VALIDAÇÃO DE PROTOCOLO PARA DETECÇÃO DE Guignardia citricarpa EM CITROS POR PCR CONVENCIONAL E PCR EM TEMPO REAL

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1 1 FERNANDA DE SILLOS FAGANELLO VALIDAÇÃO DE PROTOCOLO PARA DETECÇÃO DE Guignardia citricarpa EM CITROS POR PCR CONVENCIONAL E PCR EM TEMPO REAL Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Agronomia, da Universidade Federal de Goiás, como requisito parcial à obtenção do título de mestre em Agronomia, área de Concentração: Fitossanidade. Orientador: Prof. Dr. Marcos Gomes da Cunha Coorientadora: Dra. Regina Melo Sartoni Coelho Goiânia, GO Brasil 2013

2 Dados Internacionais de Catalogação na Publicação (CIP) GPT/BC/UFG F151v Faganello, Fernanda de Sillos. Validação de protocolo para detecção de Guignardia citricarpa em citrus por PCR convencional e PCR em tempo real [manuscrito] / Fernanda de Sillos Faganello f. : Il. Orientador: Dr. Marcos Gomes da Cunha; Coorientador: Profª. Dr.ª Regina Melo Sartoni Coelho. Dissertação (Mestrado) Universidade Federal de Goiás, Escola de Agronomia, Bibliografia. Inclui lista de figuras e tabelas 1. Guignardia citricarpa Protocolo para detecção. 2. Cationic hexadecyl trimethyl ammonium bromide (CTAB). 3. Reação em cadeia da polymerase (PCR). I. Título. CDU: :581.2 Permitida a reprodução total ou parcial deste documento, desde que citada a fonte-o autor

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5 DEDICO À minha mãe Maria Emília, pelo seu exemplo de vida e por estar sempre ao meu lado e apoiar todas as minhas decisões. E ao meu filho Caio, que deu novo sentido à minha existência. OFEREÇO Aos meus amigos, Regina, Glória e Abmael, pelo amor, amizade e apoio que me proporcionaram em todos os momentos. AGRADECIMENTOS A Deus, por me dar forças e sabedoria para a realização deste trabalho. Ao Prof. Dr. Marcos Gomes da Cunha, pela oportunidade de ser aceita neste programa de pós-graduação e pela confiança, amizade e incentivo. Às fiscais federais agropecuárias Regina e Glória, pelo tempo dispensado e pelas experiências compartilhadas. Ao Laboratório de Diagnóstico Vegetal (LDV) do Laboratório Nacional Agropecuário em Goiás (Lanagro-GO), pelo elevado espírito de colaboração científica, ao permitir a utilização de suas instalações e por disponibilizar toda infraestrutura necessária para a realização dos experimentos. À equipe do Laboratório de Diagnóstico Vegetal (LDV) do Laboratório Nacional Agropecuário em Goiás (Lanagro-GO), aos fiscais federais Abmael Monteiro de Lima Júnior, Maria da Glória Trindade e Regina Melo Sartori Coelho, pela acolhida e irrestrito apoio. À EA/UFG, pela oportunidade de realização do curso de Mestrado em Agronomia. À Agrodefesa, pelo apoio na condução da pesquisa. À Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Goiás (Fapeg), pela bolsa de estudo

6 SUMÁRIO LISTA DE TABELAS... 7 LISTA DE FIGURAS... 8 RESUMO GERAL GENERAL ABSTRACT INTRODUÇÃO GERAL REVISÃO BIBLIOGRÁFICA PINTA PRETA DOS CITROS Histórico da doença Etiologia e epidemiologia Sintomatologia Diagnóstico de Guignardia citricarpa EXTRAÇÃO DE DNA Método CTAB para extração de DNA Influência de métodos de extração de DNA e inibidores da PCR VALIDAÇÃO DE MÉTODOS DE ENSAIOS LABORATORIAIS REFERÊNCIAS VALIDAÇÃO IN HOUSE DO MÉTODO CTAB MODIFICADO PARA EXTRAÇÃO DE DNA DE Guignardia citricarpa DE TECIDOS DE FRUTOS CÍTRICOS RESUMO ABSTRACT INTRODUÇÃO MATERIAL E MÉTODOS Preparação das amostras Extração do DNA Rompimento de paredes celulares Digestão de proteínas Precipitação do DNA Lavagem e secagem do DNA Eluição do DNA e degradação do RNA Quantidade e pureza de DNA Avaliação da integridade estrutural do DNA e verificação da presença de substâncias inibidoras RESULTADOS E DISCUSSÃO CONCLUSÕES REFERÊNCIAS VALIDAÇÃO IN HOUSE DE MÉTODO PARA DIAGNÓSTICO DE Guignardia citricarpa POR PCR CONVENCIONAL E PCE EM TEMPO REAL... 58

7 RESUMO ABSTRACT INTRODUÇÃO MATERIAL E MÉTODOS Amostras para extração de DNA Isolamento e identificação de Guignardia citricarpa Extração do DNA Detecção de Guignardia citricarpa por PCR convencional Especificidade analítica Limite de detecção Detecção de Guignardia citricarpa por PCR em tempo real Especificidade analítica Limite de detecção RESULTADOS E DISCUSSÃO PCR convencional PCR em tempo real CONCLUSÕES REFERÊNCIAS DIAGNÓSTICO DE Guignardia citricarpa EM FOLHAS DE CITROS ASSINTOMÁTICAS POR PCR CONVENCIONAL E PCR EM TEMPO REAL RESUMO ABSTRACT INTRODUÇÃO MATERIAL E MÉTODOS Amostragem e preparação das amostras Extração do DNA Diagnóstico de Guignardia citricarpa por PCR convencional Diagnóstico de Guignardia citricarpa por PCR em tempo real RESULTADOS E DISCUSSÃO CONCLUSÕES REFERÊNCIAS CONSIDERAÇÕES FINAIS REFERÊNCIAS

8 LISTA DE TABELAS Tabela 3.1. Concentração e pureza do DNA extraído pelo método CTAB modificado, correspondente à média de dezoito extrações para cada amostra Tabela 3.2. Amplificação por PCR em tempo real do DNA-padrão de milho a 0,1 % para verificação da ausência de inibidores no DNA de tecidos cítricos de lesões típicas de Guignardia citricarpa Tabela 4.1. Especificidade do conjunto de primers de primers/sonda (GcF1 e GcR1)/GcF1 para detecção de Guignardia citricarpa por PCR em tempo real Tabela 4.2. Número de cópias de DNA e Ct médio observado para a amplificação da região específica de Guignardia citricarpa por PCR em tempo real em diferentes concentrações de DNA Tabela 5.1. Frequência de detecção de Guignardia citricarpa por PCR convencional e PCR em tempo real em folhas assintomáticas coletadas no terço superior, médio e inferior de plantas de citros, em duas fazendas no município de Pirenópolis e Inhumas, Goiás

