UNIVERSIDADE REGIONAL DO NOROESTE DO ESTADO DO RIO GRANDE DO SUL UNIJUI PÓS-GRADUAÇÃO EM HEMATOLOGIA LABORATORIAL MABEL FIGUEIREDO BRUM

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1 UNIVERSIDADE REGIONAL DO NOROESTE DO ESTADO DO RIO GRANDE DO SUL UNIJUI PÓS-GRADUAÇÃO EM HEMATOLOGIA LABORATORIAL MABEL FIGUEIREDO BRUM ERITROGRAMA: Novas perspectivas de análise. IJUÍ 2013

2 MABEL FIGUEIREDO BRUM ERITROGRAMA: Novas perspectivas de análise. Artigo de Conclusão da Pós-Guraduação, realizado na Universidade Regional do Noroeste do Estado do Rio Grande do Sul (UNIJUI), na área de Hematologia, como requisito para a obtenção do Grau de Especialista em Hematologia Laboratorial. Prof. Orientador: Matias Frizzo IJUÍ 2013

3 ERITROGRAMA: Novas perspectivas de análise. Mabel Figueiredo Brum 1 Matias Nunes Frizzo 2 RESUMO: O hemograma é dividido em eritrograma, leucograma e plaquetograma, sendo um dos exames mais prescritos atualmente, pois contem inúmeras informações importantes para diagnóstico de diversas doenças. As técnicas e automações laboratoriais foram sofrendo diversas alterações através dos anos, resultando, hoje, em diversos tipos distintos de metodologias. O presente estudo teve como objetivo principal explorar os índices hematimétricos mostrando como eles podem auxiliar na resolução de erros com as amostras. Para o estudo se efetuou uma pesquisa bibliográfica no período de agosto de 2012 a fevereiro de O eritrograma contem resultados de índices hematimétricos utilizados para diagnósticos de anemias ou para acompanhamento terapêutico, sendo que o mesmo descobriu-se como indicador de alterações importantes que ao serem avaliadas por um bioquímico experiente torna-se um instrumento de grande valia no que tange problemas em amostras, aparelhos ou características do próprio paciente. O principal auxiliar para interpretação de resultados alterados é o CHCM, que quando tem seu valor alto ou baixo da referência indica de maneira clara e objetiva alterações que podem ser desde erros de coleta até presença de doenças. Sendo assim, demonstrou-se a relevância de cuidados na interpretação de laudos ao expor resultados fora da normalidade e deste modo esclareceu problemas, elucidando soluções simples. Palavras-chave: Eritrograma, metodologias, CHCM, regra de 3. ABSTRACT: The hemogram (CBC) is divided between erythrocyte, leukocyte and platelet parameters, represent the most prevalent laboratory investigation in clinical pratice. The CBC analysis, contain important information for the diagnosis of several diseases. The new methods and automated blood count analyzers have been undergoing several changes over the years, resulting today in different types of the calculated results. This study aims to evaluate the red blood cell (RBC) indices showing its importance as auxiliary in laboratory errors resolution with the most diverse sample problems. For the study was performing a literature search the period from August 2012 to February The RBC indices contains results used for diagnosis of anemias or for therapeutic monitoring, while the same was discovered as an indicator of major changes to be evaluated by an experienced laboratorial professional, becomes an instrument of great value regarding problems samples, equipment or characteristics of the patient. The main aim to interpretation of abnormal results is the mean corpuscular hemoglobin concentration (MCHC), is that when your high or low value of the reference points in clear and objective changes that can be puncture blood or errors by the disease presence. Therefore, it was demonstrated the importance of analysis in interpreting reports exposing the results outside the normal range and thereby clarified issues, elucidating simple solutions. Keywords: Erythrogram, methodologies, CHCM, rule of 3. 1 Acadêmica Concluinte da Pós Graduação em Hematologia Laboratorial, ano Doutor em Biologia Celular e Molecular (PUCRS); Professor do Curso de Pós Graduação UNIJUI.

