INSTITUTO AGRONÔMICO CURSO DE PÓS-GRADUAÇÃO EM AGRICULTURA TROPICAL E SUBTROPICAL

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1 INSTITUTO AGRONÔMICO CURSO DE PÓS-GRADUAÇÃO EM AGRICULTURA TROPICAL E SUBTROPICAL VARIABILIDADE DO TEOR DE ÓLEO, DE SEU FATOR DE PROTEÇÃO SOLAR E DE OUTROS COMPONENTES DA FRAÇÃO LIPÍDICA DO GÊNERO Coffea VISANDO USOS ALTERNATIVOS AOS GRÃOS TAIS ALERIANA LUCON WAGEMAKER ORIENTADOR: Oliveiro Guerreiro Filho Dissertação submetida como requisito parcial para obtenção do grau de Mestre em Agricultura Tropical e Subtropical Área de Concentração em Genética, Melhoramento Vegetal e Biotecnologia Campinas, SP Abril II

2 Ficha elaborada pela bibliotecária do Núcleo de Informação e Documentação do Instituto Agronômico W278v Wagemaker, Tais Aleriana Lucon Variabilidade do teor de óleo, de seu fator de proteção solar e de outros componentes da fração lipídica do gênero Coffea visando usos alternativos aos grãos./ Tais Aleriana Lucon Wagemaker. Campinas, fls Orientador: Oliveiro Guerreiro Filho Dissertação (Mestrado) Genética, Melhoramento Vegetal e Biotecnologia Instituto Agronômico 1. Café 2. Óleo do café 3. Protetor solar 4. Cosméticos I. Guerreiro Filho, Oliveiro II. Título CDD

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4 Aos meus pais, pelo amor, carinho, apoio e compreensão incondicionais. Amo muito vocês. OFEREÇO 3III

5 À Cássia Regina Limonta Carvalho DEDICO 4IV

6 AGRADECIMENTOS À minha mãe e ao meu pai que deram muita força e insistiram muito para que eu fosse cursar mestrado. Sem eles nada disso seria possível. À minha irmã e ao meu namorado pela compreensão e pelo carinho. Ao meu orientador Guerreiro pelos grandes ensinamentos e por proporcionar as condições necessárias para que todas as pesquisas que julguei necessárias fossem realizadas. À minha Co-orientadora Cássia pela paciência, pelos ensinamentos sobre química e sobre alimentos, pela força e pela motivação. Ao IAC e à Pós-graduação pela oportunidade. Aos professores e funcionários pelas inúmeras e diversas contribuições. Ao Nilson, pela proposta de estudo e à Linax Óleos Essenciais pelo fornecimento de material para o início das pesquisas. À Bernadete por fornecer material de estudo e pelas horas de discussão. À Terezinha, à Masako, à Regiane, à Lígia, à Márcia e aos demais funcionários do Centro de Café por terem me recebido tão bem e por todo o auxílio prestado ao projeto. À D. Ivone pelas inúmeras coletas e por me ensinar um pouco do que ela sabe sobre café. À Maria Elisa pelo grande apoio desde o início do curso. À tia Olga pelas aulas de Inglês. Aos meus colegas de curso que atualmente são grandes amigos em especial à Samanta, Lia, Fernanda, Anita, Alan e Marcão. Ao Alexandre. E, especialmente, aos grandes amigos e amigas da Fitoquímica: À Lenita, Márcia, Maria, Roselaine e Carina; À Régia e a Eliana; Ao Luciano, ao Renato, ao Thiago, ao Jeffersson e ao Anderson. V 5

7 SUMÁRIO RESUMO...VII ABSTRACT...VIII 1 INTRODUÇÃO REVISÃO BIBLIOGRÁFICA O gênero Coffea A Lenda Importância econômica Fração lipídica Cera Óleo Ácidos graxos Matéria insaponificável Pele Radiação Ultravioleta Protetores solares Fator de Proteção Solar Antioxidantes MATERIAL E MÉTODOS Local Material vegetal Coleta e preparo das amostras Extração e determinação do teor de cera Extração e determinação do teor de óleo Transesterificação do óleo Identificação dos ácidos graxos Matéria insaponificável Separação da matéria insaponificável Quantificação do branco Quantificação da matéria insaponificável Avaliação do fator de proteção solar por espectrofotometria ultravioleta Determinação do potencial antioxidante Experimentos complementares Determinação do teor de cafeína Frutos verdes Método de extração Delineamento estatístico RESULTADOS E DISCUSSÃO Teor de cera Teor de óleo Fator de proteção solar Experimentos complementares Teor e composição de ácidos graxos Antioxidantes Teor de matéria insaponificável CONCLUSÕES REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS VI

8 WAGEMAKER, Tais Aleriana Lucon. Variabilidade do teor de óleo, de seu fator de proteção solar e de outros componentes da fração lipídica do gênero Coffea visando usos alternativos aos grãos p. Dissertação (Mestrado em Genética, Melhoramento Vegetal e Biotecnologia) Pós-Graduação IAC. RESUMO O gênero Coffea é conhecido mundialmente pela bebida extraída dos grãos torrados de suas mais importantes espécies: Coffea arabica e C. canephora. Além da bebida, o café, também pode ser utilizado em produtos cosméticos promovendo hidratação e proteção solar através de seu óleo. O óleo de café é rico em ácidos graxos insaturados com propriedades de hidratação da barreira cutânea e ainda pode ser utilizado como produto natural capaz de proteger a pele contra a radiação ultravioleta B (UVB), responsável por aumentar a incidência de câncer de pele. Este trabalho visou avaliar o potencial do uso da fração lipídica de diversas espécies e variedades de café para aplicação em protetores solares. Para isso, extraiu-se e quantificou-se a cera, o óleo e avaliou-se espectrofotometricamente o fator de proteção solar de cinco cultivares de C. arabica, sete cultivares de C. canephora e nove híbridos/clones dessas duas espécies oriundos do Banco Ativo de Germoplasma (BAG) do Instituto Agronômico de Campinas. Oito espécies selvagens do gênero Coffea também foram avaliadas quanto ao perfil dos ácidos graxos e à extração e quantificação da matéria insaponificável. Constatou-se que há grande variabilidade tanto entre espécies quanto entre cultivares e plantas. Os teores de cera variaram entre valores nulos para C. arabica (plantas 8 e 69 da cultivar Icatu Vermelho IAC 4045 e plantas 58 e 66 da cultivar Tupi IAC ) até 2,75% para C. congensis. Os valores de teor de óleo obtidos variaram entre 5,08% (C. canephora IAC 4695 C1238) a 32,36% (C. salvatrix planta 9). Os principais ácidos graxos encontrados para todas as espécies foram o ácido linoleico e o ácido palmítico. A quantidade de matéria insaponificável variou muito entre as espécies sendo as maiores médias encontradas para C. arabica (13,54%), C. congensis (12,94%) e C. salvatrix (10,71%). Significativa variabilidade foi encontrada para FPS de 0,05 para C. canephora var. Bukobensis até 3,58 para planta 4 de C. stenophylla. Palavras-chave: café, protetor solar, cosmético. 7VII

