Neopterin ELISA IQP C. Instruções de Utilização

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1 Instruções de Utilização Neopterin ELISA Ensaio imunoenzimático para a determinação quantitativa, para diagnóstico in-vitro, de neopterina em soro, plasma e urina humanos. IQP C IBL International, Germany Version 3 / V2010_06

2 APLICAÇÕES Ensaio Imunoenzimático para a determinação quantitativa, para diagnóstico in-vitro, de neopterina em soro, plasma e urina humanos. SUMÁRIO E EXPLICAÇÃO A biossíntese da neopterina está associada com a activação do sistema imunitário celular. Foram referidas concentrações elevadas de neopterina em pacientes com infecçãoe svirais, sugerindo que o aumento dos valores pode ser originado pela resposta imunitária dos pacientes direccionada contra as células infectadas por virus. Foi demonstrado que a estimulação antigénica das células mononucleares do sangue periférico leva à libertação da neopterina no meio de cultura cellular e que os macrófagos humanos produzem neopterina in vitro quando estimulados pelo interferão gama. A determinação dos níveis de neopterina nos fluídos corporais humanos oferece uma ferramente inovadora e eficaz na monitorização de doenças associadas com a activação da imunidade mediada por células. O aumento dos níveis de neopterina em várias doenças infecciosas precede o aparecimento da manifestão clínica e da seroconversão. Normalmente as amostras não são testadas para todas as infecções possíveis. Assim sendo, a medição da neopterina em amostras de dadores de sangue é uma ferramente útil para reduzir o risco de infecções através da transfusão sanguínea. Outras aplicações diagnósticas para a determinação da neopterina são: seguimento de pacientes traumatizados na UCI indicador de prognostico nas infecções por HIV e doenças malignas indicação precoce de complicações em transplantados indicador de doença activa em doenças autoimunes diagnóstico de infecções virais diagnóstico diferencial de infecções agudas virais e bacterianas diagnóstico de enfermidades tumorales controlo de seguimento de infecções crónicas e monitorização da terapêutica imuno-estimulatória PRINCÍPIO DO TESTE Ensaio Imunoenzimático (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay - ELISA) em fase sólida baseado no princípio básico de ELISA competitivo. Uma quantidade desconhecida de antigénio presente na amostra e uma quantidade fixa de antigénio marcado enzimaticamente competem pelos locais de ligação do anticorpo (anti-neopterina de coelho). Os complexos antigénio-anticorpo conjugados com peroxidase ligam-se aos poços das tiras das microplacas revestidos com um anticorpo anti-coelho de cabra. O antigénio não-ligado é removido por lavagem. A intensidade da cor desenvolvida após a incubação do substrato é inversamente proporcional à quantidade de antigénio na amostra. Os resultados das amostras podem ser determinados directamente usando a curva de calibração. AVISOS E PRECAUÇÕES 1. Apenas para diagnóstico in vitro. Apenas para utilização profissional. 2. Antes de iniciar o teste, leia as instruções completa e cuidadosamente. Utilize a versão válida do folheto informativo fornecido com o kit. Tenha a certeza de ter entendido tudo. 3. Em caso de danos no kit por favor contacte a IBL ou o seu fornecedor por escrito, até uma semana após ter recebido o kit. Não utilize componentes danificados na execução do teste, mas guarde-os para reclamação. 