UNIVERSIDADE DO ESTADO DE SANTA CATARINA-UDESC CENTRO DE EDUCAÇÃO SUPERIOR DO OESTE-CEO DEPARTAMENTO DE ZOOTECNIA JOÃO COSTA FILHO

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1 UNIVERSIDADE DO ESTADO DE SANTA CATARINA-UDESC CENTRO DE EDUCAÇÃO SUPERIOR DO OESTE-CEO DEPARTAMENTO DE ZOOTECNIA JOÃO COSTA FILHO RELATÓRIO DE ESTÁGIO SUPERVISIONADO DE CONCLUSÃO DE CURSO: IDENTIFICAÇÃO DE POLIMORFISMOS DO GENE RECEPTOR DA LEPTINA EM LINHAGEM DE AVES CHAPECÓ/SC 2009

2 JOÃO COSTA FILHO RELATÓRIO DE ESTÁGIO SUPERVISIONADO DE CONCLUSÃO DE CURSO: IDENTIFICAÇÃO DE POLIMORFISMOS DO GENE RECEPTOR DA LEPTINA EM LINHAGEM DE AVES Relatório Final de Estágio apresentado ao Curso de Zootecnia como requisito parcial para obtenção do grau de Bacharel em Zootecnia. Orientadora: Prof a. Dr a. Lenita de Cássia Moura Stefani CHAPECÓ/SC 2009

3 RELATÓRIO DE ESTÁGIO SUPERVISIONADO DE CONCLUSÃO DE CURSO EMBRAPA SUÍNOS E AVES Relatório de estágio supervisionado do curso de Zootecnia apresentado a Universidade do Estado de Santa Catarina - UDESC, como parte dos requisitos para obtenção do título de Bacharel em Zootecnia. Banca Examinadora Orientador: Prof a Dr a Lenita de Cássia Moura Stefani Universidade do Estado de Santa Catarina - UDESC Membro: Prof a Dr a Denise Maria Sousa de Mello Universidade do Estado de Santa Catarina - UDESC Membro: Prof a Dr a Carolina Riveira Duarte Maluche Baretta Universidade do Estado de Santa Catarina - UDESC CHAPECÓ, 2009

4 I DEDICO A toda minha Família, em especial meus pais João José Costa e Clélia Maria Gava Costa, por todo apoio e incentivo em todos os momentos de minha vida. Com minha Família dividi momentos de alegrias felicidades e realizei muitos sonhos. A vocês devo todas as minhas conquistas. OFEREÇO A meus pais João e Clélia pelo amor e dedicação.

5 II AGRADECIMENTOS Ao departamento de Zootecnia da UDESC-CEO e a EMBRAPA pela realização do estágio. A todas as pessoas que colaboraram para realização deste trabalho. Em especial: A pesquisadora Dr a. Mônica Corrêa Ledur pela supervisão, apoio e oportunidade de realizar este estágio. Dr a. Lenita de Cássia Moura Stefani pela orientação e aconselhamentos contribuindo para o aprendizado e desenvolvimento profissional. A Alexandre Luis Tessmann pela amizade, companheirismo e ensino de etapas laboratoriais. A pesquisadora Dr a. Jane de Oliveira Peixoto pela dedicação e esclarecimento de dúvidas sempre que existentes. A Dr. João Batista Ribeiro pela disponibilidade de tempo e contribuição ao meu ensinamento. Dr a. Leila de Genova Gaya por todos os ensinamentos desde o período de graduação até o presente estágio, meu estimado e sincero agradecimento. Marcelo Batista Fornari pela amizade e companheirismo nas atividades de estágio. A todos que estiveram presentes na minha vida para realização deste trabalho, sou grato.

6 III A ciência deve ser universal, sem dúvida. Porém não devemos acreditar incondicionalmente nisso. - César Lattes -

7 IV RESUMO Nos últimos anos a avicultura tem ocupado lugar de destaque na produção animal. Os estudos relacionados à genética molecular possuem grande tendência de crescimento na área científica e procura no mercado de trabalho, além de ser uma atividade indispensável para o desenvolvimento científico relacionado a determinadas espécies de animais. Para tanto, o estágio teve como principal objetivo aperfeiçoar o conhecimento na área de genética molecular, potencializando os estudos realizados na graduação em Zootecnia, e identificar as dificuldades encontradas nas pesquisas em genética molecular. O estágio de três meses foi realizado na Embrapa Suínos e Aves em Concórdia/SC. Durante este período foram realizadas várias atividades no laboratório de Genética Molecular, além de participações em projetos que estavam em andamento. A principal atividade desenvolvida foi no projeto de validação de marcadores moleculares em frangos de corte, com o objetivo de validar em aves da população elite TT de linhagem de corte o polimorfismo G915A, encontrado no íntron 19 do gene do receptor da leptina, identificados anteriormente na população experimental TCTC (F2). A genotipagem foi realizada mediante a técnica RFLP, com enzima de restrição BsrGI. Antes de genotipar todos os indivíduos da população elite TT, foram genotipados os parentais TT (112 animais). Assim, somente os descendentes desses indivíduos com genótipo GA poderiam ser analisados, o intuito seria encontrar nos parentais o maior número possível de heterozigotos, favorecendo a análise estatística aplicada posteriormente para a validação do marcador. Com base nos resultados obtidos da clivagem dos parentais TT, pode-se afirmar que estes indivíduos não possuem o genótipo GA para este marcador, uma vez que o alelo G é de origem das aves da linhagem de corte. Contrariamente o alelo A é de origem das aves da linhagem de postura, assim, indivíduos TT não apresentam o genótipo GA. Palavras chave: gene do receptor da leptina, genotipagem, polimorfismos

8 V 9 SUMÁRIO 1 INTRODUÇÃO EMBRAPA SUÍNOS E AVES GENÉTICA NA AVICULTURA ATIVIDADES DESENVOLVIDAS Colheita de material biológico Extração de DNA Quantificação de DNA Diluição de DNA PROJETO DE CARACTERIZAÇÃO GENÉTICA DOS RECURSOS GENÉTICOS ANIMAIS Colheita de sangue PROJETO DE VALIDAÇÃO DE MARCADORES MOLECULARES PARA FRANGOS DE CORTE População experimental de frangos de corte utilizada nas pesquisas da Embrapa Gene receptor da leptina em aves Reação em Cadeia da Polimerase (Polymerase Chain Reaction) PCR Diluição para Primers (RL gene receptor da leptina) Otimização das condições e amplificação por PCR Identificação dos produtos das reações - eletroforese em gel de agarose Método de genotipagem de marcadores SNP (Polimorfismos de Nucleotídeo Único) Genotipagem de polimorfismos no gene receptor da leptina Diluição de enzima BsrGI CURSO DE MÉTODOS BÁSICOS DE ANÁLISES FILOGENÉTICAS CONCLUSÃO REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ANEXOS... 40