9 WAGEMAKER, Tais Aleriana Lucon. Variability of content, sun protection factor of oil and Coffea genera lipid fraction composition to alternative uses for beans p. Thesis (Master in Genetic, plant breeding and biotechnology) Postgraduate IAC. ABSTRACT The Coffea genera is known beverage which is extracted of the two most important species: Coffea arabica and C. canephora. The coffee can also be used in cosmetic products for the moisturizing property of its oil. The coffee oil is rich in unsaturated fatty acids with skin moisturizing properties and can be used as the single natural product able to protect the skin from the UVB radiation. This is the most damaging radiation for human skin health because it can cause cancer. This study aimed to evaluate the coffee beans lipid fraction of different coffee species and varieties possible application in sunscreens. Wax and oil were extracted and quantified. The sun protection factor (SPF) was measured in five C. arabica cultivars, seven C. canephora selections and nine hybrids and clones their species from Instituto Agronômico de Campinas Genebank. The same was made for eight Coffea wild species with fatty acids chromatographic characterization and unsaponifiable quantify. There were high variability among species, cultivars and plants. The wax content was between 0.00% for Icatu Vermelho IAC 4045 plants 8 and 69 and Tupi IAC until 2.75% for C. congensis. The oil content was 5.08% for IAC 4695 C1238 C. canephora until 32.36% for C. salvatrix plant 9. The main fatty acids found in all species were linoleic acid and palmitic acid. There were high variability in unsaponifiable matter between species and the higher values were found for C. arabica (13.54%), C. congensis (10.94%) and C. salvatrix (10.71%). Variability has been found in SPF between 0.05 for Bukobensis until 3.58 for C. stenophylla plant 4. Key-words: coffee, sunscreen, cosmetic. VIII 8

10 1 INTRODUÇÃO O cafeeiro é uma planta originária da Etiópia tendo sido introduzido no Brasil por poucas mudas. Ao longo dos tempos, a cultura do café se difundiu e tornou este País o principal produtor e exportador mundial desse grão na atualidade. Muitas são as espécies de café, mas somente três são utilizadas para bebida: Coffea arabica, também conhecido por Arábica, é o café com maior valor comercial e de melhor qualidade; C. canephora, conhecido como café Robusta, apresenta teores superiores de cafeína, sólidos solúveis e ácidos clorogênicos e destaca-se na fabricação do café solúvel e na formação de blends; C. liberica, que produz bebida de qualidade bastante inferior que é consumida apenas em sua região de origem. O Instituto Agronômico de Campinas desenvolve desde 1934 um amplo programa de melhoramento genético, que colaborou para aumentar a variabilidade genética e permitiu a seleção de cultivares produtivas, resistentes à pragas e doenças, com alto e baixo teores de cafeína, de ácidos clorogênicos e de sólidos solúveis, tão importantes para qualidade da bebida apreciada no mundo todo. Este mesmo Instituto possui uma coleção 16 espécies do gênero Coffea, sendo que 10 foram utilizadas neste trabalho para compor uma caracterização do Banco Ativo de Germoplasma de Coffea quanto à variabilidade do caráter lipídios. Existe controvérsia quanto à importância dos lipídios na bebida de café. Pesquisas conduzidas por SPEER & KÖLLING-SPEER (2008 apud LICKINT (1931) mostram que a cera, que é uma fina camada envolvendo todo o grão, é responsável pelo mal-estar gástrico ocasionado após a ingestão da bebida. Deste modo, uma caracterização do teor de cera poderia auxiliar na seleção de cafés menos agressivos ao aparelho digestivo. Paralelamente, há autores que citam a importância do óleo de café para preservação das características de aroma e sabor da bebida indicando que cafés de melhor qualidade são aqueles que contêm mais óleo (MENCHU, 1966; FONSECA et al., 1974, OLIVEIRA, 2005). Outros, porém, não encontraram correlação entre a qualidade da bebida e a quantidade de óleo (MENCHU & IBARRA,1967). 9

11 Desde a crise de 1929, quando foram queimadas toneladas de café para diminuir a oferta do produto no mercado, produtores, pesquisadores e gestores de órgãos governamentais buscam alternativas para a utilização do café além da bebida. O óleo de café é um desses possíveis subprodutos. Utilizado principalmente para impedir a fragmentação dos grânulos do café solúvel e conferir aroma a diversos produtos alimentícios. O óleo de café se destaca também na indústria cosmética como ativo de diversos itens promovendo hidratação da pele. A matéria graxa é um dos componentes que existem em maior proporção nos grãos de café, sendo constituída principalmente de ceras, triglicerídeos e matéria insaponificável (TANGO, 1971). A cera, utilizada como antioxidante de alimentos pode também ser utilizada na separação da molécula de serotonina (BERTHOLET & HIRSBRUNNER, 1985). Os triglicerídeos são moléculas compostas por três ácidos graxos ligados a uma molécula de glicerol. No óleo de café, o ácido graxo insaturado que aparece em maior proporção é o ácido linoleico. Por ser rico em matéria insaponificável, o óleo de café é líquido a temperatura ambiente apesar de apresentar uma composição de ácidos graxos que deveria lhe conferir o estado sólido nessa mesma temperatura. A riqueza em matéria insaponificável também é a causa da dificuldade de refinamento deste óleo. Todavia, esta é responsável de acordo com TURATTI & LUCCAS (2001), pelas propriedades cosméticas de retenção da umidade, penetração e aderência na pele. Além disso, estudos conduzidos por MAIA (2004, dados não publicados) revelam que o óleo de café pode ser utilizado como ativo de protetores e filtros solares, pois através de análise espectrofotométrica foi possível identificar uma considerável curva de absorbância no comprimento de onda que mais causa danos a pele humana, de 290 a 320 nm. Deste modo, este trabalho visa avaliar a variabilidade genética entre espécies, cultivares e híbridos de café quanto à característica lipídios para subsidiar programas de melhoramento genético e para selecionar as de maior teor de óleo, melhor composição dos ácidos graxos e maior fator de proteção solar para exploração de seu potencial cosmético por meio da: Avaliação do teor de óleo e da composição de ácidos graxos; Elaboração da curva de absorbância do óleo extraído de diferentes espécies de Coffea, cultivares de C. arabica e C. canephora presentes no 10

