JUNHO Agenda. SOCIEDADE BRASILEIRA DE PATOLOGIA CLÍNICA SBPC Data: 15 a 18 de Agosto de 2009 Local: Expominas, Belo Horizonte-MG

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1 LABType High Definition Tipagem HLA-A, B, C e DRB1 Alta Resolução - PCR-SSOr Luminex JUNHO 2009 Novidade Nº bioemfoco 04 INFORMATIVO BIOMETRIX DIAGNÓSTICA MORRE JEAN DAUSSET A Biometrix Diagnóstica e a One Lambda apresentam os mais novos produtos da linha LABType. O produto LABType HD permite a tipagem HLA-A, B, C e DRB1 de Alta Resolução com excelente grau de definição. Agenda Informações do Produto Produto Código Nº de Testes Labtype HD Loco A RSSOH1A Labtype HD Loco B RSSOH1B Labtype HD Loco C RSSOH1C Labtype HD Loco DRB1 RSSOH2B1 *No momento, somente para pesquisa SOCIEDADE BRASILEIRA DE TRANSPLANTE DE MEDULA ÓSSEA SBTMO Data: 5 a 8 de Agosto de 2009 Local: Embratel Convention Center, Curitiba-PR SOCIEDADE BRASILEIRA DE PATOLOGIA CLÍNICA SBPC Data: 15 a 18 de Agosto de 2009 Local: Expominas, Belo Horizonte-MG ASSOCIAÇÃO BRASILEIRA DE TRANSPLANTE DE ÓRGÃOS ABTO Data: 13 a 17 de Outubro de 2009 Local: Centro de Convenções de Recife, Recife-PE CONGRESSO BRASILEIRO DE INFECTOLOGIA 2009 Data: 18 a 21 de Outubro de 2009 Local: Maceió-AL AMERICAN SOCIETY FO HISTOCOMPATIBILITY AND IMMUNOGENETICS ASHI Data: 2 a 6 de Novembro de 2009 Local: Hyatt Regency, São Francisco-CA - EUA SOCIEDADE BRASILEIRA DE MICROBIOLOGIA Data: 8 a 12 de Novembro de 2009 Local: Enotel Resort Spa, Porto de Galinhas - PE HEMO 2009 Data: 11 a 14 de Novembro de 2009 Local: Florianópolis - SC DDG BIO EM FOCO. JUN/09 Nº04 Untitled-3 1 Dausset morreu em Palma de Maiorca, na Espanha, onde vivia há dez anos. Hematologista e imunologista francês nascido em Toulouse, para onde sua mãe tinha sido enviada com seus três filhos durante a I Guerra pelo seu pai, que durante a II Guerra Mundial desenvolveu o interesse em hematologia, notadamente no ramo das transfusões e um dos vencedores do Prêmio Nobel de Fisiologia Medicina (1980) quando era pesquisador da Université de Paris, Laboratoire Immuno-Hématologie, Paris, França. Filho de um médico militar francês e pioneiro da reumatologia na França, Henri Dausset. Foi educado em Biarritz até a escola secundária e aos 11 sua família mudou-se permanentemente para Paris. Completou sua formação secundária no Lycée Michelet, onde obteve o bacharelado em matemática. Lutou na Segunda Guerra Mundial e depois da guerra (1944) reassumiu seus estudos médicos antes interrompidos (1939), passou a se dedicar às forças da resistência francesa (1940), formou-se em medicina aos 29 anos pela Universidade de Paris e dedicouse especialmente à imunohematoloia. Depois de uma carreira de sucesso como pesquisador, escreveu mais de 300 artigos. Dividiu igualmente o Prêmio Nobel de Fisiologia Medicina (1980), com o venezuelano Baruj Benacerraf, da Harvard Medical School, Boston, Massachusetts, e o estadunidense George D. Snell, do Jackson Laboratory, Bar Harbor, Maine, por descobertas sobre a relação da estrutura celular dos órgãos transplantados THE NOBEL PRIZE: O governo francês anunciou em 06/06/2009 a morte, aos 92 anos, do imunologista Jean Dausset, um dos ganhadores do Prêmio Nobel em Medicina Fisiologia em Características e Benefícios: Leitura em até 48 horas após finalização do teste; Fácil e rápida interpretação; Sem tiras e sem membranas; Mais eficaz que SSP; Mais rápido que seqüenciamento; Menor número de ambigüidades comparado com SSP e seqüenciamento; Metodologia já conhecida e amplamente utilizada; Número mínimo de repetições após passo de amplificação. Dausset foi o principal responsável por desvendar o sistema HLA (antígeno leucocitário humano), o qual está relacionado com a compatibilidade entre doador-recepetor de órgãos transplantados e com a diminuição dos riscos de rejeição. e as doenças. Casou-se (1963) com a espanhola Rose Mayoral, com quem teve um casal de filhos, Henri e Irène, e assumiu a cadeira de medicina experimental do Collège de France (1977). Professor Honoris Causa de várias universidades, membro de muitas academias e detentor de outros prêmios além do Nobel, como a Médaille d Argent du Centre National de la Recherche Scientifique (1967) e o Wolf Foundation Prize de Israel (1978). Fonte: 1 14/7/ :20:51

