Proposta para a estimativa da incerteza de medição e garantia da qualidade do teste de germinação 1

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1 37 Proposta para a estimativa da incerteza de medição e garantia da qualidade do teste de germinação 1 Glaucia Bortoluzzi Maag 2 *, Filipe de Medeiros Albano 3, Rosinha Maria Peroni Mesquita 2 RESUMO A norma NBR ISO/IEC exige que laboratórios implementem procedimentos para validação ou confirmação de métodos e cálculos de estimativa de incerteza. Dentro deste contexto, este trabalho objetivou apresentar uma sistemática para estimar a incerteza de medição do teste de germinação, bem como aplicar a lógica do Controle Estatístico de Processos (CEP), utilizando cartas de controle para avaliação da garantia da qualidade. O cálculo da estimativa da incerteza foi baseado no Guia para a Estimativa da Incerteza em Ensaios Microbiológicos do Instituto Português de Acreditação (IPAC), sendo que o método foi modificado para melhor adaptação na área de análise de sementes. Os cálculos foram aplicados aos dados de 20 amostras de rotina de sementes de soja do LASO/LANAGRO/RS. Comparando-se a incerteza calculada com os valores de tolerâncias admitidas nas Regras para Análise de sementes (RAS), verificou-se que o nível de incerteza do laboratório foi inferior às tolerâncias estabelecidas, demonstrando desempenho satisfatório do laboratório. Concluiuse que o CEP pode ser utilizado como ferramenta de monitoramento da garantia da qualidade dos resultados e que a sistemática de cálculos apresentada para estimar a incerteza se mostrou adequada e facilmente aplicável, constituindo-se em um instrumento útil para a avaliação e interpretação dos resultados do teste de germinação gerados pelo laboratório. Termos para indexação: credenciamento, laboratório, qualidade, NBR ISO/IEC Introdução O Laboratório Oficial de Análise de Sementes do Laboratório Nacional Agropecuário (LASO/LANAGRO/RS), pertencente ao Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento (MAPA), localizado em Porto Alegre, supervisiona e audita cerca de 40 laboratórios credenciados no Rio Grande do Sul e foi o primeiro laboratório de análise de sementes no Brasil a obter a acreditação junto ao Instituto Nacional de Metrologia, Qualidade e Tecnologia (INMETRO). Muitos laboratórios de sementes credenciados que buscam acreditação e melhoria contínua dos seus processos do sistema de gestão da qualidade têm procurado informações junto ao LASO/LANAGRO/RS sobre o atendimento ao requisito da norma NBR ISO/IEC 17025:2005, que prevê a estimativa da incerteza de medição dos ensaios. Diante disto, elaborou-se para publicação um artigo para estimativa da incerteza em análise de pureza (Maag et al., 2013), bem como o presente trabalho, a fim de divulgar os procedimentos utilizados no teste de germinação. Segundo o Vocabulário Internacional de Metrologia (VIM) 1 Submetido em 07/11/2013. Aceito para publicação em 20/11/ Laboratório Oficial de Análise de Sementes do Laboratório Nacional Agropecuário/RS, Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento (LASO/LANAGRO/RS/MAPA), Av. Farrapos, 285, Porto Alegre, RS, Brasil. (Inmetro, 2012) a incerteza de medição é definida como o parâmetro não negativo que caracteriza a dispersão dos valores atribuídos a um mensurando, com base nas informações utilizadas. Em outras palavras, a incerteza é a expressão quantitativa da qualidade da medida e uma informação numérica que complementa o resultado de uma medição. A norma NBR ISO/IEC descreve os requisitos a serem atendidos pelos laboratórios de ensaio, inclusive de análise de sementes, a fim de demonstrarem que são tecnicamente competentes. Os requisitos dessa norma exigem que esses laboratórios implementem procedimentos para validação ou confirmação de métodos e cálculos de estimativa de incerteza. Enquanto que a abordagem desenvolvida para análises químicas é bem determinada em relação à estimativa da incerteza, a mesma metodologia não é diretamente aplicável aos ensaios biológicos (Castro, 2009). Segundo Morel et al. (2006) é reconhecidamente difícil estimar a incerteza de ensaios que utilizam organismos, como espécies animais e vegetais. Devido a este fato, os laboratórios que desenvolvem ensaios biológicos, estão se preocupando cada vez mais com a estimativa da incerteza de 3 Rede Metrológica RS (RMRS), Av. Assis Brasil, 8787, Porto Alegre, RS, Brasil. *Autor para correspondência <glaucia.maag@agricultura.gov.br>

