Análise de Imagens APLICAÇÃO DA ANÁLISE DE IMAGENS PARA AVALIAÇÃO DA MORFOLOGIA INTERNA DE SEMENTES FRANCISCO GUILHIEN GOMES JUNIOR 1

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1 33 Análise de Imagens APLICAÇÃO DA ANÁLISE DE IMAGENS PARA AVALIAÇÃO DA MORFOLOGIA INTERNA DE SEMENTES FRANCISCO GUILHIEN GOMES JUNIOR 1 INTRODUÇÃO Um dos requisitos básicos para a identificação de problemas associados com o potencial fisiológico de sementes é a avaliação da sua morfologia interna. Para algumas espécies, como a soja e o milho, o conhecimento sobre a morfologia interna das sementes proporciona eficiente apoio aos programas de controle de qualidade, principalmente com a utilização do teste de tetrazólio. Entretanto, para espécies ainda pouco exploradas pela pesquisa, como as florestais, a caracterização da morfologia interna das sementes, com a identificação das partes que as compõem, são fundamentais para a elucidação de dúvidas sobre a anormalidade de plântulas ou a presença de sementes não germinadas no teste de germinação. Nos últimos anos os estudos dirigidos para a avaliação da morfologia interna de sementes têm sido apoiados em técnicas de análise de imagens. Dentre os métodos utilizados para esta finalidade, destaca-se o teste de raios X, que propicia rápida e eficiente avaliação das partes constituintes da semente da maioria das espécies. O estudo da morfologia interna de sementes por meio da análise de raios X tem gerado informações importantes para o processamento de sementes, principalmente para as espécies florestais, com a eliminação de sementes vazias e mal formadas. Além disso, as imagens radiográficas das sementes combinadas com técnicas computadorizadas de análise de imagens, como o programa Tomato Analyser, sinalizam as novas diretrizes da pesquisa no sentido do desenvolvimento de métodos não destrutivos de análise de sementes para serem integrados aos programas de controle de qualidade das empresas produtoras. O TESTE DE RAIOS X PARA AVALIAÇÃO DA MORFOLOGIA INTERNA DE SEMENTES O pioneirismo da utilização da análise de raios X para a avaliação da morfologia interna de sementes é atribuído a Simak e Gustafsson (1953), com a identificação de anormalidades no embrião de sementes de espécies florestais. A continuidade das pesquisas nesta linha ocorreu mais de 30 anos depois com a identificação de embriões haplóides em sementes de melão (Sauton, 1989) e embriões mutantes em sementes de Arabidopsis thaliana (Bino et al., 1993) e, mais recentemente, na caracterização morfológica de embriões de Tecoma stans (Sokolowski e Cicero, 2008). Ainda, o teste de raios X foi empregado na avaliação de alterações morfológicas no embrião e no endosperma durante a embebição e o condicionamento fisiológico de sementes de tomate (Lui et al., 1993) e na análise de sementes não germinadas no final do teste de germinação (Simak et al., 1989). A análise radiográfica também foi considerada vantajosa para associar aspectos morfológicos das sementes possivelmente associados 1 Eng. Agr., Dr., Departamento de Produção Vegetal, (USP/ESALQ), Piracicaba, SP.

