Protocolos de sincronização de cio em bovinos

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1 Mestrado Integrado em Medicina Veterinária Ciências Veterinárias Protocolos de sincronização de cio em bovinos Avaliação da resposta a um esquema Ovsynch modificado em vacas de leite Lúcia Susana da Costa Marciel Orientador: Professora Doutora Rita Payan Carreira Co-orientador: Dr. José Pedro Azevedo UNIVERSIDADE DE TRÁS-OS-MONTES E ALTO DOURO VILA REAL, 2010

2 Mestrado Integrado em Medicina Veterinária Ciências Veterinárias Protocolos de sincronização de cio em bovinos Avaliação da resposta a um esquema Ovsynch modificado em vacas de leite Lúcia Susana da Costa Marciel Orientador: Professora Doutora Rita Payan Carreira Co-orientador: Dr. José Pedro Azevedo UNIVERSIDADE DE TRÁS-OS-MONTES E ALTO DOURO VILA REAL, 2010

3 Não é o desafio que define quem somos nem o que somos capazes de fazer. O que nos define é o modo como enfrentamos esse desafio. Richard Bach ii

4 Agradecimentos Ao terminar este trabalho desejo agradecer a todas as pessoas que directa ou indirectamente contribuíram para a sua realização, em especial: À Professora Doutora Rita Payan Carreira por ter aceite ser minha orientadora e pelos ensinamentos, conselhos e criticas ao longo do trabalho. Ao Dr. José Pedro Azevedo por ter orientado o meu estágio e por tudo o que me ensinou e pelo apoio que demonstrou ao longo de todo este percurso. Ao professor Doutor Jorge Colaço pela disponibilidade e ajuda que me prestou no decorrer deste trabalho. À Intervet Shering na pessoa do Director da área dos bovinos, Dr. Tiago Teixeira pela cedência da hormona hcg que permitiu a realização deste trabalho e pela sua disponibilidade e conselhos prestados. Aos produtores, Sr. Manuel Balazeiro e D. Almerinda por terem permitido a realização deste estudo nas suas explorações e por toda a disponibilidade e amabilidade com que me trataram. A todos os meus amigos que me apoiaram e estiveram presentes durante estes anos, em especial à Amélia, à Ana, ao Diogo e ao Frostes. Aos meus sobrinhos simplesmente por existirem e me fazerem sorrir e viver a vida com mais alegria. À minha irmã por ser o meu ombro amigo. À minha mãe por seu o meu pilar, por me incentivar e fazer-me acreditar. Ao meu pai, por tudo aquilo que foi e continua a ser para mim, apesar de já não se encontrar entre nós; continua a dar-me força e motivação para não desistir dos meus sonhos. iii

5 Resumo Resumo O maneio reprodutivo é essencial para optimizar a performance reprodutiva nos actuais sistemas de produção, e a fraca detecção de cio é um dos principais factores limitantes do sucesso das metas reprodutivas propostas para a maioria das explorações leiteiras. Com vista a melhorar a taxa de concepção das explorações, têm-se procurado optimizar vários protocolos de sincronização de estro e/ou de ovulação, que geralmente apresentam pequenas diferenças consoante são aplicados a bovinos de leite ou de carne. Os mais frequentemente utilizados são os protocolos que utilizam as prostaglandinas, associadas ou não a agonistas de GnRH. Existem protocolos de sincronização da ovulação desenhados para permitir a inseminação sem detecção do cio, já que esta última é um dos principais factores de insucesso da IA nas explorações de leite. Estes protocolos controlam o desenvolvimento da onda folicular e a ovulação, permitindo a inseminação das fêmeas num momento fixo e pré-determinado, procurando facilitar o maneio, conseguir um aumento da taxa de submissão até determinado período pós-parto sem baixar a taxa média de gestação da exploração e diminuir o número de vacas a serem refugadas por ineficiência reprodutiva. Neste trabalho procurou-se avaliar o resultado da introdução de um protocolo modificado de sincronização da ovulação em duas explorações através do estudo das taxas de gestação da exploração, estabelecendo-se a comparação entre este tratamento (OvSynch modificado), o protocolo OvSynch tradicional e um grupo controlo de fêmeas. Em concreto, o protocolo modificado consistiu na administração de PGF 2α ao dia 8 após a primeira administração de GnRH, e diferiu do OvSynch tradicional no facto de a segunda dose do análogo da GnRH (5 ml de Receptal ) ter sido substituída por hcg (1500 UI de Chorulon ). Em ambas as explorações estudadas, os animais tratados de acordo com o protocolo modificado apresentaram taxas de gestação inferiores tanto às dos grupos controlo como à do grupo tratado com OvSynch tradicional, sendo estas diferenças mais pronunciadas na exploração B. Nesta exploração em particular, o grupo tratado com OvSynch tradicional apresentou uma taxa de gestação superior quer ao grupo controlo quer ao tratado com o protocolo OvSynch modificado (77,78%, 69,77% e 20%, respectivamente). Na exploração A, as principais diferenças foram encontradas entre o grupo tratado com o protocolo modificado e os restantes grupos (25%, 50% e 62,96%, respectivamente para os protocolos OvSynch modificado e tradicional e para o grupo controlo), que não diferiam estatisticamente entre si. No trabalho agora apresentado não foram encontrados dados favoráveis à utilização do hcg no esquema utilizado do protocolo OvSynch modificado. iv

6 Abstract Abstract In order to improve farm conception rate, many efforts have been made to improve different oestrus and/or ovulation synchronisation protocols that have some small differences when applied to dairy or beef cattle. The most frequently used in practice are those including prostaglandins associated or not to GnRH agonists. There are protocols for ovulation synchronisation that allow farmers to inseminate without heat detection, since this issue is one of the major factors for unsuccessful AI in dairy farms. By controlling the follicular wave and ovulation these protocols allow cow insemination in a fixed and pre-determined moment, turning easier the farm management, raising the submission rate up to a certain period after birth, without decreasing the farm pregnancy rate and reducing the number of cows culled due to reproductive inefficiency. This study aimed to evaluate the response to a modified ovulation synchronization protocol in two dairy farms, through the study of the pregnancy rates of the farms, establishing a comparison between this treatment (modified OvSynch), the traditional OvSynch protocol and a control group within each farm. Specifically, the new protocol consisted on the administration of PGF 2α at day 8, after the first GnRH dosis and on the replacement of the second dose of GnRH analogue (5 ml Receptal ) by hcg (1500 IU Chorulon ). In both farms, animals treated according to the modified protocol showed lower pregnancy rates than the two other groups. These differences were more pronounced at farm B, where higher pregnancy rates were observed for the traditional OvSynch group in comparison to controls and the modified Ovsynch group (77.78%, 69.77% and 20% respectively). In farm A, the main differences were found between the group treated with the modified protocol and the other groups (25%, 50% and 62.96% respectively for the modified and the traditional Ovsynch protocol and for the control group). Our study fail to demonstrate any advantage in replacing the second GnRH agonist administration by hcg. v

7 Índice Geral Índice Geral Resumo... iv Abstract... v Índice de Figuras... viii Índice de Tabelas... viii Lista de Siglas/Acrónimos, Abreviaturas e Sinais/Símbolos... ix I. Introdução Fisiologia reprodutiva das vacas Dinâmica folicular Luteogénese e luteólise Maneio reprodutivo na exploração: a detecção de cio Momento da inseminação Factores que contribuem para a diminuição da taxa de concepção Métodos de controlo do estro e/ou ovulação Protocolos de sincronização do estro Indução do estro com prostaglandinas Controlo da onda folicular e indução do estro com PGF 2α (Selectsynch) Sincronização da ovulação com progesterona e prostaglandinas Protocolos de sincronização da ovulação Protocolo Ovsynch Modificações ao protocolo Ovsynch Pré sincronização antes da IATF (Presynch) Co-sincronização (Cosynch) Protocolo Ovsynch de 56 horas Protocolo Ovsynch associado à progesterona Protocolo Heatsynch Protocolo hcg-synch vi

8 Índice Geral II. Avaliação da resposta a um esquema Ovsynch modificado em vacas de leite na região de entre o Douro e Minho de Portugal Introdução Material e métodos Caracterização das explorações Tratamentos Animais Registo de dados e análise estatística Resultados Discussão e conclusão Referências Bibliográficas vii

9 Índice de Figuras e Quadros Índice de Figuras Figura 1. Representação esquemática do ciclo éstrico da vaca, para uma duração média de ciclo de 21 dias Figura 2. Aumento e declínio das hormonas reprodutivas durante o ciclo éstrico Figura 3. Protocolos baseados no uso de PGF 2α para sincronização do estro em bovinos Figura 4. Representação esquemática do protocolo Selectsynch Figura 5. Representação esquemática de um protocolo de sincronização à base de progesterona Figura 6. Representação esquemática do protocolo Ovsynch Figura 7. Representação esquemática do protocolo Ovsynch modificado com inclusão de um esquema de pré-sincronização Figura 8. Representação esquemática do protocolo Cosynch Figura 9. Representação esquemática do protocolo Ovsynch de 56 horas Figura 10. Representação esquemática do protocolo Ovsynch associado à progesterona Figura 11. Representação esquemática do protocolo hcg-synch Figura 12. Esquema do protocolo Ovsynch implementado nas duas explorações Figura 13. Esquema do protocolo Ovsynch modificado utilizado Figura 14. Representação gráfica da taxa de gestação do grupo controlo, grupo 1 e grupo 2 da exploração A e B Índice de Quadros Quadro1. Sinais primários e secundários de cio Quadro 2. Caracterização geral das explorações A e B no que respeita à produção média de leite aos 305 dias no ano 2009, e alguns dos parâmetros reprodutivos utilizados na sua selecção Quadro 3. Caracterização geral dos grupos controlo, 1 e 2 da exploração A e B quanto à idade, produção de leite e número de partos Quadro 4. Parâmetros reprodutivos relativos ao parto anterior à introdução no estudo para o grupo controlo, e para os grupos 1 e 2 para ambas as explorações Quadro 5. Número de IA antes de implementados os protocolos Ovsynch e Ovsynch modificado Quadro 6. Parâmetros reprodutivos relativos aos grupos controlo, e grupos 1 e 2 para cada uma das explorações Quadro 7. Taxas de gestação relativas à exploração e aos grupos controlo, 1 e 2 para as explorações A e B Quadro 8. Percentagens para o global dos diagnósticos de gestação, incluindo diagnósticos de gestação por exame ginecológico ou através do retorno ao cio, das explorações A e B viii

10 Lista de Siglas/Acrónimos, Abreviaturas e Sinais/Símbolos Listas de Siglas/Acrónimos, Abreviaturas e Sinais/ Símbolos a Ano AM/PM - Manhã/tarde ANOVA - Análise de variância BEN - Balanço energético negativo BRSV - Vírus sincicial respiratório bovino BVD - Vírus da diarreia bovina CIDR - Controlled intravaginal drug release CL - Corpo lúteo d-dia dpp - Dias pós parto EB - Benzoato de estradiol ECP - Cipionato de estradiol FSH - Hormona folículo-estimulante g - Grama GnRH - Hormona libertadora de gonadotropina h - Hora hcg - Gonadotropina coriónica humana IA - Inseminação artificial IA/C - Número de inseminações por concepção IATF - Inseminação artificial a tempo fixo IBR - Rinotraqueíte infecciosa bovina IGF-I - Insulin-like growth factor I IM - Intramuscular IEP - Intervalo entre partos kg - Quilograma kg/305d - Produção de leite em quilos aos 305 dias LH - Hormona luteinizante m - Mês m 2 - Metro quadrado Máx - Máximo Mín - Mínimo ml - Mililitro n - Amostra (nº animais) Nº - Número ix

11 Lista de Siglas/Acrónimos, Abreviaturas e Sinais/Símbolos NºIA/fecundação - Número de inseminações artificiais por fecundação OT - Oxitocina p - Valor de p PGE 2 - Prostaglandina E 2 PGF 2α - Prostaglandina F 2α P-IAF - Intervalo entre o parto e a inseminação artificial fecundante PRID - Progesterone release intravaginal device PVE - Período voluntário de espera P-1ªIA - Intervalo entre o parto e a primeira inseminação artificial UI - Unidade internacional vs - Versus χ 2 - Qui-quadrado μg - Micrograma - Marca registada % - Percentagem 1ª - Primeira 2ª - Segunda < - Menor > - Maior = - Igual x

12 Introdução I. Introdução Nos últimos anos tem-se vindo a observar o decréscimo progressivo dos índices reprodutivos em explorações intensivas de bovinos de leite, em particular da taxa de concepção, que se reflecte num acréscimo do intervalo entre partos (Lucy et al., 2004). Esta redução nos índices reprodutivos da exploração decorre de uma espiral de efeitos que engloba não apenas factores biológicos próprios ao animal, de que são exemplos o balanço energético negativo, o nível nutricional, o arrastar do processo de involução uterina e a quantidade de leite produzido, mas ainda factores ambientais (conforto e bem-estar na exploração) e humanos, como sejam o maneio nutricional e a detecção de cios (Bello e Pursley, 2006). Na tentativa de dar resposta às preocupações conjuntas dos proprietários e dos veterinários, e em simultâneo maximizar as probabilidades de uma fêmea ficar gestante com um número reduzido de IA, foram-se desenvolvendo vários protocolos de sincronização de cios, alguns dos quais independentes da detecção de cios. Na maior parte destes protocolos, a manipulação da(s) onda(s) de desenvolvimento folicular, associada ou não ao encurtamento da fase lútea, procuram ainda encurtar o número de dias em aberto, indirectamente visando o encurtamento do intervalo entre partos (Lucy et al, 2004; Cavalieri et al., 2006; Lane et al., 2008). Neste trabalho procuraremos fazer uma revisão geral do ciclo reprodutivo da vaca, com realce dos fenómenos de desenvolvimento folicular cíclico, para depois abordar os protocolos desenvolvidos para manipular o ciclo éstrico em bovinos. Estes dados ser-nos-ão úteis para, na segunda parte, discutir os resultados obtidos na implementação de um protocolo Ovsynch modificado em duas explorações na região entre Douro e Minho de Portugal. 1. Fisiologia reprodutiva das vacas As vacas são uma espécie poliéstrica contínua. Uma vez atingida a puberdade, os ciclos éstricos sucedem-se ao longo do ano até ser interrompido pela gestação (Ball e Peters, 2004) O ciclo éstrico dos bovinos tem uma duração média de 3 semanas, mas pode variar entre os 17 e os 25 dias (Stevenson, 2007). De uma maneira geral, a duração do ciclo éstrico é 1 a 2 dias mais curto nas novilhas do que nas vacas (Stevenson, 2007). Classicamente, o ciclo éstrico divide-se em quatro fases (Ball e Peters, 2004) (Figura 1): - estro (dia 0); - metaestro (dia 1-4); 11

