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2 EM MAIO DE 1997 PLANTAMOS AMOS A PRIMEIRA SEMENTE DE BIOTECNOL TECNOLOGIA OGIA NA IMPRENSA BRASILEIRA 2 - Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento ano IX - nº 36 - janeiro/junho 2006

3 AGORA VOCÊ PODE COLHER OS FRUTOS KL3 Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento ano IX - nº 36 - janeiro/junho

4 ENTREVISTA ENTREVISTA Células-tronco Entrevista concedida a Edmilson Silva A pesquisa de células-tronco no Brasil Nós ainda não conhecemos nem a pequena parte da biologia de células-tronco e as suas capacidades são provavelmente muito maiores do que atualmente estimadas. Esta constatação, praticamente uma década depois de os primeiros estudos sobre o assunto serem publicados na prestigiosa revista Science, é feita pelo cientista Radovan Borojevic, professor Titular da UFRJ (Universidade Federal do Rio de Janeiro) e Chefe do Laboratório de Biologia Celular e Molecular do Departamento de Histologia e Embriologia do ICB (Instituto de Ciências Biomédicas) da UFRJ. Integrante do primeiro grupo de pesquisadores, em todo o mundo, e com sucesso, em 2001, a utilizar células-tronco para tratamento de pacientes brasileiros portadores de insuficiência cardíaca em estado avançado, Borojevic prevê nesta entrevista para a Biotecnologia, Ciência & Desenvolvimento, que a Medicina Regenerativa significará uma redução nos gastos com a Medicina tradicional, com ganhos para os pacientes do Sistema Único de Saúde (SUS), e também para os usuários dos planos de saúde, uma vez que estes também vão aderir às terapias celulares. Contrário à utilização de célulastronco embrionárias, Borojevic co- Radovan Borojevic Universidade Federal do Rio de Janeiro - UFRJ 4 - Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento ano IX - nº 36 - janeiro/junho 2006

5 memora sucessos como o de um grupo de cientistas coordenados por Nico Ferraz e Colin McGuckin, da Universidade de Newscastle, da Inglaterra, que acabam de conseguir criar, em laboratório, células do fígado e lista as doenças contra as quais a Medicina Regenerativa vem obtendo êxito, tais como na área da reparação de danos estéticos. Este pesquisador, entretanto, é categórico quanto à expectativa de que a terapia celular possa evitar o envelhecimento, sonho de muitos nessa época de culto desmedido ao corpo. Para ele, a Medicina Regenerativa é capaz de aliviar os efeitos da degeneração tecidual, garantindo a qualidade de vida, diminuindo o sofrimento, ao dar qualidade funcional e estética do corpo, gerando tranqüilidade e felicidade às pessoas que já conheceram a vida e devem aproveitar da sabedoria acumulada ao longo dos anos. Borojevic descarta a possibilidade de, dentro de meio século, as células-tronco venham a estar disponíveis em farmácias, visto que estas são sempre retiradas da medula do próprio paciente não custa reiterar que ele é contrário à utilização das células de embriões e defende a necessidade de avanço dos conhecimentos básicos e tecnológicos para melhor conhecimento desse novo manancial terapêutico. De nacionalidade francesa, mas naturalizado brasileiro, Borojevic é biólogo pela Faculdade de Ciências de Zagreb, Croácia, com mestrado na Faculté de Sciences, Université de Strasbourg, França, e doutorado em Ciências na Universidade de Paris, França. O pesquisador tem mais de 200 publicações entre livros e revistas científicas nacionais e estrangeiros. BC&D - As células-tronco já são usadas com sucesso, ainda que experimentalmente, para o tratamento de algumas doenças, principalmente as cardíacas e ortopédicas. Também se emprega para a regeneração do fígado de portadores de cirrose. Em termos de Terapia Celular, quanto ainda podemos avançar? Radovan Borojevic A Medicina Regenerativa está ainda no seu começo. Utilizam-se geralmente progenitores derivados de medula óssea, não purificados, mal caracterizados nem expandidos. Os fatores de crescimento envolvidos e as matrizes tridimensionais necessárias para Cálculos realizados recentemente no nosso grupo mostram que o maior beneficiário de terapias celulares será o SUS (Sistema Único de Saúde) a organização espacial dos implantes são pouco conhecidos. Embora as injeções de células da medula óssea têm sido feitas em fígado de pacientes com doença hepática, nenhum benefício para o paciente foi relatado; o termo e o conceito de terapia não pode ser aplicado neste caso. Por isso, os melhores avanços foram obtidos em lesões que envolvem defeitos vasculares, tais como infarto, obstrução e degeneração vascular, já "A pesquisa justifica qualquer protocolo experimental, na medida que não causa mal desnecessário a um dos envolvidos. Sou contra o uso em terapia de humanos de construções celulares, para as quais a previsibilidade de destino a longo prazo é praticamente nula" que naturalmente as células da medula óssea participam na neoangiogênese, sempre quando existe uma deficiência de oxigenação tecidual. Avanços de conhecimentos básicos e tecnológicos são necessários, e felizmente, numerosos grupos no mundo trabalham atualmente nessa área. BC&D O que era tido como promissor com a utilização das célulastronco se confirmou na prática? O que se pode esperar do emprego delas no futuro? Radovan Borojevic Sim. As possibilidades de terapias celulares continuam crescendo, tanto em modelos relativamente simples de injeção direta de células-tronco em tecidos degenerados ou lesados, quanto em bioengenharia de tecidos e órgãos in vitro. Um bom exemplo nesta área é o sucesso recente de grupos de cientistas britânicos na construção de tecido hepático em laboratório. BC&D Uma das áreas cuja demanda não pára de crescer é a de estética. Quais são as perspectivas que as células-tronco proporcionam para o setor de embelezamento? Radovan Borojevic As terapias celulares podem vir a ter uma ampla área de atuação em cirurgia reparadora. Inclui-se aqui o reparo de defeitos estéticos (cicatrizes de acne, cicatrizes solares, rítides (enrugamento), envelhecimento cutâneo etc.). As possibilidades de atuação nessa área são muito amplas. BC& D As células-tronco poderão acabar com o envelhecimento? Radovan Borojevic Não. O envelhecimento é um processo natural da vida. Entretanto, as terapias celulares podem aliviar os efeitos da degeneração tecidual, garantindo a qualidade de vida, diminuição de sofrimento, qualidade funcional e estética do corpo, tranqüilidade e felicidade das pessoas que já conheceram a vida e devem poder aproveitar da sabedoria acumulada ao longo dos anos. BC&D Além do diabetes, qual é o potencial das células-tronco contra as doenças auto-imunes? Já se pode pensar ou tem algum grupo de pesquisa tentanto usar as células-tronco Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento ano IX - nº 36 - janeiro/junho