2 34 com a viabilidade (Copeland e McDonald, 1985). Como a viabilidade das sementes submetidas ao comprimento de onda dos raios X não é comprometida devido às baixas doses de radiação utilizadas, possibilitando a realização de testes adicionais com a mesma semente (Bino et al., 1993; ISTA, 1995), vários pesquisadores tem procurado relacionar a morfologia interna das sementes com a germinação ou com a morfologia das plântulas (Tabela 1). A pesquisa sobre este tema tem priorizado o desenvolvimento de metodologias para a análise de sementes por meio de radiografias para espécies florestais, principalmente com o objetivo de aprimorar a qualidade dos lotes de sementes no que diz respeito aos seus atributos físico e fisiológico. Tem sido evidenciado que este benefício pode ser obtido pelo descarte de sementes com danos internos, como foi observado em sementes de Peltophorum dubium (Oliveira et al., 2003), embriões com danos ou anormalidades, como observado em Lithraea molleoides (Machado e Cicero, 2003), sementes vazias ou com danos internos, como em Tabebuia serratifolia e Tabebuia impetiginosa (Oliveira et al., 2004), sementes vazias ou mal formadas, como em Cecropia pachystachya (Pupim et al., 2008) e Lychnophora pinaster (Melo et al., 2009). Um aspecto importante, e que merece destaque com relação à avaliação da morfologia interna de sementes, é a utilização do teste de raios X como ferramenta para o estudo de alterações estruturais durante o condicionamento fisiológico e a dessecação, bem como variações no grau de desenvolvimento embrionário. Isso tem se tornado evidente pelo trabalho desenvolvido por Lui et al. (1993), mencionado anteriormente, e por Goodman et al. (2005), que constataram a eficiência do análise de raios X na avaliação da sensibilidade de sementes de Quercus rubra L. (recalcitrante) à dessecação, determinando-se a separação entre cotilédone-cotilédone e pericarpocotilédone com o avanço da secagem. No caso das variações no grau de desenvolvimento do embrião identificadas por meio de radiografias, uma preocupação atual da pesquisa é a automatização desta determinação no sentido de estabelecer maior precisão, eliminando interpretações subjetivas. Alguns trabalhos realizados com esta finalidade, como por exemplo, o desenvolvido com sementes de Lithraea molleoides (Machado e Cicero, 2003), as análises radiográficas das sementes foram baseadas em diferentes estágios de desenvolvimento do embrião estabelecidos de acordo com a proporção da cavidade embrionária ocupada pelo embrião de 0, < 50, 50 a 75 e 100%, porém a interpretação ocorreu a partir de estimativas visuais. Outros trabalhos citam os critérios < 50% e > 50% do embrião danificado (Oliveira et al., 2004), semente parcialmente formada (Pupim et al., 2008) e aquênios mal formados (Melo et al., 2009), o que não anula o seus méritos científicos, mas aponta para a necessidade do aprimoramento das avaliações para a maior consistência das informações. AVALIAÇÃO AUTOMATIZADA DA MORFOLOGIA INTERNA DE SEMENTES Um dos métodos iniciais propostos para a avaliação automatizada da morfologia interna de sementes foi baseado mensuração computadorizada das áreas correspondentes às partes internas de sementes de tomate (Liu et al., 1993). Assim, o procedimento para a identificação de variações morfológicas entre sementes durante a embebição e o condicionamento fisiológico foi a determinação do espaço livre, que, segundo Liu et al. (1993), corresponde à área vazia entre o embrião e o endosperma. Baseando-se nesta determinação, Dell Aquila (2007) demonstrou que a área de espaços livres pode ser utilizada como um indicador do potencial de germinação, visto que a partir de sementes radiografadas de pimentão, com área livre entre o embrião e o endosperma superior a 2,7%, foi observada redução progressiva na formação de plântulas normais. Na avaliação dos espaços livres das sementes de pimentão foi utilizado o programa denominado Image Pro Plus desenvolvido pela Mediacybernetics, em Silver Spring, EUA. Entretanto, outros programas podem ser utilizados para esta determinação, como por exemplo, o Tomato Analyzer. O Tomato Analyzer foi desenvolvido por pesquisadores da The Ohio State University, EUA, para avaliação semi-automática de características fenotípicas de frutos, permitindo substituir avaliações de atributos morfológicos efetuadas mediante mensurações manuais ou estimativas subjetivas (Brewer et al., 2006; Brewer et al., 2007). O programa foi desenvolvido para processar imagens digitais escaneadas, determinando o formato do fruto e de suas partes, calculando parâmetros a partir da identificação de limites periféricos de cada parte constituinte. A maior parte dos resultados é expressa em termos de relações, geralmente com o perímetro ou área do fruto (Gonzalo et al., 2009).

