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1 Subprojeto Identificação: Título do subprojeto: Avaliação do potencial angiogênico e elucidação das interações moleculares de células-tronco mesenquimais e células endoteliais em sistemas de co-cultivo in vitro e in vivo. País:Brasil Área do conhecimento, segundo tabela do CNPq Área:Hematologia Código: Dados do coordenador do subprojeto Nome completo: Aparecida Maria Fontes Data de nascimento: 26/11/1966 Sexo: Masculino Feminino Nacionalidade:Brasileira Endereço eletrônico: 3. Dados da instituição do coordenador do subprojeto Instituição (universidade, centro, empresa, etc): Fundação Hemocentro de Ribeirão Preto Sigla:FUNDHERP Órgão (instituto, faculdade, etc): Centro Regional de Hemoterapia Unidade (departamento, laboratório, etc): Laboratório de Transferência Gênica Cargo/função: a 4. Resumo do subprojeto Resumir em, no máximo 1 página, o resumo do subprojeto. A formação de vasos sangüíneos ocorre em resposta a fatores angiogênicos por duas vias: vasculogênese e angiogênese. A vasculogênese refere-se a formação de vasos sangüíneos a partir de células progenitoras endoteliais (angioblastos), enquanto a angiogênese refere-se ao processo de formação de novos vasos por brotamento a partir de vasos pré-existentes. A princípio acreditava-se que a formação de vasos na fase adulta ocorria exclusivamente a partir de células endoteliais maduras as quais teriam o potencial de recrutar pericitos durante esse processo. Estudos recentes conduzidos por nosso grupo levou-nos a hipótese de que as células-tronco mesenquimais poderiam consistir células-tronco mais primitivas que estariam presentes nas paredes dos capilares sangüíneos dos diferentes tecidos e que seriam responsáveis pelo processo de neovascularização durante o mecanismo de reparo tecidual (Covas et al., 2008). Em paralelo, desenvolvemos protocolos in vitro de diferenciação de células endoteliais a partir de células progenitoras endoteliais (AC133) da medula óssea (BM-CE) e do sangue do cordão umbilical (UC-CE). As células progenitoras endoteliais e as células endoteliais diferenciadas (BM-CEd e UC-CEd) foram caracterizadas quanto: a) morfologia; b) perfil f fenotípico; c) perfil de expressão gênica, d) potencial de uptake de AcLDL e e) potencial vasculogênico in vitro de formação de estruturas tubulares em matrigel. Em conjunto, esses estudos permitiram avaliar in vitro o potencial vasculogênico das BM-CE e UC-CE, elucidar modificações fenotípicas ao longo do processo de diferenciação endotelial e mapear genes e fatores de transcrição envolvidos no processo de vasculogênese (Covas, com. pessoal). Dando continuidade a esses estudos a proposta do presente projeto consiste investigar as interações entre as células-tronco mesenquimais da medula óssea (BM-MSC) e veia umbilical (UV-MSC) e pericitos cerebrais (B-Per) com as células endoteliais da veia do cordão (HUVEC), bem como, com as células endoteliais diferenciadas in vitro (BM-CE ou UC-CE). Serão desenvolvidos três modelos: 1) in vitro em ensaios de co-cultivo com e sem contato com diferentes proporções dos tipos celulares: a) BM-MSC:HUVEC; b) UV -MSC:HUVEC; c) pericito:huvec; d) BM- MSC:BM-CEd; e) BM-MSC:UC-CEd; f) UV-MSC:BM-CEd; g) UV-MSC:UC-CEd; h) pericito:bm-ced e i) pericito:uc-ced e 2) in vivo em modelos de formação de vasos em matrigel após implantes sub-cutâneos em camundongos imunodeficientes e 3) modelo de avaliação do potencial vasculogênico das células endoteliais geradas em cultura após a indução da insuficiência arterial periférica por ligação da artéria femoral. No modelo in vitro será realizada a caracterização de ambos tipos celulares antes e após diferentes e em tempos de co-cultivo utilizando seis parâmetros: a) morfologia; b) perfil fenotípico; c) perfil de expressão gênica, d) potencial de uptake de AcLDL; e) potencial vasculogênico in vitro de formação de estruturas tubulares em matrigel e f) caracterização histológica por microscopia confocal nas estruturas neoformadas em matrigel utilizando marcadores mesenquimais e endoteliais. No modelo in vivo, primeiramente será realizada a modificação gênica das células-tronco mesenquimais e pericitos com marcadores fluorescentes e bioluminescentes (DsRed e Luciferase) que permitirá a avaliação dos capilares neoformados por microscopia confocal e utilizando o sistema IVIS nas estruturas formadas em matrigel. No modelo de avaliação de insuficiência arterial periférica por ligação e remoção da artéria femoral em um dos membros inferiores, em camundongos NODSCID, células endoteliais geradas em culturas com e sem 1