6 para tratar ou repor o sistema imunológico? Radovan Borojevic Várias doenças auto-imunes já podem receber terapia celular. Destacam-se resultados clínicos relevantes em esclerose múltipla, doença reumatóide juvenil, Doença de Crohn etc. Para algumas doenças auto-imunes, a terapia celular pode ser a primeira opção terapêutica. BC&D Um dos grandes temores relacionados ao uso das células-tronco é o do desenvolvimento dos tumores, os teratomas. O estado-daarte nesta área possibilita prever esse tipo de problema, à medida que a Medicina Regenerativa tende a se popularizar? Radovan Borojevic O aparecimento de teratomas acompanha as terapias experimentais usando as células-tronco embrionárias. A meu conhecimento, não há relatos do aparecimento de teratomas consecutivo ao uso de células-tronco autólogas de pacientes adultos, e esse perigo é atualmente considerado muito remoto. BC&D Até quando as células-tronco serão utilizadas como curingas histo e fisiológicamente? Radovan Borojevic Nós ainda não conhecemos nem a pequena parte da biologia de células-tronco e as suas capacidades são provavelmente muito maiores do que atualmente estimadas. BC&D Como anda a utlização de células-tronco para regeneração óssea? E na regeneração do tecido cerebral? Radovan Borojevic Para a regeneração óssea, os ensaios clínicos já estão sendo realizados no caso de necrose avascular da cabeça de fêmur, pela equipe de ortopedia da Universidade Federal da Bahia (UFBA), em Salvador, sob a direção do professor doutor, Gildásio C. Daltro, com resultados extremamente promissores. A traumato-ortopedia é um dos campos em que a medicina regenerativa está fazendo avanços rápidos, e várias aplicações clínicas já estão sendo planejadas. Em patologia do cérebro, avanços promissores foram obtidos no caso de acidente vascular cerebral (AVC), embora nesse caso a lesão primária seja vascular e não do tecido nervoso. Resultados também promissores Nós ainda não conhecemos nem a pequena parte da biologia de células-tronco e as suas capacidades são provavelmente muito maiores do que atualmente estimadas estão sendo obtidos em modelos experimentais de várias doenças degenerativas do tecido cerebral, e podemos prever avanços clínicos para os próximos anos. BC&D Atualmente, há cientistas falando em transdiferenciação celular. Em que aspectos se diferencia da chamada diferenciação celular? Radovan Borojevic Trata-se de uma questão semântica. Rigorosamente falando, a transdiferenciação é a transformação estrutural e funcional de uma célula diferenciada em outra. O termo diferenciação se aplica em geral à aquisição de estruturas e funções específicas em uma célula progenitora, pouco diferenciada. A transdiferenciação envolve geralmente a perda de um conjunto de características específicas, adquirindo a morfologia ou mesmo a função de uma célula progenitora. BC&D Além dos aspectos técnicos, é forçoso abordar a questão ética quando se trata da utilização das células-tronco. Em outros países, à propostas de fusão de células humanas com óvulos de animais, para que, do híbrido gerado, se possa utilizar as células embrionárias em estudos. Como avalia essa questão? Radovan Borojevic A pesquisa justifica qualquer protocolo experimental, na medida que não causa mal desnecessário a um dos envolvidos. Sou contra o uso em terapia de humanos de construções celulares, para as quais a previsibilidade de destino a longo prazo é praticamente nula. BC&D - Também em outros países há cientistas que pretendem usar os embriões para criar células-tronco com defeitos genéticos responsáveis por doenças neurológicas, visando a reprogramação dos tecidos adultos e o conseqüente tratamento de doenças degenerativas. Esse tipo de proposta é viável, é promissora? Radovan Borojevic O estado atual de conhecimentos não justifica este tipo de propostas BC&D Pode-se aventar que, futuramente, daqui a 50 anos por exemplo, será possível comprar célulastronco nas farmácias? Radovan Borojevic Não. As células-tronco são normalmente derivadas do próprio paciente e devem ser adaptadas às necessidades específicas de cada um dos pacientes. BC&D E do ponto de vista econômico, corre-se o risco de diferenciação de qualidade na Medicina Regenerativa, ou seja, ter uma medicina para os mais ricos e outrao menos requintada para as classes menos favorecidas? Radovan Borojevic Cálculos realizados recentemente no nosso grupo mostram que o maior beneficiário de terapias celulares será o SUS (Sistema Único de Saúde), pela diminuição de tempo de internação de pacientes, redução de pagamento de pensões e de indenizações por invalidez, e decréscimo global do custo social da Medicina. Em breve, tanto o SUS quanto os planos de saúde optarão pelas terapias celulares, sempre quando clinicamente possível. Biotecnologia Ciência Desenvolvimento ano IX - nº 36 - janeiro/junho Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento ano IX - nº 36 - janeiro/junho 2006

7 um mundo de informações ao seu alcance Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento ano IX - nº 36 - janeiro/junho

8 BIOTECNOLOGIA Ciência & Desenvolvimento KL3 Publicações Ltda Fundador Dr. Henrique da Silva Castro Direção Geral e Edição Ana Lúcia de Almeida Diagramação e design Luiz Dourado Bezerra Home-Page Projeto Gráfico KL3 Publicações Ltda SHIN CA 02 Bloco "C" Edifício Garden Place salas 225/226 Lago Norte - Brasília - DF Cep Tel.: (061) Fax: (061) Os artigos assinados são de inteira responsabilidade de seus autores. Colaboraram nesta edição Alexander de Andrade Ana Paula Schneider Lucion Andreas K. Gombert Antonio Figueira Carlos Alberto Labate Catarina Paula da Silva Ramos Dieter Rugard Siedemberger Edmilson Silva Elisângela Nedel Marasca Francisco Harrison de Brito Pereira Frederico Augusto Ribeiro de Barros Janaína de Cássia Albino João Batista de Almeida e Silva Larissa Canilha Lidia Mariana Fiuza Luciana Harumi Morimoto Figueiredo Maria Isabel de Oliveira Penteado Mariana Brayner Cavalcanti Mariana de Souza Castro Neiva Knaak Paola A. F. Celedón Patrícia Teles Medeiros Paulo César Stringheta Radovan Borojevic Raul Antônio Morais Melo Ricardo Bastos Cunha Silas Granato Villas-Bôas Silvana Creste Thiago Martins Sampaio de Lacerda Ubirajara Machado Teixeira Wagner Fontes Walter de Carvalho Washington Batista das Neves NOTA: Todas as edições da Revista Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento estão sendo indexadas para o AGRIS (International Information System for the Agricultural Sciences and Technology) da FAO e para a AGROBASE (Base de Dados da Agricultura Brasileira). ISSN Portal Biotecnologia -

9 Conselho Científico Dr. Aluízio Borém - Genética e Melhoramento Vegetal Dr. Henrique da Silva Castro - Saúde; Dr. Ivan Rud de Moraes - Saúde - Toxicologia; Dr. João de Deus Medeiros - Embriologia Vegetal; Dr. Naftale Katz - Saúde; Dr. Pedro Jurberg - Ciências; Dr. Sérgio Costa Oliveira - Imunologia e Vacinas; Dr. Vasco Ariston de Carvalho Azevedo - Genética de Microorganismos; Dr. William Gerson Matias - Toxicologia Ambiental. Conselho Brasileiro de Fitossanidade - Cobrafi Dr. Luís Carlos Bhering Nasser - Fitopatologia Fundação Dalmo Catauli Giacometti Dr. Eugen Silvano Gander - Engenharia Genética; Dr. José Manuel Cabral de Sousa Dias - Controle Biológico; Dra. Marisa de Goes - Recursos Genéticos Instituto de Pesquisas Energéticas e Nucleares - IPEN Dr. José Roberto Rogero Sociedade Brasileira de Biotecnologia - SBBiotec Dr. Luiz Antonio Barreto de Castr o - EMBRAPA Dr. Diógenes Santiago Santos - UFRGS Dr. José Luiz Lima Filho - UFPE Dra. Elba P. S. Bon - UFRJ ENTREVISTA Células-tronco no Brasil - Radovan Borojevic pág. 04 MEIO AMBIENTE Desenvolvimento sustentável pág. 70 PATENTE Patentes em Biotecnologia pág. 32 PESQUISA O proteoma da madeira pág. 10 Microencapsulamento de antocianinas pág. 18 Genes cry1ab e cry1ac de Bacillus thuringiensis pág. 26 Espectrometria de massa de proteínas pág. 40 Biocatalizadores imobilizados pág. 48 Análise do metaboloma pág. 58 Mapa de risco em laboratório clínico pág. 78 Mapeamento genético da cana-de-açúcar pág. 82