3 35 TABELA 1. Principais observações, por espécie, obtidas com base na utilização do teste de raios X para a avaliação da morfologia interna de sementes. Espécie Observações Referência Aroeira-branca (Lithraea molleoides) Canafístula (Peltophorum dubium) Ipê (Tabebuia spp.) Milho (Zea mays) Acerola (Malpighia emarginata) Pimentão (Capsicum annuum) Embaúba (Cecropia pachystachya) Ipê-de-jardim (Tecoma stans) Pinhão-manso (Jatropha curcas) Arnica (Lychnophora pinaster) Embriões morfologicamente anormais resultaram em plântulas anormais ou sementes não germinadas; sementes em que a proporção embrião/cavidade embrionária foi inferior a 100% não germinaram. Embriões com mais de 50% da sua área danificada originaram sementes mortas. Identificação de sementes deformadas e vazias; o grau de desenvolvimento das sementes pôde ser diagnosticado com precisão. Sementes esféricas com eixos embrionários apresentando torções não apresentaram problemas na germinação, desde que não apresentassem manchas escuras e sem definição. Todas as sementes que apresentaram embriões morfologicamente anormais ou ausentes resultaram em plântulas anormais ou sementes mortas no teste de germinação. Redução progressiva da formação de plântulas normais a partir de sementes com área de espaços livres entre o embrião e o endosperma superior a 2,7%. Sementes totalmente formadas originaram 67% de plântulas normais no teste de germinação, ao passo que 100% das sementes parcialmente formadas originaram plântulas anormais e sementes não germinadas. A maioria das sementes de menor massa (0,2 a 3,3 mg) apresenta-se com embriões deformados ou sem embrião, enquanto que as de maior massa (3,4 a 11,3 mg) apresentam embriões sem defeitos, em sua maioria ou totalidade. Sementes que apresentaram manchas escuras, como sinais de tecidos deteriorados, em mais de 50% do endosperma e, ou no embrião, não germinaram ou originaram plântulas anormais. Identificação de aquênios cheios, mal formados e vazios dificilmente separados no beneficiamento. Machado e Cicero (2003) Oliveira et al. (2003) Oliveira et al. (2004) Mondo e Cicero (2005) Nassif e Cicero (2006) Dell Aquila (2007) Pupim et al. (2008) Sokolowski e Cicero (2008) Pinto et al. (2009) Melo et al. (2009) Espécies florestais de Lauraceae Abóbora (Cucurbita moschata) Alface (Lactuca sativa) Mamona (Ricinus communis) Danos no embrião ou má formação do tecido cotiledonar resultaram em sementes mortas no teste de germinação. Permitiu identificar sementes cheias, danificadas, translúcidas e vazias; a presença de sementes danificadas e translúcidas foi associada com baixa germinação para a maioria dos lotes. A diferença entre o percentual de sementes com morfologia interna normal e o percentual de germinação não superou 3% para 11 lotes de sementes. Tecidos que resultaram em imagens translúcidas, embriões deformados e tecidos com menos de 50% de endosperma ou manchados afetaram negativamente a germinação. Carvalho et al. (2009a) Carvalho et al. (2009b) Kikuti e Marcos-Filho (2010) Carvalho et al. (2010)

4 36 Programa Tomato Analyser para avaliação da morfologia interna de sementes Embora os idealizadores do Tomato Analyser tenham enfatizado a possibilidade da sua utilização na pesquisa com sementes, o primeiro trabalho que mostrou efetivamente o seu potencial para esta finalidade partiu de uma iniciativa de pesquisadores brasileiros (Marcos Filho et al., 2010). O estudo, que envolveu a análise de imagens de sementes radiografadas de algodão e de cucurbitáceas (pepino, abóbora e melancia), mostrou que o Tomato Analyser é sensível para avaliar, com segurança, o grau de desenvolvimento do embrião dessas sementes, expresso pela área embrionária ou pelo espaço livre existente entre o embrião e o tegumento. No caso do algodão, por exemplo, foram observadas sementes com a área embrionária de 86%, 57% e 41%. O grau de desenvolvimento do embrião foi determinado a partir do parâmetro Pericarp Area fornecido pelo programa. Informações adicionais sobre a utilização do Tomato Analyser para a avaliação da morfologia interna de sementes são encontradas no trabalho de Marcos Filho et al. (2010). Estudos preliminares com sementes de mamona utilizando o Tomato Analyser produziram resultados interessantes quando as sementes foram classificadas em categorias quanto ao grau de desenvolvimento do embrião e relacionadas com o desempenho das plântulas. Na Figura 1 observa-se que as variações do grau de desenvolvimento do embrião das sementes de mamona foram de 71% a 87%. A partir da análise individual das plântulas no quinto dia após a instalação do teste de germinação (Figura 2), pode-se observar que a relação entre o aumento da área do embrião e o comprimento da plântula nem sempre foi positiva. Por exemplo, as sementes 4 e 11 (Figura 1), que apresentaram área embrionária de 84% e 75%, respectivamente, originaram plântulas do mesmo tamanho. Em outra situação, a semente 8, que apresentou área embrionária de 73%, originou uma plântula com maior comprimento em relação à da semente 4 que apresentava maior área embrionária. Ainda, comparandose as sementes 1 e 4, que apresentavam áreas embrionárias semelhantes, originaram plântulas com comprimentos diferentes (9,1 e 5,2 cm, respectivamente). 86% 86% 85% 84% 85% % 87% 73% 78% 71% % 78% 75% 75% 73% FIGURA 1. Radiografias de sementes de mamona analisadas pelo Tomato Analyser classificadas em três categorias quanto ao grau de desenvolvimento do embrião e seus respectivos valores médios de comprimento de plântulas (A: > 80% = 5,6 cm; B: 75 a 80% = 4,5 cm; C: < 75% = 4,6 cm).