2 Eventos Passos: Hibridização e Captura dos Dados Possível Causa Sugestão para resolver o problema Baixo Índice de Fluorescência Temperatura de hibridização inadequada Temperatura de marcação inadequada com SAPE Tampão SAPE armazenado incorretamente 60º por 15 minutos 60º por 5 minutos Preparar nova solução estoque Abrir novo frasco armazenado à 4ºC Insuficiente homogeneização das beads sol. estoque Insuficiente homogeneização da solução de beads + tampão Possível Causa Intervalo de calibração muito prolongado Sugestão resolver o problema Realizar novapara calibração Temperatura de hibridização inadequada Escolha incorreta do lote de beads Temperatura de marcação inadequada Falta de calibração do equipamento com SAPE Falta de pressão Tampão SAPE da armazenado incorretamente Entupimento probe Equipamento fora da temperatura de calibração Insuficiente homogeneização Probe parcialmente entupida das beads sol. estoque Insuficiente homogeneização daou solução de beads + tampão Centrifugação incorreta (tempo voltagem) Intervalo de calibração muito prolongado 60º por 15 minutos Realizar replay batch após finalização da leitura 60º por 5nova minutos Realizar calibração Preparar nova solução estoque externas Verificar conexão das mangueiras Abrir novo frasco armazenado à 4ºC Retirá-la e realizar procedimento de limpeza Ajustar temperatura da sala Agitar pore aprox. segundos de limpeza Retirá-la realizar30 procedimento Agitar porvelocidade aprox. 30 segundos Conferir e tempo de centrifugação Passos: Hibridização e Captura dos Dados Baixa Contagem de beads Baixo Índice de Fluorescência Algumas beads aparecem dentro e Amostra não é aspirada Demora na contagem das beads Baixa Contagem de beads XX Jornada Brasileira de Reumatologia 2009 Data: de 17 a 20 Abril de 2009 Local: Centro de Convenções Natal. Passos: Passos: Interpretação dos Dados Escolha incorreta do lote de beads Algumas beads aparecem dentro e Falta de calibração do equipamento Realizar replay batch após finalização da leitura Amostra não é aspirada Falta de pressão Possível Causa Entupimento da probe Verificar conexão mangueiras externas Sugestão paradas resolver o problema Retirá-la e realizar procedimento de limpeza Demora na contagem das beads Equipamento fora da temperatura de calibração Temperatura e tempo de hibridização inadequados Probe parcialmente entupida Temperatura eincorreta tempo de(tempo marcação inadequados Centrifugação ou voltagem) Ajustar temperatura da sala 60º por 15 minutos Retirá-la e realizar procedimento de limpeza 60º por 5velocidade minutos e tempo de centrifugação Conferir Baixo valor do controle positivo dos exons 2 e/ou 3 Amplificação ruim presença de inibidores e/ou concentração inadequada Confirmar com corrida eletroforética e repetir amplificação fazendo os ajustes necessários Baixa contagem de beads Insuficiente homogeneização das beads sol. estoque Insuficiente homogeneização da solução de beads + tampão Intervalo de calibração muito prolongado Algumas beads aparecem dentro e Escolha incorreta do lote de beads Falta de calibração do equipamento Realizar replay batch após finalização da leitura Alto background geral Lavagens e flicagens inadequadas, concentração de DNA inadequado, não aliquotagem das beads em gelo Verificar passos de lavagens, força da flicagem e aliquotar as beads sobre o gelo Mensagem de erro Adição de caracteres proibidos Fazer as devidas correções e analisar Fazer print screen da mensagem e encaminar para o Suporte Técnico Científico da Biometrix Realizar replay batch com template correto Fazer correção e nova análise Presença de: FP, FN ou No match Troca de template no Luminex Troca de template no HLA Visual Contaminação da amostra (problema isolado) Taq polimerase com problema Um dos problemas acima Repetir extração, amplificação e hibridização Repetir amplificação e hibridização Observar a sugestão para cada possível causa Baixo índice de fluorescência geral com SAPE Tampão SAPE armazenado incorretamente Desnaturação e/ou neutralização incompleta Imagem do evento IV Workshop Avançado Labscreen One Lambda Data: de 1º a 3 de Abril de 2009 Local: Biometrix e Hotel Crowne Plaza em Curitiba Participação Especial: Dr. Peter Brescia International Technical Support Manager One Lambda. Durante este importante evento vários aspectos relacionados à determinação de anticorpos anti HLA, através da metodologia LABScreen One Lambda, foram discutidos. Reunimos mais de 30 laboratórios. Demonstração: Detecção de Mycobacterium tuberculosis por PCR em Tempo Real Data: de Maio de 2009 Local: Biometrix Diagnóstica Ltda Curitiba. Preparar nova solução estoque Abrir novo frasco armazenado à 4ºC Repetir o processo EDITORIAL INFORMATIVO DA BIOMETRIX DIAGNÓSTICA LTDA. Estrada da Graciosa, Curitiba PR. Brasil Tel.: Fax: DDG: Todas as matérias não assinadas são de responsabilidade técnica do DEPARTAMENTO DE SUPORTE TÉCNICO CIENTÍFICO: Marcelo Mion, Mauricio Cichon, Camilla Claro Pini, Guilherme Rodrigues de Oliveira, Silvia Girardello, Ana Claudia Fernandes, Simone Danielle Binda, Igor Kohiyama, Ariana Martins, Marcos Nakagawa. DEPARTAMENTO DE MARKETING: Dani Moro. DEPARTAMENTO DE NOVOS PROJETOS: Thereza Cristina de Carvalho, Naihara Goslar de Lima. DIRETOR GERAL: Hallison Passos de Almeida DESIGN GRÁFICO: Qualitá Design Gráfico. IMPRESSÃO: Serzegraf. 2 BIO EM FOCO. JUN/09 Nº04 Untitled-3 2 Estrada da Graciosa, Curitiba. PR. Brasil Tel Fax DDG /7/ :21:07