10 O Proteoma da PESQUISA MADEIRA O uso da proteômica no estudo da formação da madeira Alexander de Andrade Engenheiro Agrônomo Doutor em Genética e Melhoramento de Plantas Pesquisador, ESALQ, USP Paola A. F. Celedón Bióloga, Doutora em Genética e Melhoramento de Plantas, Pesquisadora, ESALQ, USP Carlos Alberto Labate Engenheiro Agrônomo Professor Dr. Departamento de Genética ESALQ, USP. Imagens cedidas pelos autores Introdução O setor florestal contribui de forma relevante para o desenvolvimento de vários países, em termos de geração de renda, tributos, empregos, divisas e na promoção do desenvolvimento regional. No Brasil o setor de base florestal oferece cerca de 3 milhões de empregos diretos e indiretos, participando com 4% do PIB nacional e 7,3% do total exportado (LEITE, 2005). A madeira é o quinto mais importante produto do comércio mundial (PLOMION et al., 2001). Além Figura 1 Tecidos que compõem a madeira. (A) Corte transversal do caule de Eucalyptus grandis; (B) Esquema dos tecidos que formam a madeira de ser uma formidável fonte natural e renovável de energia e fibras (papel e celulose), durante a sua formação ocorre uma grande incorporação de CO 2, contribuindo com a redução do aquecimento global (PLOMION et al., 2001). A expectativa de crescimento do consumo da madeira para a próxima década é de 20%, enquanto que a cobertura florestal natural mundial declina a uma média anual de 9,4 milhões de hectares (BOERJAN, 2005). Para atender a esta demanda e reduzir a pressão sobre as florestas nativas é necessária a obtenção de árvores mais produtivas, resistentes a fatores bióticos e abióticos e com madeira de alta qualidade, conforme a finalidade de seu uso. Dentro deste contexto, diferentes programas de pesquisa estão sendo desenvolvidos por instituições públicas e privadas, utilizando técnicas como o mapeamento genético, transgenia, genômica, transcrissoma e proteômica, aliadas ao melhoramento convencional, buscando compreender os mecanismos envolvidos com o desenvolvimento da madeira. A formação da madeira é um processo complexo que envolve muitos eventos biológicos os quais são coordenados por uma ampla variedade de fatores endógenos (fitohormônios), exógenos (fotoperíodo e temperatura) e pela interação entre ambos. O processo é dirigido pela expressão ordenada de numerosos genes estruturais e regulatórios (muitos dos quais ainda não conhecidos) envolvidos nos diferentes estádios de sua formação. A expressão destes genes é responsável pela formação dos dife Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento ano IX - nº 36 - janeiro/junho 2006

11 no caule que por diferenciação celular forma as células especializadas que compõem os tecidos vasculares (Figura 1) do xilema e do floema. O câmbio é uma excelente fonte de células para estudos, pois o tecido é rico em proteínas e ácidos nucléicos e ainda não é lignificado. A zona cambial já foi utilizada para identificar genes (SCHARADER et al., 2004) e mais recentemente proteínas consideradas importantes para a formação da madeira de Populus (VANDER-MIJNSBRUGGE et al., 2000), Pinus (GION et al., 2005) e Eucalyptus (ANDRADE, 2006; CELEDÓN, 2006; MEIRELES, 2006). Figura 2 Fluxo experimental usado pela proteômica na identificação de proteínas e genes envolvidos na formação da madeiras rentes tecidos que compõem as árvores. Apesar de sua importância o conhecimento das principais etapas envolvidas com a formação da madeira ainda está distante de ser completo. Com raras exceções, muito pouco é conhecido sobre os processos celulares, moleculares e bioquímicos responsáveis pelo seu desenvolvimento (PLOMION, 2001; CHAFFEY, 2002). A Biotecnologia e o desenvolvimento da madeira A análise molecular de espécies florestais apresenta dificuldades devido a aspectos de sua biologia como o longo ciclo de vida, falta de mutantes e de linhagens puras (DU et al., 2006). Mesmo assim grupos de pesquisa nacionais e internacionais têm dedicado esforços à compreensão dos mecanismos genéticos e moleculares envolvidos na formação da madeira em árvores. Por sua importância, principalmente para a indústria de papel e celulose, uma grande atenção vem sendo destinada à compreensão das vias metabólicas envolvidas na síntese da celulose e lignina (POKE et al., 2005), e na identificação dos vários genes envolvidos nesses processos. A descoberta de genes relacionados principalmente com a síntese destes dois polímeros abre novas perspectivas para a manipulação genética com a finalidade de alterar suas concentrações na madeira, tornado-a mais produtiva e atrativa para a indústria. Estudos com árvores transgênicas de álamo têm demonstrado que a alteração da expressão de genes relacionados com a rota metabólica da lignina pode alterar a sua composição e quantidade na madeira. A principal conseqüência da redução da quantidade e composição da lignina na madeira é a diminuição do uso de produtos químicos empregados durante o processo de sua extração na produção de papel e celulose, reduzindo custos e minimizando os impactos ambientais (BAUCHER et al., 2003). Dentre as tecnologias mais utilizadas no estudo do desenvolvimento da madeira estão os microarranjos de cdnas ou oligonucleotídeos, os quais têm identificado genes preferencialmente expressos em tecidos como xilema (HERTZBERG et al., 2001). Normalmente estes estudos têm utilizado como sistema modelo à comparação entre madeiras juvenil e adulta (EGERTSDOTTER et al., 2004) e submetidas a diferentes condições como a madeira normal e de tensão (PLOMION et al., 2003). Uma região considerada como uma importante fonte de informações é a zona cambial, formada por um tecido meristemático localizado A era Pós-Genômica Os dados gerados pelo sequenciamento do genoma, embora relevantes, são limitados, tornando necessária a integração com outras técnicas que permitam estudar tanto os processos de transcrição das informações contidas nos genes quanto os seus produtos; as proteínas. Esta constatação deu início a uma nova etapa na pesquisa biológica conhecida como Era Pós- Genômica, promovendo o desenvolvimento e o aperfeiçoamento de técnicas utilizadas no estudo de transcritos (transcrissoma), proteínas (proteômica) e metabólitos (metabolômica), todas integradas pela bioinformática (PALSSON, 2002; WECKWERTH et al., 2004). A proteômica tem ganhado destaque por complementar e ser complementada pelos dados gerados pela genômica e pela transcrissoma, representando uma ponte de ligação entre os genes e os seus produtos, as proteínas. Os recentes avanços na proteômica, como a introdução da espectrometria de massas para a análise de macromoléculas, unidos a técnicas analíticas bem conhecidas como a eletroforese bidimensional, eletroforese capilar e a cromatografia líquida e a gasosa, possibilitaram o estudo de processos fisiológicos complexos e dinâmicos (PATTERSON e AEBERSOLD, 2003), como a formação da madeira em árvores. Atual- Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento ano IX - nº 36 - janeiro/junho

