AVALIAÇÃO POR MEIO DE MEV DA REGIÃO PERIIMPLANTAR APÓS IRRADIAÇÃO COM LASER DIODO, INFRAVERMELHO

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1 130 AVALIAÇÃO POR MEIO DE MEV DA REGIÃO PERIIMPLANTAR APÓS IRRADIAÇÃO COM LASER DIODO, INFRAVERMELHO (λ= 830ŋm), EM IMPLANTES DE TITÂNIO SITUADOS EM TÍBIA DE RATO * SCANNING ELECTRON MICROSCOPY (SEM) AVALIATION OF THE PERIMPLANTAR REGION AFTER IRRADIATION WITH LOW INTENSITY LASER (830ŋm) IN IMPLANT INTERFACE OF RATTUS TIBIA JOSÉ LUIZ BERNARDON PRETTO ** ROGÉRIO MIRANDA PAGNONCELLI *** * Tese apresentada como parte dos requisitos obrigatórios para obtenção do título de Mestre em Odontologia, área de concentração em Cirurgia e Traumatologia Bucomaxilofacial (avaliada e aprovada pela Comissão Científica e de Ética da Faculdade de Odontologia da PUCRS protocolo nº. 0029/03), pela Faculdade de Odontologia da Pontifícia Universidade Católica do Rio Grande do Sul. ** Mestre aprovado no concurso e autor da dissertação. *** Professor Doutor de Cirurgia da PUC-RS e orientador da Dissertação.

2 131 RESUMO Este trabalhou avaliou, através da microscopia eletrônica de varredura (MEV), a neoformação óssea ao longo da interface tecido ósseo implante submetidos ou não a irradiação com laser de baixa intensidade, com comprimento de onda de 830 ŋm, de forma pulsada (35 pps), com potência de 100 mw. Para tal foram utilizados dezoito ratos machos, pesando entre 250 e 350 gramas da espécie Rattus novergicus, ordem Rodentia, linhagem Wistar, distribuídos aleatoriamente em seis grupos. Os implantes de titânio apresentavam 1,8 x 3,6 mm, superfície lisa e foram usinados especialmente para a inserção na tíbia deste modelo animal. Os grupos experimentais foram submetidos à laserterapia em quatro locais previamente estabelecidos: dois laterais e dois longitudinais. O grupo I recebeu 336 J/cm² e os grupos III e V totalizaram 672 J/cm², sendo os grupos II, IV e VI os controles respectivamente. Os intervalos de irradiação consistiram de 48 horas, iniciando imediatamente após a cirurgia de colocação dos implantes. Os grupos foram observados em sete dias (grupos I e II), 14 dias (grupos III e IV) e 21 dias (grupos V e VI). As peças foram processadas e observadas ao longo das interfaces tecido ósseo - implante em MEV, em SE com magnitude de 80x e 140x e BSE (backscaterred) em 80x. Através da metodologia empregada neste estudo, os resultados mostraram que os grupos I e III apresentaram diferenças qualitativas, em relação à formação óssea, em maior magnitude quando comparados aos seus respectivos controles. Enquanto o grupo V mostra uma pequena diferença em relação à maturação óssea quando confrontado com o seu controle. O laser de baixa intensidade, λ= 830ŋm, espectro infravermelho, neste modelo animal e com esta metodologia favorece a deposição da matriz e acelera a maturação óssea ao redor dos implantes de titânio. Sugerem-se novos estudos clínicos que comprovem a eficácia dessa terapia. ABSTRACT This research evaluated, by means of Scanning Electron Microscopy (SEM), the neoformation bone over bone tissue - implant interface submitted or not to irradiation with low intensity laser, with 830ŋm of wavelength, in a pulse form (35 pps), with 100 mw potency. Eighteen male rats from the species Rattus novergicus, order Rodentia, lineage Wistar were used, weighing from 250 to 350 grams, randomly divided into six groups. The titanium implants displayed 1.8 x 3.6 mm, smooth surface and were especially workable to be inserted in the animal s tibia. The experimental groups were submitted to laser therapy in four previously designated locations: two laterals and two longitudinal. Group I received 336 J/cm² and groups III and V totalized 672 J/cm², and II, IV and VI were respectively the control groups. The irradiation intervals consisted of 48 hours, starting immediately after the placing implant surgeries. The groups were observed in seven days (groups I and II), 14 days (groups III and IV) and 21 days (groups V and VI). The parts were processed and observed to the long one of the interfaces bone implant, in electron microscopy, in SE with 80 xs and 140x of magnitude and BSE (backscattered) in 80 xs. The results showed that groups I and III presented, in a bigger magnitude, qualitative differences referring to bone formation when compared with their respective control groups. While group V shows a minor difference relating to bone maturation when compared to its control. The low intensity laser, λ= 830ŋm, infrared specter, in this animal model and with this methodology, favors the matrix

3 132 deposition and accelerates the bone maturation around the titanium implants. New clinical researches that prove this therapy s efficiency are advised. Unitermos: Laser. Osseointegração. Remodelação Óssea. Implantes. Uniterms: Laser. Osseointegration. Remodeling Bone. Implants. INTRODUÇÃO A luz vem sendo utilizada para propiciar a cura desde os mais remotos tempos. Somente a partir das últimas décadas, especificamente em 1960, o LASER foi desenvolvido comercialmente. Essa palavra é um acrônimo de Light Amplification by Stimulation Emission of Radiation, ou Amplificação da Luz Estimulada de Radiação. O laser caracteriza-se por um sistema de seleção de comprimento de ondas que permite a obtenção de um feixe de luz concentrado, monocromático, paralelo e coerente. Além de possuir essas características próprias é uma forma de radiação não-ionizante que, em contato com os diferentes tecidos, resulta, de acordo com o tipo de Laser, em efeitos térmicos, fotoquímicos e lineares (BRUGNERA JÚNIOR; PINHEIRO; 1998; BRUGNERA JÚNIOR et al., 2003; SCHINDL et al., 2000). Os princípios que guiaram o seu desenvolvimento foram propostos em 1917 por Einstein, que descreveu o terceiro processo de integração da matéria, a emissão estimulada de radiação. A primeira aplicação, com sucesso, da emissão estimulada de microondas foi relatada por Gordon et al., (1955) (PINHEIRO; FRAME, 1992). Com o advento do primeiro equipamento de laser criado por Maiman (1960), utilizando o rubi como meio ativo, surgiu uma nova opção terapêutica na medicina. Na odontologia, a primeira aplicação foi realizada por Goldman (1965) (GARCIA et al., 2001). Os lasers são classificados de acordo com a sua ação terapêutica em cirúrgicos e não-cirúrgicos. Os cirúrgicos promovem corte nos tecidos através do efeito fototérmico e os não-cirúrgicos são considerados terapêuticos, tendo inúmeras nomenclaturas, como: soft laser, laser de baixa potência e laser terapêutico. Os efeitos do laser no processo de reparo ósseo foram estudados de forma intensa em vários modelos, como pós-exodontias, em movimentos ortodônticos, fraturas ósseas, osteotomias, com a intenção de buscar uma otimização do processo cicatricial, além de objetivar uma melhor analgesia e uma menor morbidade pós-operatória. Ainda não se conseguem estabelecer, de forma precisa, os efeitos dos raios laser na atividade celular, sendo essa uma das áreas de maior controvérsia. A biomodulação, através do laser, foi introduzida na Europa há mais de 20 anos. As pesquisas na então União Soviética, Hungria e Áustria utilizaram o laser de baixa potência, irradiando a pele para acelerar o processo de cicatrização da lesão. Nos Estados Unidos a FDA não regulamentou a laserterapia pela falta de comprovações da eficácia desse tratamento (CONLAN; RAPLEY; COBB, 1996). Atualmente nesse país, o laser de baixa potência possui autorização para a utilização dessa tecnologia somente em pesquisas. Efeitos bioestimulatórios foram reportados desde 1971 por Mester e colaboradores. Pode-se citar a proliferação de fibroblastos e transformação em

