Amanda Carvalho Domingos

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1 UNIVERSIDADE CASTELO BRANCO INSTITUTO QUALITTAS DE PÓS-GRADUAÇÃOEM MEDICINA VETERINÁRIA CURSO DE PATOLOGIA CLÍNICA VETERINÁRIA Métodos diagnósticos para Leishmaniose Visceral canina Amanda Carvalho Domingos Rio de Janeiro 2009

2 AMANDA CARVALHO DOMINGOS Aluna do curso de Pós Graduação em Patologia Clínica Veterinária, pelo Instituto de Pós-Graduação Qualittas, juntamente com a Universidade Castelo branco. MÉTODOS DIAGNÓSTICOS PARA LEISHMANIOSE VISCERAL CANINA Trabalho monográfico de conclusão do curso de Pós Graduação em Patologia Clínica Veterinária apresentado à UCB como requisito parcial para a obtenção do título de especializado em Patologia Clínica Veterinária sob a orientação do(a) Prof. Nayro Alencar Rio de Janeiro, Julho de 2009.

3 MÉTODOS DIAGNÓSTICOS PARA LEISHMANIOSE VISCERAL CANINA Elaborado por Amanda Carvalho Domingos Aluna do Curso de Pós-graduação em patologia Clínica Veterinária da UCB Foi analisado e aprovado com grau:... Rio de Janeiro, de de Membro Membro Professor Orientador Presidente Rio de Janeiro, abr.2009

4 DEDICATÓRIA Dedico este trabalho a Deus, que realiza maravilhas na vida de seus filhos, em uma demonstração de inesgotável amor e bondade. Obrigado pela vida, pela saúde, pela oportunidade de estudar, pelos ensinamentos, pela sabedoria, por Sua presença constante durante todos esses anos e por ter colocado pessoas tão especiais em meu caminho. Aos meus pais que sempre investiram na minha educação e eu espero jamais desapontar! iv

5 AGRADECIMENTOS Agradeço a Deus por tudo. Aos meus pais pelo apoio de sempre, a cada nova etapa e cada novo desafio que eu decido enfrentar na vida. Vocês são demais! Aos meus familiares, amigos por compreenderem minha ausência e por torcerem por mim. Aos amigos que fiz durante este curso, pelo companheirismo. Ao meu namorado, David, pelo amor, carinho, apoio, compreensão e por dividir comigo a saudade dos finais de semana que pareciam ser sempre mais longos do que de costume! Você é muito especial pra mim! Aos animais, por despertarem em mim a paixão de ser veterinária, por se doarem para que nós, veterinários, pudéssemos aprender mais sobre eles e devolver em forma de cuidado. Por serem nosso gostoso meio de vida! A eles, por expressarem sem palavras, tanto amor, companheirismo e dedicação. Em especial, aos animais que passaram de forma intensa em minha vida, as saudosas Babi, Lady, Britanny, e minha companheira de faculdade (de quatro patas), Pérola.Que saudade! E às minhas princesas Charllote e Zuleika, porque elas também são parte da família! v

6 Resumo Tema: Métodos diagnósticos para leishmaniose visceral canina Autora: Domingos, Amanda Carvalho Orientador: Prof.M.Sc. Alencar, Nayro Xavier de A leishmaniose visceral canina é uma doença infecciosa de caráter zoonótico, ou seja, que acomete os seres humanos e animais domésticos e silvestres. O agente etiológico é um protozoário difásico intracelular obrigatório que pertence ao gênero Leishmania. Sua Transmissão é feita por meio de vetores dípteros denominados flebotomíneos, estes pertencem a várias espécies do gênero Lutzomyia. Os cães exercem um papel fundamental, pois são considerados os principais reservatórios em meio urbano. Devido à grande variedade dos sinais clínicos da doença e à grande porcentagem de cães assintomáticos, o diagnóstico laboratorial é de grande importância. Os principais exames são: parasitológicos, sorológicos, imunológicos e moleculares. Dentre os testes sorológicos os mais utilizados são o ELISA e a imunofluorescência indireta, dentre os parasitológicos o mais utilizado é o citológico. Além dessas técnicas, o PCR também vem sendo bastante utilizado, apresentando alta sensibilidade e especificidade. PALAVRAS-CHAVES: Leishmaniose visceral, cães, diagnóstico. vi

7 ABSTRACT Topic: Canine visceral leishmaniasis Methods of diagnostic Author: Domingos, Amanda Carvalho Advisor: Prof.M.Sc. Alencar, Nayro Xavier de The canine visceral leishmaniasis is a disease of zoonotic character, which affects humans and domestic animals and wild. The etiological agent is a bifasic protozoan intracellular binding that belongs to the genus Leishmania. His transmission is made through vectors flies called sandflies, they belong to different species of the genus Lutzomyia. The dogs have a crucial role because it is considered the main reservoirs in the urban middle. Due to the wide variety of clinical signs of disease and the large percentage of dogs asymptomatic, the laboratorial diagnostic is of great importance. The main exams are: parasitological, serological, immunological and molecular. Among the serological tests, the most used are ELISA and indirect immunofluorescence, among the parasitological tests, the most used is the cytological. In addition to these techniques, PCR is being widely used also showing high sensitivity and specificity. KEYWORDS: leishmaniasis visceral, dogs, diagnostic. vii

8 LISTA DE FIGURAS Página Fig 1 Formas do agente etiológico... 1 Fig.2. Vetor da Leishmaniose visceral... 3 Fig.3. Ciclo da Leishmaniose visceral... 3 Fig.4. Onicogrifose... 5 Fig. 5 Caquexia... 5 Fig.6 Ulcerações na pele... 5 viii

9 LISTA DE TABELAS Página Tab.1. Sensibilidade e especificidade de testes imunocromatográficos (rk39)... 8 ix

10 SUMÁRIO RESUMO... vi ABSTRACT... vii LISTA DE FIGURAS... viii LISTA DE TABELAS... ix 1. Introdução Etiologia Epidemiologia Patogenia Manifestações Clinicas Diagnóstico História do diagnóstico Achados laboratoriais Métodos Parasitológicos... 9 Microscopia direta... 9 Isolamento em meio de cultura... 9 Isolamento em animais suscetíveis Métodos Sorológicos Reação de fixação do complemento Aglutinação direta Reação de imunofluorescência direta ELISA Imunocromatografia Métodos moleculares PCR Conclusão Referências Bibliográficas x