3 Perguntas Frequentes Educação Tipagem HLA One Lambda: Troubleshooting Rápido Diagnóstico Molecular para Doenças LABType SSO Troubleshooting Passos: Amplificação e Controle de Amplificação Possível Causa Sugestão para resolver o problema D-Mix com coloração alterada Alteração de ph Contaminação bacteriana Não utilizar, solicitar reposição. Utilizar D-Mix com coloração padrão Solução de DNA com grumos Solubilização parcial Colocar em Banho Seco à 47ºC por 30 a 45 min. com agitação periódica Ausência de banda correspondente ao exon 2 do Loco A e/ou B Baixa pureza de DNA- inferior a 1.65 (inibidores) Baixa concentração de DNA Alta concentração de DNA Presença de compostos orgânicos (etanol) Aumentar o volume de DNA para uso Deixar o tubo com tampa aberta por 10 min. à 47ºC Ausência de ambas as bandas somente no loco A Baixa concentração de DNA Aumentar o volume de DNA para uso Ausência de ambas as bandas somente no loco B Presença de compostos orgânicos (etanol) Baixa pureza de DNA- inferior a 1.65 (inibidores) Programa incorreto no termociclador Deixar o tubo com tampa aberta por 10 min. à 47ºC Revisar programação Ausência de banda somente no loco DRB1 Amostra não aplicada na placa PCR Amostra não aplicada no gel Repetir o passo de amplificação Repetir o passo de controle de amplificação Visualização somente da banda correspondente ao exon 2 dos locos A e/ou B Uso de 12 pentes ao invés de 6 na Cuba MGS-108 (OL) Perda da banda (exon 3) devido: Voltagem inadequada Tempo de corrida inadequado Concentração do gel inadequada Preparar novo gel utilizando somente 6 pentes Correr em 150V Tempo de corrida: 10 minutos Preparar gel com concentração de 2,5% Ausência de bandas para todos os exons em todas as amostras Voltagem inadequada Tempo de corrida inadequado Concentração do gel inadequada Amostra não aplicada na placa PCR Amostra não aplicada no gel DNA ruim Programa incorreto no termociclador Correr à 150V Tempo de corrida: 10 minutos Preparar gel com concentração de 2,5% Repetir o passo de amplificação Repetir o passo de controle de amplificação Repetir passo de extração Revisar programação Presença de bandas fracas para todos os exons em todas as amostras Programa incorreto no termociclador Excesso de bandas inespecíficas ou bandas específicas fracas Demora no preparo da PCR Visualização de rastro no gel DNA degradado Excesso de DNA O laboratório Qualimune iniciou suas atividades em diagnóstico molecular. No dia 30 de março de 2009, houve um evento junto à Associação Médica de Santa Cruz do Sul, no qual os Doutores Jorge Neumann e Tatiana Michelon diretores do Qualimune e especialistas em Imunogenética e Biologia Molecular apresentaram a palestra intitulada O Diagnóstico Médico na Era da Biologia Molecular com o propósito de informar sobre os benefícios do diagnóstico molecular, além de divulgar o laboratório Qualimune. O Qualimune é um laboratório desenvolvido por especialistas com larga experiência em Imunogenética e em Biologia Molecular e seu uso em medicina diagnóstica. Dispõe dos equipamentos mais modernos existentes nestas áreas, como Luminex e PCR em Tempo Real, e tem como compromisso empregar apenas metodologias e reagentes com certificação de qualidade nacional e internacional. O Qualimune emprega apenas kits diagnósticos aprovados pela Agencia Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA) Evento médico em Santa Cruz do Sul/RS Da esquerda para direita: Drs. Antonio e com selo de qualidade Borba, Tatiana Michelon, Jorge Neumann, Beatrice Neumann e Homero Agra. euoropeu (QCMD Quality Control for Diversas doenças infecciosas de origem Molecular Diagnostics), ou seja, tem o viral e bacteriana, bem como algumas compromisso com a qualidade do diagalterações genéticas ligadas à coagulação nóstico. Além disso, tem a velocidade e câncer podem ser diagnosticadas e/ou como meta, onde o médico e o paciente monitoradas através de testes oferecidos terão o resultado de seu exame no menor hoje pelo Qualimune. prazo possível. Você sabia? Rumo a de Doadores de Medula Óssea Cadastrados no REDOME REDOME - Registro Nacional de Doadores Voluntários de Medula Óssea jan/ Revisar programação dez/ jun/ Repetir nova extração Dados até janeiro/ doadores Passos: Hibridização e Captura dos Dados Possível Causa Sugestão para resolver o problema Baixo Índice de Fluorescência Temperatura de hibridização inadequada Temperatura de marcação inadequada com SAPE Tampão SAPE armazenado incorretamente 60º por 15 minutos 60º por 5 minutos Preparar nova solução estoque Abrir novo frasco armazenado à 4ºC Insuficiente homogeneização das beads sol. estoque Insuficiente homogeneização da solução de beads + tampão Intervalo de calibração muito prolongado Escolha incorreta do lote de beads Falta de calibração do equipamento Realizar replay batch após finalização da leitura Falta de pressão Entupimento da probe Verificar conexão das mangueiras externas Retirá-la e realizar procedimento de limpeza Equipamento fora da temperatura de calibração Ajustar temperatura da sala Retirá-la e realizar procedimento de limpeza Baixa Contagem de beads Algumas beads aparecem dentro e 10 BIO EM FOCO. JUN/09 Nº04 