12 mente a eletroforese bidimensional combinada com a espectrometria de massas (Figura 2) são as técnicas mais usadas na análise do proteoma de árvores. A proteômica permite conhecer o produto final de um gene, suas propriedades químicas e locais de atuação na célula, o que é impossível prever a partir de seqüências de DNA devido às etapas de processamento pós-transcricional e pós-traducional (glicosilação, fosforilação, acetilação, etc.) que modulam a atividade de uma proteína. Por outro lado, um produto gênico muitas vezes não atua isoladamente, estando com freqüência envolvido em interações com o produto de outros genes para a formação de complexos moleculares funcionais. Desta maneira, para os estudos de expressão gênica fazem-se necessárias estratégias que desvendem a regulação da funcionalidade das proteínas e sua influência no metabolismo da planta, permitindo esclarecer se a regulação de um determinado gene ocorre durante as etapas de transcrição ou tradução (VAN WIJK, 2001). O conhecimento do controle da expressão gênica está sendo complementado pela proteômica e abre a possibilidade de identificar novos genes alvos, os quais podem ser usados na manipulação genética de plantas (PANDEY e MANN, 2000; PIMENTA, 2003). Extração de proteínas da madeira A chave do sucesso na análise de qualquer proteoma está relacionada primeiramente com uma boa etapa de extração e purificação das proteínas do material analisado. A melhor preparação da amostra é aquela que utiliza um menor número possível de reagentes com a mínima manipulação. Além disso, deve extrair o maior número de proteínas com a mínima perda e modificação das moléculas durante o preparo da amostra, para evitar interferências nas etapas de separação e identificação (DUNN, 1993; GÖRG et al., 2004). Normalmente tecidos de plantas apresentam baixas concentrações de proteínas e são ricos em compostos que interagem com as proteínas durante a extração (como proteases, compostos fenólicos, pigmentos e carboidratos), interferindo e reduzindo a reprodutibilidade durante a análise (CARPENTIER et al., 2005). Em plantas lenhosas, estes compostos são ainda mais abundantes, especialmente em tecidos lignificados como a madeira (VÂLCU e SCHLINK 2006). Os compostos que interferem na extração e purificação das proteínas são específicos para cada espécie, tecido ou ainda o estádio de desenvolvimento, por isso existe a necessidade de otimizar o processo de acordo com a amostra analisada (GÖRG et al 2004). Além disso, fatores ambientais, como a seca, podem alterar as características de um tecido, necessitando de preparos adicionais durante a extração. Dentre os diferentes métodos de extração utilizados na análise do proteoma de plantas, a extração com TCA e acetona (DAMERVAL et al., 1986) é a mais difundida. O método possibilitou a obtenção de bons resultados na extração de proteínas da madeira em desenvolvimento e de tensão de Pinus pinaster (GION et al., 2005). Uma vantagem do método é a imediata precipitação das proteínas com simultânea inativação de compostos envolvidos em sua degradação, como as proteases (VÂLCU e SCHLINK, 2006). Outro método envolve a solubilização das proteínas com fenol misturado a uma fase aquosa e subseqüente precipitação com metanol e acetato de amônio (HURKMAN e TANAKA, 1986). Neste método de extração, os ácidos nucléicos e carboidratos solubilizam-se preferencialmente na fase aquosa, enquanto as proteínas permanecem no fenol, com a vantagem da proteólise ser minimizada na presença do solvente. Este método já foi utilizado para a extração de proteínas da casca e da madeira de álamo (VANDER- MIJNSBRUGGE et al., 2000), e de tecidos da madeira de Eucalyptus grandis em diferentes estádios do desenvolvimento (ANDRADE, 2006; CELEDÓN, 2006; MEIRELES, 2006). É uma estratégia bastante eficiente, porém deve ser usada com precaução devido à toxidez do fenol. O uso de detergentes como o SDS (sodium dodecyl sulfate) pode ser uma estratégia alternativa quando deseja-se favorecer o enriquecimento de proteínas citosólicas e de membrana. A comparação entre os três métodos de extração (Figura 3), com tecidos da zona cambial de árvores de 3 anos de eucalipto, demonstrou que diferentes grupos de proteínas foram favorecidos conforme a estratégia adotada. Separação das proteínas A principal estratégia usada pela proteômica durante a etapa de separação de proteínas é a eletroforese bidimensional (2D-PAGE). A técnica permite a separação, detecção e quantificação de milhares de proteínas simultaneamente presentes em uma amostra complexa, através da combinação da focalização isoelétrica e da eletroforese em gel de poliacrilamida desnaturante. A eletroforese bidimensional separa as proteínas pela sua carga (focalização isoelétrica ou IEF) na primeira dimensão e pelo seu peso molecular (SDS-PAGE) na segunda dimensão (Figura 4). Quando realizadas isoladamente, as técnicas de IEF e de SDS-PAGE permitem a separação de aproximadamente 100 proteínas de uma amostra heterogênea, porém, quando combinadas permitem a separação teórica de cerca de spots individuais. Na prática um gel de 2D-PAGE com alta resolução permite a visualização de aproximadamente 3000 proteínas dependendo da amostra e da sensibilidade da técnica de revelação, embora já tenham sido descritos géis com spots (KLOSE e KOBALZ, 1995). Nos últimos anos com o desenvolvimento de novas técnicas analíticas e com o aperfeiçoamento da preparação das amostras, a técnica 2D-PAGE sofreu uma evolução surpreendente, aumentando a sua resolução, sensibilidade e repetibilidade, tornando-se amplamente usada na separação e identificação de proteínas. Entretanto, existem ainda dificuldades associadas a esta técnica 12 - Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento ano IX - nº 36 - janeiro/junho 2006

13 Figura 3 Avaliação dos métodos de extração por eletroforese bidimensional das proteínas do caule de Eucalyptus grandis com 3 anos. Em (a) foi realizada extração com fenol, (b) extração com TCA e na (c) com SDS. A focalização foi realizada em um gradiente de ph linear de 4-7. Coloração com coomassie brilhante blue G250 como baixa resolução dos spots em algumas faixas de PM e pi, pouca sensibilidade para detecção de proteínas de baixa concentração e pequena representação de proteínas hidrofóbicas. Estas dificuldades técnicas vêm sendo superadas, com um maior número de repetições por tratamento (RUBINFELD et al., 2003), uso de sofisticados programas de imagem de géis (ROGER et al., 2003), seleção de faixas de ph estreitas as quais aumentam a resolução da amostra (GÖRG et al., 1999), enriquecimento de frações de proteínas baseado em características químicas (CORTHALS et al., 2000) e aplicação de protocolos específicos para recuperação de proteínas de baixa solubilidade (MÉCHIN et al., 2003). A eletroforese bidimensional é utilizada preferencialmente na comparação de proteomas em diferentes estádios fisiológicos ou de desenvolvimento, onde a observação de proteínas diferencialmente expressas, permite inferir o envolvimento dos genes correspondentes a cada estádio em questão. O uso da técnica na separação de proteínas da madeira de diferentes espécies como pinus, álamo e o eucalipto, tem revelado a presença de múltiplos spots de uma mesma proteína em géis bidimensionais (Figura 5). A presença de diferentes spots de uma mesma proteína pode indicar e auxiliar na compreensão de eventos como: Modificações pós-traducionais; Variações alélicas de um mesmo gene (isoformas); Figura 4 Etapas usadas na separação de proteínas por eletroforese bidimensional. (A) retirada do tecido, (B) extração e purificação das proteínas, (C) obtenção de um extrato livre de impurezas, (D) aplicação da amostra e da fita de acrilamida com gradiente de ph, (E) focalização isoelétrica, separação conforme seu ponto isoelétrico, (F) SDS-PAGE, separação pelo peso molecular, (G) gel 2D-PAGE da madeira de Eucalyptus grandis corado com coomassie brilhante blue Produtos de genes parálogos; Eventos provenientes do splicing alternativo. Em árvores de interesse florestal, a separação de proteínas por 2D- PAGE tem sido utilizada na comparação entre: proteínas da madeira e de tecidos fotossintetizantes em pinus (COSTA et al.,1999), na sazonalidade de proteínas durante o ano em diferentes tecidos de álamo (VANDER MIJNSBRUGGE et al., 2000), no estudo de madeira normal e de tensão (PLOMION et al, 2003), no estudo das proteínas da madeira de Pinus pinaster (GION et al., 2005) e de Eucalyptus grandis (Figura 6) em diferentes estádios do desenvolvimento (ANDRADE, 2006; CELEDON, 2006; MEIRELES, 2006). Identificação e sequenciamento de proteínas As principais técnicas usadas na identificação e sequenciamento de peptídeos e proteínas são a degradação de Edman e a espectrometria de massas (MS). Embora a degradação de Edman seja amplamente usada, tem como limitações: baixa sensibilidade e consome muito tempo (em média uma hora por aminoácido), sendo incompatível com proteínas que apresentam a região N-terminal bloqueada (PENG e GYGI, 2001). Atualmente a ultra-sensibilidade e resolução dos espectrômetros de massas têm desempenhado um importante papel na identificação de proteínas (Figura7), permitindo que mesmo aquelas presentes em baixíssimas concentrações possam ser analisadas e identificadas, com rapidez e robustez nas análises. O uso da espectrometria de massas por muito tempo ficou restrito a um pequeno número de moléculas capazes de resistir ao método de ionização e ao processo de análise que envolve a sua transferência para um sistema de alto vácuo e altas temperaturas, sendo um obstáculo no estudo de biomoléculas como as proteínas. No final dos anos 80, com o desenvolvimento de dois novos métodos de ionização branda (Figura 8) o MALDI (Matrix-Assisted Laser Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento ano IX - nº 36 - janeiro/junho