11 1. Introdução A leishmaniose visceral é uma zoonose importante em saúde pública, que acomete humanos, canídeos e alguns animais silvestres. Em humanos, possui alta letalidade em indivíduos não tratados e crianças desnutridas, sendo também considerada emergente em indivíduos portadores do vírus da imunodeficiência adquirida, tornando-se uma das doenças mais importantes da atualidade. O agente etiológico desta doença é um protozoário difásico do gênero Leishmania. Existem cerca de 30 espécies diferentes encontradas no mundo e a principal espécie encontrada no Brasil é a Leishmania (Leishmania) Chagasi. A transmissão ocorre a partir da picada de vetores, que são flebotomíneos do gênero Lutzomia. No Brasil, duas espécies, até o momento, estão relacionadas com a transmissão da doença, Lutzomyia longipalpis e Lutzomyia cruzi., sendo a primeira mais importante por estar mais amplamente distribuída. Na área urbana, o cão é a principal fonte de infecção, e devido à grande variedade de sinais clínicos, e à grande porcentagem de cães assintomáticos, o diagnóstico laboratorial é de grande importância. Existem vários métodos de diagnósticos disponíveis, que se dividem em parasitológicos, sorológicos e moleculares Etiologia A leishmaniose é causada por um protozoário difásico do gênero Leishmania, da classe Kinetoplastida e família Trypanosomatidae (GRENEE, 2006). Como dito anteriormente, a espécie comumente encontrada do Brasil é a L. chagasi. São parasitos intracelulares obrigatórios das células do sistema mononuclear fagocítico. Possuem uma forma flagelada ou promastigota, encontrada no tubo digestivo do inseto vetor, e outra aflagelada ou amastigota, nos tecidos dos vertebrados (MS, 2006). Fig.1: Formas do agente etiológico (promastigota, à esq. e amastigota, à dir.); Fonte:MS,

12 1.2. Epidemiologia O ciclo natural da infecção, envolve um mosquito vetor e um hospedeiro vertebrado (GRENEE, 2006). No Brasil, o principal vetor é a Lutzomia longipalpis e, recentemente, L. cruzi foi incriminada como vetora no Estado de Mato Grosso do Sul (MS, 2006). Os flebotomíneos são insetos crepusculares e noturnos que habitam tipicamente a mata, mas vêm modificando seu comportamento devido à destruição de seus habitats naturais (BRUM et al., 2007). São insetos pequenos, medindo de 1 a 3mm de comprimento, possuem o corpo revestido de pêlos e são de coloração clara, conhecido popularmente como mosquito palha (Fig. 2). As fêmeas hematófagas ingerem os parasitas presentes na pele na forma amastigota, quando se alimenta do sangue dos reservatórios infectados. Devido à diminuição da temperatura e ao aumento de ph no intestino do inseto, as formas amastigotas se transformam em promastigotas. Essas passam por várias transformações até atingirem a forma promastigota metacíclica, que é a forma infectante. Ao se alimentar novamente, a fêmea do mosquito transmite a infecção (PILATTI, 2009). Os reservatórios naturais incluem animais silvestres, como raposas e marsupiais e, em áreas urbanas, o cão (MS, 2006). A ocorrência da doença depende da presença do vetor e do reservatório (Fig.3). A leishmaniose visceral atinge 19 dos 27 estados brasileiros, especialmente a região Nordeste, onde se concentram 77% dos casos humanos da doença. Há focos importantes também nas regiões Norte, Sudeste e Centro- Oeste, sendo que nas duas últimas décadas tem havido um crescente aumento da incidência. Recentemente, a doença vem se expandindo para novas áreas urbanas e periurbanas e se transformando em um sério problema de saúde pública, com o registro de casos em grandes centros urbanos como Belo Horizonte, Fortaleza, Teresina e Campo Grande (MS, 2006). Na cadeia epidemiológica da doença, existem 3 pontos onde se focam as medidas de controle: diminuir a densidade populacional do vetor, identificar e tratar casos humanos e identificação e eliminação de cães infectados (ALVES e BEVILACQUA, 2004). Como a confirmação parasitológica é inviável para estudos de campo a soropositividade passa a indicar o sacrifício dos animais (SILVA, 2005). Conforme recomendado pelo Ministério da Saúde, o teste de ELISA deve ser utilizado para triagem e o RIFI, para confirmar casos sororeagentes ao teste ELISA ou como uma única técnica diagnóstica. Existem questionamentos sobre esta medida de controle, pois em trabalhos que avaliaram a correlação entre casos caninos e humanos, alguns autores encontraram uma correlação positiva e outros não (SILVA, 2005). Segundo GRENEE (2006), eutanasiar cães positivos é inaceitável para os proprietários e ineficiente, porque cães assintomáticos ocasionalmente soronegativos e canídeos silvestres continuam sendo fontes de infecção. O RIFI possui alta sensibilidade, em torno de 90 a 100%, mas sua especificidade não é tão elevada, em torno de 80%. Isso ocorre devido a reações cruzadas com outras doenças como a Doença de Chagas e a Leishmaniose tegumentar americana. Este fato, leva ao sacrifício de animais falso positivos, levando a insatisfação por parte de clínicos, proprietários e 2

13 sociedades protetoras. Levando em consideração, que se trata de uma zoonose importante, e que até o momento, não existe tratamento eficaz para o cão, que mesmo com a remissão dos sintomas clínicos ainda é capaz de infectar o vetor, a eutanásia dos cães positivos para controle da doença, ainda assim, se torna importante. Espera-se que o fato de que as reações cruzadas acontecem com outras zoonoses endêmicas no Brasil, que possuem o cão como reservatório e fonte de infecção para humanos e outros animais e sem tratamento eficiente para o cão, minimizem a insatisfação com a falha da especificidade do teste, até que testes cada vez mais sensíveis e específicos sejam implementados (ALVES e BEVILACQUA, 2004). Fig. 2 Lutzomia longipalpis, vetor da Leishmaniose visceral. Fonte: Site da Fiocruz. Fig.3 Ciclo da leishmaniose. Fonte: 3