4 INTRODUÇÃO O hemograma é um exame laboratorial para análise qualitativa e quantitativa dos elementos sanguíneos. Com freqüência é encontrado nas requisições médicas, em torno de 40%, o que demonstra sua tamanha importância. Na atualidade existem equipamentos de alta tecnologia disponíveis com inúmeros recursos, dentre eles os índices hematológicos - volume corpuscular médio (VCM), hemoglobina corpuscular média (HCM), concentração hemoglobínica corpuscular média (CHCM) - e tudo isso com resultados ainda mais rápidos, e ao mesmo tempo precisos e confiáveis (1, 2). O uso destes índices hematimétricos tem enorme importância para racionalizar a abordagem diagnóstica e contornar a problemática de altos custos em diagnósticos diferenciais como das anemias. No entanto, até chegar ao que temos hoje passamos por uma série de diferentes técnicas que trataremos a seguir (3). O método primariamente descrito foi à contagem celular por impedância, em 1956 por Wallece Coulter. Esta se embasa no princípio que os eritrócitos são pobres condutores de eletricidade e os diluentes bons condutores. Assim dois eletrodos de platina (um no interior do equipamento e outro no líquido), mergulhados separadamente por um orifício com diâmetro de micrometros, onde cada partícula que passe por este orifício desloca um determinado volume de líquido e produz uma impedância proporcional a esse, na qual esses pulsos são amplificados e contados (4). O princípio de Coulter foi utilizado por anos, no entanto, devido às células sanguíneas terem propriedade de dispersão de luz um novo método de quantificação surge. Agora a técnica é feita por detectores eletro-óticos, neste o que converte o impulso elétrico é o próprio volume celular (4). Para ambas as técnicas acima descritas, os resultados dos índices hematimétricos eram obtidos através de cálculos, onde o VCM é o HTC / RBC X 10, o HCM é HGB / RBC X 10 e o CHCM é HGB / HTC X 100. Portanto, para ter estes resultados dentro de valores ditos normais, os valores primários (eritrócito - RBC, hemoglobina - HGB e hematócrito - HTC) eram reorganizados através de uma regra conhecida como REGRA DE 3.

5 O princípio da regra de 3 era que para se obter o resultado do hematócrito se multiplicava a hemoglobina por 3, ou ainda a contagem de hemácias multiplicada por 9, enquanto que o resultado da hemoglobina era o número de eritrócitos multiplicado por 3. No entanto, existia uma quarta regra, que até hoje é esquecida, na qual essas 3 só poderiam ser utilizada em pacientes com valores normais (5). O tempo foi passando e as metodologias aperfeiçoando-se. Passamos pelo método de Tallquist (bloquinho de folhas com gota de sangue na qual se comparava as cores para visualizar nível de hemoglobina), pela pipeta de Sally (diluía a hemoglobina em cianometahemoglobina e assim media-se a hemoglobina), e enfim chegamos aos índices de Wintrobe que veio para minimizar inadvertências e ajudar a desmistificar essa regra de 3 (5). Porém, a modernização não extingue erros pré-analíticos e analíticos, o que exige controle contínuo e qualificação profissional, pois não há nada que substitua a análise microscópica do sangue, é nela que visualizaremos e confirmaremos a presença de uma amostra anormal. O erro mais comum que pode ser citado é: coágulos; no entanto, atualmente não precisamos visualizá-los macroscopicamente, pois os modernos instrumentos acusam tais erros através dos valores do CHCM, da concentração de hemoglobina e do VCM (6, 7). O CHCM é a avaliação da hemoglobina encontrada em 100 ml de hemácias. Esse índice permite a avaliação do grau de saturação de hemoglobina no eritrócito. A saturação da hemoglobina normal índica a presença de hemácias ditas normocrômicas. Quando diminuída, teremos hemácias denominadas hipocrômicas e, quando aumentadas, hemácias hipercrômicas (VN %) (8). O CHCM não é somente indicador de cor, mas também de inúmeros erros que pode ser percebido quando temos seu resultado falsamente elevado ou diminuído. Causas do falso aumento do CHCM: amostras hemolisadas ou lipêmicas, aglutinação de eritrócitos, esferocitose hereditária e osmolalidade anormal (sódio baixo). Causas da falsa diminuição: hipercromia, anemias hipocromicas e microcíticas, elevação do sódio sérico, amostras velhas e leucocitose (5, 7).