13 Introdução - diestro (dia 5-18); -proestro (dia 19 até o início do estro); Proestro Regressão do corpo lúteo Desenvolvimento folicular Estro Metaestro Formação do corpo lúteo Diestro Corpo lúteo activo (secreção de progesterona) Figura 1 Representação esquemática do ciclo éstrico da vaca, para uma duração média de ciclo de 21 dias. (Adaptado de Sánchez, 2008) O estro caracteriza-se pela receptividade sexual da fêmea e é nesta fase que ocorre o crescimento folicular rápido, de forma a permitir a posterior ovulação do folículo. O metaestro, do dia 1 ao dia 3-4, caracteriza-se pela maturação final do folículo, pela ovulação e formação do corpo hemorrágico, ainda com fraca capacidade de produzir progesterona, e que evoluirá para corpo lúteo. O diestro, do dia 4-5 ao dia 18, inicia-se quando a progesterona atinge concentrações significativas e continua até à regressão do corpo lúteo (CL). Nesta altura as concentrações sanguíneas de progesterona diminuem rapidamente e inicia-se o proestro, do dia até ao início do estro no dia (Ball e Peters, 2004; Stevenson, 2007), fase em 12

14 Introdução que ocorre a selecção e crescimento folicular acelerado associado ao aumento da síntese de estradiol (Fortune et al., 2004; Lucy et al., 2004). O período de estro pode ter uma duração de 2 a 50 horas sendo referido como média as 12 a 18 horas (Stevenson, 2007). A ovulação ocorre geralmente de 24 a 30 horas depois do início do estro (Walker et al., 1996; Jainudeen e Hafez, 2000). Os primeiros sinais de cio coincidem geralmente com o início do pico pré-ovulatório de hormona luteinizante (LH) e da hormona foliculo-estimulante (FSH) (Stevenson, 2007). A gestação é definida como o período que decorre desde a fecundação até ao parto e na vaca tem uma duração em média de dias (Ball e Peters, 2004), embora possa variar entre os 270 e os 292 dias (Stevenson, 2007). Após o parto, as vacas apresentam um período de aciclia, geralmente designado por anestro pós-parto. O anestro pós-parto corresponde ao intervalo entre o parto e a primeira ovulação (Jainudeen e Hafez, 2000; Stevenson, 2007) ou até à primeira manifestação comportamental de cio (Peter et al., 2009). O intervalo do parto até à primeira ovulação apresenta variações, podendo ir dos 10 aos 110 dias (Jainudeen e Hafez, 2000) conforme a raça da vaca, nutrição, produção de leite, estação do ano e presença do vitelo (Ball e Peters, 2004). Nas vacas de leite a ovulação do primeiro folículo dominante após o parto ocorre geralmente entre os dias dias (Lucy, 2001). No entanto cerca de 20 a 25% das vacas ainda se mantêm em anestro 60 dias pós-parto (Stevenson, 2007). O anestro pós-parto engloba dois eventos indispensáveis à fertilidade da vaca: a involução do útero e o reinício da actividade ovárica. A involução uterina geralmente está completa por volta do dia 30 pós-parto (Ball e Peters, 2004). No entanto, para outros autores a involução uterina completa ocorre em média um pouco mais tarde, por volta dos 45 dias pósparto podendo variar dos 32 aos 50 dias (Jainudeen e Hafez, 2000). Aos 10 dias depois do parto já se pode observar ondas consecutivas de desenvolvimento folicular (Espinosa, 2009) e num estudo realizado por Savio et al. (1990) com vacas de leite, os autores observaram que o primeiro folículo dominante que se desenvolveu pós-parto ovulou em 74% das vacas. 2. Dinâmica folicular Na vaca reconhece-se a existência de três ondas de desenvolvimento folicular em cada ciclo. Embora esta seja a regra, existem algumas fêmeas que apresentam apenas duas ondas de desenvolvimento folicular (Savio et al., 1988; Sirois e Fortune, 1988; Noseir, 2003) enquanto outras apresentam quatro ondas (Sirois e Fortune, 1988; Bleach et al., 2004). Esta é uma característica que se mantém de forma consistente numa vaca, e explica as variações que se observam na duração do ciclo entre animais. 13

15 Introdução A primeira onda de desenvolvimento folicular inicia-se logo após a ovulação, no dia 0 do ciclo éstrico (considerando-se o dia 0 como o dia da ovulação), a segunda no dia 8 ou 9 e a terceira no dia 15 ou16 (Ginther et al., 1989a; Adams et al., 2008). Podem existir diferenças nos dias em que se iniciam as ondas de desenvolvimento folicular caso a vaca apresente duas ou quatro ondas foliculares. (Townson et al., 2002; Bleach et al., 2004). A primeira onda é iniciada pelo pico de FSH que se segue 20 a 30 horas após o pico pré-ovulatório de LH (Hafez et al., 2000). À emergência de todas as ondas foliculares está associado uns aumentos transitórios detectáveis na FSH, que precedem o aparecimento ecográfico de cada onda em 1 a 2 dias (Stevenson, 2007). Cada onda de crescimento folicular apresenta quatro fases: recrutamento folicular; selecção do folículo dominante; dominância e; atrésia folicular ou ovulação (Sunderland et al., 1994; Diskin et al., 2002). O recrutamento consiste na mobilização de folículos antrais de 3 mm (15-25 folículos; Roche, 2004), para uma onda de crescimento folicular (Kanitz, 2003) e ocorre todos os 7 a 10 dias do ciclo éstrico (Roche, 2004). Ao recrutamento está associado um aumento da FSH, sendo este essencial para que os folículos sejam recrutados (Adams et al., 1992; Ginther et al., 1998; Mihm e Bleach, 2003). A seguir ao recrutamento sucede-se a selecção que é o processo pelo qual apenas um dos folículos da onda de crescimento folicular é seleccionado para se tornar dominante (Beg e Ginther, 2006). Quando o folículo de maior tamanho da onda de crescimento, alcança um diâmetro em média de 8.5 mm (aproximadamente 3 dias de crescimento) ocorre uma diferenciação entre o futuro folículo dominante e os restantes folículos subordinados, designando-se este processo por divergência (Ginther et al., 1996; Beg e Ginther, 2006). Antes da divergência todos os folículos em crescimento apresentam a capacidade de se tornarem dominantes, no entanto, após a divergência, o folículo de maior tamanho tende a tornar-se o folículo dominante, enquanto todos os outros regridem (Austin, 2001). A divergência é acompanhada por uma diminuição da concentração sanguínea de FSH. Esta diminuição é devida a um aumento da libertação de estradiol na corrente sanguínea, produzido pelo folículo de maior tamanho, que suprime as concentrações de FSH abaixo das requeridas pelos folículos de menor tamanho. (Ginther et al., 2000). Com a divergência, o folículo dominante adquire capacidade de responder à LH, e torna-se independente da FSH sérica para o seu crescimento. Para além do estradiol a inibina também contribui para a diminuição da concentração de FSH (Ginther et al., 2001). 14

16 Introdução O folículo dominante pode ser distinguido pelo seu maior tamanho, maior concentração em estradiol (Austin et al., 2001), e aumento dos receptores de LH (Beg e Ginther, 2006). O folículo dominante seleccionado apresenta aproximadamente 10 mm de diâmetro na altura em que adquire a capacidade ovulatória (Kanitz, 2003) que ocorre um dia depois do início da divergência folicular. Pensa-se que a aquisição da capacidade ovulatória envolva um aumento da expressão dos receptores de LH nas células da granulosa do folículo dominante e que esta alteração possa ser importante para o posterior crescimento e maturação do folículo dominante (Sartori et al., 2001). O folículo dominante apresenta cerca de 16 mm um dia antes da ovulação (Ginther et al., 1989b; Beg e Ginther, 2006). Lucy et al. (2004) referem que o folículo dominante aumenta de tamanho até uma dimensão entre os 14 a 20 mm, e que mantém a dominância por 5 a 7 dias. Qualquer folículo dominante pode maturar e ovular se o corpo lúteo regredir no tempo apropriado (Fortune et al. 2004). A administração de prostaglandina F 2α (PGF 2α ) durante o crescimento e fase estática do folículo dominante, conduzindo à regressão do corpo lúteo, desencadeia a ovulação (Stevenson, 2007). A maturação folicular segue acções coordenadas da LH e da FSH através dos receptores nas células da teca e da granulosa, respectivamente. A LH liga-se às células da teca e estimula a produção de androgénios, os quais subsequentemente se difundem através da membrana basal nas células da granulosa (Fortune e Quirk, 1988). A ligação da FSH às células da granulosa aumenta a actividade da aromatase, que converte os androgénios em estradiol. Por sua vez, os níveis elevados de estradiol e a FSH regulam também os receptores para a LH nas células da granulosa nos folículos pré-ovulatórios em maturação. A ligação da LH e FSH pelas células da granulosa é necessária para a regulação final da maturação folicular e eventual ovulação em resposta a estas hormonas (Stevenson, 2007). Nas situações em que um folículo dominante não ovula, o que poderá ser devido à presença de concentrações elevadas de progesterona, perde as características de dominância e torna-se atrésico, desenvolvendo-se um novo folículo dominante a partir de uma nova vaga de folículos. As concentrações de estradiol folicular e a secreção de inibina-a diminuem no folículo dominante que vai perdendo a dominância, o que favorece o aumento da concentração sanguínea de FSH dando-se início à fase de recrutamento da onda seguinte (Lucy et al., 2004; Fortune et al., 2004). Na dinâmica do ciclo éstrico, o aumento do estradiol tem um efeito positivo no hipotálamo induzindo a libertação de hormona libertadora de gonadotropina (GnRH). O estradiol parece desencadear pulsos mais frequentes de GnRH assim como um aumento da resposta hipofisária a cada pulso de GnRH, o que por sua vez leva à indução do pico pré- 15

17 Introdução ovulatório de LH que promove a ovulação do folículo dominante (Hafez et al., 2000). Os títulos de estradiol são máximos antes do pico pré-ovulatório de LH, enquanto que as concentrações de FSH são minimas (Stevenson, 2007). O estradiol é também a hormona responsável por desencadear o comportamento de cio (Nebel, 2003) e pela preparação do tracto reprodutivo para o processo associado com a fecundação (Ball e Peters, 2004). Os picos de síntese de LH e FSH têm geralmente uma duração de 6 a 12 horas (Hafez et al., 2000; Stevenson, 2007), pois a hipófise torna-se refractária à acção da GnRH em resposta à (Stevenson, 2007) diminuição da concentração dos receptores de GnRH ou à depleção do pool de gonadotropinas. Por isso, na altura da ovulação os níveis de estradiol, progesterona e LH são baixos (Hafez et al, 2000). 3. Luteogénese e luteólise Após a ovulação as células da teca e da granulosa diferenciam-se em células lúteas pequenas e células lúteas grandes respectivamente, formando o corpo lúteo responsável pela secreção de progesterona. Os dois tipos de células do corpo lúteo secretam progesterona. As células lúteas pequenas apresentam receptores de LH e respondem melhor à LH in vitro do que as células lúteas grandes em termos de secreção de progesterona (Stevenson, 2007). À medida que o corpo lúteo cresce as células lúteas pequenas transformam-se em células lúteas grandes (Alila e Hansel, 1984). As células lúteas pequenas representam cerca de 20% do total da população de células lúteas e contribuem com cerca de 15% da secreção de progesterona pelo corpo lúteo. O restante é produzido pelas células lúteas grandes (Stevenson, 2007). Para além de receptores para a LH, as células lúteas grandes possuem também receptores para a prostaglandina E 2 (PGE 2 ) e PGF 2α, além de produzirem neurofisina e oxitocina (OT) (Guldenaar et al., 1984; Harrison et al., 1987). A luteólise é o processo pelo qual ocorre a regressão do corpo lúteo e dá-se por volta do dia 15 a 17 do ciclo éstrico (Ball e Peters, 2004; Choudhary, 2005). A PGF 2α é o factor luteolítico, e tem uma origem uterina. Para que a PGF 2α actue é necessário existir uma determinada quantidade de 17β-estradiol (17βE 2 ) em circulação, uma vez que esta hormona determina os teores de oxitocina e seus receptores, tanto ao nível do útero como do corpo lúteo (Stevenson, 2007). O CL no início de função é refractário à acção da PGF 2α, até aos cerca dos 5 a 6 dias. O mecanismo responsável pela ausência de resposta luteolítica do corpo lúteo neste período ainda não foi totalmente esclarecido (Choudhary, 2005; Shirasuma et al., 2008), embora esteja descrito que a concentração e afinidade de receptores específicos para a PGF 2α nas células lúteas de bovinos são similares nos dias 2, 4, 6 e 10 do ciclo éstrico (Wiltbank et al., 1995; Stevenson, 2007). Este tema mantém-se controvérso, existindo alguns autores que associam a 16