4. Obedeça ao número de lote e ao prazo de validade. Não misture reagentes de diferentes lotes. Não utilize reagentes expirados. 5. Siga as boas práticas de laboratório e as normas de segurança. Vista bata, luvas de látex descartáveis e óculos protectores sempre que necessário. 6. Reagentes do kit contendo material perigoso podem causar irritação da pele e dos olhos. Veja MATERIAIS FORNECIDOS e os rótulos para mais detalhes. As Fichas de Segurança do produto para este kit estão disponíveis na Homepage da IBL ou a pedido directamente à IBL: 7. Químicos e reagentes preparados ou utilizados devem ser tratados como resíduos perigosos de acordo com as normas nacionais de segurança e resíduos perigosos. 8. Evite o contacto com a solução de Paragem. Pode causar irritação na pele e queimaduras. 9. Todos os componentes deste kit contendo soro ou plasma humano foram testados e foram considerados não reactivos para HIV I/II, AgHBs e HCV. No entanto, não é possível excluir em absoluto Version 3 / V2010_06 1 / 8

3 a presença destes ou outros agentes infecciosos e portanto os reagentes devem ser tratados com potencialmente perigosos quer na sua utilização quer na sua eliminação. ARMAZENAMENTO E ESTABILIDADE O kit é enviado à temperatura ambiente e deve ser armazenado de 2 a 8 C. Mantenha-o longe do calor ou da luz solar directa. A estabilidade e armazenamento das amostras e reagentes preparados são referidos nas secções correspondentes. A microplaca é estável até expirar a data de validade do kit, na embalagem aberta mas firmemente fechada, quando armazenada a 2-8 C. RECOLHA E ARMAZENAMENTO DE AMOSTRAS Soro, Plasma (EDTA) Devem ser cumpridas as habituais precauções para punção venosa. É importante preservar a integridade química de uma amostra de sangue desde o momento em que é recolhida até que é analisada. Não usar amostras exageradamente hemolisadas, ictéricas ou lipémicas. Amostras turvas devem ser centrifugadas, antes de serem testadas, para remover quaisquer partículas. Armazenamento: 2-8 C -20 C (Alíquotas) Manter afastado do calor ou luz solar directa. Estabilidade: 72 h 6 meses Evitar congelar-descongelar repetidamente. Urina É possível usar tanto a primeira urina da manhã como urina de 24 h. O volume total de urina excretada durante o período de 24 h deve ser recolhido e misturado num único frasco. Não são necessários cuidados de conservação. Determinar o volume total para cálculo de resultados. Misture e centrifugue as amostras antes de utilizar no teste. Armazenamento: 2-8 C -20 C (Alíquotas) Manter afastado do calor ou luz solar directa. Estabilidade: 72 h 6 meses Evitar congelar-descongelar repetidamente. MATERIAIS FORNECIDOS Quantidade Símbolo Componente 1 x 12x8 MTP 1 x 5 ml ANTISERUM 1 x 0.1 ml ENZCONJ CONC 6 x 0.5 ml CAL A-F 2 x 0.5 ml CONTROL x 18 ml ASSAYBUF 1 x 50 ml WASHBUF CONC 1 x 17 ml TMB SUBS 1 x 17 ml TMB STOP 1 x FOIL Microplaca Tiras separáveis. Revestida com anti-coelho IgG (cabra, policlonal). Neopterina Antisoro Pronto a usar. Contêm: Antisoro (coelho), tampão fosfato, estabilizantes. Conjugado Enzimático Concentrado (201x) Guardar protegido da luz. Contêm: Neopterina conjugado com peroxidase, tampão fosfato, estabilizantes. Padrão A-F 0; 1.35; 4.0; 12.0; 37.0; 111 nmol/l Pronto a usar. Contêm: Neopterina, tampão fosfato, estabilizantes. Controlo 1+2 Pronto a usar. Para concentrações / intervalos aceitáveis consultar etiquetas dos frascos. Tampão de Reacção Pronto a usar. Contêm: tampão fosfato, BSA, estabilizantes. Tampão de Lavagem Concentrado (20x) Contêm: tampão fosfato, Tween, estabilizantes. Solução de Substrato TMB Pronto a usar. Contêm: TMB, Tampão, estabilizantes. Solução de Paragem TMB Pronto a usar. 1 M H 2SO 4. Película Aderente 1 x preto Version 3 / V2010_06 2 / 8