Amostra não é aspirada Untitled-3 3 Demora na contagem das beads O REDOME é o 3º maior registro de doadores voluntários de medula óssea do mundo. Em 2008 foram feitos 81 transplantes de medula óssea com doadores voluntários, dos quais 63% com cadastrados no REDOME. Dos 52 transplantes com sangue de cordão umbilical, 23% foram realizados com unidades da Rede BrasilCord. Fonte: Montar a PCR sobre o gelo REREME - Registro Nacional de Receptores de Medula Óssea transplantados via REREME/REDOME - INCA -MS até dezembro/2008 Doação de órgãos cresce 42% em SP O número de doadores de órgãos no Estado de São Paulo iniciou o ano de 2009 em pleno crescimento. Balanço da Secretaria de Estado da Saúde aponta que de janeiro a abril houve 216 doadores viáveis (que tiveram pelo menos um órgão aproveitado para transplante), 42,1% a mais do que o registrado nos quatro primeiros meses do ano passado. Com o aumento nas doações foi possível a realização de 615 transplantes de órgãos, contra 455 registrados de janeiro a abril de O maior crescimento foi em relação aos transplantes de fígado: houve 184 cirurgias neste ano, 40,4% a mais do que no mesmo período de Já o número de cirurgias de rim cresceu 36%, passando de 253 para 344 no mesmo período, enquanto os transplantes de pâncreas aumentaram 27,2%, de 27 para 44. Houve oito transplantes de pulmão no período, quatro a menos que no ano passado. O pulmão é um órgão de difícil aproveitamento por conta de fatores como infecções respiratórias e tempo em que o doador passou entubado, por exemplo. De janeiro a abril houve no Estado de São Paulo 2002 transplantes de córneas neste ano, 7% a mais do que no mesmo período do ano passado. Na capital paulista, 95% dos transplantados em abril aguardaram menos de um mês para realizar a cirurgia. Fonte: Continua 3 14/7/ :21:09

4 Diagnóstico Advancing Transplant Diagnostics Catálogo: BP072/BP071 Os antígenos MICA (do inglês, Major histocompatibility complex class I chain-related gene A) são glicoproteínas codificados na região gênica do MHC de classe I e apresentam similaridades estruturais com os antígenos HLA de classe I. Entretanto, estas moléculas não se ligam à β2- microglobulina, nem apresentam peptídeos aos linfócitos T. A transcrição destas moléculas é induzida em condições de estresse celular que ocorrem predominantemente na superfície celular de fibroblastos, células endoteliais, epitélio intestinal e em células de epitélio tumoral. São moléculas que interagem com o receptor NKG2D presente em células NK e em linfócitos Tγδ e Tαβ CD8+. A expressão de quantidades grandes e intermediárias de MICA em culturas celulares de epitélios tumorais pode estar relacionada com as condições de homeostasia e crescimento do tumor; tais evidências sugerem uma função de imunidade inata contra tumores. Estudos relacionam também, os antígenos MICA na progressão de doenças infecciosas e na suscetibilidade a certas doenças autoimunes. Além disso, sua grande diversidade genética e sua expressão na superfície de células endoteliais sugerem a participação desta molécula na rejeição crônica e aguda de aloenxertos. A rejeição crônica e aguda dos aloenxertos constitui a principal causa de perda de órgãos transplantados. Os anticorpos anti-hla podem contribuir para o desenvolvimento de respostas humorais mesmo em períodos mais tardios do pós-transplante, e que juntamente com respostas celulares levam a rejeição do tipo aguda e podem preceder a perda crônica do enxerto. Recentemente, o papel e relevância Curiosidade Associação de Anticorpos Anti MICA Em Rejeição de Transplantes dos antígenos MICA no contexto dos transplantes também têm sido investigados, pois a presença de anticorpos contra tais antígenos é capaz de prognosticar a rejeição de transplante renal, apesar da compatibilidade HLA. A primeira descrição de anticorpos induzidos por peptídeos derivados tanto de MICA quanto de MICB aconteceu em 1996, a partir de experimentos realizados com coelhos imunizados e também pela análise com marcação fluorescente de diversos tipos de tecidos. O estudo realizado por um grupo da Universidade de Texas (Southwestern Medical Center) demonstrou que a présensibilização contra o antígeno MICA estava associada à rejeição precoce do transplante renal homólogo, observando predominantemente nos casos em que havia boa compatibilidade HLA ou nos casos que não havia sensibilização contra o HLA. Como os antígenos MICA são polimórficos e comprovados indutores de produção de anticorpos, os pesquisadores previram que uma resposta a esses antígenos poderia provocar a rejeição. O estudo envolveu uma análise de amostras séricas pré-transplante de 1910 receptores de transplante homólogo renal de doadores falecidos. No total, 217 pacientes (11,4%) apresentaram anti- LSMICA001 4 BIO EM FOCO. JUN/09 Nº04 Referências: ZACARIAS, F.R. Polimorfismo do gene MICA e seu desequilíbrio de ligação com HLA-B. Curitiba: UFPR, p. Tese (Mestrado) Programa de