12 Banco Ativo Germoplasma de Coffea do Instituto Agronômico de Campinas; Determinação do fator de proteção solar do óleo (FPS) por espectrofotometria; Determinação do efeito do ano de colheita dos grãos no teor do óleo e no fator de proteção solar de C. arabica; Organização de banco de dados correlacionando as informações obtidas com o possível uso do óleo como matéria-prima para produtos cosméticos com função de proteção solar. 2 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA 2.1 O gênero Coffea Os cafeeiros pertencem à família Rubiaceae, que abriga mais de dez mil espécies, constituindo uma tribo denominada Coffeeae, subdividida, por sua vez em dois gêneros denominados Coffea L. e Psilanthus Hook.f. (BRIDSON & VERDCOURT, 1988). As duas principais espécies do gênero Coffea são C. arabica e C. canephora denominadas respectivamente, café Arábica e café Robusta. Estas representam 99% do consumo mundial de café. C. arabica é tetraplóide (2n = 4x = 44 cromossomos) e autógama com cerca de apenas 10% de polinização cruzada. É oriunda de terras altas, a mais de 1000 m de altitude da Etiópia e do Sudão, onde cresce em estado semi-silvestre nos estratos inferiores da floresta, enquanto que C. canephora é diplóide (2n = 2x = 22 cromossomos) e alógama, sendo a fecundação controlada por um sistema de incompatibilidade do tipo gametofítico (CONAGIN & MENDES, 1961). Crescem como plantas silvestres nas florestas equatoriais africanas em altitudes que vão desde o nível do mar até cerca 1000 m, principalmente entre os paralelos de 10º N e 10º S, da costa ocidental de Uganda (CAMARGO & PEREIRA, 1994). 11

13 Segundo DAVIS et al. (2006) existem no total 103 espécies do gênero Coffea distribuídas em 41 espécies na África, 59 na ilha de Madagascar e três nas Ilhas Mascarenhas. 2.2 A Lenda A antiga lenda do café conta que há mais de mil anos, um monge passeava pelas pastagens da Arábia. Perto dali, onde algumas cabras brincavam, o monge notou certa agitação. A alegria dos animais era tamanha que ele resolveu se aproximar. Um jovem pastor estava sentado junto dos animais e cantarolava baixinho; todos pareciam embriagados por uma estranha felicidade. O monge chegou mais perto e notou pequenas frutinhas vermelhas que o jovem trazia nas mãos e pareciam reluzir contra a luz do entardecer. O pastor explicou que as frutas eram a fonte de alegria e motivação, e somente com a ajuda delas o rebanho conseguia caminhar vários quilômetros por subidas infindáveis. O monge apanhou um pouco das frutas e levou-as consigo até o monastério. Antes da oração noturna, resolveu experimentar o novo elixir. Seu corpo foi tomado de uma sensação de júbilo e motivação, e o monge orou durante toda a noite (PASCOAL, 2006). 2.3 Importância econômica Desde que o café foi utilizado para o consumo humano e que se percebeu sua grande utilidade para aumentar a concentração e agilizar o raciocínio, houve aumento da sua participação no mercado mundial. Trata-se de um mercado gigantesco, que movimenta, anualmente, 91 bilhões de dólares cuja cadeia emprega direta ou indiretamente meio bilhão de pessoas em todo o mundo, ou 8% da população mundial (EMBRAPA, 2009). Segundo a última estimativa de produção total de café arábica e conilon, para a safra 2009, o País deverá colher entre 36,9 e 38,8 milhões de sacas de 60 quilos de café beneficiado. Destes, 74,6% (26,8 a 28,3 milhões de sacas de café beneficiado) representam a produção de arábica e 25,4% (10,0 a 10,5 milhões de sacas de café 12

14 beneficiado) correspondem à produção de café robusta e a área total cultivada com café arábica e conilon está estimada em hectares (CONAB, 2008). Com exportação média de 28 milhões de sacas, o Brasil é o principal exportador e responde por mais de um terço de toda produção mundial - três vezes mais do que a Colômbia, o segundo maior exportador de C. arabica. O setor é responsável pela geração de sete milhões de empregos diretos e indiretos no país e por uma riqueza anual de 10 bilhões de reais (EMBRAPA, 2008). 2.4 Fração lipídica O grão de café é constituído de proteínas, açúcares e uma fração lipídica. Segundo POISSON (1979), os lipídios do café podem ser divididos em três categorias: a) ácidos graxos derivados de glicerídeos e fosfolipídios; b) constituintes da matéria insaponificável, esteróis, di e triterpenos e tocoferóis e c) constituintes da cera que recobre o grão. De acordo com FOLSTAR (1985), a fração lipídica tem em média como principais componentes os triglicerídeos (75,2%), ésteres de álcoois diterpênicos e ácidos graxos (18,5%), álcoois diterpênicos (0,4%), ésteres de esteróis (3.2%), esteróis (2,2%), tocoferóis (0,05%), fosfatídeos (0,1 a 0,5%) e derivados de triptamina (0,8%). Variabilidade intra-específica foi evidenciada por TOLEDO et al. (1961). Em seus estudos o teor de óleo em germoplasma distinto de C. arabica variou de 8,8% a 11,6%, sendo inferior às observações feitas por TURATTI (2001). Segundo esta autora, a cultivar Arábica de C. arabica contém de 12 a 18% de óleo. Para CASTILHO & PARRA (1973) a herança do conteúdo de componentes químicos pode ser poligênica e sugerem um processo de cruzamentos prévios à seleção, pois esses reuniriam diferentes fontes genéticas e aumentariam a probabilidade de obter materiais genéticos de interesse. Entretanto, de acordo com MONTAGNON et al. (1998), é alta a herdabilidade apresentada pelo gênero Coffea para o teor de lipídios, com poucos genes envolvidos na expressão dessa característica, sendo grande a possibilidade de seleção genética eficiente para o caráter desejado. Grande variabilidade para todos os componentes da fração lipídica do grão de café é observada, evidenciando que existe um grande potencial a ser explorado não só 13

