Biotecnologia da Reprodução. Inseminação artificial. Transferência de embriões. Produção de animais transgênicos. Clonagem Cultura de células-tronco

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1 23/07/12 Produção e Manipulação de Pré-embriões Inseminação artificial Fertilização in vitro Biotecnologia da Reprodução Produção de animais transgênicos Biopsia de embrião Determinação genética pré-implante ICSI Vitrificação de Oócitos e ovários Marcel Frajblat Pesquisa Básica Reprodução Humana Biologia da Conservação Biotecnologia da reprodução Infertilidade humana ü Infertilidade ü Baixo número de espermatozóides ü Inseminação artificial ü Fertilização in vitro, ICSI ü PGD - diagnostico genético pré-implante ü Eclosão assistida. ü Punção de epidídimo e testículo ü Criopreservação ü Sêmen ü Oócito ü Tecido ovariano Clonagem Cultura de células-tronco Cultura de espermatogônias Sexagem de Banco genético de espermatozóides em espécies em embriões Cultura de folículos extinção Controle hormonal pré-antrais da reprodução Universidade Federal do Rio de Janeiro Produção Animal ü Oócitos ü Fertilização ü Pró-núcleos ü Singamia ü Zigoto ü Clivagens ü Mórula ü Blastocisto ü Eclosão ü Implantação Criopreservação de gametas Transferência de embriões Produção animal Biologia da Conservação ü Inseminação artificial ü Transferência de embriões. ü Produção in vitro de embriões. ü Utilização de animais inférteis. ü Utilização de maior variedade de machos. ü Sincronização do Cio. ü Detecção da ovulação. ü Criopreservação de sêmen e embriões. ü Clonagem ü Criopreservação ü Sêmen ü Testículo ü Oócito ü Tecido ovariano ü Embriões ü Inseminação. ü Fertilização in vitro. ü Clonagem Desenvolvimento Embrionário Pesquisa cientifica Pesquisa básica ü Ferramenta/modelo de pesquisa ü Embriologia, angiogênese, implantação, placentação, toxicologia, farmacologia, biologia celular, fisiologia, metabolismo celular, mutação cromossômica entre outras. Pesquisa Aplicada ü Aumento das taxas de fertilização. ü Meios de cultura específicos. ü Fatores que afetam os gametas Fertilização Clivagem Compactação da mórula Cavitação Expansão do blastocisto Eclosão do blastocisto ü Produção de animais geneticamente modificados. 1

2 Fisiologia Reprodutiva Camundongo Mus musculus Excelente estratégia reprodutiva Ciclo extremamente inteligente Dados Reprodutivos Puberdade macho dias Puberdade fêmea dias Período de cruzamento Todo o ano Gestação dias # filhotes 4 12 filhotes Peso ao nascer 1,0-1,5 gm Desmama 21 dias Ciclo estral 4-5 dias Ovulação Período escuro Ovulação pós nascimento hr após nascimento Ciclo estral com e sem cruzamento Ov Ov Ov Ov Ov Ov 4-5 dias 4-5 dias 4-5 dias 4-5 dias 4-5 dias Ov Ov Pseudoprenhes Ov 4-5 dias dias Cruzamento com vasectomizado Prenhes Ov Ov Ov 4-5 dias 21 dias Cruzamento com macho fértil Citologia do Ciclo Estral Citologia Vaginal Esfregaço vaginal Lavado vaginal Estimulação Hormonal Superovulação Ø Proestro Ø Estro Ø Metaestro Ø Diestro Superovulação ü O camundongo é um dos animais que melhor responde a superovulação. ü Utilização de hormônios para induzir o crescimento e ovulação de um maior número de folículos ovarianos. Hormônios mais utilizados Estímulo do crescimento folicular: ü Gonadotrofina coriônica eqüina (ecg) ou gonadotropina de égua prenhe (PMSG). ü Novormon (Syntex Tecnopec) ü Folligon (Intervet) FSH Estímulo do pico de LH e ovulação: ü Gonadotrofina coriônica humana (hcg). ü Vetecor (Callier) Protocolo de superovulação v 2,5 10 UI de ecg v 2,5 10 UI de hcg horas após ecg. v Colocar fêmeas em contato com machos durante a noite. v Verificar presença de tampão vaginal na manhã seguinte. Indicativo de cópula (dia 0,5). 2

3 ecg horas Coleta de Embriões Tuba uterina hcg Macho Dia 0,5 Dia 1,0 Dia 1,5 Dia 2,0 Dia 2,5 Dia 3,0 Oócitos Zigotos Duas células (bloqueio) 2-4 células 6-8 células Até 10 células q Coleta de oócitos, zigotos e estágios iniciais de clivagem q Dias 0,5 3,0 q Requer treinamento para encontrar infundíbulo. Microgotas de Meio de cultura cobertas com óleo mineral e mantidos em incubadora de CO2 a 37 C. Dia 3,5 Mórula Dia 4,0 Blastocisto Almeida et al., 2001 Fatores que podem afetar a superovulação o Linhagem. o Horário (42 48 horas. Começar a tarde). o Idade das fêmeas (3-4 semanas). o Idade dos machos (diminui com idade). o Freqüência de cruzamento (2 dias de descanso). o Número de fêmeas (1-2 por macho). o Dosagem (2,5; 3,5; 5; 7,5; 10 UI). o Desconhecidos. Produção de Animais Geneticamente Modificados Futuro do uso de animais de laboratório Produção de Animais Transgênicos e Geneticamente Modificados Métodos ü Cooperação de dois grupos de pesquisa. Biotecnologia da Reprodução ü Produção e micromanipulação de embriões. Biologia molecular ü Construção de transgênes ü Modificações de sítios específicos do genoma de células. Produção de Animais Transgênicos e Geneticamente Modificados técnicas v Injeção de transgêne no pronúcleo. v Lentivírus v Injeção de células-tronco geneticamente modificadas em blastocistos. v Agregação de CTEs à mórulas. Injeção de transgênes em pronúcleo ü Prónucleo masculino. ü Prónucleo feminino. ü Singamia. ü Fusão dos pronúcleos origina núcleo diplóide. ü Momento propício para incorporação de DNA exógeno. Injeção pronuclear Promotor da lactose caprina Fator da coagulação humana Glândula mamária caprina ü Promotor da lactose é ativado ü Induz produção do fator Leite caprino contendo o fator da coagulação humana 3