18 Introdução incapacidade de a PGF 2α ter capacidade luteolítica antes do dia cinco do ciclo éstrico ao facto de existir um escasso número de receptores até essa altura (Diskin et al., 2002; Santos et al., 2003; Cavalieri et al., 2006; Lane et al., 2008) ou por se fazer sentir uma acção antiluteolítica (Espinosa, 2009). Na fase inicial da gestação, cerca de 20 dias após a concepção, as células lúteas grandes desaparecem, permanecendo as células lúteas pequenas, algumas das quais se expandem e tornam-se células lúteas grandes no corpo lúteo de gestação (Stevenson, 2007). Os pulsos marcados de PGF 2α produzidos pelo útero na ausência de um embrião viável induzem regressão ou lise do corpo lúteo, conduzindo ao final da fase lútea (McCracken et al., 1999; Skanzynski et al., 2001). Após 14 dias de influência da secreção de progesterona, o endométrio secreta pulsos de PGF 2α, cada um com uma duração aproximada de 6 horas, por um total de cerca de 36 horas. A PGF 2α causa um declínio imediato de progesterona e oxitocina para níveis basais dentro de 6 a 10 horas na circulação periférica e no conteúdo do corpo lúteo (Stevenson, 2007). Vários trabalhos sugerem que a PGF 2α produzida pelo corno uterino adjacente ao ovário que tem o corpo lúteo é transferida da veia uterina efluente na artéria ovárica através de um mecanismo de transferência contra corrente (McCracken et al., 1999). Sabe-se que os efeitos luteolíticos da PGF 2α ocorrem em parte através da intervenção directa sobre as células lúteas, mas a sua acção é também obtida de forma indirecta através da redução do fluxo sanguíneo ao corpo lúteo (Niswender et al., 2000; Stevenson, 2007). A PGF 2α apresenta propriedades vasoconstritoras, mas ainda não foi determinado se a diminuição do fluxo sanguíneo do corpo lúteo, que tanto ocorre na luteólise espontânea como na induzida pela PGF 2α exógena, é uma causa ou consequência da luteólise (Stevenson, 2007). A produção de estradiol pelo folículo dominante após um período prolongado de influência progestagénica, como se observa na fase final do desenvolvimento folicular, desencadeia o processo de luteólise através da indução da produção de PGF 2α (Araújo et al., 2009). Esta é produzida em consequência da estimulação dos receptores endometrais da oxitocina pelos níveis crescentes de estradiol, que quando ocupados activam a fosfolipase A 2 e a cascata do ácido araquidónico. O ácido araquidónico é o precursor da síntese uterina de PGF 2α (Sílvia et al., 1991; Stevenson, 2007). 17

19 Introdução Figura 2 - Aumento e declínio das hormonas reprodutivas durante o ciclo éstrico. Fonte: 4. Maneio reprodutivo na exploração: a detecção do cio O cio é a exibição da receptividade sexual por parte da fêmea, que se observa no estro, que na vaca se manifesta durante algumas horas, através de alterações físicas e comportamentais (Nebel, 2003). A duração do cio tem uma média de 12 a 18 horas (Allrich, 1994; Jainudeen e Hafez, 2000), mas em alguns casos pode encontrar-se reduzida a pouco mais de 30 minutos, enquanto que noutros se pode prolongar até 35.8 horas (O Connor, 2007). A duração e a intensidade com que a fêmea manifesta o cio pode ser influenciado por factores exógenos e endógenos. A duração média do cio pode ser encurtada por factores ambientais, como por exemplo quando os animais estão estabulados em permanência em pisos de cimento ou quando as temperaturas ambientes são demasiado elevadas (Britt et al., 1986). De acordo com Britt e colaboradores (1986), as vacas que se encontram em piso de terra evidenciam um maior número de montas e reflexos de imobilidade e uma duração do cio superior aos de vacas que se encontram em piso de cimento. De entre os factores endógenos que mais interferem com a duração e intensidade do cio em fêmeas de aptidão leiteira inclui-se o nível de produção de leite (Lopez, 2004). Segundo o estudo realizado por Dransfield et al. (1998) o cio tem uma duração em média de 7 horas, com 25% das vacas a apresentarem cios de curta duração. A correcta detecção do cio é indispensável à fertilidade potencial da vaca, e particularmente relevante se a fêmea for submetida a beneficiação por inseminação artificial (IA), e é também essencial ao sucesso económico da exploração. A detecção insuficiente e/ou imprecisa dos cios leva a IA fora do período fértil, e por consequência menores taxas de concepção e intervalos mais longos entre partos (Rocha et al., 2001; Graves, 2009). De acordo com os resultados obtidos por Sturman et al. (2000) em vacarias de leite, 19% das inseminações são realizadas em vacas na fase lútea ou em fases iniciais da gestação. Neste 18

20 Introdução estudo, as inseminações de vacas gestantes estiveram na origem de 17% dos casos de morte embrionária. Este estudo retrata bem o impacto que tem actualmente a deficiente detecção do estro nos parâmetros reprodutivos em vacarias de leite, com o consequente aumento do intervalo parto/fecundação, do número de IA/fecundação e do intervalo entre partos, já para não falar das consequentes perdas económicas. O recente declínio na eficiência reprodutiva da fileira leiteira pode estar associado a uma fraca manisfestação do estro (Maillard, 2006; Opsomer et al., 2007a). Esta tem sido explicada pelo facto de a expressão do estro ser um comportamento que resulta das acções do estradiol no hipotálamo, e os teores de estradiol tendem a ser menores em animais de elevada produção, em consequência do aumento do metabolismo hepático (Sangsritavong et al., 2002; Wiltbank et al., 2005). A intensidade (número de montas) e a duração do cio dependem do comportamento individual das vacas assim como das interacções das vacas entre si e com o ambiente em que se inserem (Dransfield et al., 1998). Vários factores têm sido apontados como podendo justificar a deficiente manifestação comportamental do estro em vacas de leite, entre eles (Gwazdauskas, 1985; Dransfield et al., 1998; Rensis e Scaramuzzi, 2003; Opsomer et al., 2007a): Confinamento em estábulos com um piso demasiado abrasivo ou liso; Ocorrência de alterações podais, que tornam a deslocação e as montas dolorosas; Uma fraca condição corporal ou nutrição deficiente; Stresse térmico; Desequilíbrios no metabolismo dos esteróides, resultantes de uma síntese deficiente e de um metabolismo acelerado das hormonas esteróides em vacas de leite de alta produção, com consequente decréscimo dos valores circulantes de esteróides endógenos e consequente encurtamento do comportamento de cio nestas vacas (Wiltbank et al., 2005). O aumento da ocorrência de ciclos anormais (curtos ou longos) que se tem vindo a observar nos últimos anos também torna mais difícil predizer quando uma vaca cíclica retorna ao cio (Graves, 2009; Opsomer et al., 2007a, Espinosa, 2009). Os trabalhos de Keown e Kononoff (2007) referem que cerca de 68% dos cios ocorrem entre as 6 da tarde e as seis da manhã. No entanto, em contraste, estudos publicados anteriormente evidenciaram que a actividade de monta e o início do cio ocorrem de modo uniforme ao longo do dia (Dransfield et al., 1998; Xu et al., 1998; Nebel et al., 2000). É possível que a evolução no tempo da componente genética do efectivo, do nível produtivo dos animais 19

21 Introdução ou da relação entre a produção de leite e o nível nutricional possam justificar as diferenças encontradas entre estes trabalhos. A observação das vacas para detecção do cio deveria ser feita pelo menos duas vezes por dia, por um período mínimo de 30 minutos (Maillard, 2006; O Conner, 2007). No entanto, existem autores que defendem que esta duração e frequência são actualmente insuficientes para uma detecção bem sucedida do estro (Dransfield et al., 1998; Diskin e Sreenan, 2000; Graves, 2009), defendendo que o momento ideal para a detecção de cio é de manhã muito cedo (antes de serem ordenadas e alimentadas), ao final da tarde (depois de ordenhadas e alimentadas) e à noite/madrugada (Graves, 2009). O sinal primário, mais evidente, de que a vaca se encontra em cio é o reflexo de imobilidade, que se caracteriza pelo facto de a fêmea permitir a monta (Nebel, 2003; Diskin e Sreenan, 2000; Graves, 2009). Num estudo realizado por Dransfield et al. (1998), a média de saltos por cio numa vaca de leite foi de 8,5 saltos. Existem ainda sinais secundários que poderão auxiliar na detecção de cio em vacas, embora sejam menos fiáveis por serem muito variáveis na indicação do período fértil (Allrich, 1994; Diskin e Sreenan, 2000; Graves, 2009). Em muitas explorações, a taxa de detecção de cio por meio da observação de sinais indiciadores (Quadro 1) é inferior a 50% (Senger, 1994; Nebel, 2003; Portaluppi e Stevenson, 2005; Maillard, 2006). Nos trabalhos de Rocha et al. (2001), desenvolvidos no Norte de Portugal, tendo por base os dados da taxa de não retorno aos 90 dias e no registo de nascimento de vitelos, foi reportada uma taxa média de detecção de cio de 38.1%. Estes autores encontraram ainda diferenças significativas na taxa de detecção de cio entre explorações (variando entre 14.8 a 60.8%). Dada a dificuldade que se observa na correcta detecção do cio, foram desenvolvidos diversos dispositivos ou metodologias para facilitar a sua detecção. Entre estes, destacam-se os detectores de monta sensíveis à pressão (Walker et al., 1996; Dransfield et al., 1998; Nebel, 2003; Diskan e Sreenan, 2000), os marcadores de tinta (O Connor, 2007; Graves, 2009), os podómetros/coleiras (Senger, 1994; O Connor, 2007; Diskan e Sreenan, 2000), os arreios submandibulares, a colocação de câmeras de vídeo no local, o recurso a rufiões, a medição da impedância do muco vaginal (também conhecido por método de Draminsky; Jainudeen e Hafez, 2000; Senger, 1994; O Connor, 2007) e a medição da progesterona no sangue ou leite de vacas suspeitas em cio (Jainudeen e Hafez, 2000; Pembertonet et al., 2001; Graves, 2009). 20

22 Introdução Quadro 1 Sinais primários e secundários de cio. Tipo de sinal Manifestação comportamental/física Referências Sinais primários Reflexo de imobilização Mucosa vaginal edematosa, lisa, húmida e avermelhada Muco viscoso e transparente pendente na comissura ventral da vagina Diminuição da ingestão e produção de leite Diskin e Sreenan, 2000; Yoshida e Nakao, 2005; Cutullic et al., 2009 Diskin e Sreenan, 2000; Nebel, 2003 Diskin e Sreenan, 2000; Nebel, 2003 Diskin e Sreenan, 2000; Balls e Peters, 2004; Cutullic et al., 2009 Aumento ligeiro da temperatura corporal Jainudeen e Hafez, 2000 Tentativa de montar outras vacas Cheirar ou lamber com convicção a genitália das outras vacas Aumento da vocalização, com mugidos altos e frequentes Diskin e Sreenan, 2000; Cutullic et al., 2009 Diskin e Sreenan, 2000; O Connor, 2007 Nebel, 2003, O Connor, 2007 Pôr a cabeça por cima das outras Nebel, 2003, O Connor, 2007 Sinais secundários Aumento do nervosismo, com agitação, impaciência, aumento da actividade; as vacas ficam irrequietas, movimentam-se com rapidez, agitam a cauda enérgica e frequentemente, e as suas reacções ao contacto físico são mais rápidas Reflexo de Flehmen - elevar o lábio superior na inspiração, como que num sorriso, com a cabeça levantada e o pescoço esticado (semelhante ao reflexo de Flehman) Formação de um grupo sexualmente activo na periferia do efectivo Diskin e Sreenan, 2000; O Connor, 2007; Ranasinghe et al., 2009 Nebel, 2003; O Connor, 2007 Nebel, 2003 Alteração de rotinas Balls e Peters, 2004 Três a quatro dias depois do estro as vacas podem apresentar corrimentos serosanguinolentos, geralmente designados de corrimento metaéstrico. Este sinal indica que dentro de 15 a 20 dias provavelmente se repetirá o episódio de cio Diskin e Sreenan, 2000; Keown e Kononoff, 2007 Vários estudos indicam que a eficiência da detecção de cio aumenta quando se alia a utilização destes dispositivos à observação visual (Senger, 1994; O Connor, 2007). 21