14 Figura 5 Exemplos de proteínas do caule de eucalipto encontradas em diferentes spots; (a) isoflavona redutase, (b) tubulina e (c) Figura 6 Padrão da expressão de proteínas do caule Eucalyptus grandis em diferentes idades, separadas por eletroforese bidimensional, (figura do gel de árvores de 6 anos retirado e modificado de MEIRELES, 2006) Figura 7 Etapas usadas na identificação e sequenciamento de proteínas. (A) O gel 2D-PAGE é escaneado, (B) análise do gel por programas de imagem, (C) proteínas de interesse são retiradas do gel, digeridas com tripsina e seqüenciadas por espectrometria de massas, (D) obtenção dos espectros de massa (E) através da análise e interpretação dos espectros de massas é encontrado a seqüência dos aminoácidos que compõem os peptídeos, (F) com a seqüência dos diferentes peptídeos é identificada a proteína Desorption Ionization) e o ESI (Electrospray Ionization), ocorreu uma revolução na análise de biomoléculas. Estas novas técnicas foram tão importantes que seus criadores, Koishi Tanaka (MALDI) e John Fenn (ESI) ganharam o Prêmio Nobel de Química em No início dos anos 90 as novas técnicas de ionização branda, associadas com o desenvolvimento de novos algoritmos computacionais, permitiram correlacionar dados obtidos de um espectro de massas de biomoléculas com seqüências existentes em bancos de dados. Este evento marcou a transformação da MS no estudo em larga escala e das técnicas usadas na genômica funcional (MANN e WILM, 1995; MANN et al., 2001). O sucesso dos métodos de ionização MALDI e ESI e o desenvolvimento de analisadores de massa em seqüência (tandem), levaram a um grande aumento na resolução e sensibilidade do método, tornando-o uma ferramenta obrigatória nas análises estruturais e químicas de peptídeos e proteínas. Os espectrômetros de massa atuais permitem selecionar uma só molécula ionizada, fragmentá-la (colisão com um gás inerte) e através da análise das massas dos fragmentos conhecer a estrutura da molécula original, permitindo determinar, por exemplo, a seqüência de aminoácidos de um peptídeo ou uma alteração química específica em algum resíduo de aminoácido (PIMENTA, 2003; PATTERSON e AEBERSOLD, 2003; STEEN e MANN, 2004). Diversos laboratórios têm adotado o uso do MALDI e do ESI em suas estratégias de identificação e sequenciamento de proteínas. Por usarem diferentes princípios de ionização e distintas limitações, o uso dos dois métodos tem levado a um maior número de moléculas identificadas, além de aumentar a rapidez e a confiabilidade das análises. Normalmente o MALDI-TOF-MS é usado primeiramente para determinar a massa da proteína e após a sua digestão com tripsina, seus peptídeos são separados, normalmente por cromatografia líquida acoplada diretamente no espectrômetro de massas (ESI-TOF- MS/MS) e seqüenciados (GIORGIANNI, 2003). Situação atual e perspectivas do proteoma da madeira Os trabalhos de proteoma en Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento ano IX - nº 36 - janeiro/junho 2006

15 Espectrômetro de massas Mistura de peptídeos Feixe de laser Coluna Detector Filtro de massa Aceleração por potencial elétrico Placa com a amostra e a matriz submetida a alta voltagem Descarga elétrica Matriz Capilar Analito Formação de um spray MS Figura 8 Fontes de ionização branda usada na proteômica. (A) Esquema do MALDI-MS. A matriz e a amostra são aplicadas em uma placa de metal (B) e, apüs a evaporação do solvente, as moléculas da amostra cristalizam com a matriz. Esses cristais são então bombardeados com um feixe de raio laser, ionizando as moléculas para serem detectadas pelo espectrômetro de massas. (C) Esquema do ESI-MS. A amostra é dissolvida em um solvente volátil e injetada por um tubo capilar metálico sobre o qual é aplicada uma voltagem (D); o resultado é um aerossol de analíto e solvente. A alta temperatura da fonte provoca a evaporação do solvente, produzindo íons protonados para a análise. volvendo a formação da madeira são recentes, porém têm demonstrado que entre diferentes espécies como o pinus e o eucalipto (Tabela 1) as proteínas mais expressas estão envolvidas no metabolismo de energia e em mecanismos de defesa. Além de mecanismos responsáveis pela síntese de celulose, hemicelulose e lignina, os compostos mais abundantes da madeira. O proteoma da madeira tem demonstrado também que existe uma grande similaridade entre as proteínas de angiospermas e gimnospermas (COSTA et al., 1999). A similaridade entre a abundância e homologia de proteínas de diferentes espécies indica a existência de metabolismos conservados relacionados direta ou indiretamente com a formação da madeira em distintos grupos taxonômicos. Possivelmente diferenças significativas poderão ser encontradas através da análise de proteínas de menor abundância, que devem incluir fatores de transcrição, envolvidos com o controle da expressão gênica. A mudança na expressão destes genes deve ser a grande responsável pela diferença observada entre as características da madeira de diferentes espécies. Tabela 1. Proteínas mais abundantes em ordem decrescente encontradas no proteoma do Eucaliptus grandi s e Pinus pinaster Eucalyptus grandis Pinus pinaster Proteína Função Proteína Função S adenosylmethionine Metabolismo de aminoácidos Ac tin Citoes quel eto Isoflavone reductase Metabolismo secundário Tubulin beta Citoes quel eto Actin Ci toes quel eto S adenosylmethionine synthase Metabolismo de aminoácidos HSP 70 K Da Resposta a estresse Tubul i n al pha Citoes quel eto CAffeic acid 3-O-methyltransferase Síntes e de li gnina HSP 70 KDa Respostas a estresse E nolase Energia Isoflavone reductase Metabolismo secundário ATP synthase beta chain Energia ATP synthase beta chain Energia Tubulin alpha Ci toes quel eto Caffeic acid 3-O-methyltransferase Síntes e de li gnina Tubulin beta Ci toes quel eto L-ascorbate peroxidase Energia Fructokinase Energia Regulação intracelular Regulação i ntracelul ar Triosephosphate isomerase Energia Glutamine synthase Metabolismo de nitrogênio Enolase Energia Phosphoglycerate kinase Energia UDP-glucose protein transglucosylase Energia UDP-glucose pyrophosphorilase Energia S-Adenosyl-L-homocysteine hidrolase Metabolismo de aminoácidos Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento ano IX - nº 36 - janeiro/junho