4 MATERIAIS NECESSÁRIOS MAS NÃO FORNECIDOS 1. Pipetas (Multipette Eppendorf ou aparelhos semelhantes, < 3% CV). Volumes: 10; 50; 100; 1000 µl 2. Vortex 3. Agitador orbital (500 rpm) 4. Pipeta de 8 canais com reservatório de reagente 5. Recipiente de lavagem, sistema de lavagem de microplacas automático ou semi-automático 6. Leitor de microplacas com capacidade de ler absorvâncias a 450 nm (comprimento de onda de referência nm) 7. Água bidestilada ou bi-destilada 8. Toalhas de papel, pontas para pipetas e cronómetro NOTAS SOBRE O PROCEDIMENTO 1. O manuseamento incorrecto da amostra ou alterações no procedimento do teste podem influenciar os resultados. Os volumes de pipetagem indicados bem como os tempos de incubação, a temperatura e os passos de pré-tratamento devem ser realizados estritamente de acordo com as instruções. Utilize apenas pipetas e instrumentos calibrados. 2. Uma vez iniciado o teste, todos os passos devem ser executados sem interrupção. Garanta que os reagentes necessários, os materiais e dispositivos são preparados e prontos a usar no tempo apropriado. Todos os reagentes e amostras devem estar à temperatura ambiente antes de utilizar (18-25 ºC). Agite cuidadosamente todos os frascos de reagentes líquidos e a amostra antes de utilizar. Agite os reagentes sem formar espuma. 3. Evite a contaminação dos reagentes, pipetas e poços/tubos. Utilize pontas novas descartáveis para cada reagente, padrão ou amostra. Não troque as tampas. Feche sempre os frascos não utilizados. Não reutilize poços/tubos ou reagentes. 4. Alguns componentes contêm volume de solução 250 µl. Assegurar que a solução está toda no fundo do recipiente antes de abrir. 5. Recomenda-se a determinação em duplicado das amostras de maneira a identificar potenciais erros de pipetagem. 6. Utilize um esquema de pipetagem para verificar uma disposição apropriada na placa. 7. O tempo de incubação afecta os resultados. Todos os poços devem ser manuseados pela mesma ordem e na mesma sequência de tempo. E recomendável utilizar uma Micropipeta de 8 canais para a pipetagem das soluções nos poços. 8. A lavagem da microplaca é importante. Poços mal lavados originam resultados errados. É recomendável utilizar uma pipeta multicanal ou um sistema automático de lavagem de microplacas. Não permitia que os poços sequem entre lavagens. Não arranhe as paredes dos poços durante a lavagem e aspiração. Encha todos os reagentes com cuidado. Enquanto lava, verifique que todos os poços são cheios com o Tampão de Lavagem e que não há resíduos nos poços. 9. A humidade afecta os tubos/poços revestidos. Não abra o saco até atingir a temperatura ambiente. Os tubos/poços não utilizados devem ser automaticamente guardados no saco incluindo o dessecante. INSTRUÇÕES PRÉ-TESTE Os conteúdos do kit para 96 determinações podem ser divididos em 3 séries separadas. Os volumes indicados em baixo são para uma experiência com 4 tiras (32 determinações) Preparação de Componentes liofilizados ou concentrados Diluir/ dissolver 15 ml 25 µl Componente com Diluente Relação Observações Armazenamento Estabilidade WASHBUF CONC ENZCONJ CONC 285 ml agua bidest. 1: C 1 meses 5 ml ASSAYBUF 1:201 Guardar protegido da luz. 2-8 C 24 h Version 3 / V2010_06 3 / 8