2 38 medida dos resultados produzidos (Castro, 2009). Segundo Bich e Pennecchi (2012), a estimativa da incerteza tem recebido pouca atenção na literatura que envolve ensaios microbiológicos, onde são realizadas medições por contagem, não sendo nem mesmo aplicada a estas medições. Estes ensaios estariam na categoria daqueles que dispensam o cálculo rigoroso, metrológico e estatisticamente válido da incerteza de medição (ANVISA, 2004). Em 2006, o Instituto Português de Acreditação (IPAC) publicou o Guia para a Estimativa de Incerteza em Ensaios Microbiológicos (Ipac, 2006), que se baseia na ISO TS 19036: Microbiology of Foods and Animal Feeding Stuffs Guide on Estimation of Measurement Uncertainty for Quantitative Determinations, com a finalidade de apoiar os laboratórios a quantificarem a incerteza de medição através do cálculo do desvio padrão da reprodutibilidade dos resultados dos ensaios efetuados. A garantia da qualidade dos resultados também é uma das exigências no processo de acreditação e credenciamento. Os laboratórios devem monitorar as tendências dos seus resultados com o objetivo de garantir que os mesmos são confiáveis (Abnt, 2005). Muitas vezes esta ação é realizada por meio do uso de Controle Estatístico de Processos (CEP), utilizando cartas de controle, entre outras ferramentas da qualidade (Albano e Raya-Rodriguez, 2009). Dentro deste contexto, o objetivo principal do presente trabalho foi apresentar uma sistemática para estimar a incerteza de medição do teste de germinação e propor o seu uso aos laboratórios de análises de sementes, em atendimento aos requisitos técnicos da NBR ISO/IEC Como objetivo secundário, aplicou-se a lógica do CEP nos dados oriundos dos ensaios do laboratório para analisar sua precisão intermediária avaliar a garantia da qualidade dos resultados. Material e Métodos O cálculo da estimativa da incerteza de medição do teste de germinação foi baseado no Guia para a Estimativa da Incerteza em Ensaios Microbiológicos do Instituto Português de Acreditação (Ipac, 2006), sendo que o método foi modificado pelos autores para melhor adaptação na área de análise de sementes. O trabalho foi conduzido no LASO/ LANAGRO/RS com o apoio da Rede Metrológica RS, durante os anos de 2012 e 2013, seguindo as seguintes etapas: Etapa 1: Seleção aleatória dos resultados de germinação de 20 amostras de sementes de soja, de diversas cultivares, analisadas na rotina do laboratório durante o ano de 2012, por quatro diferentes analistas. O método de germinação utilizado foi em substrato rolo de papel e temperatura de 25 ºC, conforme prescrito nas Regras para Análise de Sementes (RAS) (Brasil, 2009). Etapa 2: Elaboração de uma planilha de Excel para os cálculos da incerteza referente aos dados de plântulas normais do teste de germinação; Etapa 3: Cálculo da amplitude máxima entre os resultados de 4 repetições de 100 sementes (8 repetições de 50 sementes reunidas duas a duas) de cada amostra e da amplitude média geral dos dados; Etapa 4: Cálculo do desvio padrão da reprodutibilidade S R ; Etapa 5: Cálculo da incerteza expandida U. Aos dados de germinação foi aplicada a ferramenta do CEP com o cálculo do Limite de Controle Superior (LCS) e elaboração da carta de controle, seguindo o roteiro de cálculos apresentados em (Montgomery, 2004). Resultados e Discussão Os resultados do parâmetro plântulas normais do teste de germinação de soja e os cálculos utilizados para quantificação da incerteza de medição são apresentados na Tabela 1 e descritos nas seguintes etapas: Resultados das Etapas 1 e 2: No modelo matemático utilizado pelo Ipac (2006) para o cálculo da incerteza de medição para ensaios microbiológicos são necessários, para um mesmo método e para uma mesma matriz, no mínimo, 10 amostras analisadas em duplicata. Atendendo a este preceito, os dados utilizados para a estimativa da incerteza, constantes