16 A técnica de separação empregada nestes trabalhos envolve a eletroforese bidimensional, a qual possui como limitação a separação de proteínas hidrofóbicas de membrana (RABILOUD et al., 1997), de baixa abundância, com peso molecular muito baixo (< 10KDa), bem como as de maior peso molecular (> 200 KDa) e as extremamente ácidas ou básicas (HARDER et al., 1999). A combinação de diferentes estratégias de separação no estudo do desenvolvimento e formação da madeira como a cromatografia líquida multidimensional e a eletroforese capilar, poderá isolar grupos de proteínas com menor representatividade nos géis bidimensionais, como fatores de regulação, e que podem ser responsáveis por controlar características de importância para o setor florestal. A disponibilidade dos dados gerados pelo sequenciamento do genoma de espécies com importância florestal como o eucalipto, pinus e o álamo irão aumentar a taxa de identificação de proteínas por espectrometria de massas. Além de esclarecer questões sobre as rotas metabólicas envolvidas em sua formação e as enzimas que atuam no processo, auxiliando no isolamento de genes estruturais e que regulam a formação da madeira (ZHONG et al., 2005) disponibilizando novas possibilidades para o melhoramento genético de árvores de interesse florestal. Referências ANDRADE, A. de. Sequenciamento, identificação e análise de proteínas do caule de mudas de Eucalyptus grandis Tese (Doutorado em Genética e Melhoramento de Plantas) Escola Superior de Agricultura Luiz de Queiroz, Universidade de São Paulo, Piracicaba, 120 p. BAUCHER, M.; HALPIN, C.; PETIT- CONIL, M.; BOERJAN, W. Lignin: genetic engeneering and impact on pulping. Critical reviews in biochemistry and molecular biology, Philadelphia, v. 38, p , BOERJAN, WOUT. Biotechnology and the domestication of forest trees. Current opinion in biotechnology, London, v.16, n.2, p , CARPENTIER, SC; WRITTERS, E.; LAUKENS, K.; DECKERS, P.; SWENNEN, R.; PANIS, B. Preparation of protein extracts from recalcitrant plant tissues: An evaluation of differente methods for two-dimensional gel electrophoresis analysis. Proteomics, Wiley v.5, p , CELEDÓN, P. A. F. Identificação de proteínas da região cambial de Eucalyptus grandis por eletroforese bidimensional e espectrometria de massas Tese (Doutorado em Genética e Melhoramento de Plantas) Escola Superior de Agricultura Luiz de Queiroz, Universidade de São Paulo, Piracicaba, 112 p. CHAFFEY, N.; CHOLEWA, E.; REGAN, S.; SUNDBERG, B. Secondary xylem development in Arabidopsis: a model for wood formation. Physiologia plantarum, Lund, v.114, n.4, p , apr, COSTA, P.; PIONNEAU, C.; BAUW, G.; DUBOS, C.; BAHRMANN, N.; KREMER, A.; FRIGERIO, J. M.; PLOMION, C. Separation and characterization of needle and xylem maritime pine proteins. Electrophoresis, Weinheim, v.20, p , DAMERVAL, C.; DE VIENNE, D.; ZIVY, M.; THIELLEMENT, H. Technical improvements in twodimensional electrophoresis increase the level of genetic variation detected in wheatseedling proteins. Electrophoresis, Weinheim, v.7, p.52-54, DU, J.; XIE, H. L.;ZHANG, D. Q.; HE, X. Q.; WANG, M. J.; LI, Y. Z.; CUI, K. M.; LU, M. Z. Regeneration of the secondary vascular system in poplar as a novel system to investigate gene expression by a proteomic approach. Proteomics, Weinheim, v.6, p , DUNN, M. J., Proteins. Oxfort: Clarendon Press, p. EGERTSDOTTER, U.; VAN ZYL L. M.; MACKAY, J.; PETER, G.; KIRST, M.; CLARK, C.; WHETTEN, R.; SEDEROFF, R. Gene expression during formation of earlywood and latewood in loblolly pine: expression profiles of 350 genes. Plant Physiology, Lancaster, v.6, p , FENN, J. B.; MANN, M.; MENG, C. K.; WONG, S. F.; WHITEHOUSE, C. M. Electrospray Ionization for Mass Spectrometry of Large Biomolecules. Science, Washington, v. 246, p , GION, J. M.; LALANNE, C.; LE PROVOST, G.; FERRY- DUMAZET, H.; PAIVA, J.; CHAUMEIL, P.; FRIGERIO, J. M.; BRACH, J.; BARRE, A.; DARUVAR, A.; CLAVEROL, S.; BONNEU, M.; SOMMERER, N.; NEGRONI, L.; PLOMION, C. The proteome of maritime pine wood forming tissue. Proteomics, Weinheim, v.5, p , GIORGIANNI, S. B. Proteoma analysis by two-dimensional gel electrophoresis and mass spectrometry: strengths and limitations. Trends in analytical chemistry, Amsterdam, v. 22, n. 5, p , GÖRG, A.; WEISS, W.; DUNN, M. J. Current two dimensional electrophoresis technology for proteomics. Proteomics, Weinheim, v.4, p , HARDER, A.; WILDGRUBER, R.; NAWROCKI, A.; FEY, S. J.; LARSEN, P. M.; GORG, A. Comparison of Yeast Cell Protein Solubilization Procedures for Two-Dimensional Electrophoresis. Electrophoresis, NewYork, v. 20, p , HERTZBERG, M.; ASPEBORG, H.; 16 - Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento ano IX - nº 36 - janeiro/junho 2006