15 para desenvolvimento de produtos cosméticos como também na produção de bebida de melhor qualidade Cera A cera de café pode ser definida como o resíduo da evaporação da extração com hidrocarbonetos halogenados de grãos verdes de café não moídos (FOLSTAR et al., 1977) Os grãos de café contêm de 0,2 a 0,3% de cera, localizada na camada externa do grão, que é extraída utilizando-se solventes como clorofórmio ou diclorometano. Estes mesmos autores afirmam que a cera de café consiste em duas fases: uma solúvel em éter de petróleo com composição bastante semelhante ao óleo, sendo extraída junto com este e outra, insolúvel em éter de petróleo composta basicamente de N-alcanoil 5 hidroxitriptamina (C 5 HT) cuja molécula está representada na figura 1 (FOLSTAR, 1985 apud FOLSTAR, 1976). Figura 1- Molécula de N-alcanoil 5 hidroxitriptamina e os principais ácidos graxos ligados a esta (FOLSTAR, 1985 apud FOLSTAR, 1976). Há indícios de que a cera de café possa ser responsável pelos problemas gástricos ocasionados após a ingestão da bebida, pois, de acordo com SPEER & KÖLLING-SPEER, (2006 apud WURZIGER,1972) sua retirada durante os processos industriais resulta em bebida de mais fácil digestão. Entretanto a cera do café possui também efeito antioxidante quando utilizada em alimentos como óleos e gorduras (LEHMANN et al., 1972). Há visíveis diferenças entre as camadas cerosas das diversas espécies de Coffea depois que esta é extraída dos grãos. A cera de C. arabica, por exemplo, é amarelada, a de C. canephora é esverdeada e a de C. salvatrix apresenta tonalidade marrom. Tais 14

16 diferenças evidenciam a grande variabilidade genética que pode ser encontrada em espécies do gênero Coffea mantidas pela coleção do IAC Óleo Os lipídios são componentes importantes da bebida e do aroma do café. Estes são expelidos para a camada de superfície do grão durante a torrefação formando uma camada que impede a volatilização de aromas e a perda imediata destes componentes (CLIFFORD & WILSON, 1985). O óleo do café torrado é utilizado principalmente para conferir aroma ao café solúvel e impedir a fragmentação de seus grânulos. Também é bastante utilizado na indústria alimentícia para conferir aroma a doces e bolos. Quando é extraído do café verde, o óleo é bastante utilizado na indústria cosmética por suas propriedades relacionadas à hidratação dérmica. Este é rico em fitosteróis que promovem excelente hidratação, rápida penetração e boa aderência em aplicações cosméticas, além de ser rico em ácidos graxos essenciais. Nos anos 1960, as Indústrias Matarazzo buscavam produzir óleo através dos grãos de café. Para retirar as impurezas que tornavam este óleo impróprio para o consumo humano, foi usado o álcool da cana de açúcar. Como resultado da reação entre o álcool e o óleo obteve-se um éster etílico, produto que hoje é chamado de biodiesel (WOLF et al., 2008). Todo óleo é composto em sua maioria de triglicerídeos. Substância composta de uma molécula de glicerina e três moléculas de ácidos graxos cujo comprimento da cadeia carbônica e o grau de insaturação determinam suas propriedades físicas e químicas (OLIVEIRA, 2003). MAZZAFERA et al. (1998) estudaram o teor de óleo de várias espécies e variedades de café sendo o maior teor médio encontrado por estes autores o de C. salvatrix com 29,18% e o menor de C. liberica 8,87%. WILBAUX (1956) analisou o teor de óleo de espécies de café do continente africano e encontrou valores de 15,6-16,1% para C. eugenioides, 14,6-15,6% para C. dewevrei Excelsa e 14,8-15,2% para Arnoldiana, 14,3-15,4% para C. congensis, 11,1-11,9% para C. abeokutae, 10,6-12,6% para C. canephora Robusta e 11,9-12,0% para C. liberica. 15

17 2.4.3 Extração de óleo O principal método de extração comercial do óleo é realizado mediante a prensagem dos grãos, sendo denominada extração a frio. Este processo apresenta teor de óleo cerca de 30% menor que o processo de extração por solventes químicos. Sua qualidade é considerada baixa em função da cor escura e do elevado percentual de ácidos graxos livres que dificultam a refinação e o branqueamento (TANGO, 1971). A acidez é quase sempre superior a 10%. Para obter o óleo de café e estudar sua composição química em detalhes, é necessária a extração com solventes sem tratamento com ácidos. De acordo com SPEER & KÖLLING-SPEER (2006 apud PICARD et al., 1984) vários autores utilizam diferentes solventes com diferentes pontos de ebulição resultando em diferentes resultados, pois a polaridade das substâncias extraídas depende do solvente utilizado. Segundo FOLSTAR (1985), o teor do óleo cru de café não se obtém somente em função da composição do grão, mas também das condições de extração, do tamanho final da partícula após a moagem dos grãos, da escolha do solvente e da duração do tempo de extração. O método mais empregado na literatura científica para a extração de óleo em cafés é o Am 2-93 da AOCS (AOCS, 1998), que consta da extração utilizando-se éter de petróleo, por um período de 16 h. Pesquisas recentes avaliam a eficiência de fluídos supercríticos de CO 2 na extração do óleo de café (AZEVEDO et al., 2008), mas via de regra usa-se ainda solventes químicos, como hexano, entre outros, para extração dos componentes voláteis do café torrado Ácidos graxos Os óleos vegetais são constituídos principalmente por triacilgliceróis. Estes são obtidos como produtos de extração, por meio de diferentes técnicas, de frutas e grãos. São ésteres de glicerol aos quais ácidos graxos estão esterificados a cada um dos três grupos hidroxila. Os ácidos graxos são ácidos carboxílicos de cadeias de carbono frequentemente reduzidas (SASAKI, 2008). 16

18 Os óleos vegetais contêm ainda substâncias lipofílicas em baixa proporção como álcool de ácidos graxos, ácidos graxos livres, vitaminas e fitoesteróis. Tais substâncias, em muitos casos, são as responsáveis pelas atividades cosméticas e farmacêuticas desses óleos (ALVAREZ & RODRIGUEZ, 2000). Oito ácidos graxos são comumente encontrados nos lipídios de reserva da maioria das sementes oleaginosas: láurico (12:0), mirístico (14:0), palmítico (16:0), esteárico (18:0), oleico (18:1), linoleico (18:2), linolênico (18:3) e erúcico (22:1). Os principais componentes dos ácidos graxos descritos por FOLSTAR (1985) para óleo de C. arabica são: ácido mirístico (0,2%) ácido palmítico (35,2 a 36,7%), ácido esteárico (7,2 a 9,7%), ácido oleico (9,5 a 11,9%), ácido linoleico (41,2 a 42,6%), ácido linolênico (1,3 a 2,7%) e ácido araquídico (0,3 a 1,5%). KAUFMANN & HAMSAGAR (1962) também encontraram o ácido linoleico e o ácido palmítico como principais ácidos graxos de C. arabica. O primeiro, segundo BEVERIDGE et al. (1999) possui propriedades terapêuticas, de alívio de eczemas crônicas e cura de dermatites Matéria insaponificável O teor de matéria insaponificável (MI) em óleos vegetais é, em geral, ao redor de 1%. No óleo de café esse valor é anormalmente alto, podendo chegar a 12%, segundo KHAN & BROWN (1953). Os principais constituintes do material insaponificável são dois alcoóis diterpênicos, cafestol (C 20 H 28 O 3 ) e caveol (C 20 H 26 O 3 ), cuja estrutura foi elucidada por DJERASSI et al. (1959) e que ocorrem na forma livre ou como monoésteres de ácidos graxos. LAGO & ANTONIASSI (2001) encontraram valores de matéria insaponificável de 14,84 g.100g -1 de óleo para C. arabica. Os mesmos autores encontraram uma predominância do sitosterol como principal esterol quando avaliaram a matéria insaponificável do óleo de café verde e torrado. Resultado semelhante foi encontrado por POISSON (1979) que encontrou o sitosterol como principal esterol. 17