9 LISTA DE FIGURAS Figura 3.1. Análise eletroforética de DNA genômico de tecidos de lesões de frutos cítricos, extraído pelo método CTAB modificado, em gel de agarose 1 %. 1 e 14 - Ladder (Promega ) de 1Kb; 2 a 7 - DNA de tecidos de lesões de Guignardia citricarpa de frutos higienizados; 8 a 13 - DNA de tecidos de lesões de Guignardia citricarpa de frutos não higienizados Figura 3.2. Concentração média de DNA, por dia de extração, de lesões de tecidos cítricos, utilizando o método CTAB modificado Figura 4.1. A, B, C) Frutos de citros com sintoma de pinta preta dos citros coletados na propriedade Chácara União, no município de Pirenópolis, Goiás; B) sintoma mancha sardenta de pinta preta; C) sintoma típico de pinta preta Figura 4.2. Montagem de câmara úmida em caixa gerbox com lâmina de vidro e papel mata-borrão, com fragmentos de tecidos cítricos com lesões típicas de pinta preta para produção de picnídios e conídios Figura 4.3. A) Colônias de Guignardia citricarpa em meio aveia-ágar após 7 dias de incubação, em regime de escuro, à temperatura de 20 ºC, com pigmento amarelo na borda da colônia; B) Conídios de Guignardia citricarpa com apêndices e fino revestimento mucoso característico do fungo (Foto: Abmael Monteiro Lima Jr) Figura 4.4. Detecção de Guignardia citricarpa por PCR convencional (primers GcF3 e GcR7), para teste de especificidade. GEL 1: 1) Ladder 1kb; 2 e 3) DNA de lesão única de fruto higienizado; 4 e 5) DNA de lesão única de fruto não higienizado; 6 e 7) DNA de tecidos de lesões de frutos higienizados; 8 e 9) DNA de tecidos de lesões de frutos não higienizados; 10,11,12 e 13) DNA de isolados de Guignardia citricarpa (micélio); 14 e 15) DNA de inseto (único) Diaphorina citri; 16) DNA de folha de algodão transgênico. GEL 2: 1) Ladder 1 kb; 2) DNA de folha de algodão transgênico; 3 e 4) DNA de folha de laranja infectada com Huanglongbing; 5 e 6) DNA de Alternaria sp. 7 e 8) DNA de Candidatus Liberibacter asiaticus; 9 e 10) DNA de Candidatus Liberibacter americanos; 11 e 12) DNA de Phytoplasma; 13 e 14) DNA de Fusarium solani; 15 e 16) DNA de ração para aves Figura 4.5. Teste de repetitividade por PCR convencional de DNA de Guignardia citricarpa (primers GcF3 e GcR7). GEL 1: 1) Ladder 1kb; 2 a 11) 100 ng de DNA por reação. GEL 2: 1) Ladder 1kb; 2 a 11) 10 ng de DNA por reação Figura 4.6. Teste de repetitividade por PCR convencional de DNA de Guignardia citricarpa (primers GcF3 e GcR7). GEL 1: 1) Ladder 1kb; 2 a 11) 1 ng de DNA por reação. GEL 2: 1) Ladder 1kb; 2 a 11) 0,1 ng de DNA por reação Figura 4.7. Teste de repetitividade por PCR convencional de DNA de Guignardia citricarpa (primers GcF3 e GcR7). GEL 1: 1) Ladder 1kb; 2 a 11) 200 ng de DNA por reação. GEL 2: 1) Ladder 1kb; 2 a 11) 20 ng de DNA por reação Figura 4.8. Teste de repetitividade por PCR convencional de DNA de Guignardia

10 citricarpa (primers GcF3 e GcR7). GEL 1: 1) Ladder 1kb; 2 a 11) 2 ng de DNA por reação. GEL 2: 1) Ladder 1kb; 2 a 11) 0,2 ng de DNA por reação

11 RESUMO GERAL FAGANELLO, F. S. Validação de protocolo para detecção de Guignardia citricarpa em citros por PCR convencional e PCR em tempo real f. Dissertação (Mestre em Agronomia: Fitossanidade) Escola de Agronomia, Universidade Federal de Goiás, Goiânia, A pinta preta dos citros (PPC), causada pelo fungo Guignardia citricarpa, é considerada uma doença quarentenária, que impõe restrições ao transporte de frutas frescas para países da União Europeia. Em Goiás, apesar dos sistemáticos levantamentos fitossanitários, ainda não se conhece a real distribuição da ocorrência da PPC em função da tecnologia disponível para o diagnóstico. A ocorrência de infecção latente, a presença de uma espécie endofítica muito semelhante morfologicamente à G. citricarpa e o tempo para o diagnóstico por métodos convencionais levam à necessidade de validar métodos moleculares rápidos, eficientes, reprodutíveis, seguros e sensíveis de diagnóstico, que garantem confiabilidade dos diagnósticos e dos levantamentos de detecção e delimitação da distribuição dessa doença. Foram testadas modificações do método Cationic hexadecyl trimethyl ammonium bromide (CTAB) para extração de DNA de G. citricarpa em tecidos de frutos cítricos sintomáticos, com a avaliação da pureza química, integridade estrutural e ausência de substâncias inibidoras na solução de DNA, para posterior uso em diagnóstico por reação em cadeia da polimerase (PCR). Não houve diferença significativa na quantidade média de DNA extraído para tecidos higienizados e não higienizados (328,62 ng µl -1 e 322,79 ng µl -1, respectivamente), com baixa concentração de proteínas na suspensão de DNA. A obtenção de DNA em quantidade (>300 ng µl -1 ) e qualidade (integridade estrutural) foi suficiente para realização das análises de PCR convencional e PCR em tempo real. A ausência de compostos inibidores foi demostrada por PCR em tempo real pela adição de DNA padrão de milho, geneticamente modificado 0,1 % (evento MON 810 padrão ERM -BF413b), com a amplificação da região específica desse evento em todas as amostras teste. O método CTAB modificado apresentou repetitividade e reprodutibilidade parcial dentro dos limites aceitáveis para a metodologia, apresentando coeficientes de variação inferiores a 30 %. Em atendimento à norma ISO/IEC 17025:2005, foi validado o método para diagnóstico do fungo G. citricarpa por PCR convencional e PCR em tempo real com a avaliação da especificidade e do limite de detecção. Os métodos de PCR convencional e PCR em tempo real demonstraram serem específicos e adequados para a detecção de G. citricarpa. A PCR convencional apresentou o limite de detecção de 10 ng µl -1 de DNA do fungo, com repetitividade. A PCR em tempo real apresentou maior sensibilidade, sendo o limite de detecção determinado para a técnica, com repetitividade, na concentração 10 fg de DNA do fungo. Em duas propriedades foram coletadas 24 folhas externas assintomáticas de laranja-pera rio, sendo oito em cada terço (inferior, médio e superior) da planta, em um total de vinte plantas. Para a extração do DNA, foi utilizado o método CTAB modificado. Em folhas assintomáticas, a presença do fungo foi detectada em baixíssimas concentrações, o que inviabiliza a utilização da técnica PCR convencional. Nessas condições, a PCR em tempo real demonstrou ser viável, reprodutível e altamente sensível para a detecção de G. citricarpa, sendo detectado na concentração de 232 a 1 Orientador: Prof. Dr. Marcos Gomes da Cunha. EA/UFG. Coorientadora: Dra. Regina Melo Sartoni Coelho. Lanagro/Mapa/GO.