5 ,5 cm 5,2 cm 4,1 cm 6,1 cm 5,0 cm 7,8 cm 9,1 cm ,4 cm 4,3 cm 3,0 cm 5,1 cm 3,9 cm 4,5 cm FIGURA 2. Comprimento individual de plântulas de mamona cinco dias após a germinação a 25 C originadas das sementes analisadas pelo Tomato Analyser. Por outro lado, analisando-se as sementes agrupadas em categorias (Figura 2), observa-se que houve uma relação positiva entre o grau de desenvolvimento embrionário e o crescimento das plântulas. Para as sementes classificadas na categoria A (área embrionária > 80%) o comprimento médio de plântulas foi superior ao das sementes das categorias B e C. É importante ressaltar que na obtenção dos valores médios de comprimento de plântulas não foram consideradas as sementes não germinadas (sementes 2 e 14). Perspectivas para a utilização do Tomato Analyser A utilização da análise automatizada por meio do Tomato Analyser representa uma alternativa promissora rumo à padronização das avaliações com a separação das sementes em diferentes categorias quanto ao grau de desenvolvimento embrionário, possibilitando estabelecer relações com o seu potencial de desempenho. Conforme foi enfatizado por Marcos Filho et al. (2010), além de futuras observações sobre a relação desse parâmetro com o possível estabelecimento de valores limite para diferenciar sementes viáveis e não viáveis, há outras abordagens que merecem atenção, pois o procedimento envolvido não é destrutivo e permite a realização de testes subsequentes. Entre os temas interessantes para estudo, podem ser citados, por exemplo, a avaliação da evolução do desenvolvimento do embrião durante a maturação, as possíveis variações do tamanho do embrião durante o armazenamento (associadas ao espaço livre e à provável redução da área embrionária devido ao consumo de reservas da semente) e a resposta da semente ao condicionamento fisiológico seguido ou não por secagem (variação do espaço livre e da área do embrião). CONSIDERAÇÕES FINAIS A avaliação da morfologia interna de sementes é imprescindível tanto para a caracterização de espécies pouco estudadas quanto para a melhoria da qualidade de lotes de sementes, no que se diz respeito ao seu atributo físico e fisiológico, visto que a informação sobre a existência de sementes defeituosas e vazias é desejável porque pode influenciar nos resultados de germinação. A análise de imagens para a avaliação da morfologia interna de sementes, além de não danificar as sementes e possibilitar o exame da sua estrutura, relacionando com outros

6 38 testes, contribui para a consistência das informações, pois os procedimentos podem ser reproduzidos sem a interferência humana. Embora o Tomato Analyser tenha sido desenvolvido para a avaliação de frutos de tomate, é possível sua aplicação em estudos de imagens individuais ou de grupos de sementes de outras espécies, com estrutura semelhante às examinadas no trabalho de Marcos Filho et al. (2010). A continuidade da pesquisa no intuito de estabelecer relações entre a morfologia interna das sementes e o potencial fisiológico por meio deste programa é uma importante iniciativa que poderá trazer informações significativas para a evolução do conhecimento dirigido para o controle de qualidade de sementes. REFERÊNCIAS BINO, R.J.; AARTSE, J.W.; VAN DER BURG, W.J. Nondestructive X-ray analysis of Arabidopsis embryo mutants. Seed Science Research, v.3, n.3, p , BREWER, M.T.; MOYSEENKO, J.B.; MUNFORTE, A.J.; VAN DER KNAAP, E. Morphological variation in tomato: a comprehensive study of quantitative trait loci controlling fruit shape and development. Journal of Experimental Botany, v.58, n.6, p , BREWER, M.T; LANG, L.; K.; DUJMOVIC, N.; GRAY, M.; VAN DER KNAAP, E. Development of a controlled vocabulary and software application to analyze fruit shape variation in tomato and other plant species. Plant Physiology, v.141, n.1, p.15-25, CARVALHO, L.R.; CARVALHO, M.L.M.; DAVIDE, A.C. Utilização do teste de raios X na avaliação da qualidade de sementes de espécies florestais de Lauraceae. Revista Brasileira de Sementes, v.31, n.4, p.57-66, 2009a. CARVALHO, M.L.M.; SILVA, C.D.; OLIVEIRA, L.M.; SILVA, D.G.; CALDEIRA, C.M. Teste de raios X na avaliação da qualidade de sementes de abóbora. Revista Brasileira de Sementes, v.31, n.2, p , 2009b. CARVALHO, M.L.M.; ALVES, R.A.; OLIVEIRA, L.M. Radiographic analysis in castor bean seeds (Ricinus communis L.). Revista Brasileira de Sementes, v.32, n.1, p , COPELAND, L.O.; McDONALD, M.B. Principles of seed science and technology. 