4 133 miofibroblastos, síntese de colágeno, o acréscimo e formação de novos capilares através da liberação de fatores de crescimento, a estimulação de DNA e síntese de RNA formados no núcleo das células, além de uma rápida regeneração nervosa. Em particular a estimulação da regeneração óssea é um dos focos das pesquisas atuais (SAITO; SHIMIZU, 1997; OZAWA et al., 1998; DÖRTBUDAK; HASS; MAILATH-POKORNY, 2000). A utilização de implantes osseointegrados para a reabilitação de pacientes total ou parcialmente edêntulos, vem se tornando rotina, com tratamentos cirúrgicos que garantem um bom prognóstico, minimizando o desconforto das funções estéticas, fonéticas e mastigatórias que são oferecidas pelas próteses convencionais. A relação tecido ósseo e a superfície do implante é o fator principal do sucesso nos tratamentos reabilitadores que necessitam de uma resposta natural de cicatrização do organismo. O implante bem sucedido é aquele em que há conexão direta entre o osso vivo e o titânio, podendo esse resistir a condições de carga (WORTHINGTON; LANG; LAVELLE, 1996). Não há uma camada direta de tecido fibroso envolvendo o implante, porque o implante está mais próximo de uma raiz dentária anquilosada do que de uma raiz normal. Esse fenômeno vem sendo estudado e discutido desde 1969 e foi denominado de Osseointegração em 1977 (BRÅNEMARK; TOLMAN; 1998). Desde então, o conceito desse termo vem se modificando, dependendo do ponto de vista e da escala de interesse científico. A soma do entendimento de cada núcleo, que vai desde o paciente até a análise microscópica do processo, é que vai fornecer a definição completa de osseointegração (BRÅNEMARK; BJORN; SKALAK, 1997). O avanço científico em relação à osseointegração, a utilização cada vez mais consagrada da implantodontia na clínica diária bem como a necessidade do sucesso dos tratamentos, fizeram com que a utilização da laserterapia na implantodontia fosse investigada. O uso do laser na implantodontia representa um avanço pelos seus efeitos positivos no processo de reparo do tecido ósseo. Porém é necessário que o usuário tenha conhecimentos adicionais aos da técnica cirúrgica, pois do contrário poderá resultar em uma resposta indetectável ou inexistente (BRUGNERA JÚNIOR et al., 2003). A literatura relacionada com a avaliação do efeito da laserterapia na biomodulação do tecido ósseo periimplantar ainda é escassa. Esse trabalho utilizou um laser diodo de GaAlAs, infravermelho, com λ = 830 ηm após colocação de implantes osseointegráveis em tíbias de ratos, tendo como objetivo observar as alterações relativas a neoformação óssea ao longo da interface, entre o implante e o tecido ósseo, através da microscopia eletrônica de varredura (MEV). REVISTA DA LITERATURA Gênese do tecido ósseo O tecido ósseo é um tecido mineralizado, de natureza conjuntiva, capaz de reparação quando lesado, sofre remodelação e cresce, demonstrando sua vitalidade. O processo pelo qual esse tecido é formado chama-se de ossificação ou osteogênese, podendo ser originado de duas formas: a ossificação intramembranosa,

5 134 atualmente também conhecida como endoconjuntiva e a ossificação endocondral (KATCHBURIAN; ARANA-CHAVES; 1999). As células responsáveis pela formação, destruição, remodelação e homeostase óssea são os osteoblastos, os osteoclastos e os osteócitos. Os osteoblastos provenientes de células osteoprogenitoras, encarregam-se da síntese dos compostos orgânicos da matriz óssea, inclusive do colágeno, das proteoglicanas e glicoproteínas. Os osteócitos são células ósseas maduras derivadas dos osteoblastos que residem em lacunas dentro da matriz, e secretam substâncias necessárias para a manutenção do osso. Os osteoclastos são células derivadas de progenitores granulócitos macrófagos e, desempenham o seu papel na reabsorção óssea (KATCHBURIAN; ARANA-CHAVES; 1999; GARTNER; HIATT; 2003). Os osteócitos, os osteoblastos e as células osteoprogenitoras estão incluídos nas células formadoras do osso. A geração e a estimulação dessas células são reguladas por citocinas e fatores de crescimento, como o fator de crescimento de fibroblastos (FGF), fator de crescimento derivado de plaquetas (PDGF), fator do crescimento semelhante à insulina e o fator de crescimento transformador ß (TGFß). As células osteoprogenitoras são células-tronco mesenquimais pluripotenciais localizadas nas vizinhanças de todas as superfícies ósseas; quando apropriadamente estimuladas, elas têm a capacidade de sofrer divisão celular e produzir uma prole que se diferencia em osteoblastos. Esse processo é vital para o crescimento, remodelagem e reparo do osso (COTRAN; KUMAR; COLLINS, 2000). Os osteoblastos são capazes de secretar proteínas, dentre elas pode-se citar o colágeno tipo I, proteínas de aderência celular (osteopontina, fibronectina), de ligação ao cálcio (osteonectina), envolvidas na mineralização (osteocalcina), enzimas (fosfatase alcalina), fatores de crescimento (IGF-1, TGF-ß, PDGF) e citocinas (prostaglandinas, IL-1 e IL-6) (COTRAN; KUMAR; COLLINS, 2000). O reparo desse tecido quer seja por fratura, quer seja pela colocação de implantes osseointegrados biologicamente, reagem semelhantemente. A modelagem anabólica da superfície óssea é a primeira a acontecer, formando um calo em pontes nas superfícies endóssea e perióstea (como ocorre na cicatrização das fraturas), originando-se em alguns milímetros da margem do local da implantação (MISCH, 2000). Os prováveis mediadores celulares incluem as citocinas inflamatórias (IL-1ß), os fatores de crescimento, os sinais de isquemia, a invasão vascular, as integrinas, as prostaciclinas, as protaglandinas e o oxido nítrico. As prostaglandinas são potentes agentes metabólicos e a administração sistêmica de prostaglandina E2 resulta numa resposta modeladora. Entretanto o mecanismo ainda não é claramente compreendido. As evidências sugerem que um importante fator mediador para a remodelação é a osteopontina (ROBERTS; HARTSFIELD JÚNIOR, 2004; ROBERTS et al., 2004). O processo da cicatrização óssea pode ser dividido em três eventos biológicos: a fase inflamatória, a reparativa e a fase remodeladora. A primeira etapa é caracterizada pela formação do coágulo, a segunda pela construção do calo ósseo e a terceira é a remodelação e a formação de um novo tecido ósseo de forma lamelar (COWIN, 2001). Os vasos sangüíneos são rompidos e uma hemorragia local preenche a zona da lesão, resultando na formação de um coágulo sangüíneo. Ao mesmo tempo plaquetas desgranuladas e células inflamatórias migratórias liberam PDGF, TGF-ß FGF e IL-1 e IL-6, os quais ativam as células osteoprogenitoras no periósteo e na