da Tabela 1 foram obtidos a partir dos resultados de 20 amostras de sementes de soja, analisadas na rotina do laboratório, seguindo os procedimentos prescritos nas Regras para Análise de Sementes (RAS) (Brasil, 2009). Resultado da Etapa 3: Foram calculadas as amplitudes máximas entre as 4 repetições do teste de germinação de cada amostra e a média destas amplitudes (Tabela 1). Resultado da Etapa 4: Na sequência, calculou-se o desvio padrão da reprodutibilidade S R por meio da divisão da amplitude média dos resultados por um coeficiente d 2 tabelado: S R = R d 2 Para as quatro analistas e as 20 amostras realizadas foi considerado um d 2 de 2,07 (Aiag, 2002; Albano e Raya- Rodriguez, 2009). Resultado da Etapa 5: O resultado do desvio da reprodutibilidade S R, obtido na fórmula anterior, foi utilizado para a obtenção da incerteza expandida como segue: U = k. S R

3 39 Multiplicou-se o valor de S R por um fator de abrangência k = 2 (a um nível de confiança de 95%, de acordo com a tabela de t de Student), a fim de obter-se um valor de incerteza expandida, que fornece um intervalo de confiança onde existe a maior probabilidade de se encontrarem valores que poderão ser atribuídos ao valor verdadeiro (Castro, 2009). Neste caso, a incerteza expandida calculada foi U = 4,3%. Como o Guia do Ipac (2006) recomenda que o número de algarismos significativos da incerteza deva ser arredondado e as RAS (Brasil, 2009) preveem que a germinação seja informada com número inteiro, a incerteza calculada foi arredonda para cima e apresentada com número inteiro U = 5% (Tabela 1). Desta maneira, o resultado para amostra 1 poderia ser reportado como sendo 87% ± 5%. Tabela 1. Resultado de plântulas normais e cálculos utilizados para a estimativa da incerteza de medição no teste de germinação de 20 amostras de sementes de soja. Amostras Repetições R1 R2 R3 R4 Média Amplitude Tolerância máxima* % Amplitude Média 4,4 d 2 2,07 Desvio padrão (S R ) 2,13 U calculada 4,3 U arredondada 5 *Tolerâncias extraídas da Tabela 18.9 das Regras para Análise de Sementes (RAS) (Brasil, 2009). Em documento publicado em 2007, a ISTA salienta que as tabelas de tolerâncias ilustram a dependência da incerteza com o nível de resultado do teste de germinação (Ista, 2007). Comparando-se o resultado de incerteza do laboratório (U = 5%) com os valores de tolerâncias máximas admitidas na Tabela 18.9 das RAS (Brasil, 2009), transcritos na Tabela 1, verificou-se que o nível de incerteza foi inferior às tolerâncias estabelecidas, demonstrando desempenho satisfatório do laboratório. Embora a legislação brasileira (Brasil, 2009; Brasil, 2010) e a própria Ista (2007) não exijam o relato da incerteza na informação do resultado de análise de sementes, cabe salientar que o conhecimento da incerteza serve como uma ferramenta de avaliação do controle de qualidade do laboratório. Segundo Castro (2009), para minimizar a incerteza dos ensaios de rotina do laboratório, o controle das fontes de erro é imprescindível e para tanto alguns aspectos devem ser considerados, tais como: capacitação da equipe de analistas nas técnicas utilizadas no laboratório; manutenção e calibração de equipamentos; controle e registro das condições ambientais. Acrescentamse também: cuidados na aquisição e manuseio de materiais,

4 40 reagentes e substratos, bem como com a qualidade da água utilizada na germinação. Além do cálculo da incerteza, aos dados do teste de germinação foi aplicada a lógica do CEP, por meio do uso de cartas controle (Figura 1), para analisar sua precisão intermediária, ou seja, a variação da repetibilidade e reprodutibilidade interna do laboratório ao longo do tempo. Com as cartas de controle gráficas, pode-se acompanhar o processo de análise no laboratório ao longo do tempo, verificando sua estabilidade e as causas especiais de variação do processo (pontos fora dos limites de controle). Albano e Raya-Rodriguez (2009) salientam que sempre que forem identificadas causas especiais, os laboratórios devem fazer uma análise crítica verificando o que ocasionou a variação e sanar o problema. Pela análise da Figura 1, observou-se que, excetuando-se a amostra 11, todas as demais