19 2.5 Pele A pele é o maior órgão do corpo humano cuja principal função é separar e proteger o interior do corpo do ambiente externo além de receber estímulo sensorial, ajudar a regular a temperatura corporal e excretar substâncias indesejáveis. A superfície externa da pele consiste em um epitélio pavimentoso, estratificado e queratinizado denominado epiderme. A epiderme é sustentada e nutrida por uma camada espessa de tecido fibroelástico denso denominado derme, que é altamente vascularizada e contém muitos receptores sensitivos. A derme, por sua vez, é fixada aos tecidos subjacentes por uma lâmina de tecido frouxo denominado hipoderme como mostrado na figura 2. Figura 2- Corte de pele humana mostrando as três camadas: derme, epiderme e hipoderme (PORTAL EDUCAÇÃO, 2009). A pele apresenta, por si só, mecanismos de defesa contra a radiação solar sendo o principal deles a produção de melanina. Esta é um pigmento de cor marrom escura com capacidade de absorver a radiação ultravioleta protegendo o núcleo das células e impedindo alterações cromossômicas. 18

20 2.6 Radiação Ultravioleta O sol emite um amplo espectro de radiação eletromagnética, que é desviado ou atenuado pelas camadas atmosféricas da Terra. As radiações que chegam à superfície são classificadas como não-ionizantes e subdivididas em infravermelho, visível e ultravioleta (RIBEIRO et al., 2004). Segundo RIBEIRO (2004), a radiação ultravioleta pode ser dividida em UVC, UVB e UVA de acordo com o comprimento de onda: Radiação UVC (190 a 290 nm): possui alta capacidade de alterar o DNA, é muito carcinogênica, mas só uma quantidade mínima chega à superfície terrestre. Radiação UVB (290 a 320 nm): é responsável pelo eritema solar - vermelhidão da pele devido á vasodilatação dos capilares cutâneos - e estimula a pigmentação retardada que tem importante papel na fotoproteção natural da pele, produz morte de células epidérmicas e liberação de mediadores inflamatórios próprios da queimadura solar; é capaz de produzir dano ao DNA e em sua maior parte é filtrada pela camada de ozônio. Radiação UVA (315 a 400 nm): representa 98% da radiação que alcança a superfície terrestre, sendo parcialmente absorvida pela camada de ozônio; possui grande capacidade de penetração na pele e está envolvida na maioria das reações fotoalérgicas, algumas reações fototóxicas, carcinogênese, fotoenvelhecimento cutâneo e reações de fotossensibilização. A radiação UVB também provoca um efeito imunossupressor local por lesão das células de Langerhans, deixando a pele mais sensível a infecções. Essas células possuem importante função imunológica na pele, pois contêm receptores de superfície para imunoglobulinas que capturam os materiais antigênicos externos os quais ao entrar em contato com a pele, induzem sensibilidade específica de células T facilitando as infecções (OLIVEIRA et al., 2005). 19

21 2.7 Protetores solares Foi a partir dos anos 1930, que se começou a ter consciência dos efeitos da radiação solar e que apareceram no mercado os primeiros fotoprotetores tópicos comerciais. Estes são substâncias cuja função é evitar a passagem da radiação ultravioleta por meio de mecanismos de reflexão, refração e absorção das mesmas (MARTÍNEZ & LECHA, 2002). De acordo com SCHAEFER et al. (2000), os protetores solares são capazes de proteger a pele contra danos ao DNA, câncer de pele, mutações, imunossupressão, dermatites, fotoenvelhecimento e fotodermatites. Em todos os países os protetores solares são classificados como cosméticos, exceto nos Estados Unidos, Canadá e Austrália, onde são considerados medicamentos (BARON & STEVENS, 2002). Segundo FLOR et al. (2007), existem filtros físicos e filtros orgânicos desempenhando esta função. Os últimos são formados por moléculas orgânicas capazes de absorver a radiação UV de alta energia e transformá-la em radiações com energias menores e inofensivas ao ser humano. Essas moléculas são, essencialmente, compostos aromáticos com grupos carboxílicos. No geral, apresentam um grupo doador de elétrons, como uma amina ou um grupo metoxila, na posição orto ou para do anel aromático. Ao absorver a radiação UV, os elétrons situados no orbital HOMO (orbital molecular preenchido de mais alta energia) são excitados para orbital LUMO (orbital molecular vazio de mais baixa energia) e, ao retornarem para o estado inicial, o excesso de energia é liberado em forma de calor. As transições eletrônicas que estão envolvidas durante a absorção da luz UV ocorrem entre a diferença de energia HOMO LUMO. Além de química, fotoquímica e termicamente inertes os protetores devem apresentar características como ser atóxico; não ser sensibilizante, irritante ou mutagênico; não ser volátil; possuir características solúveis apropriadas; não ser absorvido pela pele; não alterar sua cor; não manchar a pele e vestimentas; ser incolor; ser compatível com a formulação e material de acondicionamento e, ser estável no produto final (ROSEN, 2003). Filtros solares são formulados usando um número de diferentes componentes ativos para aumentar a faixa de absorção do espectro. A composição do veículo do filtro solar é um importante fator na determinação da eficácia do produto, pois as interações químicas entre os ingredientes ativos e a composição do veículo afetam a 20