6 135 cavidade medular estimulando a atividade osteoclástica e osteoblástica. As primeiras células presentes são progenitoras pluripotentes chamadas de células tronco mesenquimais que possivelmente se originam do periósteo, do endósteo, da medula óssea, do endotélio vascular. As células osteoprogenitoras, que estão mais próximo da fratura e são supridas por uma rede de capilares, se diferenciam em osteoblastos e começam a secretar a matriz óssea, essa diferenciação aparenta ser ativada pelas BMPs. A neoformação óssea é produto tanto da ossificação intramembranosa como endocondral, pois as células osteoprogenitoras que se encontram no meio da massa em proliferação possuem um suprimento sangüíneo inadequado, transformando-se em condroblastos pela baixa tensão de oxigênio. Essas células produzirão cartilagem que acabará sendo substituída por osso primário formado pela ossificação endocondral, sendo que a intramembranosa é responsável pelo primeiro osso produzido junto ao tecido lesado. Durante o processo de remodelação o tecido ósseo primário é substituído pelo secundário reforçando ainda mais a zona de reparação de fratura (GARTNER; HIATT, 2003; COWIN, 2001; COTRAN; KUMAR; COLLINS, 2000; JUNQUEIRA; CARNEIRO; 1999). O processo da calcificação ainda não se conhece com certeza, apesar de se saber que ele é estimulado por alguns proteoglicanos e pela osteonectina. A teoria mais aceita baseia-se na presença de vesículas da matriz no osteóide (matriz óssea recém-formada ainda não calcificada), liberadas pelos osteoblastos. Com o aumento da concentração de íons de cálcio na vesícula da matriz, ocorre a cristalização e o cristal de hidroxiapatita em crescimento rompe a membrana, estourando a vesícula da matriz, liberando o conteúdo. A alta concentração de íons na vizinhança dos cristais de hidroxiapatita, juntamente com a presença de fatores de calcificação e proteínas ligantes de cálcio, promove a calcificação da matriz (GARTNER; HIATT; 2003; JUNQUEIRA; CARNEIRO; 1999). Osseointegração A relação de união entre o titânio e o tecido ósseo foi uma brilhante descoberta realizada por Per-Ingvar Brånemark quando observava a medula óssea de coelhos. Para capturar as imagens criou-se um dispositivo de titânio que foi instalado no tecido ósseo e ali permanecia para registrar a sua regeneração. No momento de sua remoção observou-se a adesão da estrutura de metal ao tecido ósseo. Desde então, inúmeras pesquisas se sucederam e definiram esse processo biológico como osseointegração (BRÅNEMARK et al., 1969; SCHOEREDER et al., 1976). A forma da interface implante-tecido ósseo foi descrita como sendo rígida, porém, há várias definições histológicas, não se chegando a um consenso e, as dificuldades em estabelecer apropriadamente o nível de resolução e, a proporção necessária do contato dessas estruturas com o osso criam um obstáculo para denominar o implante de implante osseointegrado (ALBREKTSSON; ZARB, 1993). A definição clínica e a opinião dos autores conceituam a osseointegração da seguinte forma: um processo que apresenta uma fixação rígida e clinicamente assintomática de materiais aloplásticos, realizada e sustentada no tecido ósseo durante as cargas funcionais. Podem-se descrever seis fatores que são definidos como parâmetros biológicos para o resultado final desse procedimento. A biocompatibilidade do material demonstrada pelo titânio puro em relação a outros metais, como ligas de cromo-cobalto, a vantagem da estabilidade dos implantes tipo parafuso quando comparados aos cilíndricos caracterizam o design dos implantes. O

7 136 tipo de superfície ainda requer maiores investigações in vivo. In vitro as superfícies tratadas artificialmente possuem vantagens. A técnica cirúrgica deve apresentar um planejamento prévio, buscando o controle do trauma a ser proporcionado. Outro aspecto de vital importância está relacionado ao sítio do hospedeiro, buscando avaliar a qualidade e a quantidade óssea, bem como as condições sistêmicas do paciente. Como último tópico, as condições de cargas impostas aos implantes farão a diferença na neoformação óssea, pois cargas prematuras favorecendo a sua movimentação terão como resposta um reparo constituído predominantemente por tecido mole. LEGERORS; CRAIG (1993) realizaram uma revisão bibliográfica enfatizando as respostas biológicas, biomecânicas e os biomateriais que influenciam na osseointegração. Descrevem que os implantes assumem dois tipos de integração com o tecido ósseo: uma indireta composta por uma camada fibrosa, denominada integração fibroóssea e a segunda com um contato direto entre implante e tecido ósseo descrito como osseointegração, originalmente referida como uma fixação biológica dos implantes de titânio. Ambas têm sido observadas em implantes funcionais, entretanto a falha e a perda desses tem sido atribuída à formação de tecido fibroso na interface osso-implante. Utilizando técnicas de análise com altas resoluções, tem-se observado e sugerido que uma camada de tecido fibroso interfira na interface, fornecendo então evidências de que freqüentemente uma porção orgânica ou não mineralizada faça parte desse processo. As reações celulares que caracterizam esse fenômeno supostamente são descritas como a adição de proteínas morfogenêticas. Estudos em cães relacionam a combinação de fatores de crescimento derivados de plaquetas, fatores de crescimento semelhantes ao da insulina e a aplicação de prostaglandina E1 localizada, com a provável promoção neoformação óssea local. BRÅNEMARK; BJORN; SKALAK (1997) afirmaram que a osseointegração é um modo permanente da incorporação de um componente nãobiológico no esqueleto humano, com a capacidade de suportar função, fixando elementos protéticos que irão substituir as estruturas perdidas. É definida como um fenômeno com uma conexão direta estrutural e funcional entre o osso vivo e a superfície de um implante com carga funcional. Mais tarde observou e considerou que a efetividade da osseointegração não permite um progresso no movimento entre o implante e o osso porque esses devem possuir um contato direto. WORTHINGTON (1996) teorizou que os tecidos biológicos como ossos e outros tecidos conjuntivos interagem com metais inorgânicos, provocando uma variedade de respostas. O titânio cria, espontaneamente, uma cobertura superficial forte de óxido de titânio, fornecendo uma interação cerâmica estável na qual uma matriz óssea mineralizada pode ser colocada. É dessa inércia biológica da superfície oxida que o implante consegue a importante propriedade de biocompatibilidade. O contato do tecido ósseo com o metal é o resultado de um processo de modelação e remodelação óssea, com a falta de uma resposta de reabsorção excessiva, formando um processo dinâmico de formação e reabsorção óssea. Embora os implantes osseointegrados pareçam estáveis, é importante lembrar que a resposta biológica à superfície oxida é dinâmica, estando em constantes mudanças. WATZEK (1996) relatou que o titânio forma, em contato com o ar, uma camada de óxidos em sua superfície. Essa camada consiste principalmente de óxido de titânio (TIO2). A reatividade do óxido puro é fundamental para a alta

8 137 tensão superficial e para a biocompatibilidade do metal, que poderá ser contaminado por gases presentes no ar, formando assim uma porção contaminada que estará presente na camada de óxidos. Pela sua biocompatibilidade o óxido de titânio pode ser considerado uma superfície altamente osteofílica, mostrando capacidade para formar uniões com biomoléculas quando não saturadas. De acordo com a revisão bibliográfica foi atribuído que para realizar considerações a respeito do fenômeno de osseointegracão in vivo, a composição da interface ainda não está bem definida em relação aos termos bioquímicos, mas as evidências histológicas sugerem que essa esteja enriquecida com proteoglicanas e glicoproteínas (MASUDA et al., 1998). A presença de osteopontina e α2hsglicoproteína demonstram claramente a contribuição da matriz protéica osteoblástica para a formação da interface. Existem três tipos de morfologia da matriz óssea que foram analisadas histologicamente, porque a interface não se caracteriza pela homogeniedade. Uma importante observação em relação à formação da interface osso-implante está relacionada com o processo de neovascularização. A formação de novos vasos sanguíneos ocorre da parte interna em direção à margem da superfície que recebeu o implante. A determinação da nova rede de capilares é importantíssima para a completa formação óssea após o procedimento cirúrgico, controlando, assim, uma reabsorção durante a regeneração. De fato, a neoformação do tecido duro pode ter uma significativa demora pelo ambiente inadequado promovido por uma neovascularização deficiente. Baseados nessas informações muitas características têm sido atribuídas à interface implante-tecido ósseo: concentração molecular, adesão celular, adesão da matriz mineral à superfície do implante, modulação da remodelação óssea mantendo a união do tecido ósseo com o titânio, controle da osteocondução e modulação da transferência do estresse transferido pela carga colocada sobre o implante. COOPER et al. (1998) em uma revisão demonstrando os métodos para a realização de culturas celulares com o intuito de investigar o fenômeno da osseointegração in vitro, demonstraram testes bioquímicos sensíveis para determinar os efeitos dos substratos dos osteoblastos na produção de fatores de crescimento associados com a osteogênese. Um importante aspecto da adesão do tecido ósseo ao implante é uma rápida formação da estrutura mineral logo após o procedimento cirúrgico. Esse processo requer um número suficiente de células e um alto nível de síntese dessas, para a produção das proteínas que irão atuar na formação da matriz mineralizada. Observaram a importante presença de osteoblastos produzindo matriz, osteocalcina e síntese de fosfatase alcalina. A expressão de colágeno, fibronectina e proteoglicanas mostram a notável especificidade da linhagem celular, além de altos níveis de íons de cálcio. Em termos de tempo de evolução a presença do colágeno pode ser observada três dias após o início da cultura, e a expressão de osteopontina ocorre durante a adesão das células na superfície. As investigações da proliferação celular, a síntese de proteínas, a análise da interface osso-implante permitem e suportam a interpretação das hipóteses para a evolução do processo de osseointegração nos seres humanos. A osseointegração pode ser separada em três etapas, sendo que a primeira está caracterizada pela migração celular osteogênica suportada pelo tecido de conexão. A segunda fase consiste na deposição de tecido ósseo através da mineralização da matriz e, a terceira é o remodelamento ósseo ao redor do metal (DAVIES, 1998).