6 Através do conhecimento destes dados, pretende-se minimizar inadvertências em laudos, no qual muitas vezes seus resultados eram normalizados pela regra de 3, sem conter observações necessárias e indispensáveis ao médico e paciente. Então, para melhor entendimento de como prosseguir ao receber um laudo com valores fora da referência, a seguir foi fundamentado estas causas para o aumento e diminuição do CHCM e posterior solução. Deste modo, o presente estudo teve como principal objetivo demonstrar a importância do valor do CHCM emitido pelos aparelhos de automação, o qual não serve somente para definir presença de hipo e hipercromia eritrocitária, como se imaginava antigamente, mas também para acusar problemas com amostras, sejam elas erros ou doenças; sendo assim, exemplificaram-se, através da união de trabalhos, alterações do CHCM em diversas situações pré-analíticas e analíticas. Crioaglutininas As crioaglutininas são auto-anticorpos de proteína-m para os antígenos de glóbulos vermelhos que são encontradas em títulos baixos em adultos saudáveis, mas desenvolvidas com pouca freqüência, podendo ser aglutininas frias ou quentes. Estas podem ser originadas, dentre outros motivos, após uma infecção por Mycoplasma pneumoniae, por alguma anormalidade no desenvolvimento dos linfócitos B, ou em algumas subpopulações dos linfócitos T (9, 10). A presença destas crioaglutininas ocasiona uma pseudoanemia, na qual se devem evitar transfusões sanguíneas, e o tratamento adequado para o caso é somente evitar locais com baixas temperaturas ou altas temperaturas de acordo com o caso e terapias imunossupressoras (9). Pacientes com esta patologia tem um CHCM elevado, o que é fisiologicamente impossível, e quando levado ao banho 37 este volta à normalidade (5). Anemias Microcíticas e Hipocromicas As anemias microcíticas e hipocrômicas apresentam o aspecto eritrocitário anêmico mais comum: hemácias com microcítose e hipocromia, sendo a deficiência de ferro a maior causa mundial para esta morfologia, devendo sempre ser diferenciada das outras anemias com as mesmas características, como: anemia falciforme e talassemia (3,

7 11). O CHCM em anemia ferropriva é baixo o que condiz com a concentração hemoglobínica da hemácia, já as hemoglobinopatias expressam um CHCM normal, deste modo este índice serve como mais um auxílio no diagnóstico diferencial das anemias (5). Amostras velhas Os erros com amostras velhas foram contornados com a automação que surgiu com o objetivo de assegurar a rapidez de processos e a confiabilidade dos testes hematológicos em todas as fases, sendo assim, os exames laboratoriais não podem fornecer resultados contendo erros técnicos, tais como, coleta (tempo e local), armazenamento (temperatura e tempo) e transporte. A estocagem prolongada de sangue anticoagulado com EDTA causa inúmeros problemas na amostra, sejam elas na linhagem eritróide, neutrofílica ou plaquetária (12). Neste momento se mostra a importância de um bioquímico experiente que conseguirá reconhecer artefatos de estocagem e fará um correto diferencial, e caso necessário, após exclusão de outros erros (homogeneização, amostra insuficiente, anticoagulante, hiperlipidemia, aglutinação - crioaglutininas e coágulos) se invalida a amostra e solicita-se nova coleta (12). Nesse caso, as amostras envelhecidas têm hemácias inchadas e um CHCM baixo (5). Leucocitose O grande volume leucocitário acima da normalidade (leucocitose) faz com que o organismo produza linfócitos pequenos, e estes acabam sendo contados no histograma hemático. Portanto, ainda são maiores que as hemácias, e diferentemente delas não possuem hemoglobina, sendo assim o VCM aumenta e o CHCM diminui. Alguns aparelhos possibilitam a visualização de dois picos no gráfico e assim com fácil diagnóstico do que se trata de verdadeiras hemácias, neste caso podemos sim retirar o valor real de VCM para recalcular o restante dos índices (13). Sódio anormal O sódio anormal em amostras hematológicas causa problemas nas contagens por impedância clássica com foco hidrodinâmico devido ao seu diluente isotônico.

