A importância da metrologia química nos resultados das análises de resíduos
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- Marta Delgado Angelim
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1 QUALIDADE EM CROMATOGRAFIA (QUALI) / PONTO DE VISTA A importância da metrologia qímica no reltado da análie de reído Flávio Leite Editor Ocar Bahia Filho TQW Conltoria em Qímica Analítica e Qalidade Piracicaba (SP) Brail ocarbfilho@terra.com.br Remo O cmprimento do atendimento ao ecopo em análie de reído em divera matrize paa, obrigatoriamente, pela comparação do reltado obtido com m valor limite etabelecido. Ete artigo vio correlacionar a variávei de recperação do enaio de fortificação de amotra-tetemnha com a btância de referência e com a da etimativa da incerteza global do proceo analítico drante a validação do método analítico, para qe o reltado medido acrecido dete valore não excedam a m critério de aceitabilidade do reltado. O método de análie de doxiciclina em tecido íno por cromatografia de fae líqida com detector UV-Vi foi tilizado como exemplo. Palavra-chave Doxiclina, Análie de reído, Validação de Método, etimativa da incerteza, metrologia qímica, BPL e ISO Abtract Compliance with the ervice cope in the analyi of reide in vario matrice only be done by comparing the relt to a vale limit. Thi tdy aimed to correlate the parameter of the tet recovery to fortify control ample with the reference btance with the etimate of overall ncertainty of the analytical procedre for the validation of analytical method, o that the meared relt of thee increaed vale do not exceed a criterion of acceptability of the relt. The method of analyi of doxycline, in pig tie by liqid phae chromatography with UV-Vi detector wa ed a an example. Keyword Doxycline, Reide Analyi, Method Validation, Mearement Uncertainty, Chemical Metrology, GLP and ISO v. 1 n. 4 49
2 1. Introdção A análie de reído para atendimento à exigência da agência governamentai reglamentadora, de ficalização o de regitro no qe tange a prodto e erviço qe podem caar rico à aúde hmana, animal o ao meio ambiente é regida por portaria, legilação e deciõe; empre baeada em valor máximo permitido (VMP) o limite máximo de reído (LMR). Tai valore etão diretamente relacionado à enibilidade e a reolção do eqipamento de medição ado no enaio. Com a evolção da eletrônica aliada à lógica de programação e controle, a enibilidade e a reolção dete eqipamento etão contantemente endo melhorada, reltando em limite de detecção (LD) e, coneqentemente, em limite de qantificação (LQ) cada vez melhore. Contdo, na metrologia qímica, tanto o LD qanto o LQ não ão dependente apena da etapa de medição, ma também de técnica de maniplação da amotra 1. Infelizmente, a velocidade de deenvolvimento da técnica de maniplação de amotra não é a mema do eqipamento de medição. Para etabelecer o VMP o LMR, ão tilizado etdo de impacto ambiental o toxicológico. A diretrize da boa prática de laboratório 2 (BPL) recomendam qe tai etdo devam er condzido em intalaçõe apropriada, por peoal qalificado, tilizando eqipamento calibrado e, periodicamente verificado, egindo procedimento padronizado, rotineiramente inpecionado por peoal independente e qalificado, fazendo com qe o dado brto obtido ejam adeqadamente arqivado e qe o relatório final eja validado por ma aditoria do dado brto. Já a diretrize da norma ABNT NBR ISO/IEC 17025: preconizam o atendimento ao cliente com bae em m itema de getão etrtrado, onde a competência da organização aociada à da intalaçõe e eqipamento adeqado como chave para a ratreabilidade e a confiabilidade da etdo/enaio realizado. Amba a diretrize da norma ão concordante no qe e refere ao etabelecimento da competência da organização em exectar m determinado etdo/enaio e a ignificância do reltado prodzido em atender exigência do cliente 4 o refazê-lo de maneira mai próxima poível, qando neceário. Nee entido, a metrologia qímica ame o importante papel de promover a confiança na relaçõe de conmo, de jta concorrência, de conformidade de prodto e erviço diponibilizado no mercado e, obretdo, de inibir a atação de emprea inidônea, eta última tem ido ma contante, poi