9 138 CHAPPARD et al., (1999) realizaram uma pesquisa relacionada à biologia da remodelação óssea, enfatizando a resposta do tecido ósseo frente à colocação do implante. Utilizaram ovelhas como modelo experimental, avaliando os intervalos de três e seis meses. Obtiveram como resultado que a qualidade óssea ao redor dos implantes foi melhor aos seis meses, estando relacionada diretamente com o decorrer do tempo, otimizando a estabilidade do implante. Ainda afirmaram que pouco se sabe sobre a dinâmica da remodelação e, o tempo de evolução do nível de mineralização ao redor dos implantes. A estabilidade primária do implante é principalmente determinada por propriedades mecânicas do tecido ósseo, influenciada pela técnica cirúrgica, design do implante e, especialmente relacionado com a qualidade óssea (PALACCI, 2001). Após a cicatrização inicial, estimada em torno de quatro a dezesseis semanas, a estabilidade secundária é determinada pela resposta biológica relacionada ao trauma cirúrgico, as condições de cicatrização e a qualidade do material implantado, sendo que o final do reparo provavelmente esteja situado entre três e seis meses. Descreve as fases do reparo ósseo, salientando a igualdade de respostas biológicas tanto em fraturas como na colocação dos implantes osseointegrados. A interface implantetecido ósseo é formada inicialmente de osso, porção medular, coágulo agregado com espículas ósseas provenientes da perfuração e essa união não dependem de uma ligação química verdadeira. BERGLUNDH et al., (2003) contribuíram para a determinação da atividade celular, determinando as fases iniciais da formação óssea com a instalação de implantes de titânio na mandíbula de cães. Avaliaram as amostras após 2 horas e subseqüentes dias até completar 12 semanas. Nas primeiras horas, encontrou-se o implante circundado por tecido mole e duro, alguns espaços ocupados por coágulo, um grande número de eritrócitos, alguns neutrófilos e macrófagos, além de uma rede de fibras. No 4 dia, o coágulo aparenta ter sido substituído por tecido, característica essa devido ao grande número de células semelhantes aos fibroblastos (células mesenquimais) com estruturas vasculares ao redor. Avaliando os resultados da primeira semana, a área apresentava novas formas de tecido ósseo que ocupava quase toda a região. O tecido próximo ao implante continha osteoblastos juntamente com matriz rica em unidades vasculares, poucos leucócitos e fibras colágenas, indicando que essa região estava em processo de neoformação óssea. Na quarta semana a característica marcante continua sendo a de formação, possuindo áreas com tecido imaturo e tecido ósseo lamelar ou secundário. Passando para os períodos finais de observação, após seis semanas, os espaços aparecem ocupados com tecido ósseo, sendo que esse já está em contato com a superfície do implante. Após a sexta e a décima segunda semana, os sinais de remodelação prosseguem, a matriz mineralizada vai ocupando as interfaces restantes. Os espaços vazios, inicialmente ocupados por coágulo e tecido de granulação com o passar dos dias vão sendo substituídos por uma matriz provisória composta de células mesenquimais e fibras, caracterizando o início da formação óssea nas primeiras semanas do processo de cicatrização (BERGLUNDH et al., 2003). A mesma metodologia descrita acima foi utilizada, variando apenas a superfície do implante, obtendo-se os mesmos resultados com relação à descrição microscópica da neoformação óssea relacionada ao processo de osseointegração (ABRAHAMSSON et al., 2004).

10 139 Laser de baixa potência Os lasers de baixa potência, como os de diodo, terão o seu comprimento de onda no espectro vermelho e infravermelho que variam de 620 a 1500 ŋm determinado pelo seu meio ativo e esse promove a afinidade ou não do laser com o tecido alvo. O GaAlAs é o meio ativo mais utilizados atualmente na Odontologia, sendo enquadrado entre 790 e 850 ŋm com potência variando entre 20 e 100mW, mais precisamente na faixa do infravermelho próximo. O seu funcionamento se deve a um chip semicondutor que funciona como um diodo elétrico. Uma camada de material condutor de carga elétrica positiva (camada p ) é separada de outra camada, porém com carga negativa (camada n ), através de uma camada não condutora. Quando correntes de voltagem são aplicadas nessas camadas p e n, a camada não condutora servirá de local para troca, ativando os elétrons e liberando energia. Através de uma cavidade óptica composta por superfícies reflexivas o diodo emissor de luz forma a radiação laser. O raio que sairá dessa cavidade deverá ser re-colimado e focado. Na maioria dos semicondutores a energia é liberada em forma de calor, porém em materiais como o Gálio, o Alumínio e o Arsênio, a energia é liberada na forma de fótons. Os fenômenos físicos de distribuição dessa luz: reflexão, refração, absorção, difusão e transmissão são observados nos mecanismos de interações físico-biológico e laser-tecido (BRUGNERA JÚNIOR; PINHEIRO; 1998; ALMEIDA-LOPES; MASSINI, 2001; BRUGNERA et al., 2003). A laserterapia tem sido usada com grande sucesso na clínica odontológica, podendo ser empregada como auxiliar em tratamentos convencionais ou isoladamente de forma eletiva. Observa-se que os efeitos da irradiação de baixa potência promovem um aumento no potencial de regeneração tecidual, afetando o metabolismo celular, efeito antiinflamatório, analgésico e vasodilatador. Alguns fatores como a dosimetria, o espectro do laser, a potência e a fase de irradiação, irão influenciar na modulação das respostas biológicas (CONLAN; RAPLEY; COOB, 1996; UEDA; SHIMIZU, 2001; BRUGNERA et al., 2003). Os fenômenos de absorção (1), difusão (2), transmissão (3) e reflexão (4) aparecem a partir do momento que a luz laser entra em contato com um meio, como o tecido (Fig. 1) Fig. 1 - Interação entre o laser e os tecidos: 1 - absorção, 2 - difusão, 3 - transmissão e 4 - reflexão Fonte: Adaptado de Rossi ([s.d.]).

11 140 Os lasers são classificados de acordo com muitos critérios, sendo que a mais ampla classificação divide os lasers em dois grandes grupos de acordo com a sua ação terapêutica em lasers cirúrgicos e aqueles lasers clínicos. Também, são classificados de acordo com o seu funcionamento, em contínuo ou pulsátil (PINHEIRO; FRAME, 1992). Biomodulação tecidual A extensão da interação entre lasers e os tecidos é geralmente determinada pelo comprimento de onda e pelas características ópticas de cada tecido. Durante a penetração de uma luz paralela em um material com textura heterogênea, como, por exemplo, os tecidos vivos, e por causa das reflexões múltiplas, o raio perde o seu paralelismo resultando em um fenômeno que é a difusão. A difusão da radiação laser nos tecidos é, contudo, um problema complexo, em decorrência da natureza heterogênea. A heterogeidade normalmente exclui uma determinação quantitativa de energia absorvida por unidade de volume sob uma determinada condição de irradiação. Adicionalmente, a taxa de difusão da radiação através dos tecidos não é normalmente conhecida, da mesma forma que a concentração de determinados cromóforos, que são componentes celulares que podem refletir ou absorver a energia do laser (BRUGNERA JÚNIOR; PINHEIRO; 1998). A absorção da luz laser pelos tecidos pode resultar em processos fotoquímicos, fotomecânico e fotoelétrico. O efeito fotofísico, ou também chamado de fotoelétrico, é a resposta do tecido frente à aplicação da luz infravermelha, tendo como produto modificações nos potenciais da membrana, incrementando a síntese de ATP (BRUGNERA JÚNIOR; PINHEIRO; 1998). Com o objetivo de determinar as propriedades ópticas analisando a distribuição e a variação espacial da intensidade da luz, foram utilizados diferentes tecidos de ratos que foram irradiados com comprimentos de onda de 514 e 670 ŋm (MELO et al., 2001). Observaram que a luz laser tem distribuição isotrópica nos tecidos, formando zonas esféricas de intensidade igualmente distribuídas e a sua propagação se dá de maneira diferente nos tecidos sendo que na medida em que as camadas vão se aprofundando a intensidade da luz vai diminuindo. A literatura elucida que a relação dos raios laser com os tecidos estão relacionadas com a biomodulação. Nas primeiras publicações esse fenômeno recebia o nome de bioestimulação e, essa última terminologia está em desuso na medida em que a terapia possa tanto estimular o processo de reparo como inibi-lo, intencionalmente ou não, dependendo do resultado clínico desejado (BASFORD, 1995; SCHINDL et al., 2000; TUNÉR; CHRISTENSEN, [s.d.]). Foram admitidas hipóteses para o modelo da biomodulação, sendo sugerido o incentivo às pesquisas para a investigação dos efeitos da luz no processo de reparo (KERTEZ et al., 1982). Com cautela afirmaram que o tratamento influenciava a estrutura, além da função de importantes macromoléculas, proteínas, enzimas, carbohidratos e lipídios, inclusive a relação com o DNA e o RNA. Propõem modelos para observar a dependência da coerência da luz e a atuação desse elemento na camada lipídica da membrana celular. A investigação do processo de cicatrização das feridas a nível molecular, é relatada através de análises bioquímicas, imuno-histoquímica e, microscopia eletrônica tornaram-se necessárias pelo desenvolvimento apresentado nas últimas duas décadas (MESTER et al., 1985). Os resultados positivos foram por