22 eficácia do filtro solar. A polaridade e o ph particular dos solventes e dos componentes do filtro solar também afetam a máxima absorção no produto final (CAMACHO, 2001). MANSUR (1984) relata que a camada córnea da pele humana é formada por várias membranas contendo lipídios. Assim, quanto mais lipofílico for o filtro solar, maior será a substantividade, ou seja, a habilidade do produto manter sua eficiência durante o uso, particularmente quando exposto à água. FUCHS (1998) menciona que antioxidantes contribuem para a proteção solar, pois a pele naturalmente já os utiliza para sua autoproteção contra os efeitos danosos da radiação solar. O óleo de café é uma substância bastante lipofílica e dificilmente lavável com detergentes comuns, além disso, apresenta em sua composição substâncias antioxidantes como os tocoferóis. A primeira referência que se conhece sobre o uso do óleo de café como protetor solar é a patente US de GROLLIER & PLESSIS (1988). Segundo esta patente, o óleo de café poderia absorver a radiação no comprimento de onda de 280 a 320 nm Fator de Proteção Solar A eficácia de um protetor solar é medida em função de seu fator de proteção solar (FPS), o qual indica quantas vezes o tempo de exposição ao sol, sem o risco de eritema, pode ser aumentado com o uso do protetor. Considerando, por exemplo, as mesmas localizações geográficas, estação do ano, condições climáticas e período do dia, uma pessoa de pele clara que pode ficar 20 minutos exposta ao sol sem protetor solar, poderá ficar 300 minutos exposta ao sol com um protetor de FPS = 15, pois 20 x 15 = 300 (MANSUR et al., 1986). Quanto maior o FPS maior será a proteção, ou seja, maior será o tempo que a pele ficará protegida frente à radiação UVB. Ressalta-se que o FPS é definido em função da radiação UVB causadora de eritemas. O valor do FPS pode ser calculado através da Equação 1: 21

23 Onde, DME = dose mínima eritematosa, ou seja, dose mínima necessária para ocorrer o eritema. Estudos conduzidos por GIBSON (2007) evidenciaram que os comprimentos de onda que mais causam dano aos organismos vivos estão em torno de 305 nm. Em seus cálculos (Figura 3), o autor considera que o chamado espectro de dano de eritema é dado em função do comprimento de onda, representando assim, a resposta relativa da pele humana aos raios UVB. Enquanto o comprimento de onda é decrescente, o dano aumenta logaritimicamente (seta), sendo a sensibilidade da pele a 290 nm, mil vezes maior que a 340 nm. Ao mesmo tempo, a irradiância ou número de fótons, é crescente logaritimicamente como resultado da absorção pela camada de ozônio. A Irradiância e espectro de Diffey B Irradiância de Diffey Irradiância (watts/m 2 /nm) Espectro de ação de Diffey Irradiância 350 DU Espectro de ação de Diffey (unid. relativas) Unidades relativas Comprimento de onda (nm) Comprimento de onda (nm) Figura 3 - Irradiância modelada e espectro de dano de eritema (A) e produto da irradiância pelo espectro de dano de eritema ou espectro Diffey (B). Adaptado de Gibson (2007). Para determinar o comprimento de onda em que ocorre maior dano o autor integrou as duas funções da figura 3 (A), obtendo a curva presente na figura 3 (B) que evidencia maiores danos em torno de 305 nm. Em comprimentos de onda mais curtos não há fótons suficientes e em comprimentos mais longos a energia dos fótons não é alta suficiente para causar muito dano. 2.8 Antioxidantes O café, além de propriedades cosméticas também é uma fonte natural de antioxidantes caracterizada pelos ácidos clorogênicos e pela cera que recobre o grão. Os 22

24 primeiros de acordo com VINSON & DABBAG (1998), são melhores antioxidantes que as vitaminas C e E. Além disso, o óleo de café apresenta em sua composição tocoferóis também conhecidos como vitamina E, cujas propriedades e efeitos antioxidantes são muito conhecidos. Segundo MARTÍNEZ & LECHA (2002), sabe-se que um dos mecanismos mediante o qual a radiação ultravioleta é capaz de produzir danos celulares é através da produção de reações oxidativas e geração de radicais livres. Estes desencadeiam uma série de processos atrapalhando o equilíbrio intra e intercelular e provocando uma depreciação de antioxidantes endógenos. Os mesmos autores citam que o tocoferol, vitamina E, apresenta conhecidas propriedades antioxidantes sendo capaz de reduzir a produção de radicais livres. O óleo de café, segundo FOLSTAR (1985) apresenta cerca de 400 a 600 ppm de tocoferol. Soma-se, a isto, a grande quantidade de ácido linoleico (ω-3) que, recentemente, estão sendo empregados como fotoprotetores orais (RHODES, 1998). 3 MATERIAL E MÉTODOS 3.1 Local Os experimentos foram conduzidos nos laboratórios de Fitoquímica do Centro de Recursos Genéticos Vegetais e de Química do Centro de Café do Instituto Agronômico de Campinas (IAC), localizados na Fazenda Santa Elisa, Centro Experimental de Campinas, SP. 3.2 Material vegetal Foram avaliadas quatro plantas de cada uma das cinco cultivares de C. arabica: Catuaí Vermelho IAC 81, Mundo Novo IAC 367-4, Icatu Vermelho IAC 4045, Obatã IAC e Tupi IAC , referentes às colheitas de 2007 e 2008, cujos cafeeiros fazem parte do BAG- Coffea do IAC (Tabela 1). 23

25 Tabela 1- Descrição das cultivares e respectivas plantas de C. arabica que foram avaliadas nos experimentos pertencentes ao lote 106, localizado em Campinas, SP. Germoplasma Plantas Catuaí Vermelho IAC 81 10, 24, 25 e 79 Icatu Vermelho IAC , 33, 42 e 48 Mundo Novo IAC , 58, 66 e 72 Obatã IAC , 9, 47, 66 Tupi IAC , 23, 58, 66 Avaliou-se número variável de plantas das seguintes seleções de C. canephora: Apoatã, Bukobensis, Conilon, Guarini, Kouilou, Laurenti e Robusta (Tabela 2). E número variável de plantas de cada espécie: C. congensis, C. eugenioides, C. heterocalyx, C. kapakata, C. liberica var. dewevrei Abeokutae, C. liberica var. dewevrei Excelsa, C. liberica var. liberica, C. liberica var. liberica Passipagore, C. salvatrix e C. stenophyilla (Tabela 3). O híbrido Arabusta, o híbrido H7316 plantas C339, C362, C364 e C378 e três clones de C. canephora Robusta também foram avaliados (Tabela 4), pois foi observado visualmente que estes híbridos e clones apresentam alta produtividade. Soma-se a isso o fato de serem plantas clonadas que, caso fossem tidas como as mais promissoras para rendimento e composição do óleo, não necessitariam do desenvolvimento de um programa extenso de melhoramento. 24