5 1.2. Diluição de Amostras Amostra diluir com Relação Observações Soro não Manter afastado luz solar directa. Urina geralmente ASSAYBUF 1:101 p.ex. 10 µl µl Manter afastado luz solar directa. Amostras que contenham concentrações superiores à do padrão mais elevado têm que ser novamente diluídas. Amostras de pacientes que foram tratados com ATG (globulina anti-linfócito T de coelho) após transplante causarão resultados elevados errados. Este efeito pode ser evitado com uma préincubação das amostras: Pipetar 100 µl de soro para um tubo Sarstedt ou de vidro e adicionar 200 µl de Tampão de Reacção. Tapar os tubos (usar tampas perfuradas para os tubos de vidro) e incubar durante 10 min num banho de água a C. Agitar no vortex e retirar 10 µl do gel para o ensaio. Os resultados têm que ser multiplicados por 3. PROCEDIMENTO DO ENSAIO 1. Pipetar 10 µl de cada Padrão, Controlo, amostra de soro e amostra de urina diluída para os respectivos poços da Microplaca. 2. Pipetar 100 µl de Conjugado Enzimático acabado de preparar (1:201) para cada poço. 3. Pipetar 50 µl de Antisoro para Neopterina para cada poço. 4. Tapar a placa com película aderente preta. Incubar 90 min à TA (18-25 C) num agitador orbital (500 rpm), no escuro. 5. Remover a película adesiva. Rejeitar a solução de incubação. Lavar a placa 4 x com 300 µl de Tampão de Lavagem diluído. Remover o excesso de solução batendo com a placa invertida numa toalha de papel. 6. Para a adição das Soluções de Substrato e Stop usar uma pipeta de 8 canais. A pipetagem deve ser executada nos mesmos intervalos de tempo para as Soluções de Substrato e Stop. Usar a técnica de positive displacement e evitar a formação de bolhas de ar. 7. Pipetar 150 µl de Solução de Substrato TMB para cada poço. 8. Incubar 10 min à TA (18-25 C). 9. Parar a reacção de substrato adicionando 150 µl de Solução Stop TMB para cada poço. Misturar rapidamente os conteúdos agitando cuidadosamente a placa. 10. Medir a densidade óptica com um fotómetro a 450 nm (Comprimento de onda de referência: nm) nos 15 min. A IBL-International também fornece protocolos para outros equipamentos comercialmente disponíveis p.e. Triturus da Grifols, DSX e DS2 da Dynex, Tecan Genesis RSP, BEP3 da Dade Behring etc. Por favor contacte-nos se deseja automatizar a sua ELISA. Os nossos especialistas de aplicação poderão ajudá-lo. CONTROLO DE QUALIDADE Os resultados do teste são válidos apenas se o teste tiver sido executado seguindo as instruções. Além disso, o operador deve seguir estritamente as regras de GLP (Good Laboratory Practice) ou outros padrões/leis aplicáveis. Todos os padrões e controlos do kit devem-se encontrar dentro de limites aceitáveis como indicado no Certificado de Controlo de Qualidade. Caso não se cumpram esses critérios, o ensaio não é válido e deve ser repetido. Cada laboratório deve usar amostras conhecidas como controlos adicionais. É recomendável participar em ensaios de garantia da qualidade apropriados. No caso de qualquer desvio, os seguintes detalhes técnicos devem ser verificados: datas de validade de reagentes (preparados), condições de armazenamento, pipetas, equipamentos, condições de incubação e métodos de lavagem. Version 3 / V2010_06 4 / 8