9 10 1 INTRODUÇÃO A pesquisa agropecuária é um sistema de formação de conhecimento e aprimoramento. Estudos relacionados à genética molecular possuem grande tendência de crescimento na área científica e procura no mercado de trabalho, além de ser uma atividade indispensável para o desenvolvimento científico relacionado a determinadas espécies de animais. A genômica animal é uma realidade presente nos programas de melhoramento e os impactos das aplicações desses métodos podem ser notados em várias áreas da produção animal. De acordo com Ninov (2006), nos últimos anos a avicultura tem ocupado lugar de destaque na agropecuária brasileira e internacional. A produção de aves apresenta uma constante evolução em sua produtividade (COSTA FILHO et al., 2009a). Com o passar dos anos a EMBRAPA (Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária) Suínos e Aves, Concórdia/SC, vem apresentando uma importante evolução em suas pesquisas, disponibilizando tecnologias que potencializam a produção animal, favorecendo o processo de aprendizagem de profissionais envolvidos nos mais diversos grupos de pesquisa. Desta forma, este estágio justifica-se por aprimorar o aprendizado na área científica direcionada a genética molecular, servindo como ponto de partida para contribuição profissional e carreira acadêmica. Tendo em vista a importância da pesquisa em genética molecular para o desenvolvimento científico e produção animal, os objetivos do estágio de conclusão de curso foram desenvolver e aprofundar os estudos realizados no curso de graduação em Zootecnia consolidando caráter multidisciplinar, de forma a explorar eficientemente a integração em nível institucional, ampliar a sociabilidade em grupos de estudos, identificar a importância da participação de estagiários em institutos de pesquisa, identificar as dificuldades encontradas nas pesquisas relacionadas a genética molecular e participar de atividades em projetos que estão em andamento junto ao grupo de pesquisa em Melhoramento Animal.

10 11 2 EMBRAPA SUÍNOS E AVES A Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária EMBRAPA, foi criada pela Lei n o 5.851, de 07/12/1972, e instalada e dada posse à sua primeira diretoria em 26 de abril de Está vinculada ao Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento, com personalidade jurídica de direito privado. Ela tem sede em Brasília e unidades de pesquisa distribuídas pelo território nacional. A Empresa pesquisa todos os produtos que compõe a alimentação do brasileiro: do pão à carne, do leite ao feijão. Em 1975, a EMBRAPA criou o Centro Nacional de Pesquisa de Suínos, Unidade destinada à pesquisa em suinocultura. Em 1978, incorporou-se nesse Centro a pesquisa com Aves, quando assumiu a denominação de Centro Nacional de Pesquisa de Suínos e Aves. A Unidade conta com sede própria, localizada em Concórdia, Estado de Santa Catarina, dotada de laboratórios de sanidade animal e físico-químico, sistemas de produção, unidades experimentais, estação meteorológica, fábrica de rações, prédio para administração e pesquisa, e biblioteca especializada em suínos e aves. A estrutura de pesquisa está organizada em Núcleos Temáticos nas áreas da melhoria de produção, meio ambiente, segurança alimentar, organização da produção e biologia molecular, atuando de forma multidisciplinar, visando à solução dos problemas prioritários na avicultura e suinocultura. A equipe de Genética e Melhoramento Animal desenvolve desde 1999 pesquisas em análise genômica de aves. Os objetivos dessa linha de pesquisa são: - Formar uma população de aves específica para análise genômica de aves; - Identificar marcadores moleculares e regiões genômicas associadas a características de desempenho, carcaça e qualidade da carne em aves; - Identificar novos genes em tecidos de importância para produção e qualidade de carne; - Identificar marcadores moleculares que possam ser utilizados para melhorar a eficiência produtiva e a qualidade do produto final do frango de corte, beneficiando toda a cadeia produtiva, incluindo o consumidor;

11 12 - Disponibilizar para a indústria avícola, marcadores moleculares ou genes para serem utilizados na seleção precoce de animais com melhor eficiência produtiva e qualidade de carne; - Formação de recursos humanos.

12 13 3 GENÉTICA NA AVICULTURA Ao longo das últimas quatro décadas desenvolveu-se no Brasil um dos maiores e mais competitivos complexos agroindustriais - o da avicultura de corte (GROSSO et al., 2008). A avicultura é a atividade da pecuária que apresentou os maiores índices de evolução nas últimas décadas (GAYA et al., 2006a). Um progresso significativo no melhoramento genético de aves de corte vem sendo alcançado, o que se deve, entre outros fatores, à seleção para altas taxas de crescimento, objetivando-se incrementos nos rendimentos de carcaça e de cortes dos animais (SCHMIDT et al., 2006). De acordo com Albers e Groot (1998), a seleção de aves proporcionou inúmeros benefícios, dentre eles o aumento da produção de carne e ovos foi o que mais se destacou. O grande aumento do volume de produção e eficiência de produção são atribuídos, na sua maioria, ao desenvolvimento genético das linhagens de aves. O melhoramento tradicional, baseado em genética quantitativa, tem assegurado ganho genético contínuo de todas as características de produção em aves. A seleção baseada no fenótipo e a estimativa do valor genético aditivo proporcionou a maior parte do progresso genético obtido das características quantitativas. Essa seleção é realizada sem o conhecimento do número e do efeito dos genes que atuam nas características de interesse. Apesar disso, as taxas de ganho genético ainda estão sendo obtidas e os programas de melhoramento demonstram claramente o poder do uso da genética quantitativa na seleção (DEKKERS, 1999). Contudo, segundo Ninov (2006), nas últimas décadas houve um aumento significativo de tecnologias na área biológica, principalmente no que se refere aos progressos na área do sequenciamento genômico. Com o desenvolvimento da biotecnologia, estão sendo disponibilizadas ferramentas para elucidar o controle genético de características quantitativas complexas, como é o caso das características de produção. Atualmente há uma grande preocupação no mundo inteiro com a saúde e qualidade de vida da população, aumentando o cuidado com alimentos que são consumidos. Em resposta a estas exigências por parte dos consumidores, a indústria avícola deverá produzir alimentos mais saudáveis. Para isto é necessário reduzir a deposição de gordura, bem como o uso de antibióticos e aumentar a resistência genética a patógenos. É difícil a solução destes problemas usando somente a seleção genética convencional, porém o sequenciamento do genoma da galinha traz novas perspectivas para a moderna produção animal (BURT, 2005).