8 Quando temos uma hipernatremia à célula hemática elimina água para tentar equilibrar o meio e encolhe. No momento em que a mesma é colocada em um aparelho hematológico, com diluente isotônico, ela vai ter mais sódio que o meio, tentando novamente manter seu equilíbrio ela absorve água rapidamente o que a torna inflada além do normal, resultando um hematócrito e um VCM elevado e um CHCM baixo (5). E no caso de uma hiponatremia as células contem muito mais sódio que o meio, assim para alcançar o equilíbrio absorve água sérica e quando em contato ao diluente a elimina novamente obtendo resultados como hematócrito e VCM baixos, e CHCM alto (5). A solução deste caso seria avaliação do sódio do paciente ou então rodar um hematócrito, sendo o último a melhor solução, pois através dele poderemos eliminar outros dois problemas em amostras, que causam tais alterações, como a visualização de hemólise e lipemia. Sem a presença das mesmas fica fácil resolver o problema basta utilizar o valor do hematócrito para correção dos outros índices (5). Hemólise A hemólise se trata de uma redução da vida-média (120 dias) do eritrócito. O sangue pode hemolisar devido a diversos fatores, oriundos de algum problema próprio com o paciente, ou durante algum processo com a amostra. Os efeitos causados no resultado de um hemograma são: diminuição de eritrócitos e hematócrito, e aumento da hemoglobina e CHCM (13, 14). Lipemia A lipemia está diretamente relacionada à alimentação do paciente sem ter qualquer interferência externa, e pode ser evitada quando se tem um jejum adequado. Na presença de lipemia tem-se uma hemoglobina e um CHCM falsamente elevado, isso ocorre devido à turbidez na membrana fotométrica (15).

9 METODOLOGIA Para o desenvolvimento do presente trabalho foi realizada uma pesquisa bibliográfica com uma revisão de artigos, revistas, livros e periódicos atualizados no intuito de demonstrar a acuidade dos índices hematimétricos no diagnóstico e minimização de erros através da interpretação dos mesmos. Os estudos para o desenvolvimento do mesmo se deram no período de agosto 2012 a fevereiro de 2013, privilegiando artigos atuais e sem restringir idiomas. DISCUSSÃO Os equipamentos hematológicos fornecem diversos parâmetros visando auxiliar no diagnóstico laboratorial de várias condições clínicas. No que se refere à caracterização das alterações da linhagem eritrocítica, o maior objetivo é que esses dados possam representar ferramentas úteis no diagnóstico e na diferenciação de várias formas de anemias, assim como no acompanhamento do paciente submetido a uma determinada terapêutica (6). Sendo assim, os aparelhos automatizados com alta sensibilidade e precisão vieram a auxiliar de maneira hábil e veloz os laboratórios clínicos que com o volume de amostras diárias seriam incapazes de efetuá-las manualmente de maneira eficiente (15). Esses modernos aparelhos usam o método da focagem hidrodinâmica (HDF) no qual sua metodologia embasa-se na contagem e detecção do tamanho dos eritrócitos objetivando reduzir a perda e variação de pulsos devido à passagem não axial na zona de detecção e recirculação de células, os quais podem causar falsas contagens celulares (16). Assim demonstra-se a importância de uma automação para valores mais fidedignos e exatos, pois em metodologias assim tem-se contagem de milhares de células e não somente um cálculo efetuado a partir de valores primários e em um percentual menor de hemácias (17). Portanto, essas técnicas ainda precisam ser organizadas, pois estudos mostram variabilidade entre um aparelho e outro no que diz respeito aos critérios de liberação automática dos hemogramas (15).