2.ed. New York: Macmillan, p. DELL AQUILA, A. Pepper seed germination assessed by combined X-radiography and computer-aided imaging analysis. Biologia Plantarum, v.51, p , GONZALO, M.J.; BREWER, M.T.; ANDERSON, C.; SULLIVAN, D.; GRAY, S.; van der KNAAP, E. Tomato fruit shape analysis using morphometric and morphology attributes implemented in tomato analyzer software program. Journal of the American Society of Horticultural Science, v.134, n.1, p.77-87, GOODMAN, R.C.; JACOBS, D.F.; KARRFALT, R.P. Evaluating desiccation sensitivity of Quercus rubra acorns using X-ray image analysis. Canadian Journal of Forest Research, v.35, p , INTERNATIONAL SEED TESTING ASSOCIATION- ISTA. International rules for testing seed. Seed Science and Technology, v.13, n.2, p , KIKUTI, A.L.P.; MARCOS FILHO, J. Evaluation of lettuce seed viability by combined X-ray and germination tests. In: ISTA CONGRESS, 29, 2010, Cologne. Seed Symposium Abstracts. Bassersdorf: International Seed Testing Association, 2010, p LIU, Y.; VAN DER BURG, W.J.; AARTSE, J.W.; VAN ZWOL, R.A.; JALINK, H.; BINO, R.J. X-ray studies on changes in embryo and endosperm morphology during priming and imbibition of tomato seeds. Seed Science Research, v.3, n.3, p , MACHADO, C.F.; CICERO, S.M. Aroeira branca [Lithraea molleoides (Vell.) Engl. Anacardiaceae] seed quality evaluation by the X-ray test. Scientia Agricola, v.60, n.2, p , MARCOS FILHO, J.; GOMES JUNIOR, F.G.; BENNETT, M.A.; WELLS, A.A.; STIEVE, S. Using tomato analyzer software to determine embryo size in X-rayed seeds. Revista Brasileira de Sementes, v.32, n.2, p , MELO, P.R.B. OLIVEIRA, J.A.; CARVALHO, M.L.M.; GUIMARÃES, R.M.; CARVALHO, B.O. Aplicação do teste de raios X no estudo da morfologia interna e da qualidade fisiológica de aquênios de arnica (Lychnophora pinaster Mart.). Revista Brasileira de Sementes, v.31, n.2, p , MONDO, V.H.V.; CICERO, S.M. Análise de imagens na avaliação da qualidade de sementes de milho localizadas em diferentes posições na espiga. Revista Brasileira de Sementes, v.27, n.1, p.9-18, NASSIF, D.S.P.; CICERO, S.M. Avaliação de sementes de acerola por meio de raios X. Revista Brasileira de Fruticultura, v.28, n.3, p , OLIVEIRA, L.M.; CARVALHO, M.L.M.; DAVIDE, A.C. Utilização do teste de raios X na avaliação da qualidade de sementes de canafístula (Peltophorum dubium (Sprengel)

7 39 Taubert). Revista Brasileira de Sementes, v.25, n.1, p , OLIVEIRA, L.M.; CARVALHO, M.L.M.; GUIMARÃES, R.M.; MASETTO, T.E. Avaliação da qualidade de sementes de Tabebuia serratifolia Vahlnich. e T. impetiginosa (Martius Ex A.P. de Candolle) Standley (Bignoniaceae) pelo teste de raios X. Revista Brasileira de Sementes, v.26, n.2, p , PINTO, T.L.F.; MARCOS FILHO, J.; FORTI, V.A.; CARVALHO, C.; GOMES JUNIOR, F.G. Avaliação da viabilidade de sementes de pinhão manso pelos testes de tetrazólio e de raios X. Revista Brasileira de Sementes, v.31, n.2, p , PUPIM, T.L.; NOVEMBRE, A.D.L.C.; CARVALHO, M.L.M.; CICERO, S.M. Adequação do teste de raios X para avaliação da qualidade de sementes de embaúba (Cecropia pachystachya Trec.). Revista Brasileira de Sementes, v.30, n.2, p.28-32, SAUTON, A.; OLIVIER, C.; CHAVAGNAT, A. Use of soft X-ray technique to detect haploid embryos in immature seeds of melon. Acta Horticulture, v.253, p , SIMAK, M.; BERGSTEN, U.; HENRIKSSON, G. Evaluation of ungerminated seeds at the end germination test by radiografy. Seed Science and Technology, v.17, n.2, p , SIMAK, M.; GUSTAFSSON, A. X-ray photography and sensitivity in forest tree species. Hereditas, v.39, p , SOCOLOWSKI, F.; CICERO, S.M. Caracterização morfológica de embriões por imagens de raios X e relação com a massa e a qualidade fisiológica de sementes de Tecoma stans L. Juss. ex Kunth (Bignoniaceae). Revista Brasileira de Sementes, v.30, n.2, p , 2008.