12 232 x 10² números de cópia do DNA do fungo em amostras de folhas assintomáticas, constituindo uma excelente opção para o diagnóstico desse patógeno em pomares assintomáticos. 11 Palavras-chave: CTAB modificado; PCR convencional; PCR em tempo real; pinta preta dos citros.

13 GENERAL ABSTRACT FAGANELO, F. S. Validation of protocol for detection of Guignardia citricarpa in citrus by conventional PCR and real time PCR f. Dissertation (Master s degree in Agronomy: Phytosanitary) Escola de Agronomia, Universidade Federal de Goiás, Goiânia, Citrus Black Spot (CBS) caused by Guignardia citricarpa is classified as quarantine disease, imposing restrictions to fresh fruits shipping to the European Union countries. In the state of Goiás, despite systematic phytosanitary surveys, its distribution and occurrence are unknown due to lack of available technologies for diagnosis. The occurrence of latent infections, the presence of an endophytic species morphologically similar to G. citricarpa, as well as time consuming for diagnosis through conventional methods require the validation of fast, efficient, reproducible, safe and sensitive methods of diagnosis to provide reliability of diagnosis and disease surveys for its detection and delimitation. Modifications of the Cationic hexadecyl trimethyl ammonium bromide method (CTAB) to extract DNA of G. citricarpa from symptomatic tissues with validation of chemical purity, structural integrity, and absence of DNA inhibiting substances, for further use in diagnosis by PCR were tested. There was no difference in the average of DNA extracted for hygienized and non-hygienized tissues ( ng µl -1 and ng µl -1, respectively), with low concentration of proteins in the DNA solution. The extractor of DNA in amount (>300 ng µl -1 ) and quality (structural integrity) was sufficient to perform the conventional and real-time PCR analyses. The absence of inhibitors was demonstrated by real-time PCR, adding 0.1 % genetically modified standard corn DNA (event MON 810 standard ERM -BF413b), with the amplification of the specific region of this event in all test samples. The modified CTAB method sowed repeatability and partial reproducibility among the limits acceptable in the methodology with coefficient of variability lower than 30 %. To comply with the ISO/TEC 17025:2005 norm, the method for the diagnosis of the fungus G. citricarpa by PCR conventional and real time PCR was validated with the specific evaluation of the limit of detection. Conventional and real time PCR methods were specificity and adequacy to detect G. citricarpa. Conventional PCR presented detecting limit of 10 ng µl -1 of the fungus DNA, with repeatability. Real time PCR presented higher sensitivity, having the detecting limit determined for the technique with repeatability, at the concentration of 10 fg of DNA of the fungus. In two farms 24 external asymptomatic leaves from orange trees variety Pera Rio were collected; eight from each third (lower, medium and upper); totaling twent plants. The modified CTAB method for DNA extraction was used. The presence of the fungus in very low concentrations was detected in the asymptomatic leaves, which made it impossible when we used the conventional PCR technique. In those conditions, the real-time PCR proved to be feasible, reproducible and highly sensitive for G. citricarpa detection, amplifying 1 Adiviser: Prof. Dr. Marcos Gomes da Cunha. EA/UFG. Co-adiviser: Dra. Regina Melo Sartoni Coelho. Lanagro/Mapa/GO.

14 between 232 and 232 x 10 2 DNA copies of the fungus from asymptomatic leaf samples; being an excellent option for the diagnosis of this pathogen in asymptomatic orchards. 13 Key words: modified CTAB; conventional PCR; real time PCR; citrus black spot.

15 1 INTRODUÇÃO GERAL A pinta preta dos citros (PPC) é causada pelo fungo ascomiceto Guignardia citricarpa Kiely (Kiely, 1948), forma anamórfica Phyllosticta citricarpa Van der Aa (Van Der Aa, 1973). Tradicionalmente, a pinta preta tem a presença confirmada por métodos convencionais de diagnóstico a partir de frutos maduros em lesões com a presença de picnídios (Baayen et al., 2002), com a visualização dos sintomas visuais, isolamento, cultivo e identificação do agente causal por características morfológicas, necessitando de tempo, às vezes semanas, para a conclusão do diagnóstico. Dependendo das características das espécies, o diagnóstico tradicional não é adequado à identificação de pragas quarentenárias, tornando-se impraticável quando há necessidade de resultados rápidos. A PPC é uma doença quarentenária, sujeita à medidas fitossanitárias regulatórias da União Europeia. Lotes com a presença de um único fruto sintomático para G. citricarpa têm sido rechaçados (União Europeia, 2000). A existência de uma espécie endofítica, Guignardia mangiferae, morfologicamente muito semelhante à espécie patogênica, dificulta o diagnóstico de G. citricarpa por características morfológicas (Blanco, 1999; Baayen et al., 2002; Christo, 2002; Rodrigues et al., 2004). Somam-se a essas dificuldades, a demora na incubação de frutos para a formação de picnídios e a possibilidade de ocorrência de falsos-negativos (Stringari, 2009), quando da utilização do marcador morfológico (produção de halo amarelo em meio ágar-aveia de colônias de G. citricarpa) descrito por Baayen et al. (2002). O diagnóstico ainda pode ser dificultado devido à semelhança das lesões causadas por G. citricarpa àquelas causadas por outros fungos patogênicos como Alternaria alternata pv. citri (Snowdon, 1990; Bonants et al., 2003). Os sintomas de PPC são expressos, principalmente, em frutos maduros, após a colheita ou durante o transporte e armazenamento (Feichtenberger, 1996a). A ocorrência de infecção latente, com período de infecção entre a queda das pétalas até quatro ou cinco meses depois (Baldassari, 2001), evidencia a importância da identificação antecipada da presença do patógeno antes da visualização de sintomas ainda nas unidades produtoras e a