permaneceram com a variação dentro do limite superior de controle (LCS). Para a amostra 11, como a amplitude entre as repetições foi superior à tolerância máxima permitida, a menor repetição foi eliminada para o cálculo da germinação, conforme determinam as RAS (Brasil, 2009). Em uma análise de causas, o laboratório pode concluir que a maior variação pode ser atribuída à pouca experiência do analista e determinar uma ação corretiva de retreinamento. Figura 1. Carta de controle da precisão intermediária para o teste de germinação de 20 amostras de sementes de soja. Conclusões Considerando os resultados obtidos e a facilidade de aplicação dos cálculos, sugere-se o uso da metodologia proposta para a estimativa da incerteza de medição neste tipo de teste por outros laboratórios de sementes. Cabe ressaltar que o procedimento de estimativa da incerteza está relacionado às exigências do processo de acreditação de laboratórios. Os resultados da aplicação do método proposto neste artigo também possibilitam fazer um diagnóstico sobre o desempenho do laboratório na execução dos testes, permitindo identificar quando são necessárias melhorias no processo de análise. Uma incerteza alta ou uma causa especial na carta de controle (CEP) indicam que existe uma necessidade de análise crítica dos resultados, identificando quais são as causas de variação e propondo ações corretivas. Por fim, pode-se concluir que o CEP pode ser utilizado como ferramenta de monitoramento da garantia da qualidade dos resultados e que a sistemática de cálculos apresentada para estimar a incerteza se mostrou adequada e facilmente aplicável, constituindo-se em um instrumento útil para a avaliação e interpretação dos resultados do teste de germinação gerados pelo laboratório. Referências AGÊNCIA NACIONAL DE VIGILÂNCIA SANITÁRIA (ANVISA). Acreditação para Laboratórios de Microbiologia. Brasília, anvisa.gov.br/reblas/cursos/qualidade19/acreditacao_microbiologia.pdf ALBANO, F.M.; RAYA-RODRIGUEZ, M.T.R. Validação e garantia da qualidade de ensaios laboratoriais. Porto Alegre: Rede Metrológica RS, 2009, 136p. ASSOCIAÇÃO BRASILEIRA DE NORMAS TÉCNICAS. NBR ISO/ IEC 17025: Requisitos gerais para competência de laboratórios de ensaio e calibração. Rio de Janeiro, AUTOMOTIVE INDUSTRY ACTION GROUP (AIAG). Measurement Systems Analysis. 3.ed. Detroit: Chrysler Corporation, Ford Motor and General Motors Corporation, 2002.

5 41 BICH, W.; PENNECCHI, F. Uncertainty in measurements by counting. Metrologia, v.49, p.15-19, pdf/ _49_1_003.pdf BRASIL. Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento. Regras para Análise de Sementes. Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento. Secretaria de Defesa Agropecuária. Brasília: MAPA/ACS, p. BRASIL. Instrução Normativa n.40, de 30 de novembro de Diário Ofi cial da União, Brasília, DF, 1 de dezembro de Seção 1, p.4. CASTRO, V.L.S.S. Aspectos gerais da validação de métodos químicos, biológicos e computacionais na gestão de qualidade de resultados de pesquisa. Embrapa Meio Ambiente, Jaguariúna, SP, 2009, 28p. cnpma.embrapa.br/download/documentos_75.pdf. Acesso em: 30 jan INSTITUTO NACIONAL DE METROLOGIA, QUALIDADE E TECNOLOGIA (INMETRO). Vocabulário internacional de metrologia: conceitos fundamentais e gerais e termos associados (VIM 2012). Instituto Nacional de Metrologia, Normalização e Qualidade Industrial. Lusobrasileira. Rio de Janeiro: INMETRO, 2012, 94p. br/infotec/publicacoes/vim_2012.pdf INSTITUTO PORTUGUÊS DE ACREDITAÇÃO (IPAC). OGC005: Guia para a estimativa da Incerteza em Ensaios Microbiológicos. 2006, 6p. INTERNATIONAL SEED TESTING ASSOCIATION (ISTA). ISTA position paper on quantifying and reporting uncertainty of measurement in seed testing. Bassesdorf, 2007, 3p. MAAG, G.B.; ALBANO, F.; MESQUITA, R.M. Estimativa da incerteza de medição em análise de pureza física. Abrates, v.23, n.1, MONTGOMERY, D.C. Introdução ao controle estatístico da qualidade. Rio de Janeiro: LTC, 2004, 532p. MOREL, P.; ARRUDA, T.L.; BOHRER-MOREL, M.B.C. Calculation of uncertainties in influence quantities in biological essays. Brazilian Archives of Biology and Technology, v.49, php?script=sci_arttext&pid=s &lang=pt