4 Camundongo - 25 mil genes Duplos e triplos knockout 2-4 fundos genéticos 50 mil linhagens Injeção de Células-Tronco em Blastocistos ü Células-tronco pluripotentes. ü Cultivo em laboratório. ü Mutação de um gene específico. ü Transferência para um outro blastocisto. Injeção de Células-Tronco em Blastocistos células-tronco embrionárias Recombinação homóloga Células-tronco knockout Mutação dirigida Transferência para receptora Injeção em blastocisto Ampicilina Células-tronco após a Recombinação homóloga. Parte delas foi geneticamente modificada. Como selecionar? Células-tronco após a seleção. Somente células geneticamente modificadas Células-tronco geneticamente modificadas Células-tronco Naturais do blastocisto Formação de quimeras Embriões com duas populações de célulastronco embrionárias!! Células-tronco do embrião receptor Células-tronco geneticamente modificadas (knockout) Testículos e ovários formados por células Geneticamente modificadas Blastocisto Filhotes geneticamente modificados Camundongos chimeras Criopreservação de espermatozóides e fertilização in vitro na preservação de linhagens de animais de laboratório Transferência nuclear/clonagem ü Célula embrionária. ü Célula somática adulta. Dolly

5 ü Ovócitos maduros ü Enucleação ü Visualização do núcleo através de coloração. ü Cultura de células somáticas (2n). ü Transferência da célula (inteira) somática ü Fusão celular ü Ativação para iniciar o desenvolvimento embrionário. Reprodução Humana Assistida Crescimento e dominância folicular Infertilidade Causas de Infertilidade Fatores femininos: problema ovulatório; fator tubo-peritoneal; endometriose; problema uterino; deficiência fase lútea; problema do muco 30% Fatores masculinos: ausência total ou parcial de espermatozóides; alteração na motilidade, forma; anticorpos antiespermáticos; varicocele 30% Idiopático 10% Fatores feminino e masculino 30% Ovulação 25 mm F3 F3 F3 Crescimento folicular Independente do LH e FSH Reg Reg Reg 3 mm F3 F3 F3 F3 F3 F3 F3 F2 Reg F2 Reg F2 Reg F2 Reg F2 Reg F2 Reg F2 Reg F1 Reg F1 Reg F1 Reg F1 Reg F1 Reg F1 Reg F1 Reg Fp Reg Fp Reg Fp Reg Fp Fp Reg Reg Fp Reg Fp Reg Aspiração Folicular de oócitos 2 s Aumento do # de oócitos Estratégia na fertilização in vitro Estimulação Hormonal Crescimento folicular e aspiração Fetal Pré-púbere Pós-púbere Crescimento folicular Dependente do LH e FSH Antagonista do GnRH Controle total do desenvolvimento pelo clínico FSH LH Ovulação 38h após Fertilização in vitro Cultivo embrionário Seleção e transferência de embriões 5

6 ICSI (Injeção intracitoplasmatica de espermatozóide) ü Baixa produção de espermatozoides. ü Defeitos na morfologia ü Altas taxas de fertilização mesmo em homens com sêmen normal. Técnica Auxiliar de escolha de espermatozóide Super ICSI Qual método é mais natural? Qual deve ser mais utilizado? Qual é o mais utilizado? FIV ou ICSI? Testes cromossomiais e genéticos PGD Uma doença cromossomial PGS Um srceening cromossomial PCR Doenças gênicas CGH Analisa todos cromossomos, adiçao, deleçao, microdeleçao, algumas translocações Diagnóstico genético Pré-implante - PGD FISH CGH PCR Biópsia de embrião Identificação de genes Aneuploidias Determinação do sexo. Qual o melhor embrião? v Necessidade de uma avaliação quantitativa. v Metabolismo? Critérios de Seleção Embrionária " Grau de compactação " Grau e tipo de fragmentação " Simetria de Blastômeros " Multinucleação " Espessura da Zona Pelúcida Metabolismo Embrionário Ø Compactação e cavitação consumo de glicose Ø Primeiras clivagens consumo de piruvato e lactato Transferência dia 3 ou dia 5? Duas escolas. Onde o embrião prefere/deve ficar? Menor tempo possível na placa/incubadora. Maior tempo possível na incubadora para permitir seleção. Meio único até o dia 5 ou troca de meio? Qual o melhor meio para o meu embrião? Melhor seleção permite a transferência de um único embrião. 6

7 Nutrição e qualidade embrionária 41% 73% Nolan et al., Therio, 1998 A potencial use of embryonic stem cell medium for the in vitro culture of preimplantation embryos Áreas com potencial para pesquisa Humana Ø Métodos de avaliação de embriões. Ø Efeitos ambientais e nutricionais na qualidade de gametas e embriões. Ø Meios de cultivo embrionário individualizados. Kakar et al., 2005 Animal Ø Maior eficiência nas técnicas de transgênia. Ø Maior eficiência e rapidez no processo de produção de animais knockout. 7

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