14 1.3. Patogenia Após a infecção, as formas amastigotas são fagocitadas dentro de macrófagos, e se multiplicam dentro de fagolisossomos. O macrófago rompe, liberando as formas amastigotas que penetram em outras células do hospedeiro e disseminam a partir do local da picada. Elas migram pelo corpo do hospedeiro, mas primeiramente pelo sistema hemolinfático e remotas áreas de pele até criar uma infecção generalizada. Nem todos os cães infectados desenvolvem a doença, isso depende se o sistema imune do hospedeiro conseguirá ou não interromper a replicação das formas amastigotas. Resistência para infecção experimental com L.infantum em cães está associada com a proliferação de linfócitos no sangue periférico, com produção de IL-2, fator de necrose tumoral e TNF- alfa com estimulação antígeno- específica (GRENEE, 2006). A L. infantum é a espécie que ocorre em países do Mediterrâneo e Ásia, mas estudos utilizando técnicas bioquímicas e moleculares consideram L. chagasi e L. infantum uma única espécie (MAURÌCIO et al., 2000). A proliferação de linfócitos B, plasmócitos, histiócitos e macrófagos resultam em linfadenomegalia generalizada, esplenomegalia e hiperglobulinemia consistente. A resposta de imunoglobulina é massiva, embora não seja uma resposta protetora e eventualmente possa ser prejudicial. Anticorpos que podem estar associados ao desenvolvimento de fenômenos patológicos como uma anemia e trompocitopenia imunomediada também são freqüentemente produzidos. Outro perigo potencial da regulação prejudicada de células T com atividade exuberante de células B é a geração de grande quantidade de imunocomplexos circulantes. Eles se depositam na parede dos vasos sanguíneos podendo causar vasculite, poliartrite, uveíte e glomerulonefrite. Em cães, eles se depositam nos rins e freqüentemente resultam em insuficiência renal, que é a principal causa de morte em cães com leishmaniose. A vasculite sistêmica pode levar à isquemia local que causa necrose cutânea e visceral e, embora raro, com envolvimento do sistema nervoso. Imunocomplexos também podem incluir crioglobulinas. Essas proteínas podem precipitar em vasos sanguíneos e extremidades quando expostas ao frio causando necrose isquêmica. A trompocitopenia ainda pode se desenvolver como resultado de imunocomplexos circulantes, anticorpos, seqüestro esplênico, ou supressão da medula óssea. A anemia normalmente se desenvolve como seqüela da diminuição da eritropoiese da doença crônica ou da insuficiência renal crônica mas pode ser agravada por perda de sangue, ou destruição imunomediada de eritrócitos, ou ambos (GRENEE, 2006) Manifestações clínicas A doença no cão é de evolução lenta e início insidioso, e as manifestações clínicas dependem do tipo de resposta imunológica expressa pelo animal infectado, são altamente variáreis e o período de incubação varia de 3 meses a 7 anos (MS, 2006; GRENEE, 2006). Geralmente, os cães possuem um histórico de perda de resistência, perda de peso (com perda 4

15 de apetite ou polifagia), vômito, epistaxe, melena, espirro e tosse, e ao exame clínico, os sinais mais frequentemente encontrados são: linfadenomegalia, lesões de pele, caquexia (Fig.4), locomoção anormal,esplenomegalia, febre, onicogrifose (Fig.5) e alterações oculares, como alopecia periocular, blefarite, conjuntivite, ceratite e uveíte (FULGÊNCIO et al., 2008; GRENEE, 2006). As lesões cutâneas ocorrem em aproximadamente 90% dos cães com leishmaniose visceral, ocorrendo principalmente nos espelho nasal, orelhas, focinho, cauda e articulações. As lesões incluem alopecia, descamação, ulcerações únicas ou múltiplas (Fig.6), e nódulos isolados ou disseminados por todo corpo. A alopecia geralmente é simétrica e, na maioria das vezes, descamativa, e as ulcerações afetam particularmente as proeminências ósseas, regiões mucocutâneas e de extremidades (BRUM et al., 2007; MS, 2006). Distúrbios de locomoção ocorrem por neuralgia, poliartrites, rachaduras nos coxins, úlceras interdigitais, lesões osteolíticas e osteoarticulares ou periostite proliferativa (GRENEE, 2006). A piora do quadro clínico geralmente ocorre quando a doença acomete os rins, levando a uma falência renal progressiva acompanhada de anorexia, depressão mental, poliúria, polidipsia, vômito e diarréia transitória. A maioria dos animais chega a óbito por insuficiência renal (GRENEE, 2006). Fig 4. Onicogrifose Fonte: MS, 2006 Fig. 5 Caquexia Fonte: MS, 2006 Fig. 6. Ulcerações em orelha, proeminências ósseas da face e região mucocutânea oral. Fonte: 5

16 2. Diagnóstico 2.1 História do diagnóstico Até a década de 30, o diagnóstico humano e os inquéritos caninos eram realizados por meio dos exames diretos como a punção de fígado, de baço e o raspado de pele. Esses exames são seguros quanto à positividade dos casos, mas não eficazes para realizar uma cobertura total dos animais positivos. Em 1938, a reação da fixação de complemento foi utilizada pela primeira vez para diagnosticar leishmaniose humana e em 1957, pesquisadores brasileiros descreveram a RFC para inquéritos caninos, com antígeno extraído do bacilo da tuberculose, concluindo que, esta técnica possuía sensibilidade e especificidade melhores que os exames diretos. Com a demonstração da possibilidade de aplicação da RFC em eluatos de sangue colhidos em papel de filtro, essa técnica tornou-se largamente difundida, contudo, reações cruzadas em títulos baixos podem ocorrer com a Doença de Chagas e Leishmaniose tegumentar americana (ALVES e BEVILACQUA, 2004; DEVENS, 2008). Por volta de 1940, o pesquisador Albert H. Coons desenvolveu a técnica de imunofluorescência, que passou a ser utilizada para o diagnóstico de leishmaniose visceral na década de 60 (DEVENS, 2008). Na busca por testes cada vez mais sensíveis e específicos, surge a metodologia de ensaio imunoenzimático, que teve sua primeira descrição em 1971, por, Engvall e colaboradores. (DEVENS, 2008). No decorrer da década de 70, surgiram suas variações como: Dot- ELISA, Fast - ELISA e micro ELISA, FML - ELISA (fucose manose ligant - ELISA), BSM - ELISA (bovine submaxillary mucin - ELISA), entre outras. Tanto no RIFI quanto no ELISA ainda podem ocorrer reações cruzadas com outras doenças causadas por tripanossomatídeos (ALVES e BEVILACQUA, 2004; DOURADO et al.,2007). Em 1975, a Aglutinação direta (DAT) foi descrita e foi adaptada para o diagnóstico da infecção humana e canina no final da década de 80. Este teste é tão sensível e específico quanto o ELISA e sua vantagem está na sua simplicidade e baixo custo (ALVES e BEVILACQUA, 2004). A partir da década de 1980, iniciou-se o estudo de várias metodologias de diagnóstico baseadas na biologia molecular para identificação do gênero Leishmania. É um método de hibridização por meio de sondas específicas e técnicas de amplificação de ácidos nucleicos, incluindo a reação em cadeia da polimerase transcriptase reversa (RT-PCR) para detecção de RNA e a PCR para detecção de DNA. A PCR é a mais específica e sensível, porém ainda é cara e complexa para utilização em larga escala (DOURADO et al., 2007). A partir da década de 90, ocorreu a união das técnicas imunoenzimáticas com a cromatografia, originando, assim, a imunocromatografia. As técnicas imunoenzimáticas permitem a quantificação de antígenos ou anticorpos que possam ser marcados com enzimas, sendo um procedimento rápido, de custo baixo e extremamente sensível, embora haja reações cruzadas com outras doenças. A cromatografia clássica (ou padrão) mostra um bom desempenho para análises quantitativas, é uma 6

