de substituição com valor 4, distribuição Gama com valor 1 e proporção de sítios invariáveis = Figura Topologia da árvore filogenética não enraizada das sequências proteicas de aquaporina 1, 3 e 9. Método de agrupamento de vizinhos, com programa Phylip com bootstrap com valor igual a Figura Topologia da árvore filogenética não enraizada das sequências proteicas de aquaporina 1, 3 e 9. Método Máxima Parcimônia, com programa Phylip com bootstrap com valor igual a Figura 8.1 Tela inicial do vistrails para adicionar módulos Figura 8.2 Tela do Vistrails, opção preferences selecionada Figura 8.3 Inserção de módulo no Vistrails Figura 8.4 Tela de execução do Vistrails com módulo adicionado

10 LISTA DE TABELAS Tabela Características desejáveis em workflows científicos Tabela 1.2 Tipos de aquaporinas e locais de maior expressão gênica Tabela Programas implementados no PHYLO com as respectivas funções, versão utilizada e referência Tabela Experimento Tabela Experimento Tabela Experimento Tabela Número de sequência de isoformas de aquaporinas de diferentes tipos e organismos Tabela 4.2 Características do PHYLO, sistema para reconstrução filogenética ARPA, a ferramenta Phylemon e o ScaFos Tabela 4.3 Comparação entre os módulos do PHYLO e um pipeline baseado em script x

11 LISTA DE ABREVIATURAS Aligh-m AQP AQP1ARATH AQP1LEIDO AQP1LEIMA AQP1SACE AQP3LEIBR AQP3LEIN Alinhamento múltiplo de sequências altamente divergentes Aquaporinas Sequência proteica de aquaporina tipo 1 de Arabidopsis thaliana Sequência proteica de aquaporina tipo 1 de Leishmania donovani Sequência proteica de aquaporina tipo 1 de Leishmania major Sequência proteica de aquaporina tipo 1 de Saccharomyces cerevisiae Sequência proteica de aquaporina tipo 3 de Leishmania braziliensis Sequência proteica de aquaporina tipo 3 de Leishmania infantum AQP3SACE Sequência proteica de aquaporina tipo 3 de Saccharomyces cerevisiae AQP3TRYBRU Sequência proteica de aquaporina tipo 3 de Trypanosoma brucei AQP9LEIBR AQP9LEIDO AQP9LEIMA AQP9LEIN Sequência proteica de aquaporina tipo 9 de Leishmania braziliensis Sequência proteica de aquaporina tipo 9 de Leishmania donovani Sequência proteica de aquaporina tipo 9 de Leishmania major Sequência proteica de aquaporina tipo 9 de Leishmania infantum AQP9SACE Sequência proteica de aquaporina tipo 9 de Saccharomyces cerevisiae AQP9TRYBRU Sequência proteica de aquaporina tipo 9 de Trypanosoma brucei xi

12 AQP9TRYCR Sequência proteica de aquaporina tipo 9 de Trypanosoma cruzi ARPA AV AWTY Blast cdna Reconstrução automática e análise filogenética Agrupamento de vizinhos Um sistema de exploração gráfica de MCMC com convergência filogenética em Inferência Bayesiana Ferramenta básica de procura de alinhamento local Ácido desoxirribonucléico complementar ClustalW Consense crna Programa para alinhamento múltiplo de sequências Programa para geração de árvore consensu. Ácido ribonucleico complementar DNA Garli GARSA GBlocks GenBank Mafft Modelgenerator MP MrBayes MUSCLE MV PAUP PHP Ácido desoxirribonucléico Programa que executa a inferência filogenética usando o algoritmo de máxima verossimilhança. Recurso de análise genômica para anotação de sequências. Seleção de blocos conservados a partir de alinhamentos múltiplos para utilização em análise filogenética Base de dados de sequências genéticos Programa de alinhamento múltiplo de sequências baseado em transformação rápida Fourier Programa de seleção de melhor modelo evolutivo. Máxima parcimônia Programa de filogenia usando inferência Bayesiana Programa para alinhamento múltiplo de sequências Máxima Verossimilhança Programa filogenético usando máxima parcimônia Processador de hipertexto xii