16 15 utilização de técnicas moleculares em complementação ao diagnóstico convencional. Técnicas moleculares são cada vez mais aplicadas como ferramenta para confirmação de diagnóstico de agentes patogênicos de plantas, as quais podem incluir o uso de primers e reação em cadeia da polimerase (PCR) para a amplificação de sequências de ácidos nucleicos. A maior vantagem dessas técnicas moleculares em relação aos métodos convencionais de diagnóstico é o potencial para ser altamente específicos e rápidos. A capacidade em construir primers direcionados a genes ou sequências específicas do DNA abriu novas perspectivas para o estudo da biologia de agentes patogênicos de plantas, da estrutura e dinâmica de populações do patógeno, da sua interação com o hospedeiro e o fluxo gênico, além de seu diagnóstico (Mccartney et al., 2003). A Organização Europeia e Mediterrânea para a Proteção de Plantas (EPPO/OEPP, 2009) normalizou o diagnóstico de G. citricarpa por técnicas de PCR convencional (Bonants et al., 2003) ou PCR em tempo real (Van Gent-Pelzer et al., 2007). Diagnósticos moleculares requerem DNA com alta integridade e pureza, livres de substâncias inibidoras e em quantidade suficiente para a utilização em reações de PCR com garantias de resultados analíticos confiáveis (Sangwan et al., 1998; Terry et al., 2002), e o alto grau de especificidade exigido para o diagnóstico de doenças ausentes ou quarentenárias requer validação para o aceite como análise de rotina (Lievens et al., 2005). Portanto, no sentido de verificar a efetividade do diagnóstico do citado fungo em citros por técnicas moleculares, em atendimento à ISO 17025:2005 (ISO, 2005c) este trabalho teve como objetivo: demonstrar, por evidências laboratoriais, a viabilidade, eficiência e confiabilidade da aplicação do método CTAB modificado para extração de DNA, como suficiente e efetivo para obtenção de diagnóstico de G. citricarpa em frutos cítricos sintomáticos e, principalmente, em folhas cítricas assintomáticas. Para tanto, foram realizadas pesquisas, no Laboratório de Diagnóstico Vegetal (LDV) do Laboratório Nacional Agropecuário em Goiás (Lanagro-GO), cujos materiais, metodologias e demais procedimentos necessários para tal fim, acham-se descritos nos três capítulos específicos de estudos sobre os processos de validação, que constam desta dissertação, compreendendo: 1) a validação in house do método CTAB modificado para extração de DNA de G. citricarpa em lesões de tecidos de frutos cítricos sintomáticos; 2) a validação in house do método de diagnóstico molecular para fungo G. citricarpa por técnicas de PCR convencional e PCR em tempo real; e 3) a avaliação de metodologia de diagnóstico de G. citricarpa, a partir de folhas assintomáticas, utilizando PCR

17 16 convencional e PCR tempo real. Os resultados dessas atividades de pesquisa asseguram a validade da aplicação da metodologia indicada para a obtenção de diagnóstico seguro e viável para verificação da presença do fungo e para a prevenção da pinta preta dos citros. Constituiu-se uma colaboração no sentido de oferecer mais uma alternativa ao controle dessa doença quarentenária, e suas danosas consequências para a economia goiana, tendo como seus destinatários diretos os proprietários de plantios de pomares cítricos, as autoridades fitossanitárias e a comunidade acadêmica.

18 17 2 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA 2.1 PINTA PRETA DOS CITROS Histórico da doença No mundo, os primeiros relatos da doença causada pelo fungo Guignardia citricarpa Kiely, ou PPC, aconteceram em 1895, em regiões próximas a Sidney, Austrália, afetando frutos de laranja Valência nas fases de pré e de pós-colheita (Sutton & Waterston, 1966). Na África do Sul, a doença foi relatada em 1925, onde tornou-se o principal problema fitossanitário para a citricultura (Schutte et al., 1997). A PPC é relatada em vários países da África: Quênia, Moçambique, África do Sul, Uganda, Zâmbia, Zimbábue, Rodésia, Swazilândia e Nigéria; da Ásia: Butão, China (Sichuan, Yunnan e Zhejiang, províncias chinesas), Cantão, Ilhas Fuji, Hong Kong, Japão, Indonésia, Java, Filipinas, Singapura e Taiwan; da Oceania: Austrália (Nova Gales do Sul, Queensland, Victoria), Nova Zelândia e Vanuatu; e da América: Estados Unidos (Flórida), Argentina, Brasil, Peru, Uruguai e Venezuela (Timmer et al., 2000; EPPO/OEPP, 2009; CABI, 2011). Não há relatos da doença na Europa, América Central e região do Caribe (CABI, 2011). No Brasil, o primeiro foco da doença foi descrito em 1940, no Estado de São Paulo, a partir de frutas cítricas coletadas em feira livre, em Piracicaba (Averna-Saccá, 1940). O primeiro relato em pomares comerciais ocorreu em 1980 no Rio de Janeiro (Robbs et al., 1980), afetando pomares comerciais de mexerica-do-rio em São Gonçalo e Itaboraí, na baixada fluminense. Atualmente, a doença ocorre nos Estados do Amazonas, Espírito Santo, Goiás, Mato Grosso, Mato Grosso do Sul, Minas Gerais, Paraná, Rio de Janeiro, Rio Grande do Sul, Rondônia, Santa Catarina e São Paulo (Brasil, 2008). A doença foi relatada, oficialmente, em Goiás, pela primeira vez, no município de Pirenópolis, em Atualmente, tem sua ocorrência confirmada nos municípios de Anápolis, Hidrolândia, Pirenópolis, Piracanjuba, Morrinhos, Catalão, Inhumas, Bonfinópolis, Rio Verde e Bela Vista de Goiás (Goiás, 2013).

19 Etiologia e epidemiologia A PPC é causada pelo fungo ascomiceto Guignardia citricarpa Kiely (Kiely, 1948), cuja forma anamórfica corresponde a Phyllosticta citricarpa Van der Aa (Van Der Aa, 1973). O gênero Phyllosticta é representado por patógenos foliares, com a presença de picnídios e conídios unicelulares hialinos. O fungo pertence à ordem Botryosphaeriaceae, família Botryosphaeriaceae (CABI, 2011). Todas as variedades de laranjas doces (Citrus sinensis), especialmente as de maturação tardia, são suscetíveis à pinta preta dos citros. Incluem-se também como espécies suscetíveis os limões verdadeiros (Citrus limon), pomelos (Citrus paradisi), tangerinas, como a poncã (Citrus reticulata), cravo (Citrus reticulata Blanco) e mexericado-rio (C. deliciosa), a lima-da-pérsia e tangor, especialmente o murcott (C. reticulata x C. sinensis). A laranja-azeda (Citrus aurantium) e seus híbridos, e a lima ácida tahiti (C. latifolia) são resistentes (Feichtenberger, 1996b; Kotzé, 2000). O desenvolvimento da PPC é influenciado pela disponibilidade do inóculo, pela idade da planta e pela fase de desenvolvimento dos frutos no que diz respeito à sua susceptibilidade à infecção e à ocorrência de condições ambientais favoráveis, como temperatura e umidade altas (Kotzé, 2000). Na fase perfeita (teleomórfica ou sexuada), o fungo produz pseudotécios e ascósporos somente em folhas em decomposição no solo, não sendo encontrados em lesões de frutos e em folhas ainda aderidas às plantas (Mconie, 1964) e que são a principal fonte de inóculo em áreas onde a ocorrência de chuvas limita-se a uma estação chuvosa (Spósito et al., 2005). Os ascósporos são responsáveis pela introdução do patógeno no pomar, sendo sua produção favorecida pela alternância entre períodos de molhamento e secagem das folhas, condição frequente durante a estação chuvosa. Período superior a 24 horas de água livre favorece a germinação dos ascósporos, que penetram no tecido vegetal pela formação do tubo germinativo e do apressório, com formação de massa de micélio na região subcuticular, podendo permanecer quiescente por quatro a seis meses (Timmer et al., 2000). Tipicamente, oito ascósporos são encontrados no interior dos ascos, que apresentam forma de clava, bitunicados de formato cilíndrico-clavado e arredondado na extremidade superior (Kotzé, 1988; Feichtenberger, 1996b). Os ascósporos são unicelulares, hialinos, sem partições, medindo 8 a 17,5 por 3,3 a 8 µm (Baldassari et al., 2001). A morfologia dos ascósporos favorece sua disseminação, a longas distâncias, pelo