13 14 4 ATIVIDADES DESENVOLVIDAS O plano de trabalho realizado em conjunto com o grupo de pesquisa compreendeu desde a visita ao Programa de Melhoramento Genético de Aves até a participação em atividades técnico-científicas, além da participação em projetos que na ocasião estavam em andamento. Todas as segundas o grupo de pesquisa em genômica de aves se reunia para debater assuntos pertinentes e se atualizarem a respeito do acompanhamento de todo processo de estudo. Os laboratórios de pesquisa são ambientes de extrema fragilidade, onde a manipulação dos materiais deve ser feita com cuidado, por isso leva-se algum tempo para aperfeiçoar a prática. Num primeiro momento no Laboratório de Genética Molecular acompanhou-se a rotina de preparação de reações específicas pelos laboratoristas, a manipulação de soluções e de equipamentos, a pipetagem e diluições com reagentes simples, além de conhecimento de unidades de medidas. 4.1 Colheita de material biológico Para que sejam realizadas as análises relacionadas ao genoma dos indivíduos são utilizadas amostras de material biológico (sangue). Essas são colhidas em gerações referências (animais de alto valor genético) de aves contidas em experimentos voltadas ao programa de melhoramento da EMBRAPA. Uma vez no laboratório essas amostras eram processadas com o intuito de extrair o DNA (ácido desoxirribonucléico) genômico e analisadas em procedimentos posteriores. Para se obter DNA de aves é necessária uma colheita de sangue. Desta forma, os indivíduos escolhidos para tal procedimento fazem parte de três linhagens de postura pertencentes a EMBRAPA, dentre elas CC (selecionada de ovos brancos), CC controle ou CCc (não selecionada de ovos brancos) e GG (selecionada de ovos castanhos). Em todas as linhagens os candidatos a colheita foram escolhidos ao acaso, numa proporção de 50% para machos e fêmeas. Foram colheitadas amostras de 50 aves CC, 50 aves CCc e 60 aves GG. Desta forma, o objetivo da colheita foi obter material para uma posterior genotipagem destes indivíduos para marcadores de microssatélites (sequências de um a seis pares de base unidas e

14 15 repetidas, dispersas pelo genoma) aperfeiçoando o estudo de caracterização e diversidade genética de frangos de postura. O processo de colheita compreendeu algumas etapas. Inicialmente formaram-se três duplas. Uma seria responsável pelas anotações criteriosas em formulários referentes ao número das gaiolas e da anilha de cada ave. As outras duas duplas colheitaram 2 ml (mililitro) de sangue da veia braquial de cada ave, utilizando seringas estéreis individuais evitando contaminações de material. Após a colheita cada amostra de sangue foi armazenada dentro de um tubo contendo 1 ml de EDTA (etilenodiaminotetra cético - anticoagulante) e identificada conforme o número da anilha correspondente de cada ave. Os resíduos das colheitas (seringas e embalagens) foram separados, armazenados e destinados a incineração. Após a colheita o sangue foi levado ao laboratório de genética molecular e congelado, para posteriormente passar pelo processo de extração de DNA. 4.2 Extração de DNA A extração do DNA é uma das primeiras etapas para o monitoramento genético de populações. Faz-se necessário obter uma quantidade suficiente de DNA de boa qualidade, livre de impurezas, para que as regiões desejadas sejam localizadas e amplificadas por meio de técnicas de biologia molecular (MARENGONI et al., 2006). Conforme Ferreira e Grattapaglia (1998), a pureza do DNA é afetada significativamente pela condição do material biológico anteriormente a extração e por esse motivo, recomenda-se utilizar o material mais fresco possível para a extração. As amostras de sangue provenientes das aves foram descongeladas em banho maria a 37 o C. O DNA foi extraído mediante a técnica do DNAzol (detergente que atua na lise de membranas biológicas) com o objetivo de se obter DNA íntegro e de quantidade suficiente para as análises. Esta técnica é amplamente utilizada para extrações nas mais diversas espécies animais (Informação pessoal). Ninov (2006), trabalhando com o gene da leptina e de seu receptor em duas linhagens de aves utilizou em parte esse método nas etapas de extração de DNA. Da mesma forma, Frota et al. (2005), extraiu DNA leucocitário de caprinos em suas pesquisas mediante a artrite encefalite caprina. O protocolo de extração de DNA utilizando o método DNAzol é demonstrado no ANEXO A.

15 Quantificação de DNA O DNA extraído das aves foi quantificado em espectrofotômetro no comprimento de onda de 260 nm (nanômetro). Se a concentração de DNA de fita dupla for inferior 50 µg/ml (microgramas por mililitro) indica que a quantidade de DNA extraído não era suficiente, sendo uma nova extração necessária. Marengoni et al. (2006), trabalhando com extração de DNA em peixes teleósteos, utilizaram em suas análises o método de quantificação através de espectrofotômetro. Barea et al. (2004), afirmam que resultados espectrofotométricos não são parâmetros confiáveis para direcionar os procedimentos técnicos de extração, pois em seu estudo houve amplificação de fragmentos desejados mesmo quando as medidas espectrofotométricas não revelaram presença de DNA. A execução da quantificação é um processo relativamente simples quando comparado com outras atividades laboratoriais, entretanto de relevante importância. Primeiramente coloca-se 47 µl (microlitro) de água destilada e 3 µl de DNA extraído em uma cubeta. A seguir, a cubeta é inserida no espectrofotômetro indicando o resultado da leitura, que neste caso espera-se que seja maior que 50 µg/ml. Após a quantificação, as amostras foram submetidas à eletroforese em gel de agarose 1% para identificação da integridade de DNA e confirmação da concentração. Esses resultados são apresentados na Figura 1. Figura 1- Eletroforese em gel de agarose 1% para a visualização de algumas amostras dos produtos da quantificação por espectrofotômetro.