10 Estes instrumentos têm ainda a capacidade de liberar alarmes (flags), os quais nos permitem chamar a atenção para resultados fora dos valores de referência ou com alterações nos histogramas que evidenciam possíveis alterações morfológicas. A continuação do estudo do hemograma é feita, caso não ocorra à aprovação direta, através da observação do esfregaço de sangue periférico (16). A microscopia de todos os hemogramas é economicamente inviável pelo tempo e despesa gasta com as mesmas. Desse modo, os laboratórios clínicos liberam de forma direta aqueles hemogramas em que não se observa nenhuma alteração nos laudos. Para garantia de que os aparelhos realmente têm qualidade em seus flags, trabalhos como o de Failace (2004) são efetuados mostrando que realmente existem falso-positivos gerando um gasto desnecessário, no entanto o mais preocupante o falso-negativo não se observa. Os indicadores para triagem de anemias HTC, HGB e CHCM se originaram dos resultados de eritrogramas executados por metodologias manuais. Após a automação surgiram diferenças metodológicas na qual interferem diretamente na interpretação clínica/laboratorial (17). Na execução destas técnicas as mudanças na interpretação se dão devido a algumas diferenças. Na metodologia manual os resultados do eritrograma surgem a partir de quatro técnicas laboratoriais dependentes: HTC, HGB, RBC e o estudo morfológico das hemácias. Os outros exames (VCM, HCM e CHMC) são calculados através dos anteriores de forma indireta. Já na metodologia automática a contagem e o tamanho das células são reproduzidos de forma direta e exata, onde são contadas hemácias para que enfim tenham-se os resultados do RBC, VCM, HTC, RDW. Logo a dosagem de HGB é feita uma média de duas dosagens e os únicos que continuam sendo obtidos de forma indireta é o HCM e CHCM (17). O CHCM, embora seja um índice derivado, é internacionalmente utilizada para avaliação dos resultados dos aparelhos de automação. Resultados de CHCM entre 30% e 36% não são notados na microscopia, assim confirmasse que o HCM é melhor indicador de hipocromia do que CHCM. Valores baixos sem causa óbvia justificam a passagem da amostra em aparelho de automação alternativo (17).

11 Para Rosenfeld (2012) o CHCM é um dos índices que melhor indica erros uma vez que utiliza todos os resultados primários dos instrumentos automatizados (RBC, HGB e VCM), condizendo com Failace et. al., (2004) que também demonstra que o CHCM é ótimo índice para diagnósticos de falhas em amostras. Um exemplo claro de alteração é o tempo x temperatura em que os resultados de CHCM tornaram-se discrepantes após 12 horas de armazenamento, diminuindo, tanto em temperatura ambiente ou refrigeração, sendo maior alteração no primeiro caso (12). Isso é confirmado também por Walters (2011), que demonstra de maneira clara índices sem sentido com um VCM alto e um CHCM baixo. Para solucionar de maneira rápida esses problemas, os laboratórios clínicos utilizam a REGRA DE 3, no entanto quando não bem empregada pode causar danos irreversíveis ao paciente, como por exemplo, pacientes que apresenta aglutininas frias tem seu CHCM alterado, pois suas hemácias ficam acopladas e isso pode se observar ao visualizar o esfregaço, portanto na pressa para liberar um laudo simplesmente se roda um hematócrito e ajustasse os resultados sem explanar esta importante observação. Por conseguinte, essa mesma regra se torna uma ferramenta de agilidade em casos possíveis como quando temos um paciente com leucocitose alterando o CHCM de maneira errônea pela contagem inadequada nos filtros eritrocitários, e que podem ser visualizados no gráfico hemático, no qual aparecerão dois picos. Outra e mais importante utilização da Regra de 3 é nos casos de validação de equipamentos onde temos a maioria dos pacientes normais e no caso de ter muitos resultados alterados o bioquímico deverá tomar uma providência para solucionar o problema, já que não é normal termos muitos pacientes com resultados divergentes do que padroniza esta metodologia. CONCLUSÃO Os parâmetros fornecidos pela automação representam um importante auxílio no diagnóstico de diversas condições clínicas, portanto, devem ser interpretados com cautela. O atual trabalho se deteve no valor do índice CHCM que acusa quando algo