23 Introdução 5. Momento da inseminação Para alguns autores o tempo de vida fértil do oócito bovino após a ovulação é de 8 a 12 horas (Ziegler, 2002); no entanto, há quem defenda que este período é mais alargado e poderá chegar às 20 a 24 horas (Jainudeen e Hafez, 2000), diminuindo a viabilidade do oócito ao longo do tempo (Nebel, 2003). Também os espermatozóides têm um período de vida limitado, habitualmente de 30 a 48 horas (Ziegler, 2002; Nebel, 2003). Para que ocorra a fecundação é necessário que os espermatozóides atravessem o útero, entrem nos oviductos e completem o processo de maturação, conhecido como capacitação. O tempo necessário para que um número significativo de espermatozóides viáveis e passíveis de sofrer capacitação atinja o local de fecundação requer um mínimo de seis horas, aumentando de forma progressiva o número de espermatozóides que chegam à ampola do oviducto entre as 8 e as 18 horas pós-ia; a partir deste momento, o número de espermatozóides viáveis diminui (Hank, 1983; Wilmut e Hunter, 1984). Com base neste conhecimento, se a inseminação ocorrer demasiado cedo os espermatozóides perderão capacidade fecundante antes de terem oportunidade de fecundar o oócito. Por outro lado se se atrasa demais a inseminação, o oócito perderá a sua viabilidade, tornando-se incapaz de ser fecundado ou tendendo a originar um embrião com fraca capacidade de sobrevivência. Uma vez que a ovulação ocorre 10 a 12 horas após o final do estro (Jainudeen e Hafez, 2000), o momento óptimo para a inseminação encontra-se perto do fim do estro. Como em condições práticas as vacas não são observadas continuamente, torna-se difícil a determinação exacta do fim do estro. Considerando o período de vida limitado tanto do oócito como do espermatozóide, existe uma janela de cerca de 12 horas durante a qual se obtêm as melhores taxas de concepção. Consequentemente, considerou-se que de um ponto de vista prático está aconselhado utilizar-se a regra manhã/tarde (AM/PM): todas as vacas observadas em cio durante a manhã serão inseminadas durante a tarde. As vacas ainda em cio na manhã seguinte serão inseminadas novamente. As vacas observadas em cio durante a tarde ou à noite serão inseminadas na manhã seguinte (Graves et al., 1997; Graves, 2009). Num trabalho em que avaliaram a eficiência do momento de beneficiação através das taxas de não retorno, Nebel et al. (1994) compararam a IA realizada de acordo com a regra AM/PM e a inseminação num único momento predefinido do dia (IA realizadas apenas no período da manhã, independentemente do momento da detecção do cio), estes autores não encontraram diferenças significativas nas taxas de não retorno aos 60, 75 e 90 dias: 65.6%, 60.6% e 57.8% para a regra manhã/tarde e 64.6%, 60.1% e 58.4% para a IA uma única vez ao dia, respectivamente aos 60, 75 e 90 dias. Contudo, apesar dos resultados serem semelhantes 22

24 Introdução entre os dois protocolos, os produtores continuam a realizar a IA com base na regra AM/PM (Graves, 2009). 6. Factores que contribuem para a diminuição da taxa de concepção Nos últimos anos, a diminuição progressiva da taxa de concepção global em explorações intensivas de bovinos de leite, e que rodando os 30 a 40%, tem sido fonte de preocupação para os produtores e veterinários do sector (Lucy et al., 2004). A fraca capacidade de detecção de cios é uma das causas que contribui para o decréscimo da taxa de concepção, apesar de existirem outras (Lopez et al., 2004; Wiltbank et. al, 2005; Thatcher, 2006; Opsomer et al., 2007b), como sejam: O atraso no retorno à actividade cíclica no pós-parto; Um prolongamento da fase lútea no pós-parto; O aumento do intervalo entre a primeira IA e a fecundação; Um aumento do metabolismo das hormonas esteróides em vacas de alta produção; A consequente diminuição da concentração da progesterona em vacas de leite de alta produção; O stresse térmico. A duração do intervalo entre o parto e a primeira ovulação é decorrente do reinício da actividade ovárica e da involução uterina. Se a primeira está dependente da replecção das reservas hipofisárias de LH, que por sua vez podem ser moduladas por diferentes factores ambientais e endógenos (como o balanço energético do animal), o segundo é muito influenciado pelo estatuto hígido do útero, pelo que a presença de inflamação é um importante modulador. O atraso no retorno à actividade cíclica no pós-parto pode estar associado à ocorrência de doenças puerperais, principalmente àquelas que surgem no primeiro mês após o parto, e ainda ser consequência do balanço energético negativo (BEN) no início da curva de lactação (Beam e Butler, 1998; Opsomer et al., 2007c). As vacas em lactação estão geralmente em BEN durante o período pós-parto inicial, uma vez que não obtêm a energia suficiente para as demandas do organismo através da alimentação que recebem. O balanço energético negativo e a perda de peso associado exercem um efeito inibitório tanto directo como indirecto no crescimento e desenvolvimento folicular. A hormona luteinizante e a IGF-I (Insulin-like growth factor I) actuam sinergeticamente para promover o desenvolvimento folicular. Nas vacas em balanço energético negativo, os pulsos de LH e as concentrações plasmáticas de IGF-I 23

25 Introdução encontram-se diminuídos, o que parece comprometer o crescimento folicular durante o período de pós-parto inicial e atrasar o retorno à ciclicidade (Lucy, 2000). Sabe-se que o folículo dominante nas vacas em balanço energético negativo requer mais tempo e um tamanho maior para estabelecer as concentrações de estradiol capazes de desencadear a ovulação (Lucy, 2001). Foi demonstrado que o metabolismo fisiológico das hormonas esteróides se encontra aumentado devido às exigências da alta produção (Lopez et al., 2004; Wiltbank et. al, 2005) Este aumento do metabolismo leva a uma diminuição dos níveis de estradiol endógeno. Em consequência, o folículo pré-ovulatório e o oócito ficam expostos a um prolongamento nos pulsos de LH que pode levar à ovulação de um folículo super-estimulado ou a um oócito prematuramente activado e assim promover uma diminuição da fertilidade (Wiltbank et. al, 2005). Outra das causas que contribui para a diminuição da taxa de concepção é o prolongamento da fase lútea. Opsomer et al. (1998) descreveram um aumento de fases lúteas anormais no pós-parto em vacas de leite de alta produção. Cerca de 20% das vacas em estudo apresentavam um aumento da concentração da progesterona por mais de 20 dias sem que tivessem sido submetidas anteriormente a uma IA (não podendo portanto estar gestantes). A alteração na fase lútea das vacas de leite dificulta o maneio reprodutivo. As fases lúteas longas atrasam a inseminação de vacas que não estão em protocolos de inseminação e torna mais difícil prever quando é que uma vaca cíclica retorna ao cio (Opsomer et al., 2007b). No entanto, a informação disponível na literatura é controversa, e Espinosa (2009) defende a ocorrência de ciclos curtos durante o pós-parto de vacas devido a um subdesenvolvimento nos corpos lúteos com anomalias na função endócrina, não se normalizando os ciclos até uma segunda ou terceira ovulação. Comparando aptidões produtivas distintas (carne e leite) o anestro pós-parto é mais curto nas raças de produção de leite do que nas de carne que amamentam os seus vitelos, sendo nestas últimas a amamentação e a presença do vitelo o principal factor condicionante do arranque da actividade cíclica (Espinosa, 2009). Estudos recentes demonstraram que o BEN, a nutrição, os distúrbios e as doenças pósparto são factores de risco para o atraso na ciclicidade e prolongamento da fase lútea (Opsomer et al., 2007a). Outros factores que podem contribuir para a diminuição da taxa de concepção e para o aumento do intervalo entre a primeira IA e a concepção são a falha na fecundação, que pode estar associada a má qualidade do sémen ou a má técnica de inseminação, ou ainda a um oócito envelhecido; um aumento da mortalidade embrionária ou fetal, que comprometa o sucesso da gestação; e também problemas na exibição do cio (Opsomer et al., 2007a). Em paralelo com o decréscimo da taxa de fertilidade à primeira IA, tem-se observado ainda um aumento das gestações gemelares, presumivelmente causado por taxas de ovulação 24

26 Introdução elevadas (Kinsel et al., 1998), que pode ser consequência de uma deficiente função folicular e de uma sinalização inadequada do estradiol em vacas de leite de alta produção (Fricke e Wiltbank, 1999). O estradiol e a inibina são essenciais para controlar o crescimento folicular através do seu efeito inibitório na FSH durante a onda folicular. A diminuição da concentração sanguínea de estradiol nas vacas em lactação reduz o feedback negativo sobre a FSH durante a onda folicular, conduzindo a um aumento de FSH que favorece a divergência e dominância de mais do que um folículo nas vacas em lactação. Existe também a possibilidade de outros mecanismos que controlam o crescimento folicular, seja a inibina ou outros factores ainda não descobertos, estarem comprometidos pela lactação (Lucy, 2001). A gestação gemelar é indesejável porque a produção de leite e a fertilidade após o nascimento de gémeos diminuem ainda mais (Beerepoot et al., 1992). A diminuição na taxa de concepção também pode ser devida a uma diminuição da concentração da progesterona nas vacas de leite de alta produção (Lucy, 2001) que apresentam uma metabolização mais rápida da progesterona conduzindo a uma diminuição da sua concentração (Wiltbank et al., 2006). A progesterona é requerida para a gestação e existe uma associação entre baixos níveis de progesterona e a morte embrionária precoce, apesar de ainda não ter sido estabelecida uma relação directa entre progesterona baixa e a perda embrionária. Desconhece-se a concentração mínima absoluta de progesterona necessária para manter a gestação numa vaca (Lucy, 2001). A taxa de concepção também pode ser diminuida pelo stresse térmico, tendo-se verificado que este reduz a secreção de LH, conduzindo a uma secreção inadequada de estradiol pelos folículos dominantes, diminuindo as concentrações plasmáticas de estradiol (Rensis e Scaramuzzi., 2003), que é um componente crítico da cascata luteolítica (Stevenson, 2007), o que atrasa a luteólise em vacas em lactação conduzindo a um alongamento na fase lútea das vacas (Lucy, 2001). Estes acontecimentos resultam numa diminuição da qualidade do oócito, falha na implantação e infertilidade (Hansen, 1997; Rensis e Scaramuzzi, 2003). Com a meta de um vitelo por ano (Jainudeen e Hafez, 2000; Stevenson, 2007; Espinosa, 2009), o intervalo parto-fecundação limita-se a cerca de 85 dias (Opsomer et al., 1998; Lyimo et al., 2000), durante os quais deve ocorrer a involução do útero, o reinício da actividade ovárica e a adequada detecção de cios. Por consequência, torna-se fácil de entender a importância crescente da implementação de protocolos de sincronização do estro, para submeter vacas à IA no tempo apropriado, como forma de aumentar as taxas de concepção. 25

27 Introdução 7. Métodos de controlo do estro e/ou ovulação Os protocolos de manipulação do estro e/ou ovulação podem ser agrupados em dois tipos principais: os que sincronizam o estro e os que sincronizam a ovulação. Os protocolos de sincronização do estro requerem a detecção do cio. Embora tendam a apresentar uma maior concentração dos animais que evidenciam comportamento de cio, apresentam também uma janela temporal mais ou menos variável em relação à altura da inseminação, pouco controlo sobre a altura da inseminação, estando o momento da inseminação sob dependência da capacidade da detecção de cios na exploração (Santos et al., 2003). Por outro lado, os protocolos de sincronização da ovulação permitem a inseminação num momento prédeterminado, ajustado aos produtos administrados, e prescindem da detecção do cio (Pursley et al., 1995). Este tipo de protocolos controlam a onda de desenvolvimento folicular e, por conseguinte, a ovulação (Murugavel et al., 2003a). Um protocolo de sincronização ideal deve proporcionar um início do estro preciso e uma fertilidade muito próxima da obtida em ciclos não manipulados, com taxas de gestação superiores a 55% após uma única inseminação artificial (Austin et al., 1999). Todos os métodos farmacológicos de sincronização do estro devem ser considerados como ferramentas de maneio reprodutivo úteis, cujo objectivo principal é aumentar a eficiência reprodutiva. Em paralelo, permitem melhorar a organização da reprodução ou corrigir alguma deficiência organizacional. Em alguns casos os sistemas de manipulação do estro podem ser usados como tratamento para certos transtornos reprodutivos, tais como o sub-estro ou cio silencioso ou a doença ovárica quística (Bartolome et al., 2000; Rensis et al., 2008). Contudo, os métodos farmacológicos de manipulação do ciclo éstrico não devem ser nunca considerados um substituto do maneio adequado. Caso surjam respostas negativas ao programa de sincronização, estas poderão ser devidas a diversos factores, nomeadamente, a nutrição, a fase de pós-parto, o estado de saúde, factores genéticos individuais, incumprimento dos protocolos (Lucy et al. 2004; Lopez, 2006; Maillard, 2006; Cavalieri et al., 2006), variação do metabolismo interno em particular das taxas de excreção da progesterona (Wiltbank et al., 2005). Em vacas cíclicas o ciclo éstrico pode ser manipulado de três formas (Lucy et al., 2004; Thatcher et al., 2006): Através do uso de prostaglandinas, para induzir uma luteólise precoce; Através do uso sequencial de prostaglandinas e análogos da GnRH, para obter o desenvolvimento folicular sincronizado após indução de luteólise; Pelo uso de progestagéneos, que criam uma fase lútea artificial. 26