Pós-Graduação em Genética do Departamento de Genética, Setor de Ciências Biológicas, Universidade Federal do Paraná. ZOU, Y.; STASTNY, P.; SÜSAL, C.; DÖHLER, B.; OPLZ, G. Antibodies against MICA Antigens and Kidney-Transplant Rejection. The New England Journal of Medicine 2007; 357: Produto LABScreen MICA Single Antigen Grupo 1 Catálogo Produto RSSOMICA LABType SSO MICA Nº de Testes 25 Nº de Testes 40 Linha para tipificação molecular MICA. Extração de DNA por coluna - sangue Número de testes: corpos anti MICA. Esses anticorpos foram associados a um maior risco de rejeição do transplante: 88,3% de sobrevida do transplante por um ano com anticorpos versus 93% sem os mesmos. Com o estudo, pode-se verificar a associação dos anticorpos anti MICA com o aumento da perda do enxerto, mesmo com a compatibilidade HLA. Assim, reforça-se a necessidade de saber se os anticorpos anti MICA, os quais estão associados à perda precoce de transplante renal, estão direcionados contra os alelos MICA do doador. A Biometrix e a One Lambda apresentam suas linhas de produtos para a detecção e identificação de anticorpos anti MICA e para a tipificação molecular MICA, utilizando as metodologias LABScreen e LABType, respectivamente. Linha para detecção e identificação de anticorpos anti MICA. O kit para extração de DNA por coluna fornece uma efeciente metodologia pra isolar DNA de alta qualidade a partir de amostras de sangue fresco ou congelado (anticoagulante de acordo com a metodologia em uso no laboratório, sem heparina) e buffy coat. Kit com Proteinase K Untitled-3 4 Catálogo Bactéria é despertada para a morte. 50 testes 250 testes A TAQ Polimerase é uma enzima termoestável recombinante isolada da bactériathermus aquaticus. A enzima é purificada para garantir um baixo nível de contaminação e consiste de um peptídeo simples, ligado a uma molécula de peso molecular de aproximadamente 94 kda. Nova estratégia para eliminar infecções latentes pode ajudar no combate à tuberculose e outras doenças infecciosas por Nikhil Swaminathan Pesquisadores israelenses anunciaram no mês passado o desenvolvimento de uma nova técnica que pode eliminar bactérias obstinadas que escapam dos antibióticos. Algumas infecções como a tuberculose (TB) podem permanecer latentes nos pulmões por décadas, antes de se tornarem ativas e provocarem os sintomas mesmo depois de a maioria das bactérias ter sido debelada por antibióticos.cientistas da Universidade Hebraica de Jerusalém relataram no Proceedings of the National Academy of Sciences USA, a descoberta de uma forma de erradicar esses microrganismos e evitar que voltem a atacar, quando o sistema imunológico do portador estiver fragilizado. O novo método tira partido da necessidade que as bactérias adormecidas têm de absorver nutrientes como ferro e magnésio. Esses microrganismos podem evitar os antibióticos quando estão com fome e se tornam inativas. Os pesquisadores conseguiram reduzir populações de bactérias persistentes em até 99% inicialmente revigorando-as com nutrientes e depois destruindo-as com antibiótico.no estudo, o grupo saturou uma linha de Escherichia coli bactéria comum, inofensiva, que vive no trato intestinal humano e de muitos animais, embora algumas cepas possam provocar envenenamento alimentar com antibióticos. Parte dela morreu, mas muitas obstinadas permaneceram ativas. Quando os pesquisadores mergulharam as sobreviventes em uma infusão de nutrientes (incluindo uma fonte de carbono, ferro e magnésio), elas parecem ter despertado do estado de latência por cerca de uma hora, mas não se replicaram como as bactérias normais. Posteriormente, os pesquisadores ofereceram nutrientes, acompanhados de uma boa dose de antibióticos; elas se reanimaram, mas morreram em seguida. Normalmente, quando se suspende o fornecimento de nutrientes para bactérias em laboratório, é preciso esperar algumas horas até elas se adaptarem, e isso acontece quando se começa a intro- duzir os antibióticos, observa a co-autora do estudo, Nathalie Balaban, física e bióloga. Quando as bactérias foram expostas a novos nutrientes e antibióticos simultaneamente, conseguimos reduzir o número delas significativamente. Ela estima que seu grupo eliminou 99% da população bacteriana.kim Lewis, diretor do Centro Antimicrobiano da Northeastern University, avalia que o novo trabalho é interessante, mas que pesquisas adicionais são necessárias. Ele observa que a E. coli que o grupo utilizou nos experimentos é uma cepa mutante, que costuma deixar um número mais alto de indivíduos resistentes que os tipos normais. E argumenta que essa variação pode provocar alterações nos resultados se aplicada a outros tipos de bactérias. Balaban concorda que a técnica precisa ser testada em animais para se avaliar sua eficiência em organismos complexos e não apenas em culturas celulares simples. Antecipa alguns desafios que serão constatados, incluindo a acessibilidade aos locais da infecção. No caso de uma infecção urinária, seria relativamente fácil descarregar a bexiga e o resto do trato urinário. Mas seria mais difícil atingir a bactéria em infecções respiratórias como a TB e descobrir seus nutrientes preferidos para despertá-las e fazê-las ingerir o antibiótico. Disponível em: Número de unidades: 500 unidades (5U/uL) Catálogo: TGP /7/ :21:14