20 19 ar ou, a curtas distâncias, pelos respingos de gotas d água nas folhas caídas ao solo até a superfície de órgãos da parte baixa das plantas (Feichtenberger et al., 1997). Os ascósporos são liberados até uma altura de 1,2 cm acima dos pseudotécios e são transportados por correntes de ar em todas as direções da copa e a longas distâncias, sendo influenciadas pelo padrão de precipitação (Kotzé, 1981). Na fase imperfeita (anamórfica ou assexuada), ocorre a produção de picnídios em lesões de frutos, em pedúnculos e em folhas aderidas. Os picnídios são também produzidos em grande quantidade em folhas cítricas caídas sob a copa das plantas (Mconie, 1964) e, principalmente, em ramos secos, sendo disseminados a curtas distâncias. Os conídios são unicelulares, ovoides, elípticos e levemente clavados, com base arredondada e dentada no ápice, cobertos com membrana mucilaginosa (<1,5 mmol L -1 ), apresentando apêndice apical mucoide (Feichtenberger, 1996a; Baayen et al., 2002). Em condições naturais, essa mucilagem apresenta coloração creme-claro, de aspecto brilhante, servindo de proteção contra o ressecamento das estruturas do fungo, quando expostas à ambiente adverso (Punithalingam & Woodhams, 1982). Os conídios germinam na superfície de órgãos suscetíveis produzindo apressórios. Uma delgada hifa de infecção é então formada a partir do apressório, o qual penetra através da cutícula e forma uma pequena massa de hifas entre a cutícula e a epiderme, podendo permanecer dormente por até doze meses nessa forma de micélio subcuticular quiescente. A dormência pode ser interrompida quando o fruto atinge seu tamanho final, e inicia a maturação, ou por intensa radiação solar (Kotzé, 1981). O papel dos conídios é tão importante quanto o dos ascósporos, em virtude da ocorrência simultânea de frutos sintomáticos e frutos jovens suscetíveis, principalmente nas variedades que apresentam vários surtos de florescimento e nas de maturação tardia (Feichtenberger, 1996a; Baldassari et al., 2006). Os conídios, por serem disseminados por água, somente conseguem atingir tecidos do hospedeiro a curtas distâncias, sendo que a ocorrência de chuvas em diferentes épocas do ano favorece florações sucessivas e irregulares, o que influencia a ocorrência de frutos fora de época com lesões da doença e faz com que picnídios produtores de conídios representem importante fonte de inóculo (Kotzé, 1981; Spósito et al., 2005).

21 Sintomatologia Frutos, pecíolos, folhas e galhos podem apresentar sintomas do ataque de G. citricarpa. Em frutos são descritos seis tipos de sintomas: falsa melanose, mancha dura, mancha sardenta, mancha virulenta, mancha trincada (Goes et al., 2000) e mancha rendilhada (Spósito et al., 2005). O aparecimento dos sintomas está relacionado ao tamanho dos frutos, às condições climáticas e ao tipo de esporo responsável pela infecção, e o seu desenvolvimento é influenciado pelo aumento da temperatura, intensidade de luz, quantidade de chuva e vigor das plantas. Árvores mais velhas costumam ter mais lesões que as mais jovens (Kotzé, 2000). A mancha dura é o sintoma típico mais comum. Em geral, aparece quando os frutos iniciam a maturação. Em frutos verdes, um halo amarelado aparece circundando as lesões. Já em frutos maduros ocorre o contrário, sendo produzido um halo verde ao redor das lesões, com centro deprimido de cor marrom-claro ou cinza-escuro e as bordas salientes de coloração marrom-escuro. No interior dessas lesões aparecem os picnídios do fungo representados por pequenas pontuações negras (Kotzé, 2000). As manchas sardentas aparecem depois que os frutos já atingiram a maturação, apresentando casca com coloração amarelada ou alaranjada. As lesões são levemente deprimidas e avermelhadas ou incolores, de um a três mm de diâmetro e, em geral, não apresentam picnídios. Podem coalescer, formando uma grande lesão, especialmente durante o armazenamento (Kotzé, 1981), ou permanecer pequenas e individualizadas. As manchas virulentas desenvolvem-se, normalmente, no final da safra, quando os frutos estão maduros, e as temperaturas, mais elevadas. Podem ocorrer também após a colheita, durante o transporte e o armazenamento dos frutos. As lesões aparecem como resultado do desenvolvimento e coalescência de lesões dos dois tipos anteriores, dando origem a grandes lesões deprimidas, de centro acinzentado e bordas salientes de coloração marrom-escuro ou vermelho-escuro, com aparecimento de picnídios (pontuações negras). Podem afetar toda a espessura da casca, causando queda prematura dos frutos e perdas na pós-colheita (Kotzé, 1981). Desprovidas de picnídios, as lesões do tipo falsa melanose aparecem quando o fruto encontra-se com cerca de quatro a cinco meses após a queda das pétalas, ainda nos frutos verdes (Feichtenberger, 1996b), verificando-se a sua ocorrência em pomares cítricos nos quais o fungo está presente há muito tempo (Spósito et al., 2005). As lesões medem