17 técnica com elevado investimento, porém o procedimento pode demandar tempo. A associação das duas técnicas originou a imunocromatografia, que se tornou um método mais sensível, rápido e com custo operacional mais baixo. Em regra geral, as técnicas imunocromatográficas apresentam diversos sistemas acopladores e são vistas como métodos vantajosos. Os principais métodos são: imunoblot, ensaios receptores, ensaios enzimáticos inibidores e sistemas enzimáticos com proteína A ligada a corantes específicos. Nos últimos anos, esses sistemas enzimáticos com proteína A ligada a corantes têm sido usados para a realização de teste por imunocromatografia ou Dot-Elisa em papéis, que podem ser capazes de realizar o diagnóstico rápido da LV em áreas endêmicas, dispensando etapas críticas de incubação e equipamentos de leitura óptica. O diagnóstico desta doença, por imunocromatografia, detecta anticorpo IgG contra o antígeno recombinante K39,que é um antígeno expresso nas espécies de Leishmania do complexo L. donovani (DOURADO et al., 2007). Em 1996 foi adaptada para um teste imunocromatográfico por Badaró, para diagnóstico humano, recebendo o nome de TRALd (Teste Rápido Anticorpo L. donovani). O TRALd não apresentou reação cruzada com leishmaniose cutânea, doença de Chagas, tuberculose, hanseníase e esquistossomose. Quando o teste foi realizado em cães de áreas endêmicas, a sensibilidade foi de 92% e a especificidade de 99,5%, no entanto, o teste não foi capaz de detectar infecção em animais com títulos de RIFI de1:40 a 1:320 (BADARÒ, R., 1996; GENARO, O., 1997; DOURADO et al., 2007). Em 2003, pesquisadores realizaram um extenso estudo no nordeste da Índia, em humanos,no qual utilizaram o teste imunocromatográfico DiaMed IT-LEISH. Este teste faz a detecção rápida de anticorpos contra Leishmania spp. por meio de uma tira-teste impregnada com antígeno recombinante K39 (rk39), que é um epítopo repetitivo altamente conservado entre os membros do complexo L. Donovani. Este teste foi realizado no Brasil recentemente, validando o uso do mesmo para diagnóstico em humanos (ASSIS et al., 2008). Ainda não há estudos para o diagnóstico em cães. Os testes rápidos que utilizam o antígeno recombinante K39 possibilitam a detecção de infecções clínicas ou subclínicas, sendo muito importantes em áreas onde a LV é hiperendêmica. São testes bastante promissores para uso em programas de saúde pública, pois requerem pequena quantidade de sangue periférico, são de rápida execução e fácil leitura (DOURADO et al., 2007). Abaixo se encontra um quadro comparativo entre os testes imunocromatográficos com antígeno rk39 em relação aos quesitos sensibilidade e especificidade.a variação de sensibilidade e especificidade provavelmente ocorre por causa das variações regionais de cepas. 7

18 Método Sensibilidade % Especificidade% Teste rápido rk (Índia) Imunocromatografia rk (Nepal) Imunocromatografia rk39 71,4 100 (Alemanha) Imunocromatografia 67 - (Sudão) TRALd rk ,5 (Brasil ) DiaMed IT- LEISH K (Índia ) Tabela 1. Comparação entre a sensibilidade e especificidade de testes imunocromatográficos com antígeno rk39 em trabalhos realizados no Brasil e no mundo, a partir de soro humano. Fonte: DOURADO et al., Achados laboratoriais O achado mais consistente é a hiperproteinemia com hiperglobulinemia e hipoalbuminemia, resultando numa diminuição da relação albumina/globulina. Anemia não regenerativa moderada é frequentemente encontrada, e mais raramente, anemia hemolítica regenerativa por mecanismos imunomediados. Trombocitopenia, moderada leucocitose ou leucopenia são achados inconsistentes, mas linfopenia é encontrada com muita freqüência. Elevações moderadas das enzimas hepáticas também ocorrem frequentemente e elevações de uréia e creatinina podem ocorrer como consequência da insuficiência renal que os cães começam a apresentar por causa da deposição de imunocomplexos nos glomérulos. Animais que apresentem essas alterações nos exames laboratoriais, com ou sem sintomas clínicos, principalmente em áreas endêmicas devem ser investigados. O diagnóstico da leishmaniose visceral canina pode ser realizado por métodos parasitológicos, sorológicos e moleculares (GRENEE, 2006). 8