5 Biossegurança A importância da PCR quantitativa no monitoramento da Síndrome da meningite asséptica por Enterovírus Brometo de Etídio A partir desta edição, traremos sempre uma matéria relacionada à Biossegurança. Visto a obrigatoriedade de todo serviço de saúde obedecer a normas para acondicionamento, manuseio, transporte e disposição final dos resíduos produzidos, e considerando a importância da saúde do homem, dos animais, das plantas e do meio ambiente, os procedimentos de biossegurança são importantes diretrizes na rotina laboratorial. Biossegurança é definida como o conjunto de saberes direcionados para ações de prevenção, minimização ou eliminação dos riscos relacionados às atividades de pesquisa, produção, ensino, desenvolvimento tecnológico e prestação de serviços. A biossegurança é um processo contínuo que envolve a conscientização, atitudes e busca constante de novas idéias para os problemas que surgem nos estabelecimentos de saúde. Para abrir esta coluna, selecionamos um velho conhecido dos laboratórios de biologia molecular, o Brometo de Etídio (EtBr). Essa substância é comumente utilizada para corar ácidos nucléicos submetidos à eletroforese em gel de agarose. A ação como corante do EtBr se deve a capacidade dessa substância de se intercalar entre as bases dos ácidos nucléicos e florescer sob luz Ultra Violeta. Esse caráter intercalante é também responsável pelo alto potencial mutagênico, pois pode gerar alterações na estrutura do DNA, as quais poderão ser permutadas durante o processo de duplicação, dessa forma a leitura errada das sequências de bases do DNA pode gerar mutações. As recomendações para seu manuseio em laboratório são a utilização de óculos de segurança, avental, luvas apropriadas 8 BIO EM FOCO. JUN/09 Nº04 Untitled-3 5 e manuseio em capela. As características de risco do EtBr deve ser apresentada na Ficha de Informações de Segurança de Produtos Químicos FISPQ, conforme NBR da ABNT e Decreto/PR 2657/98, em alguns países essa ficha é chamada Material Safety Data Sheet (MSDS). Segundo a Resolução RDC Diante da capacidade do EtBr se intercalar no DNA, é necessária uma grande atenção para o seu descarte. Um dos protocolos mais simples para o tratamento de resíduos com alta concentração de EtBr (até 10mg/ml) é o tratamento com Permanganato de Potássio em condições de acidez. Durante este tratamento haverá a oxidação do EtBr pelo permanganato resultando na formação de um precipitado marrom escuro. Posteriormente, esta mistura é neutralizada com NaOH e descartada (Sambrook & Al., 1989). Estes compostos podem ser também eliminados por incineração em fornalha equipada com póscombustor e purificador de gases. Para pequenas quantidades o EtBr pode ser convertido em um produto fisiologicamente inativo, 2carboxi-benzofenona com alvejante. A uma solução de 34 mg de brometo de etídio em ml de água são adicionados 300 ml de alvejante caseiro, e a mistura deve ser mexida à temperatura ambiente por duas horas, a solução é então despejada no ralo com água (ARMOUR, 1996). Os resíduos sólidos (géis e papéis) podem ser secados a temperatura ambiente e posteriormente incinerados em fornos de alta temperatura com póscombustor e purificador de gases. REFERÊNCIAS: ARMOUR, M. A. Hazardous Laboratory Chemicals Disposal Guide. Second Edition, Lewis Publishers, EUA, nº306, de 7 de dezembro de 2004 que dispõe sobre o Regulamento Técnico para o gerenciamento de resíduos de serviços da saúde, o brometo de etídio se enquadra no Apêndice VI do Grupo B de Resíduos de Serviço para a Saúde (RSS). BRASIL. Resolução RDC nº 306, de 7 de dezembro de Diário Oficial da República Federativa do Brasil, Poder Legislativo, Brasília, DF, 10 dez SAMBROOK, J.; FRITSCH, E.F.; MANIATIS, T. Molecular cloning: a laboratory manual. New York: Cold Spring Harbor, v. Desde a década de 60 os enterovírus são associados à síndrome da meningite asséptica principalmente em épocas endêmicas, com sua expressão variando entre 41% nos anos 60 até 97% nos anos 90. Tem sua clínica associada a crianças de 3 meses a 15 anos, mas apresentam-se também adultos com idade aproximada de 57 anos (São Paulo).1 Para justificativa de solicitação da pesquisa por enterovírus nos mesmos, são levados em consideração os seguintes aspectos: liquor de aspecto límpido ou levemente opalescente (máximo de 2000 células/m3), proteína menor que 150mg/dl, glicose maior que 40mg%, exames microbiológicos negativos (Gram, tinta da China, e culturas). O espécimes biológicos analisados são liquor, sangue ou soro e fezes 1. Clinicamente o paciente apresenta febre e cefaléia aguda. Normalmente o diagnóstico