cabem à agência governamentai o papel ficalizador da organizaçõe prodtora o de pretação de erviço em enaio 5. No enaio analítico, o reltado ão afetado por m grande número de fatore inerente ao proceo de medição. Etdo de robtez ão tilizado para etabelecer o fatore crítico qe afetam a confiabilidade do reltado, ob peqena variaçõe intencionai e a implicação deta modificaçõe no reltado do enaio. No entanto, a etapa de robtez, geralmente, é feita drante o deenvolvimento/adaptação/otimização do método o no início do proceo de validação. Aim, otro fatore qe podem ocorrer em período mai longo não podem er adeqadamente avaliado, dentre ele, o comportamento e a etabilidade da btância-tete no itema-tete endo m do principai fatore, principalmente em itema orgânico. Aim, o planejamento e a condção do proceo de validação é ma do principai mecanimo de confiabilidade em m enaio/etdo de reído. Uma da forma mai tilizada para determinar tanto o comportamento como a etabilidade da btância-tete no itema tete no proceo de validação, é a adição de btância referência em amotra-tete tetemnha e a medida da recperação da concentração adicionada contra a concentração obtida no enaio. Otra caracterítica importante da análie/enaio de reído é o etabelecimento do LD e LQ do método validado. Como, na metrologia qímica, a qantificação é empre indireta, ito é, tilizam-e vário nívei de concentração de olçõe padrão dilída como referência da medida e a tranformação deta por etabelecimento de algoritmo matemático qe etabelece relação entre a concentração conhecida com a repota obtida do menrando, reltado na crva analítica. Na contrção deta crva, recomenda-e qe o LQ eja menor o igal ao LRM o VMP reqerido. Por tratar de m modelo matemático, via de regra de relaçõe lineare, a análie do reído do modelo ao longo da faixa linear medida torna-e crítico, além de implemente avaliar o coeficiente de regreão (R) e o devio padrão (DP). A chave para a qalidade e confiabilidade do reltado de m enaio é a a comparabilidade. Para erem comparávei o reltado analítico devem er acompanhado da etimativa da incerteza da medição (IM) qe leva em conta a propagação de erro drante o proceo analítico. Em geral, o erro de qantificação itemática podem er claificado em doi grpo 6 : (i) o qe prodzem reltado menore qe a qantidade realmente preente (perda, correaçõe, degradaçõe,...) e (ii) o orindo do erro de medição no momento qantificação (efeito de 50
3 matriz, a variaçõe da matriz). Qalqer qe eja a origem do erro, na análie de reído torna-e mito crítica, poi ma determinada formlação pode receber regitro por m tempo de carência qe não eja real; o na avaliação do impacto ambiental podem-e emitir reltado qe poam levar a conclõe o açõe inadeqada. Nee contexto, a etimativa da incerteza aociada ao intervalo de confiança o DPR do reltado do enaio exibe importância ímpar no contexto de confiabilidade. Não é difícil imaginar o reltado de análie de reído, em qe o menrando etá preente em nívei extremamente baixo (próximo do LQ), a eqação de Horwitz 7 preconiza qe a recperação poa er na ordem de 50% do valor adicionado e prediz qe o intervalo de confiança eja batante amplo, na ordem de 20%. A coincidência dea variávei pode levar a reltado falo/negativo o falo/poitivo. Dea forma, gere-e qe para ete enaio m critério de aceitação baeado no conceito de limite de aceitabilidade, imilar ao tilizado no certificado de calibração de eqipamento, como fator importante para tomada de deciõe. No preente artigo erá dictido m exemplo tilizando a etapa de etdo de recperação em itema orgânico tilizando-e adição de doxiciclina em amotra-tetemnha de múclo íno e o mecanimo de obtenção da etimativa de incerteza aociada ao proceo para análie crítica do reltado. 