26 Tabela 2- Descrição das seleções de C. canephora utilizadas nos experimentos localizadas em Campinas. Germoplasma Lote Planta Apoatã Coleção de espécies IAC A Coleção de espécies IAC Coleção de espécies IAC A Coleção de espécies IAC Coleção de espécies IAC Coleção de espécies IAC Coleção de espécies IAC B Coleção de espécies IAC A Bukobensis Coleção de espécies IAC Conilon Lote 97 A IAC 4695 C906 Lote 97 A IAC 4695 C1238 Guarini Coleção de espécies IAC Coleção de espécies Coleção de espécies IAC IAC Kouilou Coleção de espécies IAC 66-3 A Coleção de espécies IAC Coleção de espécies IAC Coleção de espécies IAC 69-5 A Coleção de espécies IAC 70-2 Coleção de espécies IAC Coleção de espécies IAC B EP 501 IAC 68-4 Laurenti Coleção de espécies IAC Robusta EP133 IAC C347 EP133 IAC C377 EP133 IAC C360 25

27 Tabela 3- Descrição das espécies de Coffea e as respectivas plantas localizadas em Campinas que foram utilizadas nos experimentos Espécie Variedade Lote Planta C. congensis IAC 4351 Coleção de clones Mistura C. eugenioides Coleção de espécies Mistura C. heterocalyx Coleção de espécies Mistura C. kapakata Coleção barrica C 19 Coleção barrica C 20-1 Coleção barrica C 20-2 C. liberica var. dewevrei Abeokutae Coleção de espécies C 5 Coleção de espécies C 6 Coleção de espécies C 15 var. dewevrei Excelsa Coleção de espécies C 3 Coleção de espécies C 10 Coleção de espécies C 11 liberica var. liberica Coleção de espécies C 7 Coleção de espécies C 8 Coleção de espécies C 9 var. liberica Passipagore Coleção de espécies IAC C. racemosa Coleção de espécies IAC Coleção de espécies IAC Coleção de espécies IAC C. salvatrix Coleção de espécies C 9 Coleção de espécies Mistura C. stenophylla Coleção de espécies C 2 Coleção de espécies C 3 Coleção de espécies C 4 Coleção de espécies C 10 26

28 Tabela 4- Descrição de híbridos e clones localizados em Campinas que foram utilizados nos experimentos. Germoplasma Lote Planta Arabusta EP 501 H IAC H7316 Lote 95 C339 Lote 95 C362 Lote 95 C364 Lote 95 C378 Robusta Clone 17 IAC 827 C259 Robusta Clone 17 IAC 827 C265 Robusta Clone 20 IAC 640 C Coleta e preparo das amostras Frutos maduros, no estágio cereja (CAMARGO & CAMARGO, 2001), foram coletados de cultivares de C. arabica em abril de 2007 e abril de 2008 e, de cultivares de C. canephora, em julho e agosto de Também foram coletados frutos maduros de várias espécies de Coffea pertencentes ao BAG-Café do IAC durante todo o ano de 2008, uma vez que o período entre a antese e a maturação completa dos frutos é bastante variável entre as espécies do gênero. Frutos maduros foram colhidos e secos pelo processo natural de secagem, ou seja, secos ao sol sem despolpamento, sendo posteriormente armazenados em sacos de papel. Para o preparo das amostras, os frutos, em coco, foram beneficiados. Aproximadamente 15g de sementes, por repetição, foram utilizadas para análises quantitativas e qualitativas de lipídios. 3.4 Extração e determinação do teor de cera A extração da cera foi realizada utilizando-se aparato de Butt (Figura 3). Cerca de 15g de sementes beneficiadas foram colocadas em cartuchos de papel de filtro, com 27

29 proteção de algodão em ambos os lados. Os cartuchos foram introduzidos em alongas de vidro e, estas, em balões de fundo chato contendo 50 ml de clorofórmio. Após acoplagem das alongas e dos balões aos condensadores do aparelho, o sistema foi induzido à fervura, sendo contados 30 minutos de refluxo (FOLSTAR et al.,1976). O solvente foi evaporado parcialmente e o resíduo contendo solvente juntamente com a cera, foi transferido para frascos âmbares. Figura 3- Aparato de Butt utilizado para extração de cera e de óleo. Os cartuchos foram retirados do aparato e postos para secar em estufa ventilada a 60ºC por 12 h, para evaporação completa do solvente. O teor de cera, em porcentagem e expresso em base seca, foi calculado pela diferença entre a massa da amostra determinada antes e após a extração. 3.5 Extração e determinação do teor de óleo Após a extração da cera, os cartuchos de papel contendo as amostras de grãos foram secos até peso constante. Os grãos secos foram moídos durante 6 minutos e novas amostras foram secas e pesadas visando à extração de óleo. Em aparato de Butt, utilizando-se 100 ml de éter de petróleo como solvente e procedendo-se da mesma forma descrita para extração de cera, as amostras foram mantidas em refluxo por 16 h 28

30 (AOCS, 1996). O teor de óleo dos grãos, em porcentagem, foi calculado pela diferença de massa da amostra moída e seca, antes e após a extração. Os frascos contendo as amostras de cera e de óleo foram armazenados sob refrigeração a 18 C negativos para posterior avaliação dos ácidos graxos e do fator de proteção solar (FPS). 3.6 Transesterificação do óleo A transesterificação do óleo foi realizada segundo método proposto por HARTMAN & LAGO (1973). Pesou-se aproximadamente 0,5 g de óleo de café dentro de um tubo de ensaio. Adicionou-se 12 ml de solução 0,5 N de hidróxido de sódio em metanol (20 g de NaOH para 1 L de metanol). Fechou-se o tubo de ensaio e aqueceu-se este em banho-maria (85º C) agitandose ocasionalmente até dissolver os glóbulos de gordura e a solução tornar-se transparente (5 a 10 minutos). Esfriou-se o tubo de ensaio em água corrente. Adicionou-se 15 ml de reagente esterificante (solução NH 4 - H 2 SO 4 metanol - 1:1,5:30). Fechou-se e agitou-se o tubo de ensaio. Mais uma vez, colocou-se o tubo em banho-maria por 5 a 10 min. E resfriou-se em água corrente após esse período. Adicionou-se 12 ml de solução saturada de NaCl e agitou-se por 30 segundos. Adicionou-se então 3 ml de hexano e agitou-se por 30 segundos. Deixou-se em repouso e coletou-se o sobrenadante para ser injetado em cromatógrafo. 3.7 Identificação dos ácidos graxos Para a determinação da composição em ácidos graxos foi utilizado um cromatógrafo gasoso Varian, modelo 3900, equipado com amostrador automático; injetor split, razão 75:1; coluna capilar Chrompack CP-SIL 88 (100 m x 0,25 mm d. i., 0,20 μm de filme); detector por ionização em chama (FID) e uma estação de trabalho com aplicativo STAR. 29