é feito através de PCR-EV, cultura de células HEP-2 e ou RD, porém, este último necessita de grande experiência do laboratorista e a análise pode demorar até 9 dias (observação de efeitos cito patológicos).1 A PCR quantitativa ( EV Q PCR ALERT, carga vírica no líquor) deve ser sempre incluída no protocolo de avaliação dos quadros neurológicos agudos nos doentes infectados, pois, a síndrome pode se manifestar em qualquer estágio da infecção, não somente na infecção aguda, já que a mesma depende do estado imunológico do indivíduo para manifestar-se, desta forma a quantificação tem papel importante no monitoramento do paciente, evitando recaídas. Em casos onde o vírus somente é encontrado nas fezes e o teste PCR foi negativo, o caso é diagnosticado como provável etiologia viral.2 A escolha da terapêutica anti-retrovírica deve privilegiar fármacos com boa penetração no SNC, principalmente quando a carga vírica no líquor é elevada, quando existem manifestações neurológicas e durante a síndrome retrovírica aguda.2 Referências 1. SILVA, Hagamenon R; TANAJURA, Gustavo Mustafa; TAVARES NETO, José; GOMES, Maria de Lourdes C; LINHARES, Alexandre da Costa; VASCONCELOS, Pedro F C; KO, Albert Icksang. Síndrome da meningite asséptica por enterovírus e Leptospira sp em crianças de Salvador, Bahia. Rev. Soc. Bras. Med. Trop; 35(2): , mar. abr MAGALHÃES, Luísa, CARVALHO, Luísa, PAIVA, Paulo, VASCONCELOS, Carlos. Meningite asséptica recorrente associada à infecção pelo vírus da imunodeficiência humana tipo 1: Caso clínico. Medicina interna.vol.15, Nº 2, ABR/JUN Importante DNA Lula sanciona lei que cria semana de mobilização pela doação de medula óssea O presidente Luiz Inácio Lula da Silva sancionou uma lei que institui a Semana de Mobilização Nacional para Doadores de Medula Óssea. Durante a semana, que será celebrada todos os anos entre os dias 14 e 21 de dezembro, órgãos públicos e privados devem realizar campanhas para esclarecer e incentivar a doação de medula. A lei estabelece que a população deve ser orientada sobre a importância da doação da medula óssea e os procedimentos para fazer parte do cadastro de doadores. Estimula também a ação unificada da União, dos estados e municípios no sentido de estruturar laboratórios e ampliar os locais para a realização de exames que identifiquem características dos doadores. Com esse banco de dados será possível convocar um doador compatível no momento em que um paciente doente aparecer. O texto sancionado pelo presidente define ainda que durante a semana seja divulgada a frase: Neste Natal, dê um presente a quem precisa de você para viver: cadastre-se como doador de medula. A lei foi publicada no Diário Oficial da União dia 23 de Abril e nasceu de uma proposta do deputado Beto Albuquerque (PSB-RS) que em fevereiro de 2009 perdeu um filho vítima de leucemia aguda. 23/04/ :24 Agência Estado 5 14/7/ :21:23

6 Diagnóstico Fique por Dentro Doença Celíaca ou enteropatia sensível ao glúten (GES) é uma condição crônica onde as principais características incluem a inflamação e achatamento histológico característico da mucosa intestinal, tendo como resultado uma síndrome da má absorção. A etiologia exata da doença permanece desconhecida, mas a gliadina ou a fração do glúten de trigo solúvel em álcool é claramente o agente desencadeante. 1 Qual a importância do diagnóstico? A maioria dos celíacos e pacientes da GSE são diagnosticados tardiamente. Segundo a Celiac Disease Foudation, um Uso Doença Celíaca para o Profissional Médico em cada 133 indivíduos é afetado pela doença celíaca e somente 3% tem sido diagnosticado. Há pouco tempo, uma série de biópsias intestinais foi utilizada para o diagnóstico da doença celíaca e desordens relativas. Sintomático ou diagnosticado Doença Celíaca latente Doença Celíaca silenciosa Testes que beneficiam o diagnóstico sorológico da doença celíaca e da GSE Recentemente, o teste sorológico foi sugerido para pacientes suspeitos de enteropatia sensível ao glúten, bem como, para o monitoramento dietético quanto a presença de autoanticorpos. 2 3 A European Society of Pediatric Gastroenterology an População Suscetível A Doença Celíaca silenciosa representa os pacientes assintomáticos, porém com anomalia intestinal revelada na biópsia. Na doença celíaca latente, os pacientes possuem uma mucosa intestinal normal, porém, considerados de risco para doença.1 Avaliação da probalidade de dano intestinal Nutrion (ESPGAN), tem recomendado o uso de marcadores sorológicos, afim de reduzir o número de biópsias no diagnóstico. 