16 17 As canaletas 1, 2, 3, 4 e 5 demonstram, através da presença de padrões de banda, que a quantificação foi eficiente e o DNA foi extraído com sucesso podendo ser utilizado em estudos posteriores. 4.4 Diluição de DNA Para se obter DNA a ser utilizado na concentração viável de uso para os estudos em genética molecular é necessário diluí-lo a uma concentração de 25 ng/µl (nanograma por microlitro). O processo consiste em adicionar água ultra pura no volume suficiente para se atingir a concentração desejada. Na maioria dos os estudos onde se utiliza DNA é necessário uma diluição, assim é possível comprovar a importância dessa etapa na genética molecular. Temos como exemplo o resultado da quantificação por espectrofotômetro. Suponha-se que uma determinada amostra de DNA extraído apresentou uma concentração de 150 µg/ml, para o preparo de 200 µl de DNA pronto para ser utilizado na concentração de 25 ng/µl, utiliza-se a fórmula: Onde: C= concentração inicial; V= volume inicial; C 1 = concentração final; V 1 = volume final; C. V = C 1. V 1 Aplicando-se a fórmula: 150 µg/ml. V = 25 ng/µl. 200 µl V = 33,3 µl Portanto, adiciona-se 166,66 µl de água ultra pura e 33,3 µl de DNA extraído, para se obter um volume final de DNA de 200 µl com a concentração de 25 ng/µl. Após a diluição, as amostras foram submetidas à eletroforese em gel de agarose 1% para

17 18 identificação da integridade de DNA e confirmação da concentração. Esses resultados são apresentados na Figura 2. Figura 2- Eletroforese em gel de agarose 1% para a visualização de algumas amostras dos produtos da diluição para um volume final de 200 µl e concentração de 25 ng/µl. A canaleta 1 corresponde a pgem (tipo de DNA amplificado e ultra puro para a comparação de fragmentos amplificados), as canaletas 2 a 5 são amostras de DNA extraído quantificado e diluído. Foram utilizados 5 µl de DNA aplicados nos poços do gel de agarose. Contudo é possível observar que na canaleta 2, 3 e 4 a diluição está correta, ao contrário com a amostra da canaleta 5 que não apresentou nenhuma banda. Na tentativa de melhorar esses resultados faz-se necessária a repetição da extração.

18 19 5 PROJETO DE CARACTERIZAÇÃO GENÉTICA DOS RECURSOS GENÉTICOS ANIMAIS Levantamentos da FAO (Organização das Nações Unidas para Agricultura e Alimentação) sobre a situação das sete principais espécies de animais domésticos com valor pecuário têm mostrado que existe uma grande quantidade de raças ameaçadas de extinção em todo mundo. No Brasil, quase todas as 13 raças de suínos encontram-se nessa situação e essa estimativa ainda não existe para aves. Desta forma, a caracterização das raças naturalizadas existentes, a relação genética entre elas, bem como o conhecimento de suas origens em outras raças são o passo inicial para se obter subsídios para programas de melhoramento, manejo e conservação para as raças de suínos e aves naturalizadas brasileiras. Os objetivos com o plano de ação são: a) de analisar a diversidade genética de raças e linhagens de aves no Brasil por meio de três classes de marcadores moleculares (sequências de bases dispersas pelo genoma); b) realizar o manejo genético do Núcleo de Conservação do Suíno Moura no Sul do Brasil; c) analisar a diversidade genética da raça monteiro dentro do pantanal; e) ampliar o banco de DNA destas raças no Laboratório de Genética Animal localizado na Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia. O período previsto para o término do projeto é dezembro de 2012, sendo que o seu início foi em janeiro de A equipe é formada por pesquisadores da EMBRAPA, tais como os doutores Samuel Rezende Paiva, Mônica Corrêa Ledur, Silvia Tereza Ribeiro Castro, João Batista Ribeiro, Ubiratan Piovezan e Jane de Oliveira Peixoto. 5.1 Colheita de sangue Uma das atividades realizadas no período de estágio correspondeu a colheita de sangue de galinhas e galos índios. Na busca por diversidade genética é favorável obter sangue de animais de localidades divergentes. Na figura 3 é apresentado um casal de galo índio.

19 20 Figura 3 - Exemplar de um casal utilizado para a colheita de sangue e obtenção de DNA para análise de diversidade genética. Foram colheitadas amostras de sangue de 19 indivíduos, destes seis galos e 13 galinhas, no período de 09/09 a 11/09/09, com o intuito de se obter DNA para estudos de diversidade genética e armazenamento em bancos de DNA. As aves eram da cidade Vitorino/PR, possuíam grau de parentesco baixo, e os mais diversos tipos de plumagem. A cada colheita as aves foram numeradas e fotografadas para se obter um eficiente controle dos dados. Após a colheita executou-se a extração de DNA mediante a técnica DNAzol.

20 21 6 PROJETO DE VALIDAÇÃO DE MARCADORES MOLECULARES PARA FRANGOS DE CORTE A EMBRAPA Suínos e Aves e a ESALQ/USP (Escola Superior de Agricultura Luiz de Queiroz / Universidade de São Paulo) iniciaram estudos em genômica de aves em 2000, com o objetivo de identificar marcadores associados a características de crescimento e composição de carcaça. Vários marcadores foram identificados na população experimental. Muitos desses polimorfismos estão associados a características produtivas de importância econômica. Contudo, os resultados obtidos nessa população experimental não podem ser extrapolados para as linhas puras onde é praticado o melhoramento. Portanto, é preciso que esses marcadores sejam validados em linhas puras, o que tornaria esses marcadores com grande potencial de utilização em programas de seleção assistida por marcadores. O objetivo do projeto foi validar em linha elite de frango de corte os marcadores moleculares, que consistem na identificação de uma região genômica (RAMALHO et al., 2008), identificados na população experimental anteriormente desenvolvida pela Embrapa Suínos e Aves. Parte do estágio compreende a participação no projeto, com o objetivo de validar em aves da população elite TT o polimorfismo G915A, encontrado no íntron 19 do gene do receptor da leptina identificados anteriormente na população experimental TCTC (F2). Íntrons são regiões do mrna (ácido ribonucleico mensageiro) que interferem na codificação de proteínas (RAMALHO, et al. 2008). Assim, será possível realizar uma associação dos marcadores com as características fenotípicas das aves da população elite, para serem usados em programas de seleção assistida por marcadores. 6.1 População experimental de frangos de corte utilizada nas pesquisas da Embrapa Foram utilizadas duas linhagens: uma de corte (TT) e uma de postura (CC) para desenvolver a população referência F2. Tanto as linhagens (TT e CC) como a população F2 foram desenvolvidas no sistema de Melhoramento Genético de Aves da Embrapa Suínos e Aves, em Concórdia/SC. As linhagens empregadas no cruzamento, TT e CC, apresentam composições genéticas divergentes, pois a linhagem de corte teve sua origem a partir do cruzamento das raças Cornish, Hamshire e White Plymouth Rock, enquanto a linhagem de postura foi originada da raça White Leghorn.