6 CÁLCULO DE RESULTADOS Constrói-se um gráfico com a DO dos padrões (eixo dos yy, linear) em função da sua concentração (eixo dos xx, logarítmico), quer em papel gráfico semi-logarítmico quer usando um método computorizado. Uma boa curva é fornecida optando por interpolação cubic spline, ajustamento 4PL (4 parameter logistics) ou modelo logit-log. Para o cálculo da curva de calibração, deve usar cada sinal dos padrões (se um dos duplicados apresentar um valor claramente diferente do esperado pode ser omitido e o valor mais razoável pode ser usado). A concentração das amostras pode ser lida directamente a partir da curva de calibração. Devido à diluição das amostras de urina, os valores obtidos para urina têm que ser multiplicados pelo factor 101. Amostras que apresentem concentrações acima do padrão mais elevado, têm que ser diluídas como descrito em INSTRUÇÕES PRÉ-TESTE e testadas novamente. Conversão: Neopterina (nmol/l) x = ng/ml OD 450 nm Curva de Calibração Típica (Exemplo. Não usar para cálculos!) Padrão Neopterina (nmol/l) Média DO DO/DO max A B C D E F INTERPRETAÇÃO DE RESULTADOS Neopterina (Soro) Interpretação < 10 nmol/l normal > 10 nmol/l elevado Neopterin (nmol/l) Os resultados por si só não devem ser a única razão para qualquer acção terapêutica e deverão ser correlacionados com outras observações clínicas e testes de diagnóstico. Version 3 / V2010_06 5 / 8

7 VALORES ESPERADOS Indivíduos aparentemente saudáveis apresentam os seguintes valores: Soro Soro nmol/l ng/ml Idade Sexo Neopterina nmol/l Média limite superior 0-18, < 10 < , > 75, (Neopterin Biochemistry Methods - Clinical Application; H. Wachter et al. (1992), Walter de Gruyter, Berlin - New York) Urina Idade Sexo µmol Neopterina/mol Creatinina Média limite superior 1-4, , , , , > (Neopterin Biochemistry Methods - Clinical Application; H. Wachter et al. (1992), Walter de Gruyter, Berlin - New York) Recomenda-se que cada laboratório estabeleça o seu próprio intervalo de normalidade. LIMITAÇÕES DO PROCEDIMENTO A recolha de amostras tem um efeito significativo nos resultados dos testes. Ver RECOLHA E ARMAZENAMENTO DE AMOSTRAS para detalhes. Para reacções cruzadas, ver DESEMPENHO. Os seguintes componentes sanguíneos não têm um efeito significativo (+/- 20%) nos resultados do teste se estiverem em concentrações inferiores às indicadas: Hemoglobina Bilirrubina Triglicéridos 8.33 mg/ml 0.33 mg/ml 0.25 mg/ml Não usar amostras que contenham azida de sódio uma vez que estas amostras conduzem a resultados elevados errados. Amostras de pacientes que foram tratados com ATG (globulina anti-linfócito T de coelho) após transplante levarão a resultados elevados errados. Este efeito pode ser evitado com uma pré-incubação das amostras como descrito em INSTRUÇÕES PRÉ-TESTE. Version 3 / V2010_06 6 / 8

8 DESEMPENHO Substância Reacção Cruzada (%) Dihidro-Neopterina 3.5 Reactividade cruzada Especificidade Analítica Monapterina 0.29 de outras substâncias (Reacção cruzada) Biopterina 0.19 testadas < 0.05 % Dihidro-Biopterina 0.13 Tetrahidro-Neopterina 0.07 Sensibilidade Analítica 0.7 (Limite de Detecção) nmol/l Média do Sinal (Padrão Zero) - 2SD Precisão Limite (nmol/l) CV (%) Intra-Ensaio Soro Urina Inter-Ensaio Soro Urina Limite (nmol/l) Diluição em série até Limite (%) Linearidade Soro : Urina : Recuperação Média (%) Limite (%) % Recuperação após Soro adição de reforço Urina Comparação: Método Soro Teste IBL = 0.97 x HPLC r = 0.97; n = 14 Usado versus HPLC Urina Teste IBL = 1.07 x HPLC r = 0.95; n = REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS DO PRODUTO 1. Wachter H, Fuchs D, Hausen A, Reibnegger G, Weiss G, Werner ER, Werner-Felmayer G. Neopterin: Biochemistry - Methods - Clinical Application. Walter de Gruyter Berlin, New York, (1992) 2. Westermann