2. Experimental 2.1. Aplicabilidade do Método A aplicabilidade do método deve er coniderada a partir da regra do proceo de validação, qe preconizam qe o método analítico validado eja aplicável a matriz de interee; qe cbra toda a faixa de concentração deejada e qe tenha levado em conta toda a maniplação da amotra ante da medida. O atendimento ao propóito é m complemento onde a performance do método deve etar em conformidade com o reqiito do intereado. A exatidão pode er aplicada como conceito de limite de aceitabilidade λ. Aim, m reltado analítico Z pode diferir de m valor verdadeiro deconhecido T para ma faixa menor qe o limite de aceitabilidade: Z T < λ O limite de aceitabilidade depende do proceo analítico, aim m proceo pode er validado e atender ao propóito reqerido: P( Z µ < λ ) β onde β é a probabilidade qe o reltado eteja dentro do limite de aceitabilidade. Para o enaio o etdo onde a matriz analítica pode exercer grande inflência no reltado, etdo de recperação devem er condzido para determinar a poibilidade de provável interferência. Na tentativa de aplicar o conceito de limite de aceitabilidade para enaio qe e tilizam de etapa de fortificação, levando em conta tanto a recperação aparente como o fator de recperação e onde também e deve atender m determinado valor, é poível reecrever da eginte forma: LMR valor + Dif + medido Re c% µ global onde o valor medido é o valor real medido no enaio, Dif Rec% é o fator de recperação (em concentração) e µ global é a etimativa da incerteza de fatore previamente definido Determinado o Fator de Recperação (Difrec%) Para a determinação o fator de recperação, devem er preparada 7 réplica (n=7) de olção-padrão dilída no nível de LMR o VMP e otra 7 réplica de fortificação no memo nível em amotra-tetemnha. Cada ma da réplica deve er medida em triplicata. O valor médio encontrado de cada conjnto deve er bmetido ao tete de Grbb para avaliação de valore peito e ao tete de Ficher, entre o conjnto para avaliação da variância e verificação da inflência do efeito matriz. Tanto o valore da recperação percental como o DPR obtido devem atifazer o critério de Horwitz. Um trabalho intereante 7 preconiza o o criterioo e cidadoo deta eqação qando e trata de análie de baixa concentraçõe Etimando da µ método Para a obtenção da etimativa da incerteza do método analítico foram elecionada qatro etapa analítica ignificativa, qe ão o preparo da olção referência dilída (U padrão ), a contrção da crva analítica (U crva ), o enaio da precião intraenaio (U precião ) e o etdo da exatidão (U exatidão ). A eqação a egir motra a eqação tilizada para o cálclo da etimativa da incerteza global: U = U + U + U + U global padrão crva precião exatidão 2009 v. 1 n. 4 51
4 Preparo a olção padrão de referência A preza da btância de referência, a maa peada da btância, a calibração da balança tilizada, o fraco volmétrico tilizado para dilição, o dipoitivo de medição da alíqota, e certificado de calibração e repetibilidade de toda a operaçõe, contitem a etapa crítica. A eqaçõe a egir ão tilizada para o cálclo da incerteza padrão. U 1 = padrão, com padrão mi = 2 mi onde m i é o erro aociado para a medida de m dado parâmetro, tai como peo o alíqota; m i é o valor medido em cada ma dea açõe Crva analítica (CA) A medida efetada para todo o nívei de concentração qe compõem a faixa linear do método validado ão bmetida a etimativa da incerteza, tilizando a eqaçõe a egir: xo U 2 xo =, com x 0 y x yo yav = ( ) * b m n b * ( xi xav ) y x 1 2 yi yicalc = ( )2 n 2 onde xo é o DP da concentração, calclada da CA; x o é a concentração calclada da crva da CA; b é a inclinação da CA; m é o número de nívei de concentração da CA; y o é valor experimental do y calclado pela CA da concentração x o ; y av é a média do valore de y; x i a concentração do padrõe (x) ado na calibração; x av é média do valore x i ; y i é valore experimentai; y icalc valore calclado pela CA Precião da medida Do enaio de precião intralaboratório, onde e tilizam ei réplica da amotra-tetemnha fortificada preparada por analita diferente, dia diferente o eqipamento diferente; é poível obter a incerteza deta etapa tilizando a eginte eqaçõe: e U = p 3 x, com n o p = 1 2 onde é o dp do enaio de precião; n o número de enaio Exatidão da medida Do enaio de recperação, onde e tilizam ei réplica da amotra-tetemnha fortificada e o cálclo da recperação percental média e o devio padrão, é poível obter a incerteza deta etapa tilizando a eginte eqaçõe: U 4 = exatidão, com exatidão n n = 1 2 onde n é o DPR da recperação % média; n o número de enaio Exemplo: Método para a determinação de doxiciclina em múclo íno Reagente e amotra A amotra e a olçõe padrão dilída foram preparada a partir de olção etoqe e colocada em fraco âmbar, vedada e analiada no memo dia, empre qe poível. Toda a olçõe e extrato foram armazenado em refrigerador ante da análie. A doxiciclina foi adqirida da Sigma. Foram tilizado olvente acetonitrila G13C51, metanol G36E01 de gra peticida J.T. Baker; ága ltra pra (conditividade 18 S cm -1 ), ácido cítrico G46C43, citrato de ódio G08C57 da J.T. Baker e ácido oxálico G20D59 da Mallinckrodt Materiai e intrmento Sitema de cromatografia de fae líqida Shimadz formado com bomba qaternária, amotrador atomático e detector de UV/Vi; Colna analítica CROMA NST 18 (250 x 4,6 mm, 5 µm); fae móvel com olção de Ácido oxálico 50mM (6,5:3,5 ága:acetonitrila); vazão de 1,0mL/min; comprimento de onda: 351nm; injeção: 40 µl; temperatra: 30 C. 52
5 Maniplação da Amotra Cerca de 1,0 g de amotra-tetemma foi agitada com 5 ml da olção tampão hidroalcoólica (8:2 metanol) de citrato 300 mm ph 4 em vórtex egido de ltraom e centrifgação para eparação do obrenadante qe foi bmetido a extração em fae ólida em cartcho SAX (3mL/60 mg) condicionado com 2 ml de metanol e 2 ml de ága:metanol (80:20) e elição com 2 ml de olção de ácido oxálico 50 mm (4:3:3 ága:acetonotrila:metanol). O elato foi eco à 40 C ob corrente de N 2 e recontitído de 1 ml da olção de ácido oxálico 50 mm (6,5:3,5 ága:acetonitrila) em vórtex. O extrato foram acondicionado em fraco de injeção. 3. Reltado e dicão 3.1. Validação do método A metodologia analítica ada relto em ma boa eparação cromatográfica no tempo de 5,1 minto para o compoto etdado. A linearidade foi verificada na faixa de concentração de doxiciclina; o reltado foram expreo em coeficiente de determinação (R 2 ) denotando boa linearidade. O valore obtido ão motrado na Tabela 1. O LD foi calclado a partir do parâmetro da crva analítica (a oma do valor da interecção com 3 x S y/x (DP)) conforme a eqação abaixo: LD = b + ( 3 * S y x ), com S y x = ( yi yicalclado )2 n 2 Tabela 1. Reltado do parâmetro de validação para o compoto doxiciclina obtido para o método SPE LC-UV em amotra de múclo íno. Parâmetro SPE LC_UV Doxiciclina Faixa de calibração (ng ml -1 ) 50 a 500 LQ (ng ml -1 ) (N=5) 25 Precião (DPR) - precião intermediária (n=10) - repetibilidade (n=5) 1,76 1,23 Exatidão (% recperação ± DPR (n=5)) 80,16 ± 1,01 O LQ de 25 ng ml -1 confirma a adeqabilidade do método com o reqiito, poi o LMR é de 100 ng g -1. A precião foi avaliada pelo enaio de precião intermediária (dez réplica de ma amotra, preparada em doi dia por diferente colaboradore e medida em triplicata) e repetibilidade (cinco réplica com medida em triplicata). A exatidão foi exprea pelo etdo da recperação analítica (razão entre o valor encontrado e o valor eperado mltiplicado por 100) tilizando adição de material certificado de referência. Para o compoto, cinco experimento de recperação foram condzido e a concentração padrão ada foi a mema do enaio de precião. O reltado foram trancrito na tabela 1 como % de recperação e DPR, motram a adeqabilidade do método validado (70 120% e DPR 20%) Etimativa da Incerteza Para a etimativa da incerteza foi aplicado o modelo conhecido como botton-p. Nete modelo, a determinação da incerteza global aociada ao reltado prodzido pelo método ado é obtida levando-e em conideração a variada contribiçõe individai da incerteza. A Tabela 2 motra o reltado do cálclo da etimativa da incerteza para a etapa coniderada crítica no proceo. Tabela 2. Incerteza relativa ao proceo e a variávei correpondente. Variável Incerteza padrão Preparação da Solção padrão dilída - µ 1 0, Crva Analítica - µ 2 0, Precião - µ 3 0, Exatidão - µ 4 0, Incerteza padrão global 0, A incerteza padrão global encontrada foi de 0, para ma olção padrão de 5,0 ng ml -1, qe correponde a 7% de variação no valor medido. Da qatro fonte de contribição ada, a contribição relativa ao etdo da exatidão foi a mai crítica. A contribição relativa deta qatro fonte é decididamente dependente da concentraçõe ada na contrção da crva analítica e da caracterítica de enibilidade do intrmento de medida v. 1 n. 4 53