21 22 A linhagem TT é uma linha paterna de corte, cuja seleção foi efetuada dentro da linha com o objetivo de melhorar o peso corporal, conversão alimentar, rendimentos de carcaça e partes, viabilidade, fertilidade, eclodibilidade, redução da gordura abdominal e de doenças metabólicas. Na época da formação da população referência, a linhagem TT havia sido selecionada para estas características por seis gerações. A linhagem CC foi selecionada por oito gerações, para melhorar a produção de ovos, peso do ovo, conversão alimentar, viabilidade, maturidade sexual, fertilidade, eclodibilidade, qualidade do ovo e um reduzido peso corporal. Na figura 4 é apresentado o sistema de cruzamento utilizado para a obtenção das linhagens estudadas. Figura 4 - Esquema de cruzamento entre as linhagens utilizadas para identificação de polimorfismos. Na geração F2 (TCTC) foi identificado o marcador molecular. Para o uso desse marcador nos programas de seleção é necessário a sua validação, assim, com a genotipagem de indivíduos da linhagem TT poderá ser possível ou não identificar a região com o SNP (polimorfismo de base única). Primeiramente foram genotipados os parentais TT, se o polimorfismo for identificado nestes indivíduos o próximo passo é genotipar seus descendentes, 1500 animais da linhagem TT. 6.2 Gene receptor da leptina em aves A avicultura vem apresentando uma constante evolução em sua produtividade. Nas últimas décadas, buscam-se aves que apresentam bom desempenho e melhores rendimentos

22 23 de carcaça e de cortes, o que se deve, entre outros fatores, ao progresso significativo no melhoramento genético (COSTA FILHO et al., 2009b). Segundo Ninov (2006) a biotecnologia, por meio da identificação de genes de interesse econômico, tem promovido avanços no melhoramento, através de uma seleção mais efetiva. Uma estratégia para identificação de genes que controlam características de interesse é feita através de estudos utilizando-se genes candidatos. Neste sentido, o gene receptor da leptina em aves é considerado um gene candidato. Genes candidatos consistem em genes de ação biológica conhecida, que estão envolvidos com o desenvolvimento ou fisiologia da característica em espécies ricas em informações genotípicas, como em humanos e camundongos (BRYNE e MULLEN, 1996; LEDUR, 2001). De acordo com Ninov et al. (2007), alguns estudos têm demonstrado a importância do gene do receptor da leptina na regulação do peso corporal, deposição de gordura e função endócrina, sugerindo ser um excelente gene candidato para estudos de associação com características fenotípicas. De acordo com a teoria lipostática, descrita por Kennedy (1953), a regulação do balanço energético é intermediada por um produto do metabolismos energético presente na circulação sanguínea e que interage com receptores associados ao sistema nervoso central. Este modelo propõe que quando as reservas energéticas do tecido adiposo estão elevadas, os centros da saciedade no hipotálamo são ativados, provocando a redução da ingestão de alimentos e que durante a restrição alimentar ou jejum prolongado, ocorre a mobilização das reservas de gordura para a produção de energia com um aumento de apetite. A proteína leptina é sintetizada no tecido adiposo e secretada na corrente sanguínea agindo no sistema neural regulando o consumo de alimento, metabolismo da glicose, metabolismo da gordura, gasto de energia, puberdade e fertilidade de mamíferos (FRIEDMAN e HALAAS, 1998). Segundo Taouis et al. (1998), ao contrário dos mamíferos, em aves o gene da leptina é expresso principalmente no fígado e tecido adiposo. Os níveis plasmáticos de leptina estão altamente correlacionados à massa de tecido adiposo e diminuem acentuadamente tanto em humanos quanto em camundongos após a perda de peso (MAFFEI et al., 1995). Como um hormônio que interage na saciedade, suas concentrações podem mudar em respostas ao consumo de calorias, suprindo o apetite, aumentando a taxa metabólica, regulando o ganho de peso e deposição de gordura (ZHANG et al., 1994). A ação da leptina é feita a partir da ativação de seus receptores na membrana citoplasmática, conforme Tartaglia et al. (1995). Através de dados provenientes de uma população é possível a aplicação de uma análise estatística apropriada, para identificação de polimorfismos que possam estar

23 24 associados a características fenotípicas de interesse. Wang et al. (2004) identificaram dois SNPs no íntron 8 do gene do receptor da leptina que foram associados a deposição de gordura abdominal e peso do fígado em linhagens de frangos de corte selecionados divergentemente para gordura abdominal. O excesso de gordura nas carcaças de frangos de corte é uma característica indesejável tanto biologicamente como economicamente (CAMPOS et al. 2009). Através de análises de segregação, Dunn et al. (2000) localizaram o gene do receptor da leptina no cromossomo 8 da galinha. A identificação de polimorfismos nesse gene poderá contribuir para o melhor entendimento dos mecanismos moleculares envolvidos na regulação da composição e crescimento corporal em aves. 6.3 Reação em Cadeia da Polimerase (Polymerase Chain Reaction) PCR A baixa quantidade de DNA para análises é normalmente uma das principais dificuldades encontradas pelos cientistas. A tecnologia da reação de polimerase em cadeia foi concebida por Kery Mullis em meados da década de 80 (KREUZER e MASSEY, 2002). Essa tecnologia causou uma revolução nos estudos da biologia (FERREIRA e GRATTAPAGLIA, 1998), levando Kery a ganhar o prêmio Nobel de medicina na década de 90. De acordo com Kreuzer & Massey (2002), a técnica de PCR consiste na busca por isolamento e amplificação ou criação de múltiplas cópias de fragmentos específicos de DNA. A reação em cadeia de polimerase utiliza-se de duas sequências de nucleotídeos iniciadores ou primers que hibridizam com as fitas opostas, em regiões que flanqueiam o segmento a ser amplificado (SCHAERFER, 2006). Toda PCR deve ser programada, pois existe um determinado período para a sua conclusão. Nas condições do laboratório da EMBRAPA esse período é de três a quatro horas. Alguns cuidados devem ser levados em consideração, como por exemplo: os reagentes utilizados junto ao DNA genômico podem sofrer algum tipo de deterioração devido às condições do ambiente, tais como claridade, temperatura, entre outros fatores, levando a um aumento das possibilidades de fracasso de todo o processo. Diante da necessidade de se realizar a amplificação de fragmentos do gene receptor da leptina em frangos de linhagem TT, foram realizadas algumas reações buscando a otimização das condições da PCR, que consiste na estimativa precisa dos componentes e condições da