2 co-cultivo das células-tronco mesenquimais e pericitos serão infundidas nos camundongos e as análises histológicas processadas entre 5 e 10 dias após o procedimento cirúrgico. A compreensão dessas interações fornecerão subsídios relevantes para a elucidação dos mecanismos de angiogênese e vasculogênese em diferentes situações clínicas. Em colaboração com o grupo da Profa Dra Maria Angélica Miglino o presente projeto objetiva também isolar células-tronco mesenquimais e endoteliais do saco vitelínico de cães, por consistir o sítio original de formação dos vasos sangüíneos durante o desenvolvimento embrionário. Estudos recentes realizados por Maria Angélica permitiram mapear os sítios preferenciais do saco vitelínico, onde se situam as células endoteliais (SV-CE) e células-tronco mesenquimais (SV-CTM) (Miglino et al 2008). Assim, após o isolamento desses dois tipos celulares serão realizados ensaios de co-cultivo in vitro com e sem contato para a compreensão das interações moleculares entre SV-CTM e SV-CE utilizando os parâmetros acima descritos. O potencial vasculogênico também será avaliado em modelo de formação de vasos em matrigel após implantes sub-cutâneos de células-tronco mesenquimais com células endoteliais, em camundongos imunodeficientes. 5. Objetivos Listar os objetivos gerais e específicos do subprojeto. Objetivos Gerais: Contribuir para a formação de recursos humanos, nucleação de pessoal e integração com equipes multidisciplinares para a consolidação da linha de pesquisa em células-tronco com desenvolvimento de modelos in vitro e pré-clínicos que permitem avaliações mais adequadas sobre o potencial terapêutico das mesmas. Elucidar as interações moleculares do cross-talk entre populações celulares selecionadas por sorting para um dos marcadores de células-tronco mesenquimais (CTM) ou pericitos com células endoteliais em sistemas de co-cutivo in vitro e avaliação do potencial vasculogênico in vivo em modelos de co-infusão em matrigel, seguida da infusão sub-cutânea em camundongos imunodeficientes. Objetivos Específicos: 1- Isolar e caracterizar de populações celulares da medula óssea, veia do cordão e capilares cerebrais humanas no que diz respeito ao nível de expressão dos marcadores CD271, CD140B, 3G5, NG2, Stro-1 e CD146 para selecionar o marcador mais apropriado para realizar a clonagem celular; 2- Clonagem celular por sorting de populações celulares da medula óssea, veia do cordão e capilares cerebrais utilizando um dos marcadores previamente caracterizados; 3- Caracterização morfológica e imunofenotípica de populações celulares isoladas por sorting ; 4- Isolar e caracterizar células-tronco mesenquimais do saco vitelínico canino (csv-ctm); 5- Potencial de diferenciação das populações celulares humanas selecionadas por sorting e das CTM caninas em adipócito, osteócito e condrócito 6- Modificação Gênica de células-tronco humanas isoladas por sorting e das CTM caninas com luciferase/dsred e seleção das células positivas para DsRed por citometria de fluxo; 7- Isolamento e cultivo de células endoteliais humanas e caninas positivas para CD31 obtidas da veia do cordão humano (HUVEC) e do saco vitelínico canino (csv-ce), após a seleção por citometria de fluxo; 8- Geração ex-vivo de células endoteliais humanas a partir de células progenitoras endoteliais AC133+ isoladas da medula óssea e sangue do cordão umbilical; 9- Caracterização morfológica e fenotípica de células endoteliais/cd31 + obtidas de tecidos humanos e caninos e humanas diferenciadas ex-vivo; 10- Co-cultivo com contato e sem contato de populações celulares humanas isoladas por sorting e CTM caninas com células endoteliais; 11- Análise morfológica, imunofenotípica e de expressão gênica das populações celulares antes e após o co-cultivo com células endoteliais; 12- Avaliação do potencial angiogênico in vivo de populações celulares isoladas por sorting, antes e após o co-cultivo com células endoteliais em modelos de implantes de matrigel em camundongos NOD/SCID utilizando métodos não invasivos (Sistema IVIS); 13- Caracterização dos capilares dos implantes por microscopia confocal; 14- Avaliação do potencial angiogênico in vivo das células endoteliais após a indução da isquemia de membros inferiores, em camundongos NODSCID, 15- Análise histológica dos vasos neo-formados 5 a 10 dias após a infusão das células endoteliais por microscopia confocal. 2