13 Phylip PhyML PROBCONS RaxML Readseq RNA Seqboot SGBD SGWF SGWfC SWISS-PROT T-Coffee TREE-PUZZLE TrimAL UniPro UPGMA Weighbor WfMC Pacote de inferência filogenética Programa que implementa um algoritmo simples, rápido e preciso para estimar grandes filogenias por máxima verossimilhança Alinhamento probabilístico baseado na conservação de sequências múltiplas de aminoácidos Programa para inferência filogenética usando o algoritmo de máxima verossimilhança Leitura e reformatação de sequências Ácido ribonucleico Bootstrap, Jackknife, ou troca com reaproveitamento de sequências moleculares, sitio de restrição, frequência do gen ou caracteres Sistema gerenciador de banco de dados Sistemas Gerenciadores de Workflow Sistemas Gerenciadores de Workflows Científicos Banco de dados biológicos curados de sequências proteicas Programa para alinhamento múltiplo de sequências Programa para análise filogenética usando método de máxima verossimilhança e quartetos usando computação paralela Ferramenta de alinhamento automático com corte em grande escala para análise filogenética Banco de dados de busca de sequências de proteínas Método de agrupamento de pae=res com média aritmética Programa para reconstrução filogenética Coligação de administração Workflows xiii

14 SUMÁRIO 1 - INTRODUÇÃO Bioinformática e filogenia Reconstrução filogenética Pipeline filogenético Sistemas para análises filogenéticas Phylemon ARPA Workflows Sistemas de gerenciamento de workflows científicos e suas aplicações na biologia computacional e sistemas Workflows Científicos Vistrails Kepler Taverna Workflow filogenético a ser desenvolvido As aquaporinas e aquagliceroporinas Organização dos capítulos OBJETIVOS Objetivo geral Objetivos Específicos MATERIAIS E MÉTODOS Reconstrução filogenética Ambiente utilizado Especificação do workflow Execução e validação do workflow desenvolvido RESULTADOS Análise Filogenética das proteínas de aquaporinas Análise Filogenética das proteínas de aquaporinas Análise Filogenética das proteínas de aquaporinas Análise Filogenética das proteínas de aquaporinas 1, 3 e Comparação do PHYLO com outros sistemas de reconstrução filogenética Comparação entre os módulos do SGWC PHYLO e um Pipeline baseado em script xiv

15 5 - DISCUSSÃO Reconstrução filogenética semiautomática e automática Flexibilidade na execução de tarefas no PHYLO,Phylemon e o ARPA Registro das etapas de execução e proveniência de dados Uso de tecnologia WEB Reuso de módulos do PHYLO Alteração e manutenção dos módulos Composição de novos workflows científicos a partir do PHYLO Dificuldades na implementação do workflow científico PHYLO Análises protéicas das aquaporinas CONCLUSÕES Contribuições Melhorias e trabalhos futuros REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS APÊNDICES E ANEXOS xvi

16 1 - INTRODUÇÃO A comunidade científica vem desvendando muitos aspectos da ciência da vida fazendo uso, principalmente, de tecnologias avançadas. Nos últimos anos, no âmbito das ciências biológicas, dois campos emergiram: a genômica e a proteômica. Estes campos estão avançando e gerando dados muito rapidamente e a bioinformática tem fornecido as ferramentas para análise e interpretação dessa grande quantidade de dados como complemento às práticas laboratoriais. Os dados obtidos através de pesquisas em bancadas, como por exemplo, sequências nucleotídicas ou proteicas, são processados e confrontados utilizando-se softwares de bioinformática. Os dados processados são compostos de bases de dados locais ou bases disponibilizadas na internet [1] tendo, como exemplo, os bancos de dados genômicos curados ou não. A bioinformática é uma área que está em constante crescimento. Esta área reúne o conhecimento de várias ciências, tendo como base a computação, biologia, química, estatística, matemática, física e áreas afins. Utiliza-se destes conhecimentos para processar dados com softwares cujo objetivo principal é a solução de problemas biológicos. Tais processos demandam recursos computacionais e cálculos matemáticos complexos. Esta prática denomina-se pesquisa in silico [2]. Um cientista utiliza dos recursos de Bioinformática para gerar e gerenciar as informações biológicas passa por muitos desafios no desenvolvimento de softwares, principalmente no que diz respeito a dificuldade de construção de um programa que possibilite a gerência da entrada/saída de dados do programa ou das atividades de fluxo de trabalho. Normalmente, este tipo de atividade é desenvolvida utilizando-se a sequência lógica de execução do experimento e implementada em linguagens interpretadas, devido à simplicidade de implementação. No entanto, este tipo de solução é, geralmente, desenvolvido de forma específica, com dificuldade de reutilização de seus códigos ou scripts [3]. Segundo Taylor [4], pipeline é uma estrutura computacional geralmente utilizada para combinar vários módulos de programas em um só, onde o fluxo de trabalho e as atividades envolvidas são encadeados por conjuntos de scripts em uma determinada linguagem de programação. Com o advento e uso de workflows científicos, o usuário executa experimentos utilizando-se da composição de 1