19 2.3. Métodos parasitológicos Microscopia direta Representa o diagnóstico de certeza da infecção, pois a visualização do parasita é incontestável. É realizado pela visualização das formas amastigotas em cortes histológicos ou punção aspirativa de linfonodos, baço, medula óssea ou fígado, no entanto há um consenso na literatura quanto à menor sensibilidade do exame em material obtido por punção hepática em relação aos materiais obtidos dos outros órgãos, inclusive de nódulos e lesões de pele (SILVA, 2005). Para o preparo do material citológico, uma gota do aspirado é colocado numa das extremidades da lâmina previamente limpa e é dispersado na outra direção. Após secagem deve ser fixado em álcool metílico e corado por corantes derivados de Romanowsky, como Wright, Giemsa, Leishman e panótico. São recomendadas pelo menos quatro lâminas (MS, 2006). A especificidade deste teste é de 100%, mas a sensibilidade varia de 60 a 80%. A sensibilidade varia com a carga parasitária, fase de infecção e grau de experiência do observador. Outra desvantagem deste método é o seu caráter invasivo, no caso de uma punção esplênica guiada por ultrassom ou mielograma, que, dependendo do quadro do paciente, pode gerar complicações, além da menor aceitação, muitas das vezes, por parte dos proprietários, em relação a outros métodos de diagnóstico. A demora na colheita, processo e observação das amostras, a necessidade de um observador experiente e a baixa sensibilidade do método, é um fator limitante para que ele seja usado em inquéritos amplos (SILVA, 2005). Isolamento em meio de cultura (in vitro) Formas amastigotas do parasita, inoculadas em meios de cultura especiais, contendo agar e sangue de coelho, transformam-se em formas promastigotas. O clássico meio de NNN (Novy-MacNeal- Nicolle) é o mais comumente empregado. A utilização de meio líquido sobre o NNN, como o meio LIT( liver infusion tryptose) ou de Schneider, aumenta e acelera a positividade da cultura. Uma gota do material aspirado (que pode ser medula óssea, baço, linfonodos e fígado) deve ser diluído em 0,5mL de solução salina (PBS ou NaCl a 0,9%) na própria seringa. Em seguida, 0,1 ml desta solução deve ser inoculada em condições estéreis, em dois tubos de cultivo. As culturas devem ser mantidas entre C e observadas em microscopia óptica comum ou invertida, semanalmente, até quatro semanas. Os tubos positivos devem ser encaminhados para laboratórios de referência para identificação da espécie (MS, 2006). O maior problema desta técnica é a demora para obtenção do resultado. 9

20 Isolamento em animais susceptíveis (in vivo) Este método apresenta pouco valor prático devido aos elevados custos com a manutenção dos animais e o tempo exigido para superar o período pré- patente e obter a positividade dos mesmos (SILVA, 2005). Trata-se da inoculação de material em hamsters (Mesocricetus spp.) e observação de desenvolvimento de lesões nos mesmo. Os resultados podem demorar de um 1 a 3 meses (MS, 2006) Métodos sorológicos Reação de fixação de complemento (RFC) O sistema complemento é formado por mais de 30 proteínas que podem ser encontradas, de uma forma inativa, solúveis no plasma ou ligadas à superfície de certos tipos celulares. Elas desempenham um papel importante e essencial no processo de defesa do organismo. A ativação deste sistema ocorre de maneira seqüencial onde uma primeira proteína participa da ativação de uma segunda proteína e esta, por sua vez, participa da ativação de uma terceira, e assim por diante. Essa ativação consiste em mudanças conformacionais e/ou fragmentações proteolíticas (MARTINS, 2008). A ativação do sistema complemento pode ser iniciada por três vias: via alternativa, via das lectinas e via clássica. Na ativação pelas vias alternativa e das lectinas não há participação de moléculas de anticorpo, enquanto que na via clássica, a ativação depende da presença de imunoglobulinas específicas da classe IgM e/ou IgG, que irão formar complexos imunes na presença do antígeno. Esses complexos imunes propiciam a fixação do primeiro componente do sistema complemento, denominado C1q. Esse fenômeno inicial dá origem a produtos com atividade enzimática, que atuam em cascata sobre os componentes subseqüentes do sistema complemento. Se o antígeno for particulado (células eucarióticas e procarióticas), geralmente a sua interação com anticorpos fixadores de complemento resulta na destruição da célula alvo, através da lise osmótica. A lise ocorre devido à formação na membrana celular do chamado Complexo de ataque à membrana (MAC) (MARTINS, 2008). A ligação antígeno-anticorpo promove a fixação do complemento, cujo consumo, in vitro, pode ser empregado para detectar a presença de anticorpos, antígenos ou ambos. O teste utiliza um sistema homogêneo (não é preciso a separação entre fases) e é realizado em duas etapas. Na primeira etapa, o antígeno é incubado, na fase fluida, na presença de uma quantidade definida de complemento. Se o antígeno e o anticorpo correspondentes estiverem presentes, a cascata do complemento será ativada pela via clássica e haverá consumo de complemento. Na segunda etapa, adiciona-se o sistema indicador da reação que consiste em hemácias de carneiro sensibilizadas com hemolisina (anticorpo antihemácias de carneiro obtido em coelhos). A medida da atividade hemolítica do complemento no sistema indicador permite determinar a presença ou não de antígeno ou anticorpo na mistura inicial e sua 10

21 quantidade. A atividade hemolítica remanescente pode ser quantificada empregando-se diluições seriadas da amostra a ser analisada. Tanto o anticorpo como o antígeno devem ser destituídos de ação anticomplementar, ou seja, não podem ativar o complemento separadamente. O complemento deve ser obtido de soro de cobaia e colhido e estocado de maneira apropriada para preservação da atividade hemolítica. Apresenta a vantagem de poder ser empregado para diferentes sistemas sem mudar os parâmetros do teste, porém é complexo e trabalhoso (FERREIRA e ÁVILA, 1996). A reação de fixação de complemento para o diagnóstico da Leishmaniose visceral canina está em desuso atualmente, foi bastante utilizada na década de 30, com alta sensibilidade e especificidade, mas apresentava reações cruzadas em títulos baixos com doenças como a Doença de Chagas e Leishmaniose tegumentar (DOURADO, 2007). Teste de Aglutinação Direta (TAD) A reação de aglutinação caracteriza-se pela formação de agregados visíveis como resultado da interação de anticorpos específicos e partículas insolúveis que contêm determinantes antigênicos em sua superfície (FERREIRA e ÁVILA, 1996). O Teste de Aglutinação Direta (TAD), na sua versão aperfeiçoada, tem sido empregado com sucesso no diagnóstico da leishmaniose visceral ou Calazar. Ele permite um diagnóstico extraordinariamente preciso, com elevada sensibilidade e sem reações cruzadas. É um método que dispensa a utilização de equipamentos sofisticados, é de baixo custo e seus procedimentos são simples de serem executados. Do ponto de vista técnico, uma das maiores vantagens que apresenta é a não utilização de um conjugado de imunoglobulina espécie-específico, podendo ser útil em casos de infecções naturais e experimentais de mamíferos. Além disso, o antígeno tem uma longa duração quando bem acondicionado (SILVA, 2003). Na reação de aglutinação são utilizados parasitos totais ou lisados, que são tratados com tripsina, e preservados em formalina durante a preparação do antígeno, para evitar auto-aglutinação. Nos anos 80, este teste foi modificado, sendo adicionado à preparação do antígeno o azul brilhante de Coomassie, o que possibilita a visualização de títulos superiores a 1: O título indicativo de leishmaniose visceral foi considerado superior a 1: Este teste apresenta sensibilidade de 100% e especificidade 99,3% (FERREIRA e ÁVILA, 2001). Segundo ALVES e BELIVACQUA (2004), este método pode ser utilizado como alternativa aos testes de Eliza e imunofluorescência indireta, pois em trabalhos comparativos com estes, o DAT demonstrou ser igualmente sensível e específico. Reação de imunofluorescência indireta (RIFI) O teste de imunofluorescência baseia-se na capacidade das moléculas de anticorpo se ligarem covalentemente a fluorocromos sem perder sua reatividade específica com o antígeno. A 11