8 40 SISTEMA COMPUTADORIZADO DE ANÁLISE DE IMAGENS DE PLÂNTULAS (SVIS ) PARA AVALIAÇÃO DO VIGOR DE SEMENTES JULIO MARCOS FILHO 1 INTRODUÇÃO O componente fisiológico da qualidade de sementes tem sido considerado como a principal referência da eficiência e credibilidade de empresas produtoras de sementes, pois seu nível é identificado sem maior dificuldade pelo produtor rural. Sabe-se que o estabelecimento do estande constitui um dos pilares para sustentar a obtenção de produções elevadas por área; consequentemente, o desenvolvimento e o aprimoramento de procedimentos padronizados para avaliação do potencial fisiológico é uma necessidade permanente das empresas produtoras de sementes. O teste de germinação, conduzido de acordo com as instruções contidas nas Regras para Análise de Sementes, tem alto grau de confiabilidade como um dos parâmetros utilizados para a normatização da produção e comercialização de sementes, mas apresenta limitações quanto ao uso dos resultados para estimar o potencial de emergência de plântulas sob condições de ambiente menos favoráveis. A interpretação desse teste destaca a morfologia das plântulas, sem considerar a intensidade e a rapidez do crescimento, fundamentais para a garantia do estabelecimento adequado do estande, nem diferenciar as plântulas fortes e fracas, tornando mais distante a estimativa do desempenho das sementes após a semeadura em campo (Hampton e TeKrony, 1995). Por esses e outros motivos, detalhadamente documentados na literatura, os testes de vigor assumem papel preponderante na composição de programas de controle de qualidade de sementes. Três abordagens são predominantes na determinação direta ou indireta do vigor de sementes: na primeira, há verificação da resposta das sementes submetidas a alguma condição de estresse, como nos testes de frio, envelhecimento acelerado, deterioração controlada e germinação a temperatura subótima. Na segunda, é avaliado o vigor per se, ou seja, o estado metabólico atual da semente, onde são identificadas manifestações do complexo que determina a expressão do potencial fisiológico, destacandose a determinação da atividade de enzima(s) específica(s), como no teste de tetrazólio, e da integridade das membranas celulares (condutividade elétrica, lixiviação de potássio). Finalmente, há procedimentos utilizados para identificar diferenças no vigor de sementes baseando-se no desempenho de plântulas em condições controladas de laboratório ou em campo, como nos testes de velocidade de germinação ou de emergência de plântulas, crescimento de plântulas ou de uma de suas partes, da massa de matéria seca ou da classificação do vigor de plântulas; a descrição detalhada desses testes pode ser encontrada em Marcos Filho et al. (1987), Nakagawa (1999) e Baalbaki et al. (2009). As sementes mais vigorosas originam plântulas com maior desenvolvimento (comprimento ou massa seca), traduzindo a eficiência da ação de mecanismos de reparo e da mobilização de reservas e de síntese de novos tecidos durante a germinação. A avaliação do desempenho de plântulas constitui um dos procedimentos mais antigos de avaliação do vigor de lotes de sementes; além de detectar diferenças no vigor, são muito úteis para identificar sintomas de fitotoxicidade provocada pela aplicação de produtos químicos em plantas ou em sementes, geralmente identificados por atrofias no sistema radicular ou desenvolvimento anormal da parte aérea. Quando conduzidos em laboratório, geralmente seguem as instruções contidas em Regras para a Análise de Sementes, procurando atingir grau elevado de padronização dos resultados. Graças à sua simplicidade, podem ser utilizados para a avaliação do potencial fisiológico de praticamente todas as espécies cultivadas. De um modo geral, embora haja disponibilidade de 1 Eng. Agr. Dr. Prof., Departamento de Produção Vegetal, (USP/ESALQ), Piracicaba - SP. Bolsista do CNPq,