28 Introdução 7.1.Protocolos de sincronização do estro Indução do estro com prostaglandinas O efeito luteolítico da PGF 2α nas vacas foi inicialmente descrito na década de 70 (Inskeep, 1973; Hafs et al., 1974; Lauderdale et al., 1974; Wenkoff, 1975). Desde então a PGF 2α e os seus análogos sintéticos têm sido usados no controlo do ciclo em bovinos devido à sua capacidade para induzir a regressão do corpo lúteo e por consequência estimular o desenvolvimento de uma nova onda folicular ovulatória e a sincronização do estro (Odde, 1990; Murugavel et al., 2003a, Cavalieri et al., 2006). A administração de uma ou várias injecções de prostaglandina para regredir um corpo lúteo responsivo faz com que a vaca retorne ao estro em 2 a 7 dias (Figura 3) (Lauderdale et al., 1974; Santos et al., 2003). Para que o tratamento com PGF 2α seja bem sucedido, ou seja obtenha efeitos luteolíticos, as vacas devem estar na fase de diestro do ciclo éstrico. O corpo lúteo da vaca é geralmente responsivo à PGF 2α apenas após o quinto ou sexto dia do ciclo éstrico (Wenkoff, 1975; Diskin et al., 2002; Murugavel et al., 2003a; Cavalieri et al., 2006), e até ao dia 15-17, após o qual a luteólise endógena foi já desencadeada (Ball e Peters, 2004; Choudhary, 2005). A aplicação única de uma dose luteolítica de prostaglandinas obriga à identificação das vacas que apresentam um CL responsivo no ovário, para rentabilizar a aplicação do fármaco, mas o que consequentemente acarreta custos acrescidos (Ball e Peters, 2004; Cavalieri et al., 2006). Devido ao facto da PGF 2α não ter efeito sobre os folículos em desenvolvimento, e não ter também controlo sobre a onda de folículos emergente, as vacas num protocolo deste tipo entram em cio em dias diferentes depois da sua administração, havendo pouca precisão sobre o momento da inseminação ou da ovulação (Diskin et al., 2002; Santos et al., 2003; Cavalerie et al., 2006). O tempo desde a administração de PGF 2α à ovulação depende da maturidade e tamanho dos folículos da onda emergente, e ainda do facto de a onda existente já ter entrado no processo de atrésia. Se estiver presente um folículo dominante funcional por altura do tratamento, os animais entrarão em cio no espaço de 2 a 3 dias; no entanto, se os animais se encontrarem numa fase de pré-dominância da onda folicular será necessário um período adicional de 2 a 4 dias para que um folículo se torne dominante, o que alonga e torna mais variável o intervalo desde o tratamento ao início do cio (Diskin et al., 2002). Na tentativa de ultrapassar estes inconvenientes, foi desenvolvido um protocolo que consiste em duas administrações de PGF 2α dadas a intervalos de 7, 11 ou 14 dias. Neste protocolo as vacas que na primeira administração se encontrem numa fase do ciclo éstrico que não o diestro, apresentarão um corpo lúteo funcional no momento da segunda administração de PGF 2α (Figura 3) (Folman et al., 1990; Rosenberg et al., 1990; Kristula et al., 1992; Murugavel et al., 2003a). Em consequência, tem sido referenciada uma melhoria na eficiência 27

29 Introdução reprodutiva de vacas tratadas (Folman et al., 1990; Rosenberg et al., 1990) e uma maior taxa de concepção aos 30 dias (Folman et al., 1990) Alguns autores aconselham a administração de PGF 2α antes do final do período voluntário de espera (PVE) de modo a aumentar o desempenho reprodutivo das vacas e reduzir o número de dias em aberto (Pankowski et al., 1995; Stevenson, 2001; Santos et al., 2003). Stevenson (2001) recomenda a administração de PGF 2α 14 dias antes do fim do PVE; este autor não aconselha a inseminação das vacas após a primeira administração, ainda que mais de 50% das vacas exibam cio em resposta à primeira administração. A segunda administração, a ser realizada no final do PVE, possibilita a ocorrência do primeiro serviço numa altura em que as vacas já são elegíveis para a IA. Com um protocolo similar, Santos et al. (2003) obtiveram uma taxa de detecção de cios entre 50% a 60% tendo utilizado duas administrações de PGF 2α nos primeiros 50 dias do pós-parto, aconselhando a adopção deste regime protocolar nas explorações. A administração de PGF 2α durante o período inicial do pós-parto leva a um aumento das taxas de concepção ao primeiro serviço, o que poderá estar relacionada com os benefícios associados a uma melhoria da actividade uterina diminuindo desse modo o intervalo entre o parto e a concepção (Murugavel et al., 2003b; Kasimanickam et al., 2006). A administração de PGF 2α durante o período de pós-parto não só induz a luteólise, como estimula os mecanismos de defesa uterina, acelerando a expulsão das loccia e dos microrganismos que colonizam o útero no pós-parto (Kasimanickam et al., 2006). No entanto, Burton e Lean (1995), realizando uma metanálise sobre o efeito da prostaglandina F 2α, administrada no pós-parto sobre o desempenho reprodutivo de vacas de leite, concluíram que a administração sistémica de PGF 2α não diminui de forma significativa o número de dias em abertos, mesmo quando a sua aplicação se restringe a vacas com puerpério anormal (redução de 2,6 dias para todas as vacas e 3,3 dias para as vacas com puerpério anormal). Posteriormente, foi desenvolvido um protocolo de sincronização para vacas de leite em lactação no qual são administradas três injecções de PGF 2α (Figura 3). Neste protocolo, conhecido como Targeted Breeding, todos os animais que não foram detectados em cio após a primeira ou segunda administração de PGF 2α intervaladas de 14 dias, são tratados com uma terceira administração de PGF 2α aplicada com idêntico intervalo, sendo a IA realizada após detecção do cio ou realizada às 72 a 80 horas (Nebel e Jobst, 1998; Stevenson, 2001; Murugavel et al., 2003a). No entanto, a realização de inseminação artificial a tempo fixo (IATF) neste protocolo não produz taxas de gestação aceitáveis devido ao inconsistente desenvolvimento folicular e ovulação. Nos trabalhos de Nebel et al. (1994), a taxa de não retorno aos 75 dias foi de cerca de 36% quando as vacas foram inseminadas após o 28

30 Introdução tratamento com PGF 2α sem detecção de cio, em contraste com uma taxa de não retorno de 63.4% quando foram inseminadas com base na detecção de cio. (a) PGF 2α Detecção do cio e IA d d (b) PGF 2α Detecção do cio e IA PGF 2α Detecção do cio e IA d d (c) PGF 2α Detecção do cio e IA PGF 2α Detecção do cio e IA PGF 2α IA d 0 14 d 14 d h Figura 3 - Protocolos baseados no uso de PGF 2α para sincronização do estro em bovinos (adaptado de Cavalieri et al., 2006). (a) PGF 2α administrada apenas às vacas com um CL e detecção do cio nos próximos 2-7 dias; (b) 2 administrações de PGF 2α espaçadas 11 a 14 dias, detecção de cio e eventual IA realizadas nos 2-7 dias seguintes à administração de PGF 2α; (c) programa Targeted Breeding, administração de 3 doses de PGF 2α espaçadas em 14 dias, a IA é realizada após detecção de cio ou realizada 72 a 80 horas após a terceira administração de PGF 2α Controlo da onda folicular e indução do estro com prostaglandinas (Sincronização selectiva - Selectsynch) Uma maior precisão do início do estro será conseguida através do controlo da onda folicular emergente, o que permitirá que um folículo dominante seleccionado recentemente esteja presente no momento do tratamento com PGF 2α, imediatamente antes da indução do cio, conseguindo-se deste modo uma maior precisão do estro e uma taxa de concepção adequada (Santos et al., 2003). 29

31 Introdução O turnover folicular pode ser modulado através da administração de GnRH ou de estradiol. O tratamento das vacas com GnRH ou um seu análogo resulta num pico préovulatório de LH e na ovulação do folículo dominante, com subsequente recrutamento de uma nova onda de desenvolvimento folicular (Kesler e Constantaras, 2004). No entanto, o uso de GnRH para o recrutamento de uma nova onda folicular apenas será efectivo se o folículo dominante for responsivo à LH. Dez milímetros de diâmetro parece ser o tamanho mínimo para os folículos serem responsivos à LH (Ginther et al., 1996; Sartori et al, 2001). Quando a GnRH ou seus análogos são administrados com o objectivo de induzir a ovulação e recrutamento de uma nova onda folicular, observa-se uma melhor resposta se a administração ocorrer entre os dias 5 e 9 do ciclo (Vasconcelos et al, 1999), que coincide com o período de tempo em que o folículo dominante da primeira onda folicular é responsivo ao LH (Ginther et al., 1996). A utilização de GnRH seguida 7 dias mais tarde pela administração de uma dose luteolítica de PGF 2α resulta numa sincronização mais apertada do estro com uma elevada taxa detecção de cios (Santos et al, 2001). GnRH PGF 2α Detecção do cio + IA d 0 d 7 Figura 4 - Representação esquemática do protocolo Selecsynch Uma alternativa ao uso de GnRH é o recurso aos ésteres do estradiol, como o cipionato de estradiol (ECP) ou benzoato de estradiol (EB) (Santos et al., 2003). Estes têm uma actuação diferente consoante os níveis séricos de progesterona na altura da sua administração. Na presença de elevados níveis séricos de progesterona (provenientes de fonte endógena ou exógena) os ésteres de estradiol actuam de forma a reduzir a secreção de LH, induzem a atrésia do folículo dominante e a emergência de uma nova onda folicular. Na presença de níveis séricos baixos de progesterona, estes induzem a libertação de GnRH que por sua vez induz um pico de LH que promove a ovulação. O intervalo que decorre desde a administração dos ésteres de estradiol até à emergência de uma nova onda folicular depende da dose e da altura do ciclo éstrico em que estes são administrados (Lucy et al., 2004) Actualmente, com a preocupação com o uso de estrogénios em animais destinados ao consumo humano a sua utilização no maneio reprodutivo é limitada na Europa, ficando deste 30

32 Introdução modo a aplicação deste protocolo limitada geograficamente (Maillard, 2006; Lane et al., 2008; Espinosa, 2009) Sincronização da ovulação com progesterona e prostaglandinas O princípio subjacente à utilização da progesterona na sincronização do ciclo éstrico é o efeito de retroacção negativa que esta molécula exerce sobre a hipófise, inibindo a secreção de hormonas gonadotrópicas que por sua vez impedem o crescimento folicular e bloqueiam os ciclos éstricos (Espinosa, 2009). A progesterona pode ser administrada por via oral, em injecção em veículo oleoso (solução depósito) e através de dispositivos intravaginais. Contudo, em consequência da legislação europeia, apenas os dispositivos vaginais são passíveis de serem utilizados em Portugal. Os dispositivos impregnados com progesterona têm a capacidade de manter elevadas as concentrações circulantes desta hormona, exercendo o seu efeito de feedback negativo sobre a LH independentemente da presença de um corpo lúteo, permitindo a sincronização da onda folicular e o reinício de um novo ciclo após remoção do dispositivo (Santos et al., 2003). Os dispositivos variam na forma, desenho e na quantidade de progesterona com que estão impregnados, sendo os mais utilizados o CIDR e o PRID que usam progesterona para a sincronização do estro e indução da ciclicidade nas vacas. O CIDR (Pfizer) foi inicialmente introduzido na Nova Zelândia e foi desenhado para conter 1.9 g de progesterona. O PRID (Vétoquinol) contém 1.55 g de progesterona. Os protocolos em que se realiza a administração isolada de progesterona apresentam taxas de gestação relativamente baixas (Austin, 1999), o que pode ser revertido quando se lhe associa PGF 2α (Odde, 1990). O tratamento combinado de progesterona e PGF 2α apresenta como resposta um elevado número de vacas em cio, com mais de 80% das vacas que entram em cio a fazerem-no entre as 36 e 60 horas após a remoção do dispositivo (Diskin et al, 2002). Estes dispositivos intravaginais estão indicados na sincronização de novilhas e vacas pós-parto, especialmente para aquelas que mostram problemas no reinício do ciclo éstrico, sendo considerado o tratamento de eleição para animais em anestro (Zulu et al., 2000; Lane et al., 2008). O sucesso do tratamento nas vacas em pós-parto é muito variável (50-70%) e está muito dependente do intervalo desde o parto ao momento do tratamento, bem como da causa subjacente ao anestro (Diskin et al., 2002) Embora ainda não disponível em Portugal, surgiu recentemente no mercado um dispositivo de plástico intravaginal em cujo interior é possível encaixar uma matriz de silicone com 1.56 g de progesterona (Cue-Mate, Bioniche Animal Health; Rogan et al., 2007). Este dispositivo não apresenta uma haste de silicone impregnada com composto activo, mas a progesterona é colocada no dispositivo antes de ser introduzido no animal, apresentando a 31

33 Introdução vantagem adicional de permitir a reutilização da haste após a lavagem com um desinfectante usual (Hanlon et al., 2002; Cavalieri et al., 2004). As taxas de submissão e de fecundação encontradas em animais tratados com este dispositivo são semelhantes às do CIDR (92% vs 94% e 41% vs 43%, respectivamente) (Hanlon et al., 2002). Devido ao facto de concentrações de progesterona subluteais, como as que se obtêm com este tipo de dispositivos, tenderem a produzir folículos persistentes que resultam em baixa fertilidade (Savio et al., 1993; Austin et al, 1999), o uso dos dispositivos de progesterona não deve ultrapassar os 7 a 9 dias. O protocolo de tratamento mais comum é a inserção do CIDR ou de PRID por 7 dias associado à administração de PGF 2α no dia 6 ou 7. Este protocolo pode ser melhorado através da inclusão de uma administração de GnRH na altura da inserção do CIDR para favorecer o recrutamento de uma nova onda folicular (Figura 5) (Santos et al., 2003). CIDR PGF 2α Remoção do CIDR Detecção do cio e IA d 0 d 6 d 7 Figura 5 Representação esquemática do protocolo de sincronização à base de progesterona Protocolos de sincronização da ovulação Protocolo Ovsynch O protocolo Ovsynch foi desenvolvido por Pursley et al. (1995) com o propósito de permitir a inseminação artificial a tempo fixo sem a necessidade de detecção do cio. As estratégias para o controlo da ovulação são, até ao momento, baseadas no controlo do tempo de vida do CL pela PGF 2α, na estimulação do desenvolvimento folicular e na sincronização da ovulação, ou no impedimento do retorno ao estro usando tratamentos de progesterona. Parte destas abordagens foram integradas com o desenvolvimento do protocolo Ovsynch (Thatcher et al., 2006). O protocolo consiste na administração de GnRH ou análogos numa altura aleatória do ciclo éstrico (Santos et al., 2003). Esta administração de GnRH induz a ovulação ou luteinização do folículo dominante, dependendo da fase do ciclo éstrico em que a vaca se encontra, sincroniza a onda de folículos emergente e controla o estado de desenvolvimento do 32