12 141 eles observados desde 1971 quando iniciaram o tratamento de úlceras com difícil cicatrização ou que não respondiam a procedimentos terapêuticos usuais, utilizando 4 J/cm2. Os resultados dos achados mostram que o laser influencia os eventos enzimáticos precocemente no processo de cicatrização, auxilia no desenvolvimento de novos vasos e no aumento da formação de prostaglandina. Concluem esses autores que o acréscimo de prostaglandina e a sua diferenciação contribuem para a aceleração parcial de cicatrização, atenuando na fase inflamatória. O fenômeno dos bioefeitos do laser estão relacionados diretamente com a dosagem, sendo assim dose-dependentes e, a afinidade do tecido com o comprimento de onda específico (BELKIN; SCHWARTZ, 1989). Os efeitos consistem em estimulação ou inibição bioquímica, fisiológica e, ativação da proliferação, além do que a coerência da luz não é um pré-requisito para que esses ocorram. A irradiação direta dos tecidos alvos não é necessária porque a luz atinge camadas mais profundas produzindo muitos efeitos. Por fim alertam para a observação das doses corretas, pois em excesso poderão causar retardo no processo de reparo. A fotobiologia dos efeitos do laser não-cirúrgico, particularmente a irradiação com HeNe, teve que ser investigada e discutida pelo crescimento do interesse no efeito biomodulatório. Realmente é incompreensível como pode se explicar a sensibilidade das células à irradiação vermelha. Durante os últimos seis anos estudos sistemáticos a nível celular foram conduzidos com o objetivo de explicar as alterações celulares após a ação do espectro da luz e muitos resultados mostraram a estimulação da síntese de DNA. Os efeitos fotobiológicos dependem do comprimento de onda, da dosimetria e da intensidade da luz, portanto, a bioestimulação depende desse fenômeno e não da coerência da luz. Os fotoreceptores fazem parte da cadeia respiratória estimulando o metabolismo celular e os efeitos são dependentes das doses. Por fim os efeitos terapêuticos da laserterapia aumentam a proliferação celular atuando nas fases iniciais da mitose celular e a sua magnitude irá depender do estado fisiológico das células no momento da irradiação (KARU, 1987; KARU, 1989; BASFORD, 1995). A laserterapia é largamente utilizada tanto no comprimento de onda vermelho como no infravermelho (BASFORD, 1995). Inicialmente as pesquisas enfatizavam a luz visível principalmente do HeNe. Muito recentemente a maioria dos trabalhos foram efetuados com GaAs e GaAlAs, que são diodos com comprimento de onda entre 820ŋm e 904ŋm. As características de coerência, colimação e monocromaticidade estão sendo investigadas em detalhes. Em particular, as duas primeiras características citadas acima não parecem serem cruciais, pois sofrem rápida dispersão após a passagem pelo tecido. Uma revisão da literatura descreveu que o processo de cicatrização divide-se em três fases, do substrato à proliferação e a remodelação (CONLAN et al., 1996). A biomodulação através do laser apresenta o seu maior efeito durante a fase de proliferação, acelerando a cicatrização e aumentando a proliferação epitelial. Acredita-se que o processo do metabolismo celular acentua-se devido à fotorecepção da luz monocromática, acrescendo assim o metabolismo respiratório de certas células, afetando as propriedades eletrofisiológicas. Com relação ao processo cicatricial as alterações podem ser notadas in vitro, na proliferação dos fibroblastos, síntese de colágeno e um aumento na proporção da produção da matriz extracelular. Os efeitos fotoquímicos como a excitação no estado elétrico dos átomos das moléculas, o aumento do estado vibracional pela absorção dos fótons também são

13 142 observados graças à monocromaticidade e à intensidade da luz permitindo a excitação dos átomos das moléculas. A elevação dos níveis de ácido ascórbico, a ótima produção de hidroxiprolina induzem o aumento da formação de colágeno. Os efeitos primários da laserterapia estimulam a absorção celular do ácido ascórbico através de uma reação fisioquímica, mudanças dos níveis de ATP ou camp e a estabilização da membrana celular. Outro benefício relacionado às mitocôndrias também é reportado proporcionando assim um acréscimo na síntese de ATP pela estimulação de fotoreceptores na cadeia respiratória. Recentemente sugeriu-se que essa terapia causaria transformação dos fatores de crescimento e fatores de crescimento derivados de plaquetas originadas nos fibroblastos, entretanto, os mecanismos da ação do laser ainda não são bem compreendidos. Pesquisa relacionada com a estimulação através de HeNe, com comprimento de onda de 632,8 ŋm, em culturas celulares, encontraram mudanças estruturais, quantitativas e qualitativas, nas mitocôndrias, resultando numa rápida regulação da síntese de ATP, além de afetar, também, a síntese de proteínas mitocondriais a nível genético (KARU et al., 1999). SCHINDL et al., (2000) complementam as afirmações de TINA KARU e BASFORD a respeito dos parâmetros fundamentais para o protocolo da laserterapia, indicando que o comprimento de onda, a freqüência, a potência de saída, o diâmetro do spot, a intensidade, a dose e os intervalos de tratamento são essenciais para o sucesso. Estima-se que a profundidade de penetração seja suficiente, já que muitas células que sofrem o efeito da luz laser estão localizadas na epiderme e no interior da derme (fibroblastos, queratinócitos, macrófagos e células endoteliais). Basicamente duas reações biológicas acontecem com doses entre 1 e 50 J/cm2. A primária são reações induzidas diretamente pela luz (light-induced) promovendo alterações fotoquímicas e fotofísicas possuindo as seguintes teorias: Olson et al., afirmam que a primeira absorção da luz ocorre na mitocôndria, promovendo um aumento da temperatura local, pelo aumento do estado vibracional molecular; Karu et al., sugerem que a luz inibe e estimula, proporcionando resultados na absorção de flavinas e citocromos, que se encontram na cadeia respiratória das mitocôndrias, promovendo a transferência de elétrons e caracterizando a oxi-redução; para Lubart, a existência de oxigênio simples fotoinduzido pelas porfirinas endógenas, pode ser outro caminho; Smith com modelo modificado de Karu, propõe que o infravermelho próximo em um caminho adicional possa ativar diretamente os canais de cálcio da membrana promovendo modificações fotofísicas, induzindo a saída de Ca+2 e a proliferação celular. A reação biológica secundária (dark) fornece reações para a transdução. A alteração do ph intracelular através da ativação das ATPases seguido de uma troca do nível intracelular de cálcio, aparenta ser o caminho geral para a transdução e amplificação de todas as fotoreações primárias. A oxi-redução conduz para o aumento de Ca2- intracelular e a estimulação do metabolismo celular, entretanto a redução muito acentuada de Ca2+ poderá causar a inibição. Altos níveis de Ca2+, intracelular e ao redor, são conhecidos como estimulador de vários processos biológicos como a síntese de RNA em DNA, mitose celular e secreção de proteínas. Experimentos usando doses muito baixas ou demasiadamente altas não produziram a indução de respostas fotobiológicas adequadas. Em uma revista de literatura a respeito da laserterapia observaram que a variedade dos sistemas de laser e as diferentes condições experimentais utilizadas tornam difícil a comparação dos resultados. Após a avaliação dos diferentes dados, concluíram que essa terapia