22 21 aproximadamente 1 mm, com coloração marrom escuro a preto e podem coalesce (Kotzé, 2000). A mancha trincada é inicialmente observada em frutos ainda verdes, nos quais são produzidas manchas de aspecto oleoso. Posteriormente à maturação dos frutos, as manchas exibem trincas. Essas lesões são de tamanho variável, superficiais, com margens irregulares e desprovidos de picnídios. O sintoma tipo mancha trincada é resultante do efeito da interação G. citricarpa e o ácaro da falsa ferrugem, Phyllocoptruta oleivora Ashmead (Nozaki, 2007). A mancha rendilhada é caracterizada pela presença de lesões superficiais, amareladas com centro castanho-escuro, sem borda definida e textura lisa (Aguilar-Vildoso et al., 2002), que aparecem quando os frutos ainda estão verdes (Goes et al., 2000). Aparenta ser uma variante do sintoma da falsa melanose. Em geral, os sintomas da pinta preta são observados em maior frequência na fase inicial de maturação dos frutos. Nessa fase, os sintomas são favorecidos pela radiação solar intensa e as altas temperaturas, estresse hídrico e debilidade das plantas (Kotzé, 1981; Feichtenberger, 1996b). Apenas os tecidos tenros dos frutos cítricos mostram-se suscetíveis à infecção por G. citricarpa. Com o passar do tempo, os frutos tornam-se, naturalmente, resistentes (Mconie, 1967). Para Kellerman & Kotze (1977), os frutos são suscetíveis à G. citricarpa do período entre a antese até as dezesseis semanas subsequentes. Klotz (1978) e Baldassari et al. (2006) observaram sintomas em frutos inoculados até 24 semanas após a queda das pétalas. Kotzé (2000) observou que sintomas em frutos só aparecem após seis meses da frutificação, quando estão totalmente desenvolvidos ou maduros. A presença de pragas como ácaros e cochonilhas, especialmente Parlatoria ziziphus e P. pergandii, podem agravar os sintomas nos frutos, com consequente queda prematura. Nas condições brasileiras, os frutos de laranja Valência e Natal são susceptíveis até, pelo menos, 24 semanas após a queda de 75 % das pétalas, para aqueles de 5 a 6 cm de diâmetro Baldassari et al. (2006). Para Kotzé (1981), o período crítico de suscetibilidade do fruto, nas condições da África do Sul, varia de 17 a 21 semanas após a queda de pétalas. De acordo com Calavan (1960), para as condições da Austrália, a extensão do período de suscetibilidade para a laranja valência não é completamente esclarecida, podendo alcançar seis meses após a queda de pétalas. Em geral, as infecções não apresentam sintomas visíveis em folhas ou são

23 22 pouco frequentes (Sutton & Waterston, 1966). Esses sintomas assemelham-se àqueles do tipo mancha dura dos frutos, com centro deprimido e as bordas escuras salientes, presentes nos dois lados das folhas. As manchas são circulares com centro cinza ou marrom-claro, bordas escuras e halo amarelo, alcançando até três milímetros de diâmetro (Kotzé, 2000) Diagnóstico de Guignardia citricarpa A PPC é, tradicionalmente, diagnosticada por características morfológicas, a partir de frutos com lesões produzindo picnídios. No entanto, nem sempre essas estruturas estão presentes. O diagnóstico de lesões de pinta preta sem os sinais do patógeno pode ser realizado pelo corte da casca e incubação de lesões individuais por, no mínimo, cinco dias em condições adequadas para a formação de picnídios. É possível identificar o fungo G. citricarpa pelas características morfológicas dos picnídios e conídios. Se as lesões não produzirem picnídios, os frutos são considerados livres do patógeno. Esse método direto de diagnóstico, embora não produza falsos positivos, tem eficácia de apenas 50 % (Brodrick & Rabie, 1970). O método tradicional de diagnóstico por características morfológicas é demorado e envolve incubação do material infectado, exame morfológico do fungo e talvez dissecação e plaqueamento de lesões. Métodos mais rápidos e eficientes para verificação e identificação de G. citricarpa em frutas cítricas é essencial tanto para o produtor quanto para as autoridades reguladoras (Meyer et al., 2012). Nas exportações para a União Européia, quando é detectado um único fruto com a doença na inspeção de entrada, todo o lote é rechaçado (União Europeia, 2000; Brasil, 2009). A PPC faz parte do grupo de doenças que o momento da infecção não pode ser determinado com a visualização dos sintomas, por apresentar infecção latente ou período de incubação relativamente longo. Esse período corresponde ao tempo entre a deposição do patógeno sobre o hospedeiro e a observação de sintomas visíveis (Bergamin Filho & Amorin, 1996). A expressão dos sintomas em frutos maduros ocorre muitas vezes após a colheita, no transporte e no armazenamento (Feichtenberger, 1996a), A expressão dos sintomas está em função do estádio fenológico do órgão afetado, com pouca relação com o momento da infecção, sendo recomendados estudos que determinem a época mais provável de ocorrência da infecção, e não o acompanhamento do aparecimento dos sintomas

24 23 (Bergamin Filho & Amorin, 2002). O conhecimento do período de infecção para a doença causada por G. citricarpa tem evidente valor para o estabelecimento de medidas de controle do patógeno e proteção dos frutos, com o objetivo de reduzir os custos de produção com a aplicação de fungicidas e os efeitos nocivos ao meio ambiente, justificando o desenvolvimento de técnicas precisas e rápidas de diagnose quando a infecção ainda está na fase de latência. Além do fungo G. citricarpa apresentar infecção latente, os sintomas de pinta preta são variáveis na aparência e assemelham aos sintomas causados por outros patógenos (Smith et al., 1997; Kotzé, 2000). As lesões causadas por G. citricarpa podem ser muito semelhantes àquelas causadas por Alternaria alternata pv. citri, Colletotrichum spp, Diaporthe citri, Mycosphaerella citri, Septoria spp, Phyllosticta citriasiana, além dos sintomas causados por insetos ou injúrias mecânicas (Snowdon, 1990; Bonants et al., 2003). O fungo Colletotrichum subtis, endófito comum em citros, requer estudos de diagnóstico em culturas puras para distinção de G. citricarpa (Baayen et al., 2002). Outro aspecto relevante no diagnóstico de pinta preta é a presença de duas espécies distintas de Guignardia associadas aos citros, ou seja, o agente patogênico G. citricarpa e o endófito Guignardia mangiferae (Phyllosticta capitalensis), que são muito semelhantes morfologicamente (Baayen et al., 2002; Baldassari et al., 2008). Anteriormente aos estudos de variabilidade genética, acreditava-se que G. citricarpa poderia ser encontrada na forma de infecção assintomática em plantas aparentemente sadias e como patogênicas em lesões características da PPC. A partir da utilização de técnicas moleculares, diversos autores (Christo, 2002; Glienke-Blanco et al., 2011) isolaram espécies de Phyllosticta de material aparentemente sadio, como endofíticas. Baldassari et al. (2008) observaram que as espécies de G. citricarpa e G. mangiferae podem ser isoladas de lesões características da pinta negra dos citros e também de tecidos assintomáticos, dificultando ainda mais a distinção entre essas espécies por análise morfológica dos organismos. Métodos clássicos de identificação de espécies fitopatogênicas e endofíticas utilizam o isolamento do patógeno em meio de cultura seletiva, com a caracterização morfológica das colônias, medição do tamanho, forma de estruturas reprodutivas, avaliação de taxa de crescimento e produção de pigmentos. Esses procedimentos demandam tempo e necessitam que as estruturas viáveis dos fungos estejam presentes na planta, sendo essa presença influenciada pelo tratamento dos pomares com fungicidas e