22 imunofluorescência indireta pode ser empregada na pesquisa de antígeno ou de anticorpos. No caso do diagnóstico da leishmaniose visceral canina, é feita a pesquisa de anticorpos no soro dos animais. Antígenos padronizados são fixados a lâminas de vidro. O soro do paciente é diluído, colocado sobre o antígeno e incubado para permitir a formação do complexo antígeno-anticorpo. Após lavagens, a preparação é incubada com o conjugado fluorescente (anti-igg de cão produzida em outra espécie animal, marcada com substância fluorescente) e, se houver anticorpo no soro, o conjugado reage com o anticorpo específico para o antígeno. O preparado é então observado em microscópio de fluorescência (FERREIRA e ÁVILA, 1996). A RIFI é recomendada pelo Ministério da Saúde para avaliação de soroprevalência em inquéritos caninos amostrais e censitários, para confirmar os cães sororreagentes pelo teste de ELISA ou como método sorológico de rotina. O resultado considerado sororreagente é aquele que possui título igual ou superior ao ponto de corte que é a diluição de 1:40 (MS, 2006). Possui uma sensibilidade que varia entre 90 e 100% e especificidade aproximada de 80% para amostras de soro, podendo apresentar reações cruzadas com doenças causadas por outros tripassonomatídeos com a Doença de Chagas e Leishmaniose tegumentar (ALVES e BELIVACQUA, 2004). Estas reações inespecíficas ocorrem graças à grande complexidade antigênica dos tripanossomatídeos, que compartilham vários epitopos comuns (SILVA, 2005). Segundo ZANETTE (2006), a RIFI também pode apresentar reações cruzadas com toxoplasmose, mas não com a Ehrlichia canis, porém, em um estudo realizado por FERREIRA (2006) em Belo Horizonte, a RIFI apresentou reação cruzada com T. cruzi, L. braziliensis e E. canis. Portanto, conclui-se que ainda há discordância entre autores sobre a presença ou não de reação cruzada com a Ehrlichia canis. A ocorrência das reações cruzadas constitui um dos principais problemas da RIFI. Além disso, apresenta limitada capacidade de processamento de amostras, pois exige leitura em microscópio de fluorescência, não sendo passível de automação. É de leitura subjetiva, podendo ocorrer discordâncias de resultados entre observadores diferentes. Para reduzir o problema, os laboratórios de referência recomendam a leitura por dois observadores e, em caso de discordâncias, confirmação por um terceiro (SILVA, 2005). Ensaio imunoenzimático (ELISA) As técnicas imunoenzimáticas são baseadas na utilização de antígenos ou anticorpos marcados com enzimas e permitem a detecção, titulação e quantificação de substancias de interesse biológico. O ELISA foi desenvolvido como uma alternativa ao radioimunoensaio para a detecção de antígenos e anticorpos, apresenta vantagens de utilizar reagentes estáveis, estar livre das exigências de trabalhar com radioisótopos e poder ser adaptado tanto a testes simples como à automação sofisticada (FERREIRA e ÁVILA, 1996). 12

23 Este teste consiste na reação de anticorpos presentes nos soros com antígenos solúveis e purificados de Leishmania obtidos a partir de cultura in vitro. Esse antígeno é adsorvido em microplacas e os soros diluídos (controle do teste e das amostras) são adicionados posteriormente. A presença de anticorpos específicos no soro vão se fixar aos antígenos. A visualização da reação ocorre quando adicionada uma anti-imunoglobulina de cão marcada com a enzima peroxidase, que se ligará aos anticorpos específicos caso estejam presentes, gerando um produto colorido que poderá ser medido por espectrofotometria. O resultado considerado sororreagente é aquele que apresente o valor da densidade ótica igual ou superior a 3 desvio-padrões do ponto de corte (Cut-Off) do resultado do controle negativo (MS, 2006). O teste detecta quantidades extremamente pequenas de antígenos ou anticorpos, podendo ter elevada precisão se os reagentes e os parâmetros do ensaio forem bem padronizados Especial atenção deve ser dada a fase sólida, cujas propriedades podem variar de acordo com a composição. O grau de pureza do antígeno ou do anticorpo da fase sólida é muito importante, pois qualquer material heterólogo competirá pelo espaço na placa (FERREIRA e ÁVILA, 1996). ZANETTE (2006) encontrou sensibilidade de 94% e especificidade de 84,4% para o teste ELISA com antígeno total de L. chagasi (cepa MHOM/BR/74/PP75). Já MACHADO (2008) encontrou sensibilidade de 87,23% e especificidade de 99,5% utilizando o antígeno L. major. A sensibilidade e especificidade deste método dependem do tipo de antígeno empregado (espécie ou forma evolutiva do parasita) e de mudanças no protocolo experimental padrão (tempo de incubação ou tipo de microplacas utilizadas). As técnicas que utilizam antígenos totais são limitadas em termos de especificidade, apresentando reações cruzadas não somente com outras espécies da família Trypanosomatidae, mas também com organismos filogeneticamente distantes. Com o objetivo de tentar elevar a sensibilidade e a especificidade das provas sorológicas, têm sido utilizados antígenos purificados como as glicoproteínas de membrana gp63, gp72, gp70 específicas do gênero Leishmania, entretanto, ainda assim podem ocorrer reações cruzadas com outros tripanosomatídeos. Alguns antígenos recombinantes, como o rk39, o rk9 e o rk26, foram geneticamente desenvolvidos e parecem conferir grande sensibilidade quando da realização da sorologia (ZANETTE, 2006). Dentre os antígenos recombinantes desenvolvidos, o mais utilizado é o rk39, que contém uma unidade repetitiva de 39 aminoácidos de formas amastigotas de L. chagasi. O antígeno FML (Ligante Fucose-Manose) foi utilizado no teste de ELISA para o diagnóstico de LVC por Borja-Cabrera et al. (1999). Estes autores encontraram valores de sensibilidade e especificidade iguais a 100%. Entretanto, estes índices foram calculados a partir de apenas 38 cães com confirmação parasitológica da infecção (SILVA, 2008). O ELISA apresenta vantagens, é de fácil automação, com leitura espectrofotométrica proporcionando objetividade na leitura, rápida execução, baixo custo e simplicidade técnica, tornando possível a realização de um elevado número de amostras em um mesmo ensaio. Além disso, para o diagnóstico da LVC por esta reação, amostras de SDPF (sangue dessecado em papel de filtro) podem 13