17 SCHRADER, J.; ANDERSSON, A.; ERLANDSSON, R.; BLOMQVIST, K.; BHALERAO, R.; UHLEN, M.; TEERI, T. T.; LUNDEBERG, J.; SUNDBERG, B.; NILSSON, P.; SANDBERG, G. A transcriptional roadmap to wood formation. Proceeding of the National Academy of Sciences of the United States of America, Washington, v.98, n.25, p , Dec, HURKMAN, W. J.; TANAKA, C. K. Solubilization of plant membrane proteins for analysis by twodimensional gel electrophoresis. Plant Physiology, Lancaster, v.81, p , KLOSE, J.; KOBALZ, U. 2-Dimensional electrophoresis of proteins - an updated protocol and implications for a functional analysis of the genome. Electrophoresis, New York, v.6., n. 16, p , LEITE, N. B. Avanços da silvicultura brasileira são significativos. Visão Agrícola, Piracicaba, n. 5, p.12-18, jul-dez, MANN, M.; HENDRICKSON, R. C. A. Analysis of proteins and proteomes by mass spectrometry. Annual review of biochemistry, Palo Alto, v. 70, p , MANN, M.; WILM, M. Electrospray mass spectrometry for protein characterization. Trends in biochemical sciences, Amsterdam, v.6, p , MECHIN, V.; CONSOLI, L.; LE GUILLOUX, M.; DAMERVAL, C. An efficient solubilization buffer for plant proteins focused in immobilized ph gradients. Proteomics, New York, v.3, p , MEIRELES, K. G. X. Identificação de proteínas expressas na região cambial de Eucalyptus grandis por espectrometria de massas Tese (Doutorado em Genética e Melhoramento de Plantas). Escola Superior de Agricultura Luiz de Queiroz, Universidade de São Paulo, Piracicaba. 117 p. PALSSON, B. In silico biology through omics. Nature biotechnology, New York, v. 20, n. 7, p , PANDEY, A.; MANN, M. Proteomics to study genes and genomes. Nature, London, v. 405, p , PATTERSON, S.D.; AEBERSOLD, R. H. Proteomics: the first decade and beyond. Nature genetics, New York, v. 33, p , PENG, J.; GYGI, S. P. Proteomics: the move to mixtures. Journal of mass spectrometry, Chichester, v. 36, p , PIMENTA, A. M. C. Os desafios do proteoma. Ciência Hoje, v. 32, n. 192, p , PLOMION, C.; LEPROVOST, C.; STOKES, A. Wood formation in trees. Plant Physiology, Lancaster, v. 127, p , PLOMION, C.; PIONNEAU, C.; BAILLÈRES, H. Analysis of protein expression along the normal to tensin wood gradient in Eucalyptus gunnii. Holzforschung, Berlin, v.57, p , POKE, F. S.; VAILLANCOURT, R. E.; POTTS, B. M.; REID, J. B. Genomic research in Eucalyptus. Genetica, Dordrecht v. 125, , set, RABILOUD, T.; ADESSI, C.; GIRAUDEL, A.; LUNARDI, J.; Improvement of the Solubilization of Proteins in Two-Dimensional Electrophoresis with Immobilized ph Gradients. Electrophoresis, Weinheim, v. 18, p , ROGERS, M.; GRAHAM, J.; TONGE, R.P. Using statistical image models for objetive evaluation of spot detection in twodimensional gels. Proteomics, New York, v.3, p , RUBINFELD, A.; KEREN-LEHRER, T.; HADAS, G.; SMILANSKY, Z.. Hierarchical analysis of largescale two-dimensional gel electrophoresis experiments. Proteomics, New York, v.3, p , STEEN, H.; MANN, M. The ABC S (and XYZ S) of peptide sequencing. Nature reviews, London, v. 5, p , VANDER-MIJNSBRUGGE, K.; MEYERMANS, H.; VAN MONTAGU, M.; BAUW, G.; BOERJAN, W. Wood for-mation in poplar: identification, characterization and seasonal variation of xylem proteins. Planta, Berlin, v. 210: , VÂLCU, C. M.; SCHLINK, K. Reduction of proteins during sample preparation and twodimensional gel electrophoresis of woody plant samples. Proteomics, Wiley, v.6, p , VAN WIJK, K.J. Challenges and Prospects of Plant Proteomics. Plant Physiology, Lancaster, v.126, n.2, p , WECKWERTH, W.; LOUREIRO, M. E.; WENZEL, K.; FIEHN, O. Differential metabolic networks unravel the effects of silent plant phenotypes. Proceeding of the National Academy of Sciences of the United States of America, Washington, v.101, n. 20, p , ZHONG, R.; PENA, M. J.; ZHOU, G. K.; NAIRN, C. J.; WOOD-JONES, A.; RICHARDSON, E. A.; MORRISON, W. H.; DARVILL, A. G.; YORK, W. S.; YE, Z. H. Arabidopsis fragile fiber8, which encodes a putative glucuronyltransferase, is essential for normal secondary wall synthesis. The Plant Cell, Rockville, v. 17, p , Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento ano IX - nº 36 - janeiro/junho

18 PESQUISA Microencapsulamento de ANTOCIANINAS Uma alternativa para o aumento de sua aplicabilidade como ingrediente alimentício Frederico Augusto Ribeiro de Barros Mestrando em Food Engineering, Biological & Agricultural Engineering department Texas A&M University - Texas-USA. Paulo César Stringheta Professor doutor, Titular do Depto de Tecnologia de Alimentos Universidade Federal de Viçosa Imagens cedidas pelos autores 1. Introdução É fato conhecido que a cor é um atributo que influencia de forma decisiva na preferência do consumidor ao adquirir determinado alimento. Geralmente, afeta o julgamento, sendo utilizada como forte indicador de qualidade. Assim, o desenvolvimento de produtos de aparência atrativa é importante para a indústria de alimentos. Considerando que a manutenção da cor original no produto processado e armazenado é um fator de qualidade, a adição de corantes artificiais tornou-se prática usual e necessária, devido a sua maior estabilidade. Para os vários tipos de pigmentos naturais esta manutenção é, muitas vezes, difícil pelas possibilidades de transformação que estes podem sofrer. A utilização dos corantes naturais requer o conhecimento químico de suas moléculas para adaptá-las às condições de uso em processos, embalagens e distribuição (ARAÚJO, 1999). Recentemente, os corantes artificiais têm sido questionados por certos segmentos da população, e esta tendência, aliada à publicidade contínua e adversa, tem aumentado o interesse pelos corantes de origem natural. Assim, o uso de corantes naturais em produtos alimentícios é uma tendência atual, principalmente pelo seu forte apelo de marketing, em razão dos consumidores demandarem cada vez mais produtos naturais e que tragam benefícios para a saúde. As antocianinas são pigmentos naturais, hidrossolúveis, bastante conhecidos, pois determinam a coloração característica de uma grande variedade de vegetais, incluindo aqueles usados na alimentação humana. Estes pigmentos têm sido, portanto, consumidos pelo homem por incontáveis gerações sem causar aparentemente qualquer efeito sobre a saúde. Apesar disso, seu uso como aditivo natural está ainda bastante restrito em função de limitações, como a disponibilidade de matéria-prima produtora de pigmentos na quantidade e na qualidade requerida, a dificuldade na sua purificação, o poder corante reduzido quando comparado aos produtos sintéticos e, principalmente, a baixa estabilidade apresentada pelas antocianinas (STRINGHETA, 1991). O corante antocianina é encontrado em diversas fontes vegetais, sendo as principais: morango, uva, jabuticaba, cereja, berinjela e repolho roxo. As antocianinas são comercialmente usadas em soluções ácidas como em refrigerantes (ph entre 2,5 e 3,8, em que se apresentam na cor vermelha). São ainda usadas em doces, produtos de confeitaria, refrescos, pós para refrescos, coberturas de bolo, gelatinas e geléias. Para aplicação geral, o ph entre 1,0 e 3,5 confere maior estabilidade ao pigmento. Existem evidências indicando que as antocianinas, além de não serem tóxicas nem mutagênicas, apresentam propriedades terapêuticas benéficas, particularmente na oftalmologia e no tratamento de vários problemas de circulação sanguínea 18 - Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento ano IX - nº 36 - janeiro/junho 2006