24 25 reação. Para a reação é necessário um mix e amostras de DNA. O mix é considerado uma solução que contém todos os componentes necessários para dar início a PCR. Tais componentes, suas descrições e ordem de formulação, são listados na Tabela 1. Tabela 1 - Reagentes da composição do mix para realização da PCR, sua respectiva descrição e ordem de formulação. Componentes Descrição 1 Ordem dntp [10mM (milimolar)] Nucleotídeos (A, C, T, G) 3 Primers [µm (micromolar)] Iniciam a amplificação do DNA 5 Taq [5 U/µL (unidades por microlitro)] Extensão do dntp (nucleotídeos) 7 MgCl 2 (50 mm) Auxilia na Taq 4 Água DNAse RNAse free Diluente 1 Tampão 10X (concentrado dez vezes) Estabiliza o ph, auxiliando a reação 2 Master Amp Estabiliza o ph, auxiliando a reação 6 1 Estabelecida de acordo com o laboratorista. Lembrando que a Taq (5 U/µL) deve ser adicionada sempre ao final da realização do mix. Após o término do mix foram adicionadas determinadas quantidades nas amostras de DNA a serem amplificadas. Diante disso, as amostras podem ser direcionadas ao Termociclador (Px2 Thermal Cycler). Este equipamento irá aquecer e esfriar as amostras até completar os ciclos e quando tudo ocorrer como esperado, amplificará o fragmento de DNA. Os termocicladores são aparelhos fundamentais para realizar a PCR. Em vários estudos tanto em vegetais como em animais é necessário sua utilização para amplificação de fragmentos de DNA. Soares et al. (2008) trabalhando com plantas utilizou termociclador no programa de amplificação de fragmentos de DNA, na tentativa de identificar níveis de diversidade genética. Em um estudo realizado por Kowalski et al. (2007), não foi possível a amplificação do gene que codifica a ferritina (proteína globular) em galinhas. Nesta ocasião foi utilizado termociclador para realização da PCR, contudo, a intenção é de desenhar novos primers para se obter melhores resultados nas próximas tentativas de amplificação. Na Figura 5 é demonstrado um ciclo no termociclador e sua atuação na amplificação.

25 26 Figura 5 - Amplificação realizada por termociclador. 1- desnaturação da fita de DNA 94 a 96 o C; 2- anelamento dos primers 48 a 60 o C; 3- Taq atua no alongamento e cria uma nova fita (68 a 72 o C); 4- início de um novo ciclo com desnaturação. Ao todo são 30 ciclos, levando um tempo aproximado de 90 minutos para a amplificação exponencial dos fragmentos de DNA. Fonte: (07/09/2009). 6.4 Diluição para Primers (RL gene receptor da leptina) A reação em cadeia da polimerase é uma técnica molecular cuja escolha do DNA alvo e definição dos primers dentro da sequência do DNA são fatores determinantes na sua acuidade (OGUSKU e SALEM, 2004). Os primers são pontos de partida, ou seja, um pedaço de DNA de bases complementares à fita-molde (KREUZER e MASSEY, 2002). Este primer após sua compra precisa ser manipulado, processo que se chama diluição de primer. O primer é recebido na forma de pó, e diluído com de acordo com a sua concentração. Após isso armazena-se no congelador a -20 o C.

26 27 O primer é formado por um par, direto (RL D) e reverso (RL R). As concentrações iniciais são diferentes para ambos. A sequência dos primers desenhados por Ninov (2006) e tamanho da região flanqueada podem ser observadas na Tabela 2. Tabela 2 - Sequência dos primers desenhados e tamanho da região flanqueada. Gene Primer Sequência dos primers Tamanho pb Receptor da leptina RL D RL R 5'-AAAACCAGCACCCTGAAATG-3' 5'-CAGACTGTGCTTGGGGATTT-3' 940 Os primers devem ser utilizados na unidade de medida µl. Diante disso, será feita a elaboração da diluição mediante o exemplo apresentado no ANEXO B. 6.5 Otimização das condições e amplificação por PCR Para um bom resultado nas condições da reação é preciso ajustar todos os componentes envolvidos, dentre eles, a temperatura de anelamento dos primers, as quantidades dos componentes utilizados e por fim a qualidade das soluções (SCHAEFER, 2006). Em alguns casos pode ocorrer alguma contaminação por intermédio de algum descuido na manipulação da técnica. Foram realizados testes de otimizações para as condições de amplificação para os primers (RL D e RL R) do gene receptor da leptina, com o objetivo de estabelecer uma condição ótima da reação. Para a reação de PCR foram utilizados 3 µl de DNA genômico de aves linhagem TT adicionados a 22 µl do mix de reação composto pelos seguintes reagentes: 2,5 µl de tampão 10 X, 1 µl de MgSO 4, 1 µl de dntp, 2,5 µl de cada primer, 0,3 µl de enzima Taq DNA polimerase, 12,2 µl de água ultra pura, para um volume final de 25 µl. Para amplificação de fragmentos do gene receptor da leptina foi feita uma desnaturação inicial de cinco minutos a 95 o C, seguindo-se de uma nova desnaturação por um minuto a 95 o C. As condições de anelamento foram de 59,3 o C por um minuto e a extensão a 72 o C por um minuto seguindo-se de uma extensão final a 72 o C por dez minutos. Foram realizados 30 ciclos nas reações para os primers.