3 6. Plano de trabalho Não se aplica 7. Metodologia Indicar a metodologia que será aplicada na pesquisa pretendida. 1. Isolamento, seleção e cultivo de células-tronco mesenquimais do sangue da medula óssea e da veia umbilical humana e do saco vitelínico canino. Para o isolamento das CTM da medula óssea será realizado o gradiente de ficoll para separação de células mononucleares, seguida do protocolo de aderência ao plástico, cultivo e expansão para a seleção de um população enriquecida em CTM. Para o isolamento de CTM da veia umbilical e saco vitelínico canino será utilizado o protocolo clássico de digestão por colagenase, seguida da aderência ao plástico. 2. Isolamento e cultivo de pericitos cerebrais. Será realizado o gradiente de dextran para a separação dos capilares sangüíneos, seguida da digestão com colagenase para a obtenção das células dos capilares; 3. Clonagem celular: as culturas de CTM dos diferentes tecidos serão submetidas a marcação com diferentes marcadores de CTM e pericitos para a seleção do marcador mais apropriado para a realização da clonagem celular por citometria de fluxo; 4. Modificação Gênica de MSC e pericitos com luciferase e DsRed: Após a clonagem celular, as linhagens celulares serão modificadas geneticametne com o gene da luciferase utilizando o sistema transposional que permite a inserção dos mesmos no genoma das MSC e pericitos. Após a expansão será realizada a seleção de células positivas para DsRed por citometria de fluxo; 5. Isolamento, seleção e cultivo de células endoteliais maduras. Será realizado o despreendimento das células da parede da veia umbilical e do saco vitelínico após o tratamento com colagenase. Em seguida, será realizada a seleção com anti-cd31 por citometria de fluxo. Células positivas para CD31 serão submetidas ao protocolo de aderência ao plástico, em meio específico, para a seleção de uma população homogênea de células endoteliais; 6. Geração ex-vivo de células endoteliais: Células mononucleares da medula óssea e sangue do cordão umbilical serão submetidas a seleção por anti-cd133, seguida do cultivo com um coquetel específico de citocinas para a obtenção de uma população de células endoteliais maduras portadoras de CD31; 7. Análise Morfológica: será realizada por microscopia de contraste de fase e microscopia convencional após a coloração por Leishman; 8. Co-Cultivo das CTM e pericitos com células endoteliais: será realizado o co-cultivo com e sem contato dos dois tipos celulares em placas de 6 poços. As células serão colocadas a princípio na proporção 1:1 e a análise realizada após diferentes tempos de co-cultivo (5, 10, 15 e 20 dias). Periodicamente, as células serão caracterizadas quanto o imunofenótipo e o perfil de expressão gênica para marcadores de MSC, pericitos e endoteliais; 9. Ensaios in vivo da avaliação do potencial angiogênico em camundongos NOD/SCID: MSC ou pericitos serão ressuspendidos em matrigel na presença de células endoteliais e infundidos, via sub-cutânea, em camundongos NOD/SCID; 10. Avaliação dos animais utilizando sistema IVIS: Diferentes tempos após a infusão método não invasivo de obtenção de imagens será utilizado; 11. Avaliação histológica por HE: diferentes tempos após a infusão, os animais serão sacrificados e o matrigel submetido ao procedimentro histológico, seguida da coloração por HE 12. Caracterização das estruturas histológicas por imuno-histoquímica: os tecidos serão fixados, submetidos a cortes de 8 µm e em seguida será realizada a caracterização imuno-histoquímica por microscopia confocal; 13. Lesão isquêmica seguida da infusão das células progenitoras endoteliais e endoteliais geradas exvivo: será realizada a ligação e remoção da artéria femoral em um dos membros inferiores do camundongo seguida da infusão das células endoteliais. Entre 10 a 20 dias após o procedimento cirúrgico os tecidos serão processados para histologia para a caracterização dos vasos neoformados por microscopia confocal. 8. Equipe Executora - Atividades dos pesquisadores que integram o subprojeto 3