34 Introdução folículo pré-ovulatório antes da administração da PGF 2α (Keith et al., 2005), que é realizada sete dias depois da administração de GnRH. A prostaglandina induz a regressão do corpo lúteo original e/ou do corpo lúteo recém-formado (Keith et. al., 2005; Tatcher et al., 2006). Quarenta e oito horas mais tarde realiza-se uma segunda administração de GnRH para induzir um pico pré-ovulatório de LH e a ovulação subsequente do folículo dominante no espaço de 24 a 32 horas (Peters et al., 1999; Murugavel et al., 2003a). A inseminação a tempo fixo, será realizada 12 a 16 horas após a segunda administração de GnRH (Figura 6) (Wiltbank, 2005a). GnRH PGF 2α GnRH IA d 0 d 7 d h Figura 6 Representação esquemática do protocolo Ovsynch Têm sido propostas algumas alterações a este protocolo, como sejam um intervalo diferente entre a administração da PGF 2α e a segunda administração de GnRH, ou o tempo desde da segunda administração de GnRH à IA (Pursley et al., 1998; Peters e Pursley, 2003). Os trabalhos de Peters e Pursley (2003) revelaram que intervalos curtos entre estas duas administrações se traduzem numa redução da fertilidade que se acompanha de uma elevada frequência de fases lúteas curtas, pelo que recomendam a administração de GnRH a um intervalo mínimo de 36 horas após a administração da PGF 2α. Noutro estudo demonstrouse haver uma tendência linear positiva entre o diâmetro do folículo pré-ovulatório e a taxa de gestação (Cavalieri et al., 2006). Os trabalhos desenvolvidos por Pursley et al. (1998), em que foi avaliada a fertilidade de animais tratados com intervalos diferentes entre a 2ª administração de GnRH e a IA (0h, 8h, 16h, 24h e 32h), revelaram que o intervalo de 16 horas foi o que apresentou melhores resultados. A partir das 24 horas, a fertilidade decai muito rapidamente, pelo que se deverá ter a preocupação de inseminar antes disso. No entanto, Lopez (2006) não encontrou diferenças nas taxas de concepção em vacas inseminadas às 16 ou às 24 horas depois da segunda administração de GnRH. Sem comprometer a eficácia do protocolo de sincronização, e permitindo uma redução de custos da sincronização, por vaca e por gestação, Fricke et al. (1998) recomendam uma dose de 50 μg de GnRH, em vez da dose tradicionalmente utilizada de 100 μg (Pursley et al, 1995). 33

35 Introdução A comparação da taxa de gestação em vacas leiteiras e novilhas tratadas com o protocolo Ovsynch e o protocolo de sincronização utilizando só administrações de PGF 2α (Pursley et al., 1997a; Pursley et al., 1997b; Stevenson et al., 1996; Fricke et al., 1998) não mostraram diferenças significativas no caso das fêmeas adultas (37.8% vs 38.9%, respectivamente), mas encontraram maiores taxas de gestação em novilhas para o protocolo de sincronização só com PGF 2α (74.4%) do que para o protocolo Ovsynch (35.1%) (Pursley et al., 1997a). Além disso, o valor de mediana para os dias parto/1ªia e para os dias em aberto foi mais baixa para as vacas submetidas ao protocolo Ovsynch em comparação com vacas inseminadas a seguir à detecção do cio (54 vs 83; P<0.001 e 99 vs 118; P<0.001, respectivamente) (Pursley et al., 1997b). A implementação da IATF com o protocolo Ovsynch para a primeira IA pós-parto melhorou o desempenho reprodutivo nas vacas de leite e a subsequente reinseminação a tempo fixo das vacas não gestantes, resultando num aumento na taxa de gestação. O resultado do uso do protocolo Ovsynch foi comparado com os resultados da monta natural, injecção única, dupla ou tripla de PGF 2α, e os protocolos Selectsynch, Heatsynch, e Ovsynch modificado (que serão descritos na secção seguinte), tendo sido concluído que as taxas de gestação para os protocolos Ovsynch não diferiram significativamente das taxas obtidas com a monta natural. Além disso, a probabilidade de concepção e gestação não diferiu significativamente entre o grupo Ovsynch e as vacas tratadas com prostaglandinas. A probabilidade de gestação em vacas sujeitas a tratamento com Ovsynch, Heatsynch, Selectsynch não diferiu significativamente (Rabbie et al., 2005). Este protocolo tem sido implementado com sucesso em várias explorações de vacas leiteiras como estratégia para a IA durante o primeiro serviço pós-parto, assim como para a reinseminação das vacas que não ficaram gestantes (Santos et al., 2003) Modificações ao protocolo Ovsynch Pré sincronização com IATF (Presynch) Quer a resposta ovulatória quer a função luteínica após indução da ovulação com GnRH estão dependentes da dimensão dos folículos ováricos no momento da administração. O recurso a um esquema de pré-sincronização optimiza o protocolo Ovsynch clássico, aumentando a probabilidade de a ovulação ser induzida pela primeira administração de GnRH e de que ocorra luteólise e uma melhor sincronização da ovulação aquando das administrações de PGF 2α e de GnRH no final do protocolo (Thatcher et al., 2002), o que permite melhorar a taxa de gestação uma vez que ocorre a indução de um folículo ovulatório com um período reduzido de dominância (Austin et al., 1999). 34

36 Introdução O protocolo Ovsynch evidencia maior eficiência quando iniciado entre os dias 5 e 12 do ciclo éstrico. Moreira et al. (2001) concebeu um protocolo de pré sincronização para optimizar a resposta ao protocolo Ovsynch através da administração de duas injecções de PGF 2α com 14 dias de intervalo em que a segunda injecção de PGF 2α é administrada 12 dias antes da primeira administração de GnRH do protocolo de IATF. PGF 2α PGF 2α GnRH PGF 2α GnRH IA d d +12 d +7 d +2 d h Figura 7 Representação esquemática do protocolo Ovsynch modificado com inclusão de um esquema de présincronização. O que se pretende com a pré-sincronização é aumentar a proporção de vacas na fase lútea inicial ou intermédia do ciclo éstrico na altura em que se inicia o protocolo Ovsynch (Kasimanickam et al., 2006), tendo sido demonstrado que com ele se obtém uma melhor taxa de concepção (Moreira et al., 2001; El-Zarkouny et al., 2004; Navanukraw et al., 2004). A présincronização de vacas de leite com duas administrações de PGF 2α intervaladas de 12 a 14 dias antes de se iniciar o protocolo Ovsynch pode aumentar de forma significativa, em mais de 10 pontos percentuais, a taxa de gestação (Moreira et al., 2001; Navanukraw et al., 2004; Maillard, 2006). Também El-Zarkouny et al. (2004) demonstraram que a pré-sincronização de vacas cíclicas antes da administração de GnRH baseada num protocolo com a inserção de CIDR melhora a taxa de gestação comparativamente com as alcançadas sem présincronização (46.8% e 37.5%, respectivamente). Os protocolos de pré-sincronização só serão eficientes em vacas que já tenham recuperado ciclicidade. No entanto, o sucesso dos protocolos de pré-sincronização com IATF para o primeiro serviço varia de exploração para exploração, dependendo do grau de anestro e da execução na implementação da sequência de tratamentos (Lucy et al., 2004). Acrescentam-se ainda as vantagens que apresenta para o estatuto uterino, de um melhor crescimento do folículo pré-ovulatório e na diminuição da taxa de morte embrionária (Lucy et al., 2004; El-Zarkouny et al., 2004; Stevenson, 2005; Cavalieri et al., 2006). 35

37 Introdução Co-sincronização (Cosynch) O protocolo Cosynch é também um protocolo Ovsynch modificado em que a IA é realizada na mesma altura em que as vacas recebem a segunda administração de GnRH (48 horas após a administração da PGF 2α ) (Geary e Whittier, 1998). GnRH PGF 2α GnRH + IA d 0 d 7 d 9 Figura 8 Representação esquemática do protocolo Cosynch. Este protocolo apresenta como principal vantagem o facto de reduzir o número de vezes que se manuseia os animais (Brusveen et al., 2007). No entanto, apresenta uma taxa de concepção mais baixa do que quando as vacas são inseminadas a tempo fixo, 16 a 24 horas depois da segunda injecção de GnRH (Ovsynch clássico) (Geary e Whittier, 1998; Lopez, 2006). Para tentar contornar este inconveniente, Stevenson et al. (2004) apresentaram uma variação ao protocolo Cosynch, em que a segunda administração de GnRH e a IA são realizadas 72 horas após a administração da PGF 2α. Stevenson et al. (2004) concluíram que atrasar a injecção de GnRH e a IA até 72 horas após PGF 2α aumenta a taxa de gestação comparativamente ao protocolo Presynch-Ovsynch com a injecção de GnRH e IA 48 horas após a PGF 2α (35% vs 23%), tendo os seus resultados sido posteriormente confirmados por Alnimer et al. (2009). Uma justificação pode ser o facto de o dia adicional favorecer o crescimento folicular e desta forma permitir uma maturação adicional do oócito e a ovulação de um folículo de maiores dimensões (Lopez, 2006). No entanto, num estudo realizado por Sterry et al. (2007) não se encontraram diferenças entre os dois tratamentos. As taxas de concepção para este protocolo podem ser optimizadas utilizando-se em combinação um bom programa de detecção de cios. Estudos com este protocolo reportam entre 38% e 51% das vacas a demonstrarem cio no segundo dia depois da administração da PGF 2α. É importante ter em consideração que as vacas que evidenciam comportamento de cio durante o protocolo necessitam ser identificadas e beneficiadas no momento correcto, pelo que a IATF neste protocolo deve servir sobretudo como forma de inseminação das vacas cujos cios não foram detectados atempadamente (Lopez, 2006). 36

38 Introdução Ovsynch de 56 horas Esta é uma outra variação do protocolo Ovsynch, desenvolvida na Universidade de Wisconsin-Madison. Neste protocolo as vacas recebem a segunda administração da GnRH 56 horas depois da administração da PGF 2α e a IATF 16 horas depois da administração da GnRH (Brusveen et al., 2007). A razão deste protocolo é também proporcionar tempo adicional para a maturação folicular, além de optimizar o tempo da IA em relação à segunda administração de GnRH (Lopez, 2006). As taxas de concepção com este protocolo, foram melhores ao primeiro serviço e à resincronização comparativamente com as vacas IATF submetidas a protocolos de Cosynch (48 e 72 horas) (Brusveen et al., 2007) GnRH PGF 2α GnRH IA d 0 d h +16 h Figura 9 Representação esquemática do protocolo Ovsynch de 56 horas. As principais desvantagens na implementação do protocolo de 56 horas é o facto de a segunda administração de GnRH ser aplicada nas vacas num momento que não se ajusta ao programa regular do maneio reprodutivo. É muito importante avaliar se as administrações podem ser realizadas no momento adequado antes de se adoptar este protocolo, pois a mudança de rotina pode criar um problema na realização da administração da injecção que se reflectem em resultados decepcionantes. Para explorações intensivas uma boa opção para a administração da segunda injecção de GnRH é a sua aplicação quando as vacas saem da sala de ordenha, nos corredores de saída (Lopez, 2006) Ovsynch associado à progesterona A conjugação do protocolo Ovsynch à administração de progesterona aumentou a taxa de gestação aos 29 dias em comparação com o protocolo Ovsynch (36.3% e 59.3%, respectivamente) (El-Zarkouny et al., 2004). Resultados similares foram também encontrados por Stevenson et al. (2006), que observaram um aumento da taxa de concepção aos 28 dias quando compararam os mesmos protocolos (40.0% vs 50.0%). Uma pequena percentagem de vacas cíclicas manifestam cio prematuramente durante o protocolo Ovsynch, razão pela qual se utilizam progestagénios entre a primeira administração de GnRH e a de PGF 2α, impedindo 37

39 Introdução um estro precoce e a ovulação prematura, melhorando a sincronização (Lucy et al., 2004; Stevenson, 2005; Maillard, 2006). CIDR + GnRH Remoção do CIDR + PGF 2α GnRH IA d 0 d 7 d h PGF2α Figura 10- Representação esquemática do protocolo Ovsynch associado à progesterona Protocolo Heatsynch Como alternativa ao protocolo Ovsynch surgiu ainda o protocolo Heatsynch, que combina uma administração de ésteres de estradiol (ECP) no final do protocolo, 24 horas após a administração da PGF 2α. Este protocolo induz uma ovulação sincrona (Thatcher et al., 2002; Stenvenson et al., 2004), sendo a IATF realizada 48 horas após a administração do ECP (Pancarci et al., 2002). O uso de ésteres de estradiol é uma estratégia alternativa para o controlo do tempo da ovulação, passível de ser utilizada em países em que o emprego de esteróides não está condicionada, devido à capacidade do estradiol exógeno para induzir um pico de LH com uma duração aproximada de 10 horas, se administrada num ambiente com baixos níveis de progesterona. Este pico é similar a um pico de LH espontâneo observado durante o estro, mas mais longo que o observado após a administração de 100 μg de GnRH (gonadorelina) que é geralmente usada no protocolo Ovsynch (Santos et al., 2003). A fertilidade com o protocolo Heatsynch é similar à do Ovsynch, mas as vacas com o protocolo Heatsynch, que não demonstrem sinais de cio, antes ou na inseminação artificial a tempo fixo, apresentam baixa fertilidade (Pancarci et al., 2002) Protocolo hcg-synch Uma alteração recente ao protocolo Ovsynch foi a substituição da segunda administração de GnRH, por hcg (Rensis et al., 2002). 38