24 ser ensaiadas em substituição ao uso tradicional de soro, havendo boa correlação com os resultados obtidos com este último. Estas características fazem do ELISA o método de escolha para o diagnóstico da LV em larga escala. Esta técnica vem sendo amplamente utilizada em inquéritos caninos podendo apresentar elevada sensibilidade e especificidade. No entanto, como dito anteriormente, o desempenho da reação pode variar de acordo com modificações técnicas, principalmente em relação ao antígeno empregado (SILVA, 2005), e são descritas reações cruzadas em literatura com Doença de Chagas, Leishmaniose tegumentar e erliquiose (FERREIRA, 2006; ZANETTE, 2006). O FAST-ELISA nasceu da necessidade de testes rápidos e de fácil utilização em situações de campo. Utiliza conjugados de proteína A, com execução da técnica em aproximadamente 30 minutos, permitindo que as leituras sejam realizadas a olho nu. Estes autores encontraram valores de sensibilidade e especificidade comparáveis com a ELISA convencional. A técnica de ELISA comporta inesgotáveis possibilidades de variação (SILVA, 2005). Testes imunocromatográficos Além das provas sorológicas de rotina existem testes comerciais de imunocromatografia utilizados tanto em humanos quanto em animais. Geralmente são fitas impregnadas de antígeno (rk39), onde se adiciona o soro teste. Durante o teste a amostra de soro reage com o conjugado, em geral, proteína A conjugada a ouro coloidal, e a mistura então ascende através da membrana por capilaridade, reagindo com o antígeno e produzindo uma banda colorida (ZANETTE, 2006). Conhecido como TRALd Teste Rápido Anti-Leishmania donovani, este teste tem se mostrado adequado para utilização em condições de campo, dada sua simplicidade técnica, possibilitando sua utilização a um custo considerado baixo (SILVA, 2005). Ele é realizado em papéis, o que possibilita sua utilização em áreas endêmicas, pois dispensa etapas críticas de incubação e leitura ótica, dispensando equipamentos e treinamento específico para realizar o teste ou interpretar os resultados. Além disso, ao contrário de outros métodos de diagnóstico, que geralmente levam horas, a imunocromatografia gera um resultado em aproximadamente 10 minutos, possibilitando uma intervenção clínica imediata (FERREIRA e ÁVILA, 2001). Entretanto, este teste não é capaz de detectar anticorpos em todo o espectro da doença, possuindo baixa sensibilidade para detectar indivíduos com infecção assintomática por Leishmania chagasi (SILVA, 2005). A sensibilidade e a especificidade destes testes, utilizando o antígeno recombinante rk39 para o diagnóstico da leishmaniose visceral humana variam, de acordo com a literatura, de 90 a 100% e de 93 a 100%, respectivamente. Já na avaliação do teste de imunocromatografia para detecção de leishmaniose visceral canina, enquanto alguns autores descreveram valores de sensibilidade entre 84 e 92,1% e de especificidade entre 99 e 100% outros observaram uma sensibilidade de 100% e especificidade de 75%. 14

25 Apesar dos relatos de que os testes de imunocromatografia podem levar a uma grande proporção de diagnósticos falso positivos, existem discordâncias quanto à ocorrência de reação cruzada do antígeno rk39 com Leishmaniose tegumentar e Doença de Chagas (ZANETTE, 2006). Segundo SILVA (2005), em soros humanos, ocorrem reações cruzadas com malária, leishmaniose tegumentar e Doença de Chagas. Num estudo realizado por ZANETTE (2006), em soro de cães, a imunocromatografia não apresentou reação cruzada com Doença de Chagas, porém, a apresentou com erliquiose, toxoplasmose e neosporose. 2.5 Métodos moleculares Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) A reação em cadeia da polimerase (PCR) permite a amplificação seletiva de seqüências do DNA do parasito, o que conseqüentemente viabiliza um instrumento diagnóstico espécie-específico para doenças infecciosas (FERREIRA e ÁVILA, 2001). A amplificação ocorre com o uso de uma enzima termoestável chamada Taq DNA polimerase, isolada da bactéria termofílica Thermus aquaticus. Com essa enzima a sequência alvo do DNA pode ser amplificada em até um milhão de vezes após sucessivos ciclos, sendo que estes consistem em três passos. No primeiro passo, à temperatura de 94ºC, o DNA é desnaturado, produzindo duas fitas simples de DNA. No segundo passo, ocorre o anelamento, onde os oligonucleotídeos iniciadores (primers) se ligam às sequências complementares do DNA alvo.a temperatura de anelamento, depende do comprimento e do conteúdo dos oligonucleotídeos utilizados. No terceiro passo, à 72ºC, ocorre a extensão das novas fitas formadas, onde a enzima adiciona às novas fitas os desoxinucletídeos trifosfatos presentes na solução. Antes de iniciar a reação, é necessário obter o DNA do parasita, o que é realizado através do método de extração, que pode ser conduzido através de substâncias químicas ou simples fervura. A extração é muito importante e às vezes influencia muito na obtenção dos resultados, por isso é importante remover os inibidores da PCR, como por exemplo, a heparina, utilizada na coleta de sangue, e a hemoglobina (PILATTI, 2009). A PCR pode ser feita com o DNA extraído da medula óssea, biopsias cutâneas, aspirados de linfonodos, baço, sangue (mesmo coletado em papel de filtro), cortes histológicos de tecidos parafinados, células de meio de cultura, camada leucocitária e mais recentemente, esfregaço de conjuntiva (GRENEE, 2006; PILATTI, 2009). Além da possibilidade de usar várias amostras clínicas, apresenta também como vantagem a habilidade de trabalhar com pequenas quantidades de material a ser analisado e ser capaz de detectar níveis baixos de parasitas na amostra (PILATTI, 2009). Devido à alta sensibilidade e especificidade da técnica, próximas a 100%, ela constitui-se em uma nova perspectiva para o diagnóstico da leishmaniose visceral (ZANETTE, 2006). Entretanto, apesar de se mostrar potencialmente sensível e específica, apresenta limitações como custo elevado, 15