4 Descrição detalhada do grupo proponente explicitando a qualificação dos pesquisadores. Especificar as atividades a serem desempenhadas pelos membros da equipe, informando as experiências anteriores dos mesmos em atividades de pesquisa e desenvolvimento. Nome CPF Objetivo/Justificativa da atividade Dimas Tadeu Covas Aparecida Maria Fontes Ricardo B. Silva Danilo Almeida Maristela Delgado Orellana Estudante DTI Patrícia Palma Angélica Miglino VB Avaliação semanal do andamento do projeto com a equipe do Hemocentro Ribeirão Preto Responsável pela elaboração do protocolo experimental Executará os ensaios de expressão gênica dos ensaios de cocultivo, seguida da caracterização em modelo animal Responsável pelos ensaios de co-infusão em matrigel Responsável pelo isolamento e cultivo das MSC, pericitos e endoteliais Auxiliará nos ensaios de lesão isquêmica Responsável pelo sorting por citometria Função no projeto (pesquisador ou responsável pelo Laboratório Coordenador Experiências anteriores a Pós-doc em terapia gênica bolsista Execução dos ensaios pilotos em camundongos bolsista Cultura e expansão de CTM e com ensaios animais Responsável Isolamento e pelo cultivo de MSC e laboratório de endoteliais cultura celular humanas Responsável pelo laboratório de Virgínia Picanço- Castro Danielle AR Magalhães citometria de fluxo Auxiliará nas Bolsista pósdoc discussões dos resultados Auxiliará nas análises Tec. Pesq. de expressão gênica Lab. Transf. e modificação gênica Gênica Avaliação semanal do andamento do projeto com a equipe da Fac. Medicina Veterinária e Zootecnia da USP Irina Kerkis Responsável pela elaboração do protocolo experimental com a equipe da Fac. Medicina Veterinária Coordenadora do projeto com a equipe da Fac. Medicina Veterinária e Zootecnia da USP Análise imunofenotípica por Citometria de Fluxo Modificação Gênica célulastronco Análise de expressão gênica em microarray Coordenadoras de Projeto temático, auxílios à pesquisa e auxílios viagens Titulação MD, Bacharel Mestrando Mestre Bióloga a Profa. com mestrado e doutorado na Rússia, desenvolveu no Brasil a patente Profa. Titular do Departamento de Cirurgia Dra. PcQ IV do Instituto Butantan 4

5 Daniele Santos Martins Carlos Eduardo Ambrosio dos Flávia Thomaz Verechia Pereira e Zootecnia da USP Responsável caracterização células tronco pela das Responsável pelo isolamento e cultivo das CTM e endoteliais Obtenção das células bovinas GFP+ a Pós-doc do LMMD, FZEA- USP, Pirassununga e responsável pelo Unesp Dracena da extração das células de polpa de dente Células-tronco germinativas de origem fetal canina com experiência na área de placentação em carnívoros e cultivo celular Desenvolvimento da gestação conceptos bovinos clonados e transgênicos GFP+ Jovem da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia Profa. Dra. da Faculdade Estadual Paulista unidade Dracena/SP 9. Fontes de financiamento Relação dos projetos financiados nos últimos 5 anos (vigentes ou encerrados) Fonte Financiamento de Título Vigência Valor Relação com a presente solicitação 10. Contrapartida das instituições participantes Detalhar, em moeda corrente nacional, a contrapartida das instituições brasileiras e francesas participantes do subprojeto temático, na forma de: infra-estrutura, recursos financeiros, recursos humanos (horas de trabalho), materiais de consumo e diárias e passagens. Não se aplica 11. Orçamento justificado e adequado com a proposta Formulário anexo 12. Bolsas Esses recursos não poderão ultrapassar 15% do valor total solicitado para o projeto Modalidade de bolsa: (IC, ITI, DTI, AT, PDJ, BEV) Modalidade Duração Quantidade DTI 36 meses Implantação de cursos ou disciplinas de pós-graduação: Detalhar treinamento tecnológico de alto nível ou implantação de metodologias laboratoriais inovadoras 5

6 indicar horas/aula e o programa. Indicar classificação CAPES 6

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