31 As condições cromatográficas foram: temperatura da coluna programada com temperatura inicial 120ºC/ 5min, aquecimento de 120 a 220ºC (3ºC min -1 ) e de 220 a 235ºC (1ºC/ min), permanecendo na temperatura de 235ºC por 12 min; o gás de arraste utilizado foi nitrogênio numa vazão de 1 ml min -1 ; o gás make-up foi hidrogênio a 30 ml min -1 ; a temperatura do injetor foi 270ºC; a temperatura do detector foi 300ºC e o volume de injeção 1μl. A identificação dos ácidos graxos foi realizada por meio da comparação do tempo de retenção dos ácidos graxos das amostras e padrões. Foram utilizados um total de 37 padrões de ácidos graxos saturados, monoinsaturados e poiliinsaturados (Supelco 37 Component FAME Mix U). A quantificação dos ácidos graxos foi realizada por normalização de área e os resultados expressos em g 100g -1 de amostra. 3.8 Matéria insaponificável A matéria insaponificável foi extraída do óleo de café e quantificada via titulação utilizando-se adaptação do método Ca 6B-53 da AOCS (AOCS, 1998) Separação da matéria insaponificável Amostra de 2 a 2,5 g de óleo de café foi adicionada a balão de 125 ml previamente pesado. Foram adicionados 25 ml de álcool etílico 95% e 1,5 ml de solução aquosa de KOH 50 % ao balão contendo óleo. O mesmo foi encaixado no extrator de Butt e, a partir do início do gotejamento, esperou-se 30 minutos de refluxo. O conteúdo do balão depois de frio foi transferido para um funil de separação. Lavou-se o balão com 50 ml de água destilada e adicionou-se ao funil de separação. Lavou-se novamente o balão, mas desta vez com 50 ml de éter etílico e novamente adicionou-se ao funil. Tampou-se o funil e agitou-se vigorosamente durante pelo menos um minuto esperando-se a separação das fases por cerca de cinco minutos. A fase inferior foi retirada e transferida para outro funil de separação, sendo esta operação repetida três vezes. Descartou-se então a fase inferior. 30

32 No primeiro funil de separação (3 porções superiores = 150 ml) foram adicionados 20 ml de água destilada e 20 ml de solução aquosa de KOH 0,5N. Tampou-se o funil e agitou-se vigorosamente durante pelo menos 1 minuto, esperando-se a separação das fases (cerca de 5 minutos). A fração inferior foi retirada e descartada. Esta operação foi repetida por 3 vezes. Adicionou-se 20 ml de água destilada, esperou-se a separação das fases e descartou-se a fase inferior. Esta operação foi repetida por cinco vezes. Transferiu-se a fase superior para o mesmo balão de 125 ml já lavado e seco. Colocou-se em estufa até secagem completa do solvente (massa A). Para quantificar a matéria insaponificável, foram adicionados 2 ml de éter etílico e 10 ml de solução alcoólica de fenolftaleína ao balão contendo a matéria insaponificável. Titulou-se o conteúdo do balão com a solução de NaOH 0,02N até a mudança de cor do amarelo para laranja. O peso do resíduo foi corrigido pelo conteúdo de ácidos graxos livres usando a seguinte equação: Equação 2: (massa B) Quantificação do branco Para utilização da equação 3 foi necessário quantificar o branco. Para isto, titulou-se uma solução contendo somente 2 ml de éter etílico e 10 ml de solução alcoólica de fenolftaleína e corrigiu-se a massa do resíduo pelo conteúdo de ácidos graxos livres usando a equação 2 (massa C) Quantificação da matéria insaponificável Calculou-se o teor de matéria insaponificável através da seguinte equação: Equação 3: Onde, A = massa do resíduo em gramas 31

33 B = massa de ácido graxo em gramas C = massa do branco em gramas 3.9 Avaliação do fator de proteção solar por espectrofotometria ultravioleta Para determinar o FPS dos óleos extraídos, alíquotas de óleo foram dissolvidas em éter etílico na concentração de 0,2 μl ml -1. Os valores de FPS das soluções oleosas foram determinados utilizando-se a metodologia in vitro desenvolvida por MANSUR et al. (1986), empregando-se a fórmula matemática descrita abaixo, que se baseia nas propriedades absortivas ou refletoras dos compostos com atividade de proteção solar. Equação 4: Onde, FC = fator de correção (=10) determinado de acordo com dois protetores solares de FPS conhecidos; EE = efeito eritemogênico da radiação de comprimento de onda λ; I(λ) = intensidade do sol no comprimento de onda λ; Abs(λ) = absorbância da solução no comprimento de onda λ. Segundo essa mesma fórmula, as leituras de absorbância obtidas para os comprimentos de onda de 290 a 320 nm, em espectrofotômetro da marca Shimadzu modelo U2000, foram multiplicadas de acordo com a tabela 5. Após a multiplicação, os valores foram somados e a soma multiplicada por

34 Tabela 5- Comprimentos de onda e respectivos fatores de multiplicação para cálculo do FPS. Comprimento de onda (nm) Fator de multiplicação 290 0, , , , , , , Determinação do potencial antioxidante O potencial antioxidante de duas amostras de óleo extraído com éter de petróleo e com prensa mecânica obtidas dos mesmos grãos de café, foi determinado por método que utiliza a atividade antioxidante do radical 2,2-diphenil-1-picrilhidrazil (DPPH) (SCHERER & GODOY, 2009). Alíquota 0,1 ml de solução metanólica contendo diferentes concentrações de óleo foi adicionada a 3,9 ml de solução metanólica de DPPH. Três soluções de DPPH nas concentrações 0,2000, 0,1242 e 0,0800 mm foram testadas, sendo preparadas dissolvendo-se 39,4, 24,5 ou 15,8 mg da substância em 500 ml de metanol, respectivamente. O branco, ou tratamento controle, foi obtido pela adição 0,1 ml de metanol a 3,9 ml de DPPH. Após 60 minutos de incubação no escuro e em temperatura ambiente, foi medida a absorbância a 517 nm. A atividade do radical foi calculada pela seguinte equação (Equação 5): Equação 5: Onde Abs 0 = absorbância do branco Abs 1 = absorbância na presença da amostra em diferentes concentrações. A atividade antioxidante foi expressa em índice de atividade antioxidante (IAA), calculado pela seguinte equação (Equação 6): 33