26 laboratórios com equipamentos sofisticados e a inadequação para utilização à campo, o que limita o seu emprego (SILVA, 2005). A sensibilidade e especificidade da PCR esta altamente relacionada ao conjunto de iniciadores utilizados, ao número de cópias do alvo a ser amplificado, ao método de extração de DNA, ao tipo de material a ser analisado e ao protocolo utilizado (PILATTI, 2009). Devido à existência de tantas variáveis, a comparação de resultados encontrados entre diferentes autores é prejudicada, pela falta de padronização metodológica entre eles (SILVA, 2005). Os alvos normalmente são constituídos por sequências repetitivas e/ou polimórficas. Atualmente são usados como alvo de amplificação do genoma de Leishmania minicírculos do DNA do cinetoplasto (kdna), com aproximadamente cópias por célula, os miniexons dos genes de RNA (com 100 a 200 cópias por célula), as sequências dos genes da pequena subunidade ribossomal (com aproximadamente 160 cópias por célula), a β-tubulina, o lócus gp63, o lócus hsp70, as sequências dos genes das cisteino proteinases e a ITS1(com 40 a 200 cópias por célula). Dentre eles, o kdna tem sido considerado um dos melhores alvos para a PCR, sendo que podem ser amplificados os minicírculos completos ou somente suas regiões conservadas (PILATTI, 2009). 3. Conclusão O diagnóstico da leishmaniose visceral canina ainda representa um desafio, principalmente na ausência de sinais clínicos consistentes e devido aos achados laboratoriais serem inespecíficos. A bibliografia confirma que ainda não existe uma técnica diagnóstica com 100% de sensibilidade e especificidade. As provas sorológicas mais utilizadas no diagnóstico têm apresentado reações cruzadas com outras doenças, podendo implicar na eutanásia de um animal com outra doença passível de tratamento. Por outro lado, podem falhar em detectar cães infectados no período pré-patente e antes da soroconversão ou cães que nunca farão soroconversão e cães soropositivos que se convertem em soronegativos, mas ainda permanecem infectados e representam risco para o controle da leishmaniose visceral, por permanecerem como fontes de infecção. Vale a pena lembrar que cães com menos de três meses de idade não devem ser avaliados através de métodos sorológicos pois podem apresentar resultados positivos pela presença de anticorpos maternos. Por este motivo, devem ser utilizados, sempre que possível, concomitantemente ao exame sorológico, outro método diagnóstico, como o parasitológico, que é sem dúvida, 100% específico, ou a PCR que é mais sensível e específico que o ELISA e a RIFI. Outra possibilidade para nortear o clínico na escolha de um melhor método diagnóstico, é conhecer as doenças endêmicas na área e escolher um teste que ofereça menor risco de reações cruzadas. Para inquéritos epidemiológicos, onde a PCR e os métodos parasitológicos são impraticáveis, a sorologia por RIFI e ELISA ainda é a melhor escolha, pois ambos os métodos possuem sensibilidade e 16

27 especificidade relativamente elevadas, são de baixo custo e permitem avaliação de grande número de amostras em curto tempo, desde que haja cautela na interpretação dos resultados. 17

28 Referências Bibliográficas ALVES, W. A.; BEVILACQUA, P. D. Quality of diagnosis of canine visceral leishmaniasis in epidemiological surveys:na epidemic in Belo Horizonte, Minas Gerais, Brazil, Caderno Saúde Pública, Rio de Janeiro, v. 20, p , jan./fev ASSIS, T. S. M.; BRAGA, A. S. C.; PEDRAS, M. J. et al. Validação do teste imunocromatográfico rápido IT-LEISH para o diagnóstico da leishmaniose visceral humana. Epidemiol. Serv. Saúde, Brasília, 17(2): abr./jun BADARÓ R. Desenvolvimento e utilização de um antígeno recombinante específico de Leishmania chagasi (rk39) no diagnóstico sorológico da Leishmaniose Visceral. São Paulo. Tese de Doutorado, Universidade Federal de São Paulo, São Paulo, SP, BRUM, L. C.; CONCEIÇÃO, L. G.; RIBEIRO, V. M.; HADDAD, VIDAL. Principais dermatoses zoonóticas de cães e gatos. Clínica Veterinária,Ano XII, n.69, Julho/Agosto, 2007, pg DEVENS, B. A. Leishmaniose: histórico, etiologia, epidemiologia, sinais clínicos, diagnóstico e controle. PUBVET,Londrina,V.2,N.13, Mar 5, Disponível em: < Acesso em: 18/05/2009. DOURADO, Z. F., SILVA, H. D., LACERDA, E. P. S., ZAPATA, M. T. A. G. Panorama histórico do diagnóstico laboratorial da leishmaniose visceral até o surgimento dos testes imunocromatográficos (rk39). Revista de patologia Tropical, Vol.36 (3), Set-Dez/2007, p. 205 FERREIRA, A. Watter; ÁVILA, Sandra L. M. Diagnóstico Laboratorial. 1996, editora Guanabara Koogan, Rio de Janeiro - RJ. FERREIRA, A. W.; ÁVILA, S. L. M. Diagnóstico laboratorial das principais doenças infecciosas e auto-imunes. Rio Janeiro, 2º ed. Editora Guanabara Koogan, p FERREIRA, E. C. Comparação de técnicas sorológicas para a identificação da Leishmaniose Visceral canina (LVC) visando a otimização do diagnóstico em inquéritos epidemiológicos. Disponível em: Acesso em: 02/06/09. FULGÊNCIO, G.O; BORGES, K. D. A; VIANA, F.A.B. Oftalmopatias associadas a Leishmaniose Visceral canina revisão de literatura. Revista do Conselho Federal de Medicina Veterinária, ano 14/2008 Nº45 Setembro/Outubro/Novembro/Dezembro, p

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