17 programas que operam em regime de fluxo de atividades, podendo ser executado em ambiente local ou distribuído. Taylor [4], ao analisar a metodologia utilizada em reconstrução filogenética, percebe que, para um cientista trabalhar com um pipeline filogenético, é necessário que esse profissional tenha domínio de lógica de programação e conhecimento da estrutura da linguagem onde o mesmo foi escrito. Além disso, dependendo do script desenvolvido, o grau de dificuldade pode ser ainda maior, tornando complexas sua utilização, flexibilidade e facilidade de reutilização, manutenção e composição de recursos. A utilização de Sistemas Gerenciadores de Workflows Científicos (SGWF) possibilita ao usuário a verificação de erros, a execução total ou parcial do experimento, bem como o aproveitamento ou reuso dos módulos desenvolvidos em outros experimentos. Os Sistemas de Gerência de Workflows Científicos (SGWfC) são sistemas específicos [5], que possuem seus próprios mecanismos de gerência e linguagem para definição e execução dos módulos criados nestes ambientes. São normalmente lineares e centrados em dados, necessitando de estruturas de controle de fluxo [6]. Na tentativa de oferecer maior flexibilidade para a investigação de questões biológicas, em especial, estudos de filogenia, esta dissertação tem como propósito desenvolver uma biblioteca de módulos de um workflow científico para filogenia. Sendo assim, este sistema tem o propósito de disponibilizar um conjunto de módulos que implementem métodos filogenéticos para facilitar a definição dos fluxos de atividades e o encadeamento de programas, além de oferecer flexibilidade na composição de novos workflows filogenéticos, permitindo registrar informações sobre sua definição e execução. Esta introdução encontra-se dividida em sete partes. Na primeira parte, serão abordados conceitos de Bioinformática e Filogenia. Na segunda parte, serão abordados os conceitos de reconstrução filogenética. Na terceira parte, será descrito um pipeline filogenético, que motivou o início dos estudos deste trabalho. Na quarta parte serão discutidos os sistemas para análise filogenética, onde serão abordados o Phylemon [7] e o pipeline automático para reconstrução filogenética, o ARPA [8]. Na quinta parte serão discutidos os conceitos de Sistemas Gerenciadores de Workflow (SGWF) e Workflow científico. Na sexta parte, será abordado o alvo da investigação, que são as aquaporinas e aquagliceroporinas. E na última parte encontra-se a organização dos capítulos desta dissertação. 2

18 1.1 - Bioinformática e filogenia Com o advento da descoberta da estrutura de DNA [9] e o surgimento dos primeiros sequenciadores por Sanger e Coulson [10], vários métodos de filogenia têm sido desenvolvidos com o auxílio da biologia molecular para apoiar estudos filogenéticos. A aplicação desses métodos ampliou o universo de descobertas na área biológica, especialmente com a utilização de dados moleculares ao invés dos métodos tradicionais de classificação de organismos, como os baseados em morfologia, fisiologia e paleontologia. Dados moleculares são poderosos elementos de estudo da história evolutiva, por possibilitarem a reconstrução da filogenia dos grupos de organismos vivos. Baldi e Brunak [11] detectaram que a cada experimento um grande volume de dados biológicos era gerado e necessitavam da cooperação de várias áreas de conhecimento para serem analisados. A informática, com suas técnicas computacionais, tem se revelado eficiente através da bioinformática, na resolução de problemas biológicos como: sequenciamento de DNA e cdna, análise de expressões gênicas e determinação de estruturas proteicas, assim como na inferência de árvores filogenéticas [12],[11]. A evolução da infraestrutura computacional tem contribuído para aprimorar as formas de experimentação das pesquisas biológicas in silico, que utilizam Sistemas Gerenciadores de Banco de Dados (SGBD), Sistemas Gerenciadores de Workflows Científicos (SGWfC), programas biológicos e plataformas gráficas 2D e 3D, facilitando desvendar os questionamentos sobre o estudo da vida. Desde o marco fundamental representado pela teoria da evolução de Darwin [13] a filogenia direciona seus estudos para as relações evolutivas dos seres, representadas graficamente através de árvores filogenéticas, também conhecidas como grafos ou cladogramas [14]. No que se refere à filogenia, pode-se ressaltar duas importantes considerações: a filogenia clássica, que tem como base os caracteres dos organismos, os fenótipos e os registros paleontológicos [15]; os estudos filogenéticos, que servem tanto para inferir quanto para validar hipóteses ao confrontar com bancos de dados genômicos, permitindo a investigação das relações filogenéticas entre espécies. O conceito clássico de filogenia é representado por dois segmentos de pensamento: a escola cladista e a fenética. A cladista, ou filogenia tradicional, é a filogenia que estuda a relação dos organismos utilizando caracteres morfológicos, 3