40 Introdução GnRH PGF 2α hcg IA d 0 d 7 d h Figura 11- Representação esquemática do protocolo hcg-synch A gonadotropina coriónica humana apresenta uma actividade similar à da LH e promove a ovulação do folículo dominante (Santos et al., 2001). A hcg apresenta uma semi-vida mais longa do que a da LH, mantendo o folículo sob uma dominância trópica mais prolongada (Rensis et al., 2002). Assim, uma estimulação mais prolongada dos receptores foliculares para a LH, devido à acção da hcg, mantendo as concentrações plasmáticas marcadamente aumentadas por cerca de 30 horas após a sua administração, poderá favorecer a luteinização das estruturas folículares após a ovulação quando comparada com a obtida através da administração de GnRH, e assim permitir reduzir a incidência de mortalidade embrionária. A administração do análogo de GnRH induz um pico de LH de apenas 5 horas em novilhas, o qual é aproximadamente metade do pico de LH que ocorre naturalmente (10 horas), podendo ainda assim resultar na indução de uma estimulação completa do folículo ovulatório e formação completa do corpo lúteo funcional, com uma vida normal (Schmitt et al., 1996; Rensis et al., 2002). Embora estes autores não tenham encontrado diferenças entre a GnRH e a hcg para induzir a ovulação nem para o aumento das taxas de gestação após a IATF, preconizam o uso de GnRH para a sincronização da ovulação, quer devido ao seu baixo custo quer ao risco de formação de auto-anticorpos associada a administrações sucessivas de hcg. Quando aplicado em vacas de leite com quistos ováricos observou-se um efeito positivo da hcg na taxa de gestação cumulativa quando comparado com o protocolo Ovsynch, mas apenas nas alturas do ano de maior calor (Rensis et al., 2008). 39

41 Resposta a um esquema Ovsynch modificado em vacas de leite Parte II - Avaliação da resposta a um esquema Ovsynch modificado em vacas de leite na região de entre o Douro e Minho de Portugal 40

42 Resposta a um esquema Ovsynch modificado em vacas de leite 1. Introdução O protocolo Ovsynch foi o primeiro protocolo de inseminação artificial a tempo fixo (IATF) a ser desenvolvido para bovinos (Pursley et al., 1995) e é actualmente um dos mais usados. Com este tipo de protocolos consegue-se a inseminação das vacas num momento fixo e pré-determinado sem necessidade de detecção de cio, o que facilita o maneio além de permitir estabelecer objectivos relativamente ao número mínimo de vacas a inseminar num deternimado momento do período pós-parto. Apresentam ainda como vantagem a possibilidade de se inseminar vacas que não foram detectadas em cio, possibilitando a redução dos dias em aberto. Embora a finalidade dos protocolos de sincronização seja a inseminação de grupos de vacas de uma forma síncrona, a maioria dos produtores em Portugal usam este tipo de protocolos de forma individual quando as vacas não são detectadas em cio ou não ficam gestantes após uma ou duas inseminações artificiais consecutivas. Em consequência, e dado que a detecção de cios é ainda uma das principais causas de insucesso reprodutivo em Portugal, acrescido ao facto de a maioria das vacas tratadas serem animais com problemas reprodutivos em vez de animais padrão (sem problemas de fertilidade), o sucesso dos protocolos reprodutivos mantém-se geralmente muito aquém do esperado. No entanto, há que salientar que esta não é de todo a finalidade deste tipo de protocolo, já que não foram desenvolvidos com o objectivo de tratar a infertilidade ou eventuais doenças reprodutivas. Neste trabalho procurou-se avaliar o sucesso de um protocolo modificado de sincronização da ovulação em duas explorações no concelho de Vila do Conde, através da análise comparativa das taxas de gestação entre grupos de animais sincronizados e animais co-habitantes não tratados (controlos) e ainda avaliar o reflexo da utilização deste protocolo na taxa global de gestação em ambas as explorações. 41

43 Resposta a um esquema Ovsynch modificado em vacas de leite 2. Material e métodos 2.1. Caracterização das explorações Para este trabalho foram utilizadas fêmeas de raça Holstein pertencentes a duas explorações da área geográfica do Concelho de Vila do Conde. A exploração A, com um total de 232 animais e 103 vacas em ordenha, apresentou no ano de 2009 uma produção média de leite aos 305 dias de 9821 kg, (Quadro 2). Nesta exploração os tratamentos foram realizados no período de Agosto a Outubro de 2009, embora se tenham também utilizado os dados retrospectivos da exploração relativos ao período compreendido entre Dezembro de 2006 e Dezembro de 2009 para a análise dos parâmetros reprodutivos. A exploração B possui um total de 360 animais, com 183 fêmeas em ordenha, e uma produção média de leite aos 305 dias, no ano de 2009, de kg (Quadro 2). Nesta exploração os tratamentos foram realizados entre Julho e Outubro de 2009, tendo-se ainda recolhido para análise os dados relativos ao período entre Junho de 2007 e Dezembro de Os dados apresentados para a caracterização das explorações A e B quanto à produção média de leite aos 305 dias, ao intervalo médio entre partos (IEP), ao intervalo médio parto primeira IA, ao intervalo médio parto IA fecundante e número médio de IA por fecundação (Quadro 2) foram fornecidos pela Associação de Apoio à Bovinicultura Leiteira do Norte (ABLN), enquanto o período voluntário de espera (PVE) foi fornecido pelo proprietário. Quadro 2 Caracterização geral das explorações A e B no que respeita à produção média de leite aos 305 dias no ano de 2009, e alguns dos parâmetros reprodutivos utilizados na sua selecção. Exploração Parâmetros A B Nº animais Produção média de leite aos 305 d (kg) IEP (dias) PVE (dias) Intervalo Parto-1ªIA médio (dias) Intervalo Parto-fecundação médio (dias) Nº IA/fecundação

44 Resposta a um esquema Ovsynch modificado em vacas de leite As instalações da exploração A compreendem um pavilhão com cerca de 1000 m 2 e um parque semi-coberto de 375 m 2. O pavilhão é composto por dois compartimentos grandes. O maior encontra-se dividido em dois espaços separados por um corredor central por onde circulam as máquinas agrícolas necessárias às tarefas de maneio. No espaço maior, com uma área de 650 m 2, encontram-se as vacas em produção confinadas em regime semi-livre, coberto, com piso de cimento riscado. No espaço menor, com uma área total de 200 m 2, existem 10 celas com capacidade para 5 animais cada, onde estão alojadas as novilhas de recria. A divisão mais pequena possui uma área de 60 m 2, dividida em celas individuais, onde se encontram alojadas as vitelas. No parque semi-coberto encontram-se as vacas secas. Estas têm acesso a um parque de exercícios, ao ar livre e com piso de terra. A exploração B é constituída por um pavilhão com cerca de 700 m 2 e um parque de exercícios ao ar livre de 400 m 2 com piso de cimento riscado, onde se encontram as vacas em produção. Apresenta um corredor lateral por onde circulam as máquinas agrícolas necessárias às tarefas de maneio. Existe um outro pavilhão com cerca de 600 m 2 que se encontra dividido por um separador em duas partes iguais. Numa das partes estão estabuladas as vacas secas e no outro estão vacas em produção. As vacas que estão prestes a parir encontram-se numa área coberta com 100 m 2. Existe ainda numa área de cerca de 120 m 2 um viteleiro com celas individuais com capacidade para 30 vitelos. As novilhas de recria encontram-se alojadas noutro local, um pavilhão com uma área total de 300 m 2. O pavilhão apresenta um corredor lateral e 4 celas com capacidade para 12 animais cada. Em ambas as explorações, a alimentação dos animais é feita de modo igual ao longo do ano, variando apenas em função do estado fisiológico do animal, o nível de produção de leite e a qualidade da silagem. A dieta é à base de silagem de milho, palha e uma mistura, estando sob responsabilidade do Engenheiro Zootécnico que presta apoio às explorações. A mistura é constuída fundamentalmente por semente de algodão, glúten de milho, soja e polpa de citrinos. A distribuição de alimento é feita duas vezes por dia, com recurso a um unifeed, a primeira dose após a ordenha da manhã e a outra após a ordenha da tarde. Em ambas as explorações os animais são vacinados com Bovilis IBR, Bovilis BVD e Bovilis Bovipast RSP da Intervet. Na exploração A os animais são vacinados a cada 6 meses contra a Rinotraquite Infecciosa Bovina (IBR) e Vírus Sincicial Respiratório Bovino (BRSV) e a cada 8 meses contra o Vírus da Diarreia Bovina (BVD). As desparasitações são realizadas pontualmente não se adoptando um esquema específico. Na exploração B realizam-se as vacinações contra IBR, BRSV e BVD de 6 em 6 meses, e os animais são desparasitados anualmente. Em ambas as explorações o desparasitante utilizado é a Eprinex (eprinomectina; Merial). 43

45 Resposta a um esquema Ovsynch modificado em vacas de leite 2.2. Tratamentos Para este estudo, foram utilizadas vacas repetidoras (animais com mais de 4 inseminações artificiais na mesma época reprodutiva), animais que não responderam a um tratamento anterior com PGF 2α, vacas que não manifestaram comportamento de cio no final do PVE e animais com uma ou duas inseminações e diagnosticados como não gestantes em um ou dois exames consecutivos. A condição corporal das vacas foi avaliada e foram excluídas do estudo as vacas com condição corporal inferior a 2 numa escala de 1 a 5 (vacas que se sabe terem predisposição para não responderem aos tratamentos de implementação reprodutiva e os produtores nestes animais pretenderem alargar o período voluntário de espera). Os dados relativos à resposta ao tratamento em cada exploração foram comparados com os dados obtidos com base nos registos da exploração, para um grupo de animais controlo, semelhantes em termos de idade, paridade e produção. Em cada uma das explorações, os animais seleccionados para os tratamentos foram dividos em dois grupos, constituídos de forma aleatória. Num dos grupos utilizou-se o protocolo Ovsynch (Grupo 1) e no outro grupo o protocolo Ovsynch modificado (Grupo 2). No protocolo Ovsynch, ao dia 0 os animais receberam uma injecção IM de 5 ml de um análogo da GnRH (buserelina; Receptal, Intervet), na tarde do dia 8 uma injecção IM de um análogo da PGF 2α (cloprostenol; Estrumate, Intervet), no dia 9 uma injecção IM de 5 ml de Receptal de tarde e passadas horas procedeu-se à inseminação artificial (Figura 12). GnRH Receptal 5 ml PGF 2α Estrumate 2 ml GnRH Receptal 5ml IATF d 0 d 8 d h Figura 12 - Esquema do protocolo Ovsynch implementado nas duas explorações. No protocolo Ovsynch modificado, procedeu-se de igual modo, com excepção da segunda administração do análogo da GnRH que foi substituída por uma administração IM de 1500 UI de hcg (Chorulon, Intervet) (Figura 13). 44

46 Resposta a um esquema Ovsynch modificado em vacas de leite GnRH Receptal 5 ml PGF 2α Estrumate 2 ml hcg Chorulon 1500UI IATF d 0 d 8 d h Figura 13- Esquema do protocolo Ovsynch-modificado utilizado. Antes de implementar os tratamentos, a condição corporal de todas as fêmeas foi avaliada e a actividade ovárica, grau de involução uterina, ciclicidade e presença de um corpo lúteo nos ovários foi avaliada por palpação transrectal. Em ambas as explorações, a observação do retorno ao cio dos animais tratados foi realizada pelo proprietário, em particular de manhã e à noite, e de uma maneira geral inespecífica ao longo de todo o dia, em simultâneo com a realização de outras tarefas. Depois de cada tratamento procedeu-se ao diagnóstico ecográfico de gestação, realizado por volta dos 30 dias, com confirmação posterior aos cerca de 45 dias, desta vez por palpação transrectal. No grupo controlo a palpação transrectal foi realizada entre os dias 45 e 60, em função do dia de visita à exploração. Os dois tratamentos, protocolo Ovsynch e protocolo Ovsynch modificado, foram realizados em ambas as explorações Animais Para este trabalho utilizaram-se os dados de animais tratados durante o período de estágio em cada uma das explorações (n= 5 na exploração A e n= 16 na exploração B) e ainda os dados rectrospectivos dos animais tratados com o protocolo Ovynch durante o período de Janeiro a Abril de 2009 (n=16 tanto na exploração A como na B). Como controlos, seleccionaram-se 27 animais na exploração A e 43 animais na exploração B, com características similares, na medida do possível, nomeadamente idade, número de lactações e condição corporal, relativamente aos quais se recolheram os mesmos dados que para as vacas submetidas a tratamento. A distribuição dos animais pelos tratamentos foi feita segundo determinação do proprietário, de modo aleatório, sem um critério de escolha objectivo e sempre independente do Veterinário assistente. Na exploração A, o protocolo Ovsynch foi implementado em 18 animais, com idades compreendidas entre os 2 e os 8 anos, e uma produção média de leite de kg. O protocolo Ovsynch modificado foi realizado em 4 animais na exploração A, com idades compreendidas entre os 3 e os 7 anos e com uma produção de leite média aos 305 dias de 45