14 143 auxilia na otimização do processo de reparo, ressaltando que mais investigações são necessárias para justificar a sua indicação. Com relação aos achados negativos do efeito da luz laser, é importante ressaltar que a fotosensibilidade celular apresenta um equilíbrio, onde as respostas não serão apenas positivas ou ausentes, dependendo estreitamente do seu estado fisiológico e do tipo celular, pois algumas linhagens reagem melhor ao estímulo fornecido pela laserterapia. Devido a essas observações no momento da avaliação dos resultados é necessário cautela para não relatar resultados falsos negativos (KARU et al., 1989; BASFORD, 1995; SCHINDL et al., 2000). O processo de reparo e a transmissão do laser pela pele foi avaliado sendo utilizados vários tipos de meios ativos, dentre eles o GaAlAs com comprimento de onda de 780 e 830 ŋm (AL-WATBAN; ZHANG, 2001). Os estudos demostraram que a transmissão pela pele eleva-se com o aumento de comprimento de onda, sendo que o GaAlAs apresenta os índices mais altos. Porém, esse resultado não está diretamente relacionado à biomodulação, e a aceleração do processo cicatricial não está atribuída ao poder de transmissão na pele. Foi comprovado, também, recentemente que as dosimetrias e a intensidade de energia mínima capazes de provocar a bioestimulação são biologicamente independentes uma das outras, não havendo uma relação de proporcionalidade, sendo esses parâmetros fundamentais para o desencadeamento dos efeitos fotobiológicos (SOMMER et al., 2001). Laser e reparo ósseo Foram utilizados vinte e quatro ratos machos Wistar, para observar a influência da laserterapia no reparo ósseo. Após as extrações dentárias, os locais foram submetidos a irradiação com GaAs com comprimento de onda de 904 ŋm, potência de 25 mw e dosimetria de 20 J/cm2. As aplicações foram realizadas diariamente, totalizando cinco dias. Os resultados desse estudo, utilizando o GaAs, sugerem que o laser, de baixa intensidade, apresenta um efeito benéfico em relação ao processo cicatricial ósseo. Além dessa conclusão, colocada pelo autor, ele ainda salienta o aumento da proliferação fibroblástica oriunda do ligamento periodontal remanescente (TAKEDA, 1988). GARGIA; CARVALHO; OLIVEIRA (1995) avaliaram a influência do raio laser no alvéolo infectado de 36 ratos Wistar, machos, com meio ativo de GaAs, comprimento de onda de 904 ŋm, emissão pulsátil e potência média de saída entre 0,5 a 3,5 mw, aplicado através de fibra ótica. Após os procedimentos de anestesia dos animais, foi realizada a exodontia dos incisivos superiores direitos e provocado uma isquemia do alvéolo e posterior contaminação dos mesmos através de coleção purulenta de ratos doadores. Decorridos seis, 15 e 28 dias os animais foram sacrificados e as peças foram observadas através de microscopia ótica onde os resultados ficaram evidentes, mostrando que as feridas dos grupos II e III obtiveram um processo de reparo mais favorável, sendo que no grupo III os escores foram mais altos, nos períodos de seis e 15 dias. Nesse último intervalo de tempo já se observar pequenas espículas ósseas. YAAKOBI; MALTZ; ORON (1996) realizaram lojas cirúrgicas em tíbias de ratos utilizando a laserterapia com HeNe para analisar a otimização do processo de reparo ósseo. O comprimento de onda empregado foi de 632 ŋm, com potência de 5,3 mw, dosimetria de 31 J/cm2 perfazendo um total de 2,3 minutos de

15 144 aplicação. A irradiação foi aplicada no quinto e no sexto dia após a realização da injúria e, o grupo controle foi submetido a aplicação de uma luz vermelha (660 ŋm, 0,4 J/cm2) no lugar do laser. As peças foram analisadas com nove, dez, 11, 13 e 15 dias, sendo que a fosfatase alcalina elevou-se progressivamente no grupo irradiado tendo o seu pico entre o nono e o décimo terceiro dias, bem como o percentual de calcificação. O acúmulo de cálcio foi mais expressivo no décimo terceiro dia, porém em todas as análises mostrou-se superior ao grupo controle. Em mesmo modelo animal e protocolo da laserterapia idêntico foi avaliado índice do marcador TRAP que define a atividade osteoclástica e observaram que o seu pico é no décimo segundo dia estabelecendo uma diferença significante em relação ao grupo controle. Em análise microscópica a neoformação óssea foi privilegiada no grupo irradiado e, claramente os índices demonstram a melhora do processo de reparo nesse modelo animal com a utilização da laserterapia (BARUSKA; YAAKOBI; ORON, 1995). SAITO; SHIMIZU (1997) realizaram um modelo experimental para observar o estímulo da irradiação com laser de baixa intensidade durante a realização de expansão ortopédica em ratos. Utilizaram setenta e seis machos da linhagem Wistar. Os resultados demostraram que a neoformação óssea no grupo irradiado por sete dias obteve um aumento significativo, sendo que no irradiado por dez minutos esse acréscimo foi ainda mais relevante quando comparado com o grupo controle. Comparando o grupo que foi dividido em períodos (0-3 dias e 3-6 dias), ambos tiveram diferenças significativas em relação ao controle, entretanto o período inicial apresenta mais relevância. Os animais que sofreram apenas uma aplicação não obtiveram nenhuma diferença significante quando comparados com o controle. Os autores concluem que a irradiação com laser de baixa potência (GaAlAs) apresenta um estímulo significativo para a regeneração óssea, entretanto mais estudos são necessários para a introdução dessa terapia em expansões rápidas do palato assistidas ortodonticamente. Um estudo foi desenvolvido para observar o efeito da irradiação laser na cicatrização de fraturas provocadas em tíbias de ratos Wistar machos. A amostra consistia de 25 animais que tiveram as suas tíbias fraturadas com o auxílio de motor elétrico e estabilizada com fio de Kirschiner. Após quatro semanas as tíbias foram removidas e submetidas ao teste de tensão. A carga máxima suportada antes da falha teve uma diferença estatisticamente significante no grupo irradiado quando comparado com o controle. A dureza estrutural da tíbia também foi favorecida no grupo irradiado e com relação à extensão da área do calo ósseo, o maior valor foi encontrado no grupo não irradiado. Talvez essa diferença seja resultado da aceleração do processo de reparo ósseo no grupo irradiado. Outro resultado interessante é que em 19 ratos do grupo não irradiados, quatro não tiveram a união dos cotos, contra nenhum do grupo teste, o que demonstra o possível efeito positivo do laser não ablativo no processo de reparo ósseo. O processo de ativação do metabolismo pela energia reflete no aumento da liberação de cálcio e de ATP pela mitocôndria, com um ganho moderado da atividade celular. Os autores recomendam maiores investigações para provar os efeitos em humanos (LUGER et al., 1998). OZAWA et al., (1998) para determinar o alvo da ação do laser durante a formação óssea, investigaram os efeitos em vários estágios da proliferação de cultura celular, observando a formação de nódulos ósseos, a atividade da fosfatase alcalina, o gene de expressão da osteocalcina, utilizando células da calvária dos ratos. Osteoblastos foram isolados e irradiados com GaAlAs (830 ŋm, 500 mw), correspondendo a um total de energia de 3,82 J/cm2, totalizando dez minutos de