25 24 pelo processamento pós-colheita dos frutos (Bonants et al., 2003; Sasseron, 2008). Considerando os aspectos anteriores, os estudos para o diagnóstico de pinta preta também focaram na identificação antecipada da presença do patógeno, antes da visualização de sintomas, ainda nas unidades produtoras, no refinamento do diagnóstico em frutos pós-colheita e na utilização de técnicas moleculares em complementação ao diagnóstico convencional. Baldassari et al. (2007) propôs uma metodologia para diagnóstico e severidade da pinta preta com antecedência de até 105 dias antes da colheita. Os melhores resultados foram obtidos com a imersão em solução de ethephon (2,10 g L -1 ) por um minuto de frutos assintomáticos de laranja-pera rio, com idades entre 20 e 28 semanas após o florescimento. O ethephon induz à expressão precoce de sintomas de G. citricarpa. A melhor avaliação foi determinada entre 28 e 35 dias após a indução. Um sistema de visão artificial para automatizar a identificação dos ascósporos de G. citricarpa foi desenvolvido por meio da coleta de partículas suspensas em pomares por aspiração em caça-esporo com deposição em disco coletor. Os discos são analisados em microscópio, e as aplicações técnicas de visão computacional e de reconhecimento de padrões permitem informar ao produtor a existência de ascósporos do fungo no pomar. Segundo os autores, os resultados foram satisfatórios com 97 % de acerto na identificação do fungo. Esse trabalho foi o primeiro a identificar o fungo por método de captura, o que gerou pedido de patente nacional e internacional (Pazoti et al., 2006). Baayen et al. (2002), em estudos de populações de G. citricarpa e Guignardia spp., caracterizaram as diferenças dessas espécies quanto à taxa de desenvolvimento vegetativo em meios de cultura, à coloração de colônias e à morfologia dos conídios. Dentre os grupos predefinidos para esse estudo, agruparam-se o grupo I, isolados obtidos de tecidos de lesões de PPC, e os do grupo II, isolados obtidos de plantas assintomáticas de diversos hospedeiros. Por análises de sequências ITS, marcadores AFLP e características morfológicas, os autores confirmaram que os isolados do grupo I referiam-se ao fungo G. citricarpa (patogênica), e que o grupo II, ao fungo Phyllosticta capitalensis (G. mangiferae/endofítica). Uma importante característica cultural dos isolados de G. citricarpa relatada foi a formação de halo amarelo ao redor da colônia quando cultivado em meio ágar-aveia, na ausência de luz e a 22 ºC. Essa característica morfológica possibilita a distinção de isolados de G. citricarpa e G. mangiferae. Stringari (2009), em estudos de validação desse marcador morfológico em meio ágar-aveia, descrito por Baayen et al. (2002), ressalta que

26 25 este pode ser utilizado na confirmação da identificação de G. citricarpa somente quando há a formação de halo amarelo ao redor das colônias, pois se constatou que alguns isolados de G. citricarpa nem sempre apresentaram essa característica. Fabris et al. (2008) encontraram 2,87 % de resultados falsos negativos utilizando esse marcador morfológico para G. citricarpa. Segundo Punithalingam & Woodhams (1982), a colônia de G. citricarpa cresce lentamente em vários meios de cultura, atingindo diâmetro aproximado de sete centimetros em vinte dias. A distinção entre crescimento lento da espécie patogênica e de rápido crescimento para os isolados não patogênicos é corroborado por vários autores (Smith et al., 1997; Kotzé, 2000). Os dados morfológicos estão de acordo com os descritos por Mconie (1964), em que isolados patogênicos apresentam crescimento lento, em comparação com isolados endofíticos. Uma nova espécie, Phyllosticta citriasiana, foi descrita por Wulandari et al. (2009), causando a Mancha Tan (Citrus Tan Spot), mas sua presença ainda não foi observada no Brasil até o momento. Manchas necróticas semelhantes às causadas por G. citricarpa foram observadas em frutos de Citrus máxima (pomelo). O fungo foi isolado e submetido à análise multigênica: região ribossômica (ITS1, 5.8S nrdna, ITS2), fator α1 de elongação (TEF1) e genes da actina. Três espécies bem definidas foram identificadas: G. mangiferae (fase anamórfica, Phyllosticta capitalensis), G. citricarpa (fase anamórfica, Phyllosticta citricarpa) e a recente espécie Phyllosticta citriasiana. Morfologicamente, o fungo P. citriasiana possui conídios maiores que os conídios de G. citricarpa e não produz pigmento amarelo, quando cultivado em meio ágar-aveia. Em comparação com G. citricarpa e G. mangiferae, as colônias de P. citriasiana crescem mais rapidamente e apresentam tons mais escuros de cinza e preto em meio ágar-aveia, extrato de malte e BDA. Assim, o diagnóstico baseado somente na metodologia tradicional revelou-se impreciso em algumas situações. Sem dúvida, a publicação de vários conjuntos de iniciadores de amplificação universal para fungos alavancou os estudos de diagnóstico molecular, principalmente para gêneros cujas espécies têm sobreposição de características morfológicas (White et al., 1990). O uso de sequências específicas de DNA nos estudos de relações filogenéticas apresentou um grande avanço na identificação de várias espécies do gênero Guignardia, facilitando o diagnóstico da doença. Com base nas sequências ITS, vários métodos de detecção por meio da reação em cadeia da polimerase (PCR) foram