27 Identificação dos produtos das reações - eletroforese em gel de agarose O produto da PCR ou as amostras amplificadas foram analisadas através de um padrão de bandas obtido pelo procedimento de eletroforese. Esta técnica é amplamente utilizada em procedimentos de genética molecular para separar, identificar e purificar fragmentos de DNA (TEIXEIRA, 2003; SCHAEFER, 2006). Segundo Regitano (2001), eletroforese em gel é um termo utilizado para descrever o movimento de íons em solução como consequência da aplicação de um campo elétrico. A eletroforese em gel tira proveito de uma característica química do DNA para separar seus fragmentos. Em circunstâncias normais, os grupos fosfato do DNA são carregados negativamente. Por convenção, os opostos se atraem e, assim, as moléculas de DNA são fortemente atraídas por qualquer objeto carregado positivamente. Na eletroforese em gel, as moléculas de DNA são colocadas em um campo elétrico (que tem um pólo positivo e um pólo negativo), de maneira que elas migram em direção ao pólo positivo (KREUZER e MASSEY, 2002). O laboratório onde foram realizadas as eletroforeses é diferenciado de outros ambientes devido aos tipos de reagentes utilizados para a formação do gel de agarose. O brometo de etídeo (agente usado como marcador de ácidos nucleicos) é um destes reagentes um conhecido composto mutagênico. Por isso, para evitar qualquer tipo de contaminação, existem regras para o uso do laboratório, tais como, usar luvas, protetores nos sapatos e jalecos específicos, e o devido descarte do material utilizado em local específico. Com todas as precauções exigidas pode-se, dar início aos procedimentos da construção do gel de agarose, seguindo as etapas: 1. Através de uma balança analítica pesar num erlenmeyer a quantidade de agarose necessária; 2. Aquecer por cerca de 1 minuto em forno de microondas, evitando a fervura (misturar com cuidado, pois a solução ferve e é atirada para fora do frasco; interrompa sempre que necessário, misturar calmamente a solução e colocá-la de volta no microondas); 3. Esperar a solução esfriar (ponto que tolere encostar na sua pele), para evitar danos à forma do gel; 4. Adicionar brometo de etídeo (fazer esta operação cuidando com a contaminação); 5. Verter o gel na forma fechada nas extremidades e com o pente em posição; 6. Remover bolhas com ponteiras e esperar esfriar; 7. Após polimerizado o gel, remover o pente com cuidado;

28 29 8. Colocar o gel na cuba e completar o volume do tampão até cobrir o gel; 9. Enquanto isso, preparar as amostras a serem carregadas no gel; 10. Adicionar em cada amostra de reação o azul de bromofenol. 11. Transferir essas amostras para os poços do gel; 12. Conectar os eletrodos à fonte e ligar. O DNA encontra-se no ph do tampão TBE 1X (tampão) carregados negativamente (preto) e migram para o pólo positivo, eletrodo vermelho; 13. Após a corrida, transferir o gel para uma bandeja; 14. Observar sob luz ultravioleta no transiluminador; 15. Visualização do padrão de bandas formado e interpretação dos resultados. Na Tabela 3 são apresentados os componentes do processo de eletroforese e as quantidades utilizadas, para visualização da otimização dos produtos da PCR realizadas em oito amostras de DNA de aves. Tabela 3 - Componentes utilizados para o processo de eletroforese e suas quantidades. Componentes 1 Quantidade Solução tampão 35 ml Agarose (pó) 2 % tampão 2 Brometo de etídeo 10 % do tampão Azul de bromofenol 2 µl/amostra 3 Amostras de DNA 20 µl/amostra 1 Estimada mediante o tipo de reação em questão. 2 Composto mutagênico. 3 Nesta ocasião 9 amostras. Com a visualização e interpretação dos resultados obtidos pela eletroforese é possível afirmar que neste caso o melhor padrão de banda amplificado é o da canaleta 9, pois se apresenta nítida e sem bandas inespecíficas (provocadas por altas temperaturas). Indicando que a temperatura de anelamento ideal para a amplificação de fragmentos do gene do receptor da leptina seria 59,3 o C, portanto a reação de PCR está otimizada para essas condições. Os produtos amplificados visualizados no gel de agarose 2 % são demonstrados na Figura 6.

29 30 Figura 6 - Gel de agarose 2 % para visualização dos fragmentos amplificados do gene receptor da leptina. A canaleta 1 corresponde ao marcador [100 pb (pares de base)], as canaletas 2 a 9 são amostras de DNA usadas para teste de amplificação (temperaturas de anelamento variando entre 55,5 e 59,3 o C) e a canaleta 10 corresponde a amostra negativa ou sem DNA para a detecção de alguma possível contaminação. 6.7 Método de genotipagem de marcadores SNP (Polimorfismos de Nucleotídeo Único) Os marcadores moleculares têm-se mostrado uma poderosa ferramenta nos estudos de animais domésticos, auxiliando no descobrimento de parâmetros genéticos importantes para as espécies (FERREIRA, 2007). Os marcadores SNP tem como base as alterações mais elementares da molécula de DNA, ou seja, mutações em bases únicas da cadeia de bases nitrogenadas, podendo haver milhões deste tipo de polimorfismo no genoma de um indivíduo (CAETANO, 2009). Segundo Boscheiro et al. (2009), o estudo de polimorfismos em genes candidatos tem contribuído com informações que podem ser incorporadas aos programas de melhoramento genético de aves. Essa prática visa identificar marcadores moleculares que possam ser utilizados em programas de seleção para melhoria de características difíceis de serem medidas (NINOV et al., 2007). A diferença em sequências de nucleotídeos ao longo da fita de DNA de indivíduos distintos é potencialmente enorme. A detecção destas diferenças abre perspectivas relevantes