16 145 aplicação. Os resultados sugerem que o estímulo ocorre durante a proliferação e os estágios iniciais da diferenciação celular, sendo que ambas irão estimular a neoformação através da irradiação em culturas celulares imaturas. KAWASAKI; SHIMIZU (2000) observaram a remodelação óssea durante o movimento ortodôntico em dentes de ratos com a aplicação de laser de baixa potência. Os resultados demonstraram que a quantidade de movimento dentário, a mineralização de um tecido ósseo neoformado no lado de tensão, a neoformação óssea ao longo do alvéolo, o número de osteoblastos foram significativamente aumentados no grupo irradiado. Demonstraram o efeito estimulatório do laser, influenciando na proliferação celular, na diferenciação, na formação de matriz óssea e na mineralização. Obtiveram uma diferença estatisticamente significante no primeiro e segundo dia do grupo irradiado quando comparado com o não irradiado. Os autores afirmam que a introdução da laserterapia nos estágios iniciais do movimento ortodôntico parece abreviar e benificar o tratamento ortodôntico. GARCIA et al., (2000) avaliaram a influência do número de aplicações de raio laser sobre o reparo de feridas de extração dentária em ratos da linhagem Wistar, observando o resultado da biomodulação microscopicamente. As feridas tratadas com laser demonstraram reparação alveolar diferenciada, caracterizada pela formação mais rápida do tecido de granulação cicatricial, neoformação óssea precoce e maior grau de ossificação e fechamento mais rápido das bordas epiteliais das feridas. Os eventos biológicos mostraram-se mais evidentes nos períodos iniciais de três e sete dias, persistindo mais favoráveis nos grupos experimentais durante toda a pesquisa. Os grupos tratados com maior número de aplicações demonstraram maior aceleração do processo de reparação alveolar, sendo mais evidente no grupo IV. Esses resultados fortalecem as evidências de que a ação do laser se processa a nível vascular e celular com maior intensidade nas fases iniciais do processo de reparo. Embora o mecanismo da biomodulação óssea não esteja muito bem esclarecido, os autores acreditam que as células mesenquimais indiferenciadas recebam o estímulo e procedam a diferenciação osteoblástica. DÖRTBUDAK; HASS; MAILATH-POKORNY (2000) utilizaram a irradiação com laser de diodo com comprimento de onda de 690 ŋm, 1,6 J/cm², por sessenta segundos a um centímetro da cultura, com 21 mw de potência, irradiados em três tempos (3º, 5º, 7º dias). As culturas foram obtidas de medula óssea do fêmur de ratos machos da linhagem Wistar, tendo como objetivo irradiar osteoblasto in vitro. A diferença foi estatisticamente mais significante nos osteoblastos após dezesseis dias no grupo irradiado. Portanto, a irradiação do laser de diodo tem efeito biomodulador em osteoblastos in vitro, podendo ser possível a sua utilização na osseointegração em implantes. GARCIA et al., (2000) tiveram como objetivo analisar o efeito do laser GaAs (904 ŋm) com diferentes energias de irradiação, tendo como metodologia básica à mesma da pesquisa relatada anteriormente. Obtiveram como conclusão que os grupos experimentais demonstraram um reparo do processo alveolar acelerado, quando comparados com o controle. Já o grupo III que recebeu uma quantidade maior de energia, mostrou um processo de reparo mais acelerado quando comparado com o grupo II e o grupo I. Esses fatos se caracterizam por uma organização mais rápida do coágulo, maior proliferação vascular e fibroblástica e formação óssea diferenciada.

17 146 Igualmente ao resultado anterior, KREISLER et al., (2003) obtiveram um aumento da proliferação fibroblástica com diferença significante em relação ao grupo não irradiado. Utilizaram culturas de ligamentos humanos removidos de terceiros molares extraídos, irradiando com GaAlAs (809 ŋm) com potência de 10 mw e emissão contínua, variando a dosimetria entre 1,96 e 7,84 J/cm2 e o número de irradiações de um a três. SILVA JÚNIOR et al., (2000) avaliaram o efeito da terapia do laser de baixa potência (GaAlAs, comprimento de onda de 830 ŋm com freqüência contínua) no reparo ósseo, iniciando 48 horas após a confecção do defeito cirúrgico. Utilizaram quarenta ratos divididos em quatro grupos de dez animais cada. Os resultados mostraram diferenças estatisticamente significante entre o grupo teste de 7 e 14 dias e o controle, porém os animais avaliados após 28 dias não demonstraram diferença relevante quando comparada com o controle. A laserterapia estimula o reparo ósseo em seu processo inicial, sendo possível que o efeito do laser terapêutico sobre a biomodulação tecidual dependa não somente da dose total, mas, também, do tempo e do modo de irradiação. UEDA; SHIMIZU (2001) descreveram os efeitos da irradiação no estímulo a formação óssea em culturas celulares obtidas da calvária de ratos onde essas foram irradiadas com GaAlAs com comprimento de onda de 830 ŋm e potência de 500 mw. Utilizaram os dois modos de freqüência o pulsátil e o contínuo sendo analisados os efeitos na proliferação celular, formação de tecido ósseo, ativação e expressão do gene da fosfatase alcalina. Conclui-se que a freqüência pulsátil apresenta uma biomodulação mais favorável em relação à contínua, mostrando que esse método é um importante fator para acentuar a resposta biológica. Entretanto a capacidade de biomodulação é influenciada por diversos fatores como a dosimetria total, a potência, a fase de irradiação das células. Porém, para se definir o melhor protocolo de irradiação com relação à freqüência há a necessidade da realização de muitos estudos comparando os seus efeitos. GUZZARDELLA et al., (2002) analisaram os efeitos do laser em defeitos criados cirurgicamente em fêmur dissecado de ratas e mantidos em meios de cultura. Utilizaram o GaAlAs com comprimento de onda de 780 ŋm, 300 J/cm², potência de 1 W, 300 Hz de freqüência, emissão pulsátil, totalizando dez minutos de aplicação. Os resultados mostraram que a regeneração do osso trabecular no grupo teste é mais efetiva, com relação aos parâmetros citados acima a fosfatase apresenta um acréscimo significativo em 21 dias no grupo irradiado. O óxido nítrico tanto em 14 como em 21 dias mostra diferença estatisticamente significante quando comparado ao controle. Já o cálcio apresentou uma diminuição nos seus níveis tendo também uma significância no último período analisado em relação ao grupo controle. Esses índices sugerem a atividade osteoblástica e o baixo nível de cálcio demonstra o final do processo de mineralização. KHADRA et al., (2004a) afirmam que o meio ativo GaAlAs que é utilizado neste estudo obteve um grande crescimento progressivamente nos últimos dez anos. Esse tipo de laser possui uma alta penetração quando comparados a outros meios ativos e mostra-se como uma excelente ferramenta na clínica diária. Os resultados sugerem que a laserterapia promove benefícios clínicos na regeneração de defeitos esqueléticos, porém os mecanismos ainda necessitam de maiores investigações em relação aos fatores de crescimento, expressão de prostaglandinas e citocinas na síntese da matriz óssea.