12 não vai bem, e demonstrou de maneira clara a importância do mesmo para análise mais apurada de determinados casos. A correta interpretação, por um bioquímico, do CHCM é primordial para liberação de um laudo correto. Nele conseguimos visualizar falhas que outros índices não nos permitem e nenhum aparelho de automação libera. Sendo assim a utilização da regra de 3 nem sempre será possível e o contrário também é verdadeiro, seu uso é por vezes essencial após alguns testes. Assim demonstrar-se também a importância de se manterem os valores de referência do CHCM com critérios rígidos, pois com esse resultado consegue-se liberar laudos com alta confiabilidade diretamente dos aparelhos de automação em hematologia, fazendo com que o clínico possa ter mais segurança no diagnóstico e acompanhamento de seus pacientes.

13 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 1. TEIXEIRA, F. G. Comparação dos resultados de hemogramas do contador eletrônico ABX PENTRA 60 com a microscopia. Porto Alegre, Acesso em: <http://www.lume.ufrgs.br/bitstream/handle/10183/7399/ pdf?sequence=1> 2. HOFFMANN, L. P.; POLLETTI, C.; ROEHRIG, K. S.; ET AL. Avaliação dos índices hematimétricos emitidos pelos contadores hematológicos Pentra 120 Range e Sysmex XT-2000i. Rev. Bras. Análises Clínicas. vol. 39(1): 25-28, Acesso em: <https://sbac.org.br/pt/pdfs/rbac/rbac_39_01/rbac_39_1_05.pdf> 3. MELO, M. R.; PURINI, M. C.; CANÇADO, R. D.; et al. Uso de índices hematimétricos no diagnóstico diferencial de anemias microcíticas: Uma abordagem a ser adotada? Rev. Assoc. Med. Brás, N. 48(3), , Acesso em: <http://www.scielo.br/pdf/%0d/ramb/v48n3/11819.pdf > 4. BACALL, N. S. Analisador automático hematológico e a importância de validar novos equipamentos em laboratórios clínicos. Rev. Bras. Hematol. Hemoter., ed. 31(4), p , WALTERS, J. O poder dos índices hematimétricos. Desmistificando as regas de 3. Seminário em Português da Sysmex GROTTO, H. Z. W. Diferenciação das anemias microcíticas utilizando a determinação do RDW. Rev. Bras. Hematol. Hemoter., ed. 30(2), p , ROSENFELD, R. Hemograma. Jornal Brás. Patol. Med.Lab., v. 48, n. 4, Agosto: CARMO, M. Polígrafo Hematologia Clínica. UNIFRA. 9. GARCÍA-ERCE, J. A.; REBILLO, M. D.; LAFUENTE, L.M.; et.al. Falsa anemia por crioaglutininas precedida em el tiempo de una anemia hemolítica autoinmune por anticuerpos calientes. Cartas al director, v. 18, n. 9, p , STONE, M. J. Heating up cold agglutinins. Jornal Inside Blood, v.16, n.17, p , Outubro: HENNEBERG, R.; LEITE, A. A.; NASCIMENTO, A. J. Caracterização eritrocitométrica diferencial entre portadores de anemia por deficiência de ferro, traço falciforme e beta talassemia menor. Visão Acadêmica, v. 9, n.2, p , Curitiba, Jul-Dez: DALANHOL, M.; BARROS, M.; MAZUCHELLI, J.; et.al. Efeitos quantitativos da estocagem de sangue periférico nas determinações do hemograma automatizado. Revista brasileira de hematologia e hemoterapia. Paraná: 2009.

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