27 26 desenvolvidos para a detecção de G. citricarpa (Bonants et al., 2003; Meyer et al., 2006; Peres et al., 2007; Van Gent-Pelzer et al., 2007). Blanco (1999) citado por Stringari et al. (2009) utilizou marcadores RAPD para estudar a variabilidade genética em isolados patogênicos e endofíticos de Guignardia spp. Desenvolveu um par de primers (GCP1/GCP2) capaz de amplificar um fragmento em torno de 300 pb, específico para identificação de G. citricarpa. Christo (2002) analisou a variabilidade genética de isolados endofíticos e patogênicos de Guignardia spp e isolados de diversos hospedeiros, também por marcadores RAPD. Relatou a existência de três espécies de Guignardia em Citrus sp. e sugeriu que os isolados de tecidos de lesões de pinta preta pertencem à G. citricarpa e de tecidos assintomáticos pertencem a isolados endofíticos. Glienke-Blanco et al. (2002) obtiveram 407 isolados fúngicos em folhas assintomáticas de três espécies cítricas (laranja, tangerina, tangor), em regiões sem relato da doença. Dos fungos isolados, 27 % pertenciam ao gênero Guignardia. A maioria dos isolados produziu ascos maduros, sustentando a hipótese de que eles seriam endofíticos (G. mangiferae) e não patogênicos. Glienke-Blanco et al. (2002) fizeram análise multigênica de DNA ribossomal (ITS1, 5.8S nrdna, ITS2), fator α1 de elongação (TEF1), actina e desidrogenase (GPDH/glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase) e construção da árvore filogenética combinada. Observaram que isolados de ambas as espécies agrupam-se diferentemente e sugeriram que os endofíticos não patogênicos isolados em uma ampla gama de hospedeiros seriam mais corretamente designados de Phyllosticta capitalensis. A Organização Europeia e Mediterrânea para a Proteção das Plantas (EPPO/OEPP, 2009) reconhece o diagnóstico por técnicas moleculares do fungo Guignardia citricarpa: por PCR convencional, o protoloco desenvolvido por Bonants et al. (2003) e por PCR em tempo real, o protocolo de Van Gent-Pelzer et al. (2007). Bonants et al. (2003), baseados nas regiões ITS do DNA ribossômico, desenvolveram um conjunto de primers específicos para detecção de G. Citricarpa: GcF3 (5 AAA AAG CCG GAC CTA CCT 3 ) e GcR7 (5 TGT CCG GCG GCC AG 3 ). A eficácia do método de PCR convencional para detecção de G. citricarpa foi de aproximadamente % em lesões sem picnídios e de cerca de 90 % em lesões com picnídios. Um controle interno foi desenvolvido para monitorar amostras de DNA quanto à ocorrência da inibição na PCR. Os primers específicos demostraram que G. citricarpa pode ocorrer como endófito assintomático em folhas.

28 27 Van Gent-Pelzer et al. (2007) otimizaram o diagnóstico de G. citricarpa a partir de lesões dissecadas de frutos de laranja, por meio de PCR em tempo real, com elevada sensibilidade da técnica em relação à PCR convencional. Um conjunto de primers (GcF1 / 5 GGT GAT GGA AGG GAG GCC T 3 e GcR1 / 5 GCA ACA TGG TAG ATA CAC AAG GGT 3 ) e sonda TaqMan (GcP1 / 5 AAA AAG CCG CCC GAC CTA CCT TCA 3 ) de combinação específica para distinção de G. citricarpa e G. mangiferae foi concebido com base na região conservada ITS do rdna. A amplificação dessa região pela técnica de PCR em tempo real foi específica, uma vez que não foi observada reação cruzada com uma série de agentes patogênicos de citros e espécies correlatas. Fabris et al. (2008) isolaram e analisaram 147 isolados obtidos de lesões de PPC, 97 isolados como endofíticos em citros e 40 endofíticos em manga. Utilizaram a técnica PCR multiplex com marcadores GCP1/GCP2 (Blanco, 1999) para G. citricarpa e GMF1/GMR2 (Kava-Cordeiro, 2004) para G. mangiferae. O método demonstrou-se sensível em concentrações de pelo menos 2,5 % de DNA fúngico em relação ao DNA vegetal. A PCR multiplex mostrou-se eficiente na identificação de G. citricarpa e G. mangiferae. Dos 97 isolados considerados como endofíticos, 30 foram identificadas como G. citricarpa, constatando que o fungo G. citricarpa pode ser isolado como endofítico em folhas de citros. Meyer et al. (2006) apresentaram mais uma opção de primers específicos capazes de detectar e distinguir entre as espécies patogênicas e endofíticas: CITRIC1 e CAMEL2 em conjunção com o primer ITS4, com o produto de amplificação esperado de 580 pb e 430 pb, respectivamente. Esses primers não reagem com quaisquer gêneros de fungos, confirmado por PCR. Meyer et al. (2006) utilizou a PCR convencional, CITRIC1 e CAMEL2 em duas reações (aninhada) para aumentar a sensibilidade e a especificidade da PCR na identificação de G. citricarpa a partir de folhas assintomáticas e sintomáticas, frutos, ramos, pecíolos, solo e armadilhas de esporos. Os autores analisaram mais de 800 amostras coletadas em sete anos em diferentes ambientes (creches, pomares, casas de embalagem e terminais de exportação) para elaboração de procedimentos padrões de preparação de amostras. Para folhas assintomáticas, antes da extração de DNA, as folhas foram estimuladas a formar corpos de frutificação com a alternância de molhamento e secagem diários, por um período consecutivo de quatro a dez dias. Essa técnica é utilizada em escala pela indústria de citros da África do Sul, voltada à prevenção de G. citricarpa

29 28 em viveiros e evitar a disseminação em novos pomares. Adamoski et al. (2010) extraíram DNA fúngico a partir de lesões típicas de pinta preta e sequenciaram regiões amplificadas a partir de RAPD, visando desenhar conjunto de primers específicos para identificação de G. citricarpa. Os autores encontraram duas regiões polimórficas, sendo que apenas a amplificação de uma delas foi eficiente para diferenciar o patógeno de espécies endofíticas associadas à doença. Tomlinson et al. (2013), utilizando a amplificação isotérmica do DNA, denominada Loop Mediated-Isothermal Amplification (LAMP), propuseram um método simples e rápido (em torno de 40 minutos entre a preparação da amostra e a finalização do ensaio), para a detecção da G. citricarpa de lesões com e sem picnídios. Os resultados obtidos determinaram um limite de detecção entre 0,06 ng e 0,6 ng. 2.2 EXTRAÇÃO DE DNA Método CTAB para extração de DNA Basicamente, os protocolos de extração de DNA disponíveis são derivados do método descrito por Dellaporta et al. (1983), que utiliza o dodecil sulfato de sódio (SDS), bem como pelos que utilizam o detergente Cationic hexadecyl trimethyl ammonium bromide (CTAB) (Doyle & Doyle, 1990). Também é utilizado o polivinilpolipirrolidona (PVPP) para matrizes contendo uma elevada quantidade de compostos polifenólicos. Este último inclui no processo de lise térmica, SDS e EDTA seguido por adição de PVPP e acetato de amônio para remover os contaminantes, tais como os compostos polifenólicos e polissacarídios (ISO, 2005b). Basicamente, esses protocolos diferem na composição do tampão de extração, no tipo de sal para dissociar as proteínas do DNA e no detergente para solubilizar as membranas (Bered, 1998). Outras substâncias, como fenol e clorofórmio, com modificações para ajuste às características específicas das matrizes também são utilizados nos processos de extração de DNA (Danner et al., 2011). O método de extração CTAB foi proposto por Saghai-Maroof et al. (1984), para uso em tecidos liofilizados, como alternativa ao protocolo de extração com cloreto de césio, em que produzia apenas DNA degradado em extração de folhas de soja. Doyle & Doyle (1990) propuseram modificações para uso em tecido vegetal fresco, com a

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