6 Banerjee e colaboradore 8 ecreveram artigo obre validação e incerteza de vário peticida em va ando a técnica de cromatografia líqida com detecção em epectrometria de maa. De forma geral, o atore encontraram incerteza global com ma ordem de grandeza menor qe a encontrada para a doxiciclina. Ito talvez poa er explicado pelo intrmento de medida er mai enível e qe a reprodtibilidade da recperação não ter variado tanto como no método da doxiciclina. Já Ratola e colaboradore 9, etdando a incerteza aociada a análie de peticida organoclorado em ága por cromatografia de fae gaoa com detector de captra de elétron, determinaram qe a contrção da crva de calibração foi a variável mai crítica na contribição da incerteza global, repreentando cerca de 25% para a faixa, podendo repreentar até 50% e a faixa e etender até próximo do LD. Ambo o trabalho determinaram qe para m nível de concentração de cerca de 10 ng/g foi poível obter recperaçõe entre % com etimativa de incerteza global entre 10-20%. Ora, para m determinado compoto qe exibe ma recperação de 70%, e for aplicada ma correção para qe o valor repreente 100% e omarem-e o 20% da provável incerteza da medida, o valor obervado da amotra pode etar acima do LMR o VPM definido pelo cliente. Em otra palavra, e omarmo o valor encontrado para a amotra ao fator de recperação e a incerteza global aociada ao método de enaio, o λ pode etar endo fora do limite. Deta forma, na validação do método, da etapa devem er exativamente etdada e metrologicamente determinada: (i) recperação do compoto e a (ii) etimativa da incerteza global do método. Coniderando o método da doxiciclina, o valor obtido de recperação foi de 80% e a etimativa da incerteza do método de 7%. Aim, o coeficiente de variação de m reltado obtido deve er de 27%. Portanto a análie crítica de m reltado de ma amotra de 80 ng/g pode ignificar qe ele eteja fora do LMR epecífico 4. Conclão Na validação de m método para análie de reído, onde o reltado do enaio erão obrigatoriamente comparado a valore limite, a ecolha do olvente, proceo de extração o de iolamento qe fazem parte da etapa de recperação devem er exativamente etdado e metrologicamente determinado. O omatório dea variável com a etimativa da incerteza global do proceo da medida determina o intervalo de confiança da medida efetada ando o método validado. Sempre qe poível, deve er determinado o limite de aceitabilidade do reltado do enaio para verificar o atendimento ao ecopo do cliente. 5. Referência Bibliográfica 1. Valcarcel, M; Lendl, B.. Analytical chemitry at the interface between metrology and problem olving. Trend in anal. Chem., 23 (8): NIT-DICLA-035: Critério para o credenciamento de laboratório de enaio egndo o princípio da boa prática de laboratório BPL. INMETRO, Rio de Janeiro (Brail), NBR ISO/IEC 17025: 2005(E): Reqiito gerai para competência de laboratório de enaio e calibração. ABNT, Rio de Janeiro (Brail), González, A.G.; Herrador, M. A.. A pratical gide to analytical method validation, inclding mearement ncertainty and accracy profile. Trend in Anal. Chem. 26 (3): Bahia Filho, O. O paradigma da atogetão no laboratório de enaio. Scientia Chromatographica, 1(3): Cadro-Rogrige, L.; Almana-Lopez, E.M.; Garcia-Canpana, A.M.; Gonzalez-Caado, A.; Egea-Gonzale, F.J.; Garrido-Frenich, A.; Martinez-Vidal, J.L.. Setting p of recovery profile: A tool to performance the compliance with recovery reqirement for reide analyi. Talanta 66: Liinger, T.P.J.; Joeph, R.D.. Limitation of the application of the Horwitz eqation. Trend in Anal. Chem., 25(11): Banerjee, K.; Olkar, D.; Gadpta, S.; Patil, S.B.; Patil, S.H.; Savant, R.; Adle, P;G.. Validation and ncertainty analyi of a mlti-reide method for peticide in grape ing ethyl acetate extraction and liqid chromatography-tandem ma pectrometry. J. of Chromatography A, 1173: Ratola, N,; Santo, L.; Herbert, P.; Alve, A.. Uncertainty aociated to the analyi of organochlorine peticidie in water by olid-phae microextraction/ga chromatography-electron captre detection Evalation ing two diferente approache. Anal. Chim. Acta, :
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