18 147 Laser e osseointegração DÖRTBUDAK; HAAS; MAILATH-POKORNY (2002) afirmam que o mecanismo de ação do laser de baixa potência ainda não está claramente entendido, porém as teorias demonstram que esse fenômeno seja um efeito de natureza fotoquímica. Para observar os efeitos do laser terapêutico no tecido ósseo perimplantar utilizaram macacos como modelo. Esse estudo demonstrou que a laserterapia influencia de forma positiva em relação aos osteócitos viáveis, provavelmente promovendo um acréscimo benéfico no processo de osseointegração. KREISLER et al., (2002) investigaram a possibilidade de danos a superfície dos implantes com a aplicação da luz laser. Utilizaram discos de titânio, com quatro superfícies diferentes (somente polida, com hidroxiapatita, plasma e com tratamento ácido). Os meios ativos utilizados foram Nd: YAG, Er: YAG, Ho: YAG, CO2 e GaAlAs. Esse último possuía um comprimento de onda de 809 ŋm com uma dosimetria situada entre 1,9 e 26,6 J/cm2, com potência variando entre 0,5 e sete Watts. Nenhuma alteração na superfície foi encontrada quando essa foi irradiada com GaAlAs, mesmo quando a dosimetria mais elevada e a potência máxima foram utilizadas. LOPES (2002) teve como objetivo monitorar através da Espectroscopia Raman, a concentração de hidroxiapatita de cálcio e matriz orgânica na cicatrização óssea periimplantar (15, 30 e 45 dias após a cirurgia) tratada com laser não cirúrgico e observar através da Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV) a relação de contato osso-implante. O modelo animal escolhido para este estudo foi o coelho e os sítios receptores dos implantes foram as tíbias, sendo utilizado um total de quinze animais, divididos entre os grupos irradiados (dois em cada subgrupo), os não irradiados (três em cada subgrupo) e o período de tempo 15, 30 e 45 dias (subgrupos). O laser utilizado foi um diodo com meio ativo de GaAlAs, infravermelho próximo (830 ŋm), com emissão contínua numa densidade de energia de 21,5 J/cm2, potência 10 mw, aplicação pontual e por seis segundos. Os resultados em relação à concentração média de hidroxiapatita encontradas nos terços (superior, médio e apical) permitiram observar que não houve diferença significante em 15 dias entre os animais irradiados e não irradiados. Porém, uma diferença significante entre os animais irradiados e não irradiados foi observada em 30 e 45 dias. Com relação à média total da concentração da matriz orgânica, é possível observar que não houve diferença nos períodos de 15 e 45 dias, porém em 30 dias foi possível observar uma diferença significante entre os animais irradiados e não irradiados. A microscopia eletrônica de varredura (MEV) também foi utilizada, e as peças sugerem uma melhor união entre osso-implante aos 30 dias, principalmente nos terços médio e inferior comparados aos não irradiados. E com 45 dias após a cirurgia, é possível observar uma acentuada diferença na união osso-implante entre os espécimes irradiados e não irradiados. A partir dos resultados obtidos a autora conclui que o laser não cirúrgico em 830 ŋm promove uma cicatrização óssea periimplantar mais acelerada. GUZZARDELLA et al. (2003) relatam que a estimulação com o laser de baixa potência para a otimização do reparo ósseo vem sendo pesquisada em modelos experimentais relacionados com defeitos ou fraturas ósseas. Poucos dados a respeito da biomodulação na osseointegração de implantes endósseos são relatados. Esse estudo in vivo utiliza o meio ativo de GaAlAs (780 ŋm) com o seguinte protocolo: 300 J/cm², 1 W, 300 HZ, emissão pulsátil, com um tempo total de

19 148 aplicação de 10 minutos e implantes de titânio com superfície tratada com hidroxiapatita (3mm x 5mm). Em ambos os testes a interface osso-hidroxiapatita revelou diferença significante favorável ao grupo irradiado, promovendo características diferenciadas no processo de reparo com melhor desempenho no grupo de três semanas. A laserterapia aparece como um fator positivo no efeito histomorfométrico na osseointegração cerâmica. Com relação à microdureza, no grupo irradiado, as medidas mostraram a melhor maturação óssea em três semanas, pois na sexta semana esse índice diminui, provavelmente pela remodelação óssea. PINHEIRO (2003) afirma que o primeiro passo para o uso dessa modalidade terapêutica é a perfeita seleção do comprimento de onda próximo ou no infravermelho, tendo em vista que o tecido ósseo está mais profundamente localizado. O cálculo da dosimetria deve ser observado bem como a sua freqüência, pois o autor recomenda através dos resultados dos seus estudos que o intervalo entre uma terapia e outra seja de 48 horas. Ressalta ainda o aumento significativo na quantidade de fibras colágenas e um arranjo lamelar compacto quando osso é irradiado, apresentando um tecido periimplantar mais vascularizado e um maior arranjo lamelar, acelerando o período de carga do implante. SILVA JÚNIOR (2003) avaliou o crescimento, a proliferação e a diferenciação de células derivadas da medula óssea humana, cultivadas sobre discos de titânio altamente polidos, submetidos a irradiação com laser diodo (InGaAlP), λ 685 ŋm. Avaliou quantitativamente as células e a detecção de osteonectina, osteopontina e osteocalcina. Os resultados demonstraram que tanto o número de células como a expressão de osteopontina e osteocalcina esteve aumentada nos grupos irradiados quando comparados com o controle, permitindo concluir que o laser terapêutico pode estimular a proliferação celular nos períodos iniciais de crescimento em cultura. Já o titânio altamente polido favorece a diferenciação e a proliferação celular sobre a sua superfície, reafirmando a sua propriedade de biocompatibilidade. KHADRA et al. (2004b) investigaram o efeito do GaAsAl (830 ŋm) na cicatrização de implantes de titânio colocados em coelhos. O estudo utilizou 48 animais divididos em dois grupos, o irradiado e o controle que não recebeu a laserterapia. As avaliações dos resultados demonstraram que o grupo irradiado obteve um ganho de adesão do tecido ósseo no implante, pois os índices no teste de tensão favoreceram esse grupo, bem como na histomorfometria o contato do titânio com o osso foi maior em relação ao grupo teste. Os valores do cálcio e do fósforo também foram altamente significantes nos animais tratados com o laser, sugerindo então que o processo de maturação óssea seja mais rápido no grupo irradiado. Contudo os possíveis requisitos da laserterapia de algum modo afetam positivamente o processo de cicatrização, pois o mecanismo de atuação ainda não é bem conhecido, otimizando a união do implante ao tecido ósseo. Microscopia eletrônica de varredura A invenção do microscópio eletrônico é datada de 1930 e, com o passar dos anos as evoluções foram sendo incorporadas ao projeto original e, a maior proximidade com as estruturas só foi possível com a melhora da resolução, expandindo o mundo da microscopia óptica. Esse aparelho influenciou profundamente o entendimento da organização de tecidos, especialmente das células,

20 149 bem como tem sido utilizado para avaliar a interface implante-osso (ALBREKTSSON; ZARB, 1993). O primeiro microscópio eletrônico de varredura (MEV) foi elaborado (KNOLL; VON ARDENNE, 1940), porém somente em 1963 foi comercializado, proporcionando uma magnificação de 300 vezes em relação ao microscópio ótico. Atualmente os modelos mais recentes atingem um aumento de vezes ou mais, produzindo uma imagem com aparência tridimensional (KESTEMNBACH FILHO; BOTTA FILHO, 1989). O MEV pode ser subdividido entre sistemas de componentes que se encarregam de varias funções. Entre esses temos: as lentes que proporcionam o foco aos sítios de elétrons que são detectados na superfície do espécime. Estação do espécime lugar onde é colocada a amostra, o detector de elétrons secundários utilizado para coletar os elétrons e gerar o sinal que será processado e mostrado na tela. O sistema de vácuo se encarrega de remover as moléculas do ar que podem impedir a passagem da alta energia dos elétrons até a parte inferior da coluna, quanto da baixa energia dos elétrons secundários para chegar até o detector (CARTER; WILLIAMS, 1996). Interação do elétron espécime Os elétrons sob uma determinada aceleração batem na superfície do espécime produzindo um número de emanações e, dependendo da velocidade do elétron e da densidade do espécime, a emissão pode penetrar em diferentes profundidades do espécime. Existem dois tipos de dispersão do elétron que resultam da interação da emissão primária do elétron com os átomos do espécime: dispersão elástica e dispersão inelástica. A dispersão elástica consiste na mudança da direção da dispersão do elétron sem perder velocidade ou energia e, a dispersão inelástica consiste na interação da emissão do elétron com os átomos do espécime para produzir baixa energia ou elétrons secundários. (GOMES et al., 2000; CARTER; WILLIANS, 1996). Manipulação do espécime O espécime é normalmente colocado em cima de um suporte metálico, usualmente de alumínio, fixado na base da câmara para prevenir a formação de estática por cargas de alta voltagem, quando a emissão do elétron bate na amostra. A ordem de orientação do objeto a ser observada está exatamente relacionada com a emissão e o detector de elétrons. Todos os MEV possuem movimentos transversais e rotacionais e, a combinação desses movimentos permite uma localização precisa da área desejada na amostra, o que pode influenciar na magnificação, contraste, resolução, e profundidade do campo. Conseqüentemente, quando imagens deficientes são encontradas basta uma simples reorientação do espécime (GOMES et al., 2000; KESTEMNBACH FILHO; BOTTA FILHO, 1989). Processamento e análise da imagem através do computador O objetivo da microscopia eletrônica é produzir uma imagem obtendo informações de um espécime sob investigação. O desenvolvimento das diferentes