47 Resposta a um esquema Ovsynch modificado em vacas de leite kg. Um dos animais que realizou o protocolo Ovsynch modificado foi submetido posteriormente ao protocolo Ovsynch sendo a sua resposta estudada em ambos os grupos de tratamento. Na exploração B, o protocolo Ovsynch foi implementado em 26 animais com idades compreendidas entre os 2 e os 8 anos e com uma produção média de leite aos 305 dias de 9924 kg. Das vacas incluídas no protocolo Ovsynch, duas repetiram o protocolo. O protocolo Ovsynch modificado foi realizado em 5 animais na exploração B, com idades compreendidas entre os 2 e os 4 anos e com uma produção média de leite aos 305 dias de kg Registo de dados e análise estatística Para cada animal foi elaborado uma folha de registo que incluiu, além da sua identificação (número de identificação nacional e número de casa), e registos reprodutivos anteriores (o número de partos e abortos, o número de IA/concepção), as datas das inseminações artificiais realizadas e as datas e resultados dos diagnósticos de gestação subsequentes. Os registos foram elaborados individualmente para os animais dos grupos tratados e também para o grupo controlo. Os dados relativos à resposta ao tratamento, efectuada com base na taxa de gestação, foram avaliados e comparados para os dois protocolos, com os dos animais controlos e com a taxa de gestação média da exploração. A análise estatistica foi feita com recurso ao programa SPSS 11.5, com um nível de probabilidade (p)<0.05 como estatisticamente significativo para todos os testes utilizados. Algumas vacas incluídas neste estudo não apresentavam a produção de leite acumulada aos 305 dias por terem sido secas antes disso ou por ainda não terem atingido os 305 dias nessa lactação. De forma a uniformizar o parâmetro foram calculadas as curvas de lactação dessas vacas através do modelo de Wood s. As taxas de gestação foram comparadas entre grupos pelo teste estatístico do Quiquadrado (χ 2 ), enquanto que o efeito do número de lactações, da exploração e do diagnóstico de gestação na produção de leite aos 305 dias foram avaliados através do teste estatístico Bonferroni. Para avaliação dos outros parâmetros reprodutivos (IEP; intervalo parto primeira IA, intervalo parto IA fecundante e número de IA por concepção) foram avalidados através da análise de variância simples. 46

48 Resposta a um esquema Ovsynch modificado em vacas de leite 3. Resultados Neste trabalho foi comparada a prestação reprodutiva de um grupo de animais submetido a um tratamento de Ovsynch modificado (n=9) com a registada para um grupo tratado com o protocolo Ovsynch tradicional (n=44) e para um grupo padrão ou controlo (n=70). Os animais encontravam-se localizados em duas explorações da área geográfica de Vila do Conde, que se procurou que fossem semelhantes no que respeitava ao efectivo, nº de lactações e produções médias de leite aos 305 dias. No quadro 3 apresentam-se os dados globais das explorações onde se implementaram os protocolos e os grupos de animais tratados e controlo em cada uma das explorações. Quadro 3 Caracterização geral dos grupos controlo, 1 e 2 da exploração A e B quanto à idade, produção de leite, número de partos. Idade (anos) Nº lactações Nível produtivo (kg leite/305 d) A B n Média Mín-Máx Média Mediana Média Mín Máx Controlo Grupo Grupo Global* Controlo Grupo Grupo Global* *Uma vez que estes dados foram fornecidos pela ABLN, que não faz projecção das curvas de lactação aos 305 dias, estes valores não dizem respeito à totalidade da exploração mas apenas aos animais com lactações de 305 dias. O grupo controlo da exploração A era constituído por 27 animais com idades compreendidas entre os 2 e os 9 anos, apresentando uma produção média de leite aos 305 dias de 9649 kg (variando entre 7826 kg e kg). Este grupo inclui vacas com 1 até 6 partos. Nesta exploração o grupo 1 (protocolo Ovsynch) era constituído por 18 animais com idades compreendidas entre os 2 e os 8 anos, com uma produção média de leite aos 305 dias de kg (variando entre 9041kg e kg; Quadro 3). Relativamente ao número de partos, foram incluídas neste grupo vacas com 1 até 6 partos. O grupo 2 era constituído por 4 animais com idades entre os 3 e os 7 anos, com uma produção média de leite aos 305 dias de kg (oscilando entre kg e kg; Quadro 3). Das 4 vacas incluídas neste grupo uma tinha 1 parto, duas tinham 2 partos e uma outra tinha 6 partos. Na exploração B o grupo controlo era constituído por 43 animais com idades compreendidas entre os 2 anos e os 8 anos e com uma produção média de leite aos 305 dias de kg (limite inferior de 7220 kg e limite superior de kg; Quadro 3). Este grupo incluiu vacas com 1 a 6 partos. Nesta exploração, o grupo 1 era constituído por 26 vacas com 47

49 Resposta a um esquema Ovsynch modificado em vacas de leite idades compreendidas entre os 2 anos e os 8 anos com uma produção média de leite aos 305 dias de 9224 kg (limite inferior de 7815 kg e limite superior de kg; Quadro 3). Neste grupo incluíam-se vacas com 1 a 7 partos. O grupo 2 nesta exploração era constituído por 5 vacas com idades compreendidas entre os 2 anos e os 4 anos e com uma produção média de leite aos 305 dias de kg (limite inferior de 8379 kg e limite superior de kg; Quadro 3). Este grupo incluía vacas com 1 até 3 partos. No quadro 4 resumem-se os parâmetros reprodutivos, respeitantes ao parto anterior à introdução no estudo, dos animais que integraram os grupos controlo e os dois grupos de tratamento para ambas as explorações A e B, nomeadamente no que respeita ao intervalo parto/ia fecundante e número de IA. Quando se procedeu à análise estatística não foram encontradas diferenças estatisticamente significativas entre os grupos de ambas as explorações em nenhum dos parâmetros reprodutivos, nomeadamente intervalo P/IA fecundante e NºIA/fecundação (p>0.05 para ambas as explorações e para estes dois parâmetros). Quadro 4 Pârametros reprodutivos relativos ao parto anterior à introdução no estudo para o grupo controlo, e para os grupos 1 e 2 para ambas as explorações. Indicador Exploração Média Desvio Padrão Mediana n Controlo A Grupo Intervalo Grupo P/IAFecundante Controlo B Grupo Grupo Controlo A Grupo NºIA/Fecundação Grupo Controlo B Grupo Grupo No quadro 5 apresentam-se os dados relativos ao número de IA a que os animais foram sujeitos antes de serem submetidos aos protocolos Ovsynch e Ovsynch modificado. Estatisticamente não se encontraram diferenças significativas entre os grupos em ambas as explorações (p>0.05). 48

50 Resposta a um esquema Ovsynch modificado em vacas de leite Quadro 5- Número de IA antes de implementados os protocolos Ovsynch e Ovsynch modificado Indicador Exploração Média Desvio Padrão Mediana n IA antes dos protocolos A B Grupo Grupo Grupo Grupo No quadro 6 resumem-se os parâmetros reprodutivos relativos aos grupos controlo, e grupos 1 e 2 para as explorações integradas neste estudo, nomeadamente: parto primeira IA, parto IA fecundante, intervalo entre partos e número de IA por concepção. A análise estatística efectuada para estes parâmetros encontrou diferenças estatisticamente significativas tanto na exploração A como na B para o P-IAF (p=0.003 e p=0.016, respectivamente) e para o IA/C (p=0.015 e p=0.014, respectivamente) entre o grupo controlo e o grupo 1. Para além destas foram encontradas diferenças estatisticamente significativas, apenas para a exploração B, entre o grupo controlo e o grupo 2 no que respeita ao P-IAF (p=0.03) e ao P-1ª IA (p=0.039) e entre o grupo 1 e o grupo 2 relativas ao P-1ª IA (p=0.009). No quadro 7 encontram-se as taxas de gestação relativas aos 3 grupos considerados e ao total da exploração, para cada uma das explorações em estudo. A taxa de gestação foi superior para o grupo 1 (50% e 77.78%) comparativamente com o grupo 2 (25% e 20%) para a exploração A e B respectivamente, se bem que não tenham sido encontradas diferenças estatísticas na exploração A (p=0.364) contrariamente ao observado na exploração B (p=0.013). Na exploração A, a taxa de gestação para o grupo controlo (62,96 %) foi superior à taxa de gestação de ambos os grupos de tratamento (50% vs 25%, respectivamente para os grupos 1 e 2; Quadro 8) apesar de esta diferença não ter significado estatístico (p=0.312). Na exploração B a taxa de gestação foi maior no grupo 1 do que no grupo controlo (77.78% vs 69.77%) embora esta diferença não tenha significado estatístico (p=0.519). Na exploração B, a taxa de gestação encontrada para o grupo 2 foi significativamente inferior à do outro grupo de tratamento (p=0.013) e à do grupo controlo (p=0.028). 49

51 Resposta a um esquema Ovsynch modificado em vacas de leite Quadro 6 Parâmetros reprodutivos relativos aos grupos controlo, e grupos 1 e 2 para cada uma das explorações. Índice Exploração Grupo Média Desvio Padrão Mediana n P-1ª IA (d) P- IAF (d) IEP d IA/C A B A B A B A B Controlo Grupo Grupo Controlo Grupo Grupo Controlo Grupo Grupo Controlo Grupo Grupo Controlo Grupo Grupo Controlo Grupo Grupo Controlo Grupo Grupo Controlo Grupo Grupo Quadro 7 - Taxas de gestação relativas à exploração e aos grupos controlo, 1 e 2 para as explorações A e B. Exploração Taxa de gestação da exploração n Controlo n Grupo 1 n Grupo 2 n A 65.51% % 27 50% 18 25% 4 B 62.96% % % 27 20% 5 A taxa de gestação do global da exploração (Quadro 8) foi ligeiramente superior à do grupo controlo na exploração A (65.51% vs 62.96%) mas não na exploração B (62.96% vs 69.77%), contudo estas diferenças não têm significado estatístico (p>0.05). Por outro lado, quando comparadas com a taxa de gestação global da exploração (65.51%), as taxas de gestação dos grupos 1 e 2 na exploração A são-lhe inferiores (50% vs 25%, respectivamente) ainda que sem significado estatístico (p=0.171). Já na exploração B a taxa de gestação global da exploração (62.96%) foi superior à taxa de gestação do grupo 2 (20%) mas inferior à taxa de gestação do grupo 1 (77.78%). Também aqui não foram encontradas diferenças significativas 50

52 Resposta a um esquema Ovsynch modificado em vacas de leite entre os grupos e os outros animais da exploração (p=0.122 e p=0.052 para os grupos 1 e 2, respectivamente). No quadro 8 apresentam-se os dados relativos aos resultados dos diagnósticos de gestação realizados nos animais do grupo controlo, e dos grupos de tratamento1 e 2 nas duas explorações estudadas. Para o diagnóstico de gestação foram contabilizadas as informações obtidas por palpação e ecografia transrectais, realizadas no âmbito dos tratamentos, mas ainda o retorno ao cio detectado pelo proprietário. Na exploração A o registo de diagnósticos de gestação positivos foi inferior em todos grupos (25%, 42.86% e 25% para o grupo controlo, grupo 1 e grupo 2, respectivamente) relativamente aos diagnósticos de gestação negativos. Não foram encontradas diferenças estatisticamente significativas entre os grupos (p=0.28) Quadro 8 - Percentagens para o global dos diagnósticos de gestação, incluindo diagnósticos de gestação por exame ginecológico ou através do retorno ao cio, das explorações A e B. Controlo Grupo 1 Grupo 2 Grupos Exploração Dignóstico de gestação (%) Positivo Negativo A B Total A B Total A B Total Global da Exploração A Global da Exploração B n Na exploração B o registo de diagnósticos de gestação positivos foi inferior no grupo controlo e no grupo 2 (36.14% e 20%, respectivamente) ao contrário do sucedido no grupo 1 em que a percentagem de diagnósticos positivos foi superior aos negativos (71.43% vs 28.57%). Foram encontradas diferenças estatisticamente significativas entre o grupo controlo e o grupo 1 (p=0.001) e entre o grupo 1 e 2 (p=0.028). No global do grupo controlo e do grupo 2 verificou-se uma percentagem inferior de diagnósticos de gestação positivos (31.13% e 22.22%, respectivamente) relativamente aos diagnósticos de gestação negativos. Contrariamente, no grupo 1 a percentagem de diagnósticos positivos foi superior à percentagem de diagnósticos negativos (59.18% vs 40.82%). Estatisticamente foram encontradas diferenças significativas na percentagem de 51

53 Controlo Grupo 1 Grupo 2 Controlo Grupo 1 Grupo 2 Resposta a um esquema Ovsynch modificado em vacas de leite diagnósticos de gestação positivos e negativos entre o grupo controlo e o grupo 1 (p=0.0004) e entre o grupo 1 e 2 (p=0.04). Relativamente ao global da exploração verificou-se que em ambas as explorações a percentagem de diagnósticos de gestação positivos foi inferior à de diagnósticos de gestação negativos, 29.03% vs 70.97% e 43.97% vs 56.03% para as explorações A e B respectivamente. Foram encontradas diferenças estatisticamente significativas na percentagem de diagnósticos de gestação positivos e negativos entre a exploração A e B, p= Na figura 14 estão representadas em gráfico as taxas de gestação encontradas para os grupos controlo e os dois grupos tratados na exploração A e B. 100% 80% 60% 40% 20% Não gestantes Gestantes 0% Exploração A Exploração B Figura 14 Representação gráfica da taxa de gestação do grupo controlo, grupo 1 e grupo 2 da exploração A e B. 52