19 fisiológicos ou paleontológicos, que dão origem aos cladogramas ou árvores filogenéticas. Já a escola fenética utiliza dados moleculares e algoritmos matemáticos e/ou estatísticos para inferir a ordem de divergência dos táxons, assim como os comprimentos dos ramos que os conectam, para a construção de árvores filogenéticas dos organismos estudados [16]. A interpretação destas árvores permite a inferência de hipóteses sobre os organismos estudados principalmente no que diz respeito às relações evolutivas entre os dados estudados. A filogenia tem contribuído para um melhor entendimento de como os processos evolutivos atuam na estruturação dos seres, sendo evidente que ela é uma ferramenta potencial de integração de questões evolutivas. Podemos citar como exemplos de sua utilização a construção da árvore da vida [17], representada na Figura 1.1, o estudo ecológico de comunidades [18], o entendimento do funcionamento de ecossistemas [19], o estudo da estrutura e funções das aquaporinas visando ao desenvolvimento de fármacos [20] e a avaliação da resistência a fármacos desenvolvida por Tripanossomatídeos [21]. 4

20 Figura 1.1 Árvore da vida, baseada em genes ortólogos mostrando as relações filogenéticas entre diversos grupos de organismo. Fonte: (Ciccareli et al.,2006) Reconstrução filogenética Inicialmente, todas as árvores filogenéticas ou cladogramas eram confeccionadas manualmente. Segundo Scheineider [14], os cientistas utilizavam caracteres morfológicos (medidas corporais, medidas parciais e presença de estruturas) como base de todo o trabalho de prospecção de dados conceituada como análise filogenética clássica. Atualmente, com o surgimento da análise filogenética moderna, os cientistas passaram a utilizar dados moleculares e métodos estatísticos para construção de árvores filogenéticas [15]. No entanto, a melhor forma de elucidar problemas biológicos se constitui na combinação de dados moleculares e morfológicos [22]. Segundo Nahum e Pereira [23], os principais componentes da análise filogenética molecular incluem: a seleção de genes ou produtos de genes de interesse, a identificação de potenciais homólogos, a busca através de métodos baseados em similaridade de sequência, a criação de alinhamentos múltiplos das 5

21 sequências, a reconstrução de árvores filogenéticas utilizando diferentes métodos de inferência e o mapeamento de informações disponíveis sobre as árvores. Coletivamente, esses componentes servem como um quadro para testar uma hipótese evolutiva, para suportar uma variedade de análises, como, por exemplo, uma pesquisa na busca por um gene conservado [24], reconstrução da história evolutiva de sequências (nucleotídicas e protéicas) através de suas relações de ancestralidade, dentre outras [25]. Com o advento da filogenia moderna, houve a iniciativa de algumas entidades nacionais e internacionais de unirem esforços para o desenvolvimento de bases de dados para armazenamento de dados genômicos visando à realização de pesquisas, sendo o GenBank um dos principais bancos utilizados [26]. Atualmente, várias pesquisas in silico utilizam em suas análises bases de dados e sistemas para reconstrução e análise filogenética que, em função de suas características, contribuem para reduzir o tempo e custo na obtenção de resultados. Além disso, contribuem na identificação de organismos [27], na construção de árvores filogenéticas e anotação funcional de proteínas [28] e genes [29]. Segundo Page e Holmes [30], os métodos de construção de árvores filogenéticas podem ser classificados em dois tipos, de acordo com os dados a serem tratados: métodos de distância e métodos discretos. O primeiro está limitado à construção de uma matriz de distância na qual a diferença entre sequências é calculada, utilizando-se um modelo de substituição de nucleotídeos [31] [14]. No método discreto todos os caracteres são analisados diretamente, considerando o alinhamento de sequência [30] [14]. Dentre os métodos de distância, o UPGMA (Unweighted Pair Group Method with Arithmetic Mean) foi desenvolvido para a construção de árvores que refletem o grau de similaridade entre os táxons estudados [32], [33] e [34], podendo também ser utilizado para construção de árvores, desde que não ocorra uma grande variabilidade na taxa de substituição entre as linhagens estudadas, garantindo assim uma relação aproximada entre a linha da distância evolutiva e o tempo de divergência [35]. O método de distância de agrupamento de vizinhos é utilizado quando se tem variação entre as taxas de substituição entre as linhagens. Desenvolvido por Saitou e Nei [36], este método é amplamente utilizado e tem como principal característica ser o mais eficiente algoritmo de distância, cujo objetivo é a obtenção da árvore com menor soma de ramos [37] [31]. Segundo Nei e Kumar [35], o método de 6