J, Thiemann F, Gerstner L, Tatzber F, Kozák I, Bertsch T, Krüger C. Evaluation of a New Simple and Rapid Enzyme-Linked Immunosorbent Assay Kit for Neopterin Determination. Clin Chem Lab Med, 38 (4): (2000) 3. X Garcia-Moll, D Cole, E Zouridakis, JC Kaski. Increased serum Neopterin: a marker of coronary artery disease activity in woman. Heart 83: (2000) 4. Smith D, Zouridakis, E, Mariani M, Fredericks S, Cole D, Kaski J. Neopterin levels in patients with coronary artery disease are independent of Chlamydia pneumoniae seropositivity. Am Heart J, 146 (1): (2003) 5. B. Inci Fisenk, Durdal US, Osman I. Ozcebe & Gulsen Hascelik. The value of increased Neopterin levels in reducing transfusion-transmitted virus infections: Detection of a donation from a HbsAg positive chronic carrier by screening of neopterin in Turkish blood donors. Scandinavian Journal of Infectious disease, 37: (2005) 6. Michaela Bayer, Sven Schmitz, Jürgen Westermann, Frank Thiemann, Ralf Edelmann, Claudia Szakacs, Gerhardt Lanzer, Jens Blecken. Evaluation of a New-Linked Immunosorbent Assay for the Determination of Neopterin. Clin Lab. 51 (2005) 7. R. Weimer, C. Süsal, S. Yildiz, A. Staak, S. Pelzl, F. Renner, H. Dietrich, V. Daniel, S. Kamali-Ernst, W. Padberg, G. Opelz. Post-Transplant scd30 and Neopterin as Predictors of Chronic Allograft Nephropathy: Impact of Different Immunosuppressive Regimes. Amercan Journal of Transplantation (2006) 8. Cangel P.Y. Chan, Junet W.Y. Choi, Kai-Yuan Cao, Ming Wang, Yang Gao, Duan-Hua Zhou, Biao Di, Hui- Fang Xu, Man-Fai Leung, Andreas Bergmann, Matthias Lehmann, Yong-Mei Nie, George W.H. Cautherley, Dietmar Fuchs, Reinhard Renneberg, Bo-Jian Zheng. Detection of serum neopterin for early assessment of dengue virus infection. Journal of Infection (2006) 9. Douglas T. Johnston, Marios Gagos, Nicolas Raio, Louis Ragolia, David Shenouda, Mark A. Davis-Lorton, Joshua R. De Leon. Alterations in serum neopterin correlate with thrombolysis in myocardial infarction risk scores in acute coronary syndromes. Coronary artery disease 2006, 17: SP Gieseg, EM Crone, EA Flavall, Z Amit. Potential to inhibit growth of atherosclerotic plaque development through modulation of macrophages neopterin/ 7,8-dihydroneopterin synthesis. British Journal of Pharmacology (2007) 11. Kausik K. Ray, David A. Morrow, Marc S. Sabatine, Amy Shui, Nader Rifai, Christopher P. Cannon, Eugene Braunwald. Circulation 2007; 115; 3071:3078 Version 3 / V2010_06 7 / 8

9 19. GARANTIA A garantia dos produtos vendidos ao abrigo da mesma abrange apenas a quantidade e os conteúdos mencionados no rótulo aquando da entrega ao cliente. Não existem quaisquer garantias, expressas ou implícitas, que abranjam mais do que o descrito no rótulo do produto. A IQ Products não é responsável por quaisquer danos de propriedade, danos pessoais ou perdas económicas causadas pelo produto. 20. EXPLANATION OF USED SYMBOLS I Instructions for use [REF] Product number s Amount of tests per package [IVD] For In Vitro Diagnostic use! Caution, consult accompanying document [CONC] Concentrate [LYO] Lyophilised K Protect from the light D Biological risks t Store at temperature range ( C) [RUO] For Research Use Only [LOT] Batch code e Use by yyyy-mm-dd M Manufacturer [EC_ REP] Representative in the European Community 21. CONTACT INFORMATION Rozenburglaan 13a 9727 DL Groningen The Netherlands T +31 (0) F +31 (0) E Version 3 / V2010_06 8 / 8

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