30 31 ao estudo do genoma. A técnica PCR-RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism), que significa polimorfismos de comprimento de fragmento de restrição, combina uma sequência de passos para detectar eficientemente estas diferenças (FERREIRA e GRATTAPAGLIA, 1998). Diante disso, a genotipagem é um procedimento onde são analisados fragmentos, com a identificação de alelos ao longo do DNA (BOSCHEIRO et al., 2007). Marcadores baseados em PCR-RFLP permitem a identificação de genótipos heterozigotos e homozigotos, gerando muitas informações a nível genético e permitindo análise detalhada da expressão gênica e interação entre os alelos em estudos de mapeamento de características quantitativas (FERREIRA e GRATTAPAGLIA, 1998). Esta técnica utiliza a síntese in vitro de um segmento de DNA pela reação em cadeia da polimerase. Este segmento é digerido com enzimas de restrição visando identificar mutações de ponto na sequência (MACHADO e MARTINEZ, 2001). Na década de 60 pesquisadores descobriram que as bactérias possuem enzimas que cortam ou digerem uma sequência específica de DNA de fita dupla (SCHAEFER, 2006). De acordo com Kreuzer e Massey (2002), as enzimas de restrição reconhecem e cortam posições específicas ao longo da molécula de DNA, nos chamados sítios de restrição. Segundo Regitano (2001) essas enzimas geralmente compostas de quatro a seis nucleotídeos, efetuam a clivagem da molécula dentro ou próximo dessa sequência de reconhecimento. Para tanto, de acordo com esse mesmo autor, essa técnica permite a identificação de diferenças entre os indivíduos quanto ao número e posição de restrição em uma determinada molécula de DNA. 6.8 Genotipagem de polimorfismos no gene receptor da leptina Os animais escolhidos para tal procedimento foram 112 indivíduos parentais TT (item 5.1). O loco estudado foi o G915A na região amplificada pelo primer do gene receptor da leptina. A genotipagem desta região foi realizada com a utilização da técnica PCR-RFLP. Os produtos da PCR foram tratados com a enzima BsrGI diluída e incubados a 60 o C por três horas. Sofía et al. (2009) utilizaram esta mesma enzima em fragmentos de DNA de patos silvestres para a identificação da histocompatibilidade com Gallus gallus. A sequência das bases reconhecidas pela enzima de restrição BsrGI pode ser observada na Figura 7.

31 32 Figura 7 - Sítio de restrição da enzima BsrGI, utilizada para a genotipagem do polimorfismo G915A encontrado no íntron 19 do gene do receptor da leptina Diluição de enzima BsrGI Para maximizar o uso da enzima BsrGI responsável pela clivagem do fragmento do gene receptor da leptina, foi realizada uma diluição conforme recomendação dos fornecedores com 10 µl da enzima BsrGI e 90 µl de solução tampão. A preparação do tampão constituiu várias etapas, tais como, cálculos para concentração e volume dos reagentes. Para um volume final de 10 ml de tampão foram utilizadas as quantidades de 100 µl de NaCl (50 mm), 100 µl de Tris-HCl (10 mm ph 4,0), 2 µl de EDTA [0,1 M (molar)], 100 µl de DTT (1 mm), 200 µl BSA (200 µg/ml), 6,315 g de glicerol, completando-se o volume com água ultra pura. Depois de diluída, a enzima foi utilizada para a reação de clivagem. O volume final de reação foi de 15,1 µl, constituindo-se de 1,5 µl de 10X NEBuffer, 1 µl de BSA, 0,8 µl de enzima BsrGI diluída, 4 µl de DNA amplificado, completando-se o volume com água ultra pura. A reação de amplificação do fragmento do íntron 19 resultou em um fragmento de 940pb, sendo que na clivagem com a enzima BsrGI espera-se três fragmentos: 940, 674 e 266pb. Os indivíduos homozigotos GG apresentam somente uma banda de 940pb. Os homozigotos AA deveriam apresentar duas bandas, a primeira 674pb e a segunda de 266pb e os indivíduos heterozigotos GA apresentariam três bandas, 940pb, 674pb e 266pb. A figura 8 mostra o padrão de bandas do polimorfismo (G915A) após a clivagem seguida pela eletroforese em gel de agarose 2 %. Vários testes foram realizados para verificar atividade enzimática da BsrGI. Em um destes testes escolheu-se um indivíduo F2 (TCTC), com genótipo (GA) conhecido, como

32 33 controle positivo. Assim, se todos os parentais da reação enzimática estivessem corretos, três fragmentos poderiam ser observados nesta amostra controle. Figura 8 - Padrão de fragmentos do produto amplificado do íntron 19 do gene do receptor da leptina digerido com a enzima BsrGI diluída. As canaletas mostram alguns dos 112 indivíduos parentais TT, neste caso todos de genótipo homozigoto (GG). Último indivíduo é o controle com genótipo GA conhecido. Com base nos resultados obtidos da clivagem dos parentais TT, pode-se afirmar que estes indivíduos não possuem o genótipo GA para este marcador, mas sim o genótipo GG, uma vez que o alelo G é de origem das aves da linhagem de corte TT, e o alelo A é de origem

33 34 das aves da linhagem de postura CC (NINOV, 2006). Por outro lado, nos animais TCTC (F2) o marcador foi identificado, pois existe o cruzamento das duas linhagens, favorecendo a ocorrência do polimorfismo. Assim, não foi necessário genotipar os 1500 indivíduos da linhagem TT, partindo do pressuposto que estes também não possuem o polimorfismo G915A.

34 35 7 CURSO DE MÉTODOS BÁSICOS DE ANÁLISES FILOGENÉTICAS Um grupo de pesquisadores da área de Sanidade Animal da EMBRAPA, ofereceram um curso em filogenética, com o objetivo de atualizar profissionais pesquisadores nesta área. O curso de Análise em Filogenética foi ministrado pelo Dr. Nelson J. R. Fagundes UFRGS (Universidade Federal do Rio Grande do Sul), no período de 16/09/09 a 18/09/09 em Concórdia/SC, compreendendo um total de 20 h. Os temas abordados foram a importância das análises filogenéticas, os objetivos de uma análise, manipulação de bancos de dados biológicos e suas limitações e por fim alinhamento de nucleotídeos. A filogenia consiste na resolução de problemas de origem genética, utilizando-se o histórico genealógico de um grupo biológico. Realiza-se filogenia para identificar a relação entre as espécies, mapear caracteres de organismos, encontrar ancestrais comuns, dinâmica demográfica, expansão populacional entre indivíduos, dentre outras aplicabilidades. Os bancos de dados utilizados em análises de filogenética possibilitam várias vantagens, pois disponibilizam amostragem e podem completar bancos de dados criados para outros fins de pesquisas. Por outro lado, existem limitações para o uso e manipulação dos bancos de dados, tais como: dados genéticos errados, informações erradas e o fato de espécies não descritas que não constam em bancos de dados. Um ótimo exemplo de banco de dados é o GenBank (disponível online), onde estão disponíveis sequências de nucleotídeos e traduções de suas proteínas. O GenBank recebe sequências produzidas nos laboratórios de todo mundo, e vêm crescendo cada dia mais, servindo como ponto de partida para muitas pesquisas em genética molecular. Para tanto, através da participação neste curso foi possível aperfeiçoar os conhecimentos básicos em Filogenética, contribuindo para a formação acadêmica e conhecimento de mais um dos ramos ou segmentos de estudos em genética molecular, tendo em vista o Melhoramento Animal.