19 Figura 1 Esquema das microcápsulas e microesferas respectivamente (JÚNIOR, 2005) (TIMBERLAKE, 1988). Microencapsulamento é um processo pelo qual minúsculas partículas de ingredientes ativos de gás, líquidos ou sólidos são empacotados dentro de um segundo material (RISCH & REINECCIUS, 1995). De modo geral, pode-se classificar o processo como: macro (> 5000 µm), micro ( µm) e nano (< 0.2 µm). Quanto à forma, as cápsulas são idealmente esféricas, embora seu formato seja influenciado pela estrutura original do ingrediente encapsulado (RISCH & REINECCIUS, 1995). Quanto à estrutura física, as micropartículas podem ser classificadas como microcápsulas ou microesferas. As microcápsulas consistem em micropartículas onde o núcleo está envolvido por uma camada ou filme polimérico formando um sistema do tipo reservatório. O material microencapsulado é chamado de núcleo ou fase interna, enquanto a fase externa é chamada de parede, revestimento ou membrana (JÚNIOR, 2005). As microesferas diferem das microcápsulas pelo fato de constituírem um sistema matricial, no qual o polímero forma uma rede tridimensional onde o material a ser microencapsulado pode estar adsorvido, incorporado ou ligado covalentemente à matriz polimérica, formando sistemas de dissolução, dispersão ou sistemas porosos (JÚNIOR, 2005). O material polimérico é selecionado de acordo com as propriedades físico-químicas do compostos a ser microencapsulado, processo de produção, aplicação e via de administração (FINCH, 1990). A finalidade básica da microencapsulação na indústria de alimentos é proteger os ingredientes encapsulados contra oxidação química ou de fatores do ambiente como no caso de algumas vitaminas, polipeptídeos, pigmentos e compostos bioativos como a luteína e o licopeno. Também tem como objetivo o retardamento da evaporação de núcleos voláteis como alguns óleos essenciais. Em algumas técnicas, a cápsula pode ser também projetada para liberar lentamente o produto com o passar do tempo ou até que determinada condição físico-química seja alcançada (THIES, 1994). Os métodos de microencapsulamento podem ser classificados em métodos físico-químicos como coacervação e técnicas envolvendo emulsificação; métodos químicos como a polimerização interfacial e gelificação; e métodos mecânicos como revestimento em turbinas, suspensão no ar ou leito fluidizado, centrifugação em multiorifício e secagem por atomização spray drying (OLIVEI- RA et al, 1992). Tradicionalmente, o método mais comum de encapsulação de ingredientes alimentícios é o spray drying. Spray drying é ainda a técnica de encapsulamento mais econômica e tem vasto uso na indústria Figura 2 Molécula de β-ciclodextrina (DZIEZAK, 1988) Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento ano IX - nº 36 - janeiro/junho

20 Quadro 1. Formulações utilizadas Designação MD de aromas. Existe a disponibilidade de equipamentos e seu custo de produção é baixo quando comparado com a maioria dos outros métodos (CONSTANT, 1999). O primeiro passo para efetuar tal processo é selecionar o agente encapsulante adequado. O encapsulante ideal deve ter propriedades emulsificantes, ser capaz de formar filmes, ser biodegradável, resistente ao trato gastrintestinal, ter baixa viscosidade a altos níveis de sólidos, exibir baixa higroscopicidade e ser de baixo custo. Goma arábica, amidos modificados e amidos hidrolisados são os agentes encapsulantes mais freqüentemente usados no Spray drying (CONSTANT, 1999). Uma vez escolhido o agente encapsulante, este deve ser hidratado. A encapsulação conduzida em um Spray drying envolve três etapas básicas: a primeira, relativa à preparação da dispersão ou emulsão a ser processada; a segunda, homogeneização da dispersão; e, finalmente, a atomização da massa dentro da câmara de secagem (RISCH & REINECCIUS, 1995). Como exemplo, a β-ciclodextrina é um polímero cíclico de glicose, obtido pela degradação controlada do amido por enzimas específicas e contém 7 unidades de glicose unidas em α-1,4. Essa molécula apresenta a particularidade de possuir uma estrutura fracamente polar no interior do anel e polar no lado externo, conseqüentemente em solução aquosa, as moléculas de água no interior do anel são facilmente substituídas por moléculas apolares, ou de polaridade menor que a da água, formando estruturas que são energeticamente mais estáveis, podendo ser isoladas por cristalização ou secagem (BOBBIO, 1995). Dificilmente um agente encapsulante apresenta isoladamente todas as propriedades citadas, assim, na prática, é comum empregar misturas de dois ou mais components (CONSTANT, 1999). Ao contrário de outros métodos de microencapsulamento, a técnica de secagem por atomização é rápida e de única etapa, conveniente, possui flexibilidade de uso em alta escala, envolve condições brandas e é pouco influenciada pelos parâmetros de solubilidade da fase interna e do polímero (JÚNIOR, 2005). 2. Metodologia As antocianinas foram extraídas com etanol a partir de inflorescências de capim gordura (Melinis minutiflora) colhidos em Viçosa, MG. O ph foi corrigido para 2,0 com solução de HCl. O extrato foi filtrado em papel Whatman nº 1, em funil de Buchner e a remoção da clorofila foi realizada mediante solução de éter etílico:éter de petróleo na proporção de 1:1, utilizando um funil de separação. O extrato assim obtido foi concentrado sob vácuo na temperatura de 45 ºC, até a solução apresentar-se viscosa. Posteriormente, o extrato foi armazenado sob atmosfera de nitrogênio ao abrigo da luz à temperatura de 4 ºC. Utilizou-se polissacarídeos como agentes encapsulantes. Os encapsulantes testados foram soluções de maltodextrina e goma-arábica em uma concentração de 30%; solução de β-ciclodextrina com uma concentração de 10%. E as soluções de capsul e flomax foram testadas em concentrações de 20%. Mistura destes encapsulantes também foram testadas. As formulações empregadas estão descritas no quadro 1. Na maior parte das formulações foi usado um teor de sólidos de 30%, de acordo FORMULAÇÕES Concentração dos encapsulantes 30% Maltodextrina GMD 25% Maltodextri na, 5% Goma-arábica Beta 10% de β-ciclodextrina fl omd 25% Maltodextri na, 5% Flomax Relação corante/encapsulante (m/m) 1:4 1:4 1:4 1:4 com sugestão de literatura (RISCH & REINECCIUS, 1995). As amostras foram levadas ao secador tipo spray dryer (modelo BUCHI mini spray dryer B-191) onde se procedeu a atomização. As condições de secagem foram: vácuo (30mbar); temperatura do ar de entrada (180 ºC); temperatura do ar de saída (65 ± 5)ºC; e pressão manométrica positiva. A quantidade de solução atomizada para cada amostra foi em média de 120 ml, e o tempo de secagem variou de 15 a 20 minutos. Após a etapa anterior, o produto recolhido na forma de pó foi acondicionado em embalagens de vidro âmbar e armazenado sob refrigeração em torno de 0ºC. A figura 3 mostra o fluxograma do processo de obtenção das microesferas utilizadas no presente trabalho. Estudo da Estabilidade: Uma fração do pó foi diluída em tampão HCl/KCl para os testes em ph 2,0 e citrato/fosfato para ph 3,0 e 4,0. O extrato líquido foi utilizado como controle nos testes de estabilidade. Em cada ph foram diluídas quantidades de corante suficientes para a obtenção de absorbância inicial entre 0,6 e 0,8 no comprimento de máxima absorção. No teste de estabilidade à luz, as soluções de antocianinas a ph 2, 3 e 4 foram acondicionadas em frascos de vidros hermeticamente fechados. Uma parte das amostras foi colocada em um suporte em fila dupla, 20 - Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento ano IX - nº 36 - janeiro/junho 2006

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