4 A Biometrix Diagnóstica disponibiliza um painel detalhado dos ensaios sorológicos que abrangem o espectro das manifestações da GSE, incluindo sugestões para amostras de pacientes com diagnóstico complicado, fig Com um número elevado de metodologias disponíveis, o profissional médico pode montar um perfil da necessidade de cada paciente e de cada laboratório. REFERÊNCIAS 1. AGA Technical Review on Celiac Sprue. Ciclitira P. and Americam Gastroenterological Association Clinical Practice and Practice Economics Committee. Gastroenterology 2001; 120: Predictive value for Celiac disease of antibodies to gliadin, endomysium and jejunun in patients attending for jejunal biopsy. McMillam S. BMJ 303: , Screening for antibodies against gliadin in patients with A doença celíaca é uma desordem autoimune que afeta aproximadamente um em cada cem pessoas. Infelizmente, 97% permanecem sem diagnóstico e sem tratamento Peter H. Green, MD Celiac Disease: A Hidden Epidemic HarpecColins, 2006, New York, NY) osteoporosis. Journal of Internal Medicine 241: , Revised criteria for diagnosis of celiac disease. Working Group of European Society of Pediatric Gastroenterology. Arch Dis Child 65: , Antibodies against Synthetic Deamidated Gliadin Peptides in Celiac Disease Diagnosis and Follow-Up in Children, Bassi D. Clinical Chemistry. 2009; 55: Usefulness of Antibodies to Deamidated Gliadin Peptides in Celiac Disease Diagnosis and Follow-Up. Volata U. Dig Dis Sci 2008; 53: Antibodies Against Synthetic Deamidated Gliadin Peptides and Tissue Transglutaminase for the Identification of Childhood Celiac Disease. Agardh D. Clinical Gastroenterology and Hepatology 2007;5: Coeliac Antibody Testing With Deamidated Gliadin Peptides In Difficult Patient Samples. Korponay-Szabó, I Gut 2007; 56 (Supll III) A Evaluation of the INOVA Diagnostics Enzyme-Linked Immunosorbent Assay Kits for Measuring Serum Immunoglobulin G () and to Deamidated Gliadin Peptides. Prince, H. Clinical and Vaccine Immunology Jan., A Report on the International transglutaminase Autoantibody Workshop of Celiac Disease. Liu E. Americam journal of Gastroenterology 2009; Vol. 104: anti-actin antibodies ELISA in celiac disease: A multicentre study. Carroccio A. Digestive and Liver Disease 2007; 39: Objetivo Ensaios Disponíveis Triagem em população de risco com sensibilidade elevada h-ttg/dgp triar conjugados IgA/IgG misturados. Detecção da GSE e doença celíaca não complicada, por métodos estabelecidos h-ttg ELISA Gliadina II (DGP) IgA ELISA Detectando Celíacos com deficiência seletiva de IgA h-ttg/dgp triar conjugados IgA/IgG misturados. Detectando Celíacos com deficiência seletiva de IgA, Dermatite herpetiforme, Pediátricos ou pacientes complicados, como os doentes Celíacos Latentes. Celiac DGP triar conjugados IgA/IgG. Estabelecido ou suspeita de atrofia vilosa F-Actina IgA ELISA kit Quanta Lite h-ttg assays Uma comparação entre laboratórios, o Quanta Lite h-ttf, demonstrou ótima sensibilidade e especificidade na detetecção da Doença Celíaca. O Quanta Lite h-ttg tiveram sensibildade de % e especificidade de 99% Essa sensibilidade e especificidade, foi alcançada com a retirada dos soros de pacientes com dieta isenta de glúten, porém, a INOVA obteve os melhores resultados ELISA com pacientes em dieta. Para maiores detalhes temos essa publicação na íntegra. Quanta Lite DGP assays Detecta a doença em amostras de pacientes complicados. Permite a detecção dos anticorpos específicos da doença onde o ensaio convencional do h-ttg falhou. Os ensaios INOVA DGP tem demonstrado uma concordância de 97% com os resultados do ttg e antiendomisio (IFA). Os ensaios INOVA DGP eliminam 96% dos pacientes não-celíacos-específicos que são encontrados no ensaio convencional, utilizando a molécula inteira da gliadina. 9 % 90% 80% 70% 60% 50% 40% + Def. CD + D. herpetiformis INOVA DGP / combo + Problem CD/ Equivocal EMA h-ttg Adapted from Korponay-Szabá, I. Gut 2007; 56 (Suppl III) A109 6 Gliadina II (DGP) IgA ELISA Gliadina IgA ELISA Gliadina IgG Elisa Celiac IgA Profile (h-ttg e DGP) tecnologia Luminex Anti Endomísio (EMA) por imunofluorescência indireta h-ttg IgG ELISA Celiac IgG Profile tecnologia Luminex Celiac DGP triar conjugados IgA/IgG misturados. O ensaio combinado de IgAG-DGP/tTG é recomendado como uma triagem inicial (screening) para a identificação da doença celíaca na infância e igualmente pode ser usado como um marcador da aquiescência dietética. 7 PERCENTAGE % 90% 80% 70% 60% INOVA Sensitivity Specificity A E G N T Q B OI D I M C R S H ttg ELISA KITS adapted from Liu E. Americam Journal of Gastroenterology 2009; Vol. 104: Por que a linha INOVA atende as necessidades dos Médicos e dos Laboratórios? O Quanta Lite h-ttg/dgp Screen Possui sensibilidade de 95% em testes simultâneos para autoanticorpos e. Teste ideal para triagem de grandes populações como a pediátrica. Permite a identificação de pacientes com sintomas atípicos da doença celíaca. Sensibilidade 95% h-ttg/dgp Screem (/) 90% DGP Screem (/) Ensaios 84% h-ttg () A sensibilidade relativa do h-ttg reflete a inclusão de pacientes com deficiência de, na coorte (6%). ttg ELISA EMA - IFA Fig. 1 Este quadro demonstra a condição clínica do celíaco e a aplicação dos ensaios sorológicos disponíveis. 6 BIO EM FOCO. JUN/09 Nº04 7 Untitled /7/ :21:23

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