9 41 vários métodos para avaliação do vigor de sementes e os procedimentos para a condução de cada teste estejam razoavelmente bem definidos e produzam resultados confiáveis, sempre há oportunidades para o aprimoramento da metodologia ou inclusão de alternativas inovadoras. A perspectiva é, sempre, favorecer a padronização, a precisão, a objetividade, a redução do período necessário para realização do teste e a consistência das informações proporcionadas. Um dos exemplos mais significativos dessa evolução é a utilização de recursos da informática para a avaliação do potencial fisiológico de sementes. AVALIAÇÃO AUTOMATIZADA DO VIGOR DE SEMENTES Uma das primeiras tentativas para a utilização da análise computadorizada de imagens de plântulas, visando à determinação do vigor de sementes foi efetuada por McCormac et al. (1990), avaliando o comprimento da raiz primária de plântulas normais de cenoura e de alface, e por Howarth e Stanwood (1993), em alface e sorgo. Posteriormente, Sako et al. (2001) desenvolveram, na Ohio State University/EUA, um sistema automatizado para avaliação do vigor de sementes de alface, denominado Seed Vigor Imaging System (SVIS ); para tanto, trabalharam com plântulas escaneadas, cujas partes eram identificadas e marcadas por software específico. Após o processamento das imagens em computador, obtiveram, simultaneamente, dados referentes ao comprimento da raiz primária, do hipocótilo e da plântula toda, além da relação raiz/hipocótilo e parâmetros baseados na velocidade e uniformidade de crescimento. A escolha da alface para esse tipo de estudo foi justificada pela produção de plântulas eretas com raiz primária bem definida; além disso, as partes da plântula são muito bem identificadas, com a separação nítida entre raiz e hipocótilo, auxiliada pela presença de pelos radiculares (ver Figura 1). Nessa mesma época, Geneve e Kester (2001) também demonstraram que o uso de escaner poderia constituir importante ferramenta para o monitoramento da germinação de sementes de floríferas; essa observação foi confirmada por Oakley et al. (2004), trabalhando com sementes de Impatiens sp. O sistema desenvolvido por Sako et al. (2001) foi adaptado com sucesso para outras espécies, como soja (Hoffmaster et al., 2003; Marcos Filho et al., 2009), milho (Otoni e McDonald, 2005), melão (Marcos Filho et al., 2006), permitindo o cálculo de índice de vigor, grau de uniformidade de desenvolvimento e comprimento de plântulas ou de suas partes. Permite efetuar a análise relativamente rápida de plântulas (geralmente menos de 60 segundos para avaliação de 20 ou 25 plântulas em um rolo de papel-toalha), representando economia significativa de tempo, em comparação à maioria dos testes para avaliação do desempenho de plântulas. Os valores do índice de vigor são baseados na rapidez e uniformidade de desenvolvimento das plântulas da amostra, em relação ao máximo valor estimado para plântulas com a idade pré-estabelecida na programação do software. Por outro lado, a uniformidade é determinada com base nos dos desvios do comprimento de cada plântula, em relação àquele máximo desenvolvimento estimado; a informação desse valor deve ser fornecida ao programa antes de se proceder a análise das plântulas escaneadas. Assim, após o processamento das imagens, o software gera automaticamente valores numéricos referentes ao índice de vigor (valores de 0 a 1000, diretamente proporcionais ao vigor) e à uniformidade de desenvolvimento (também de 0 a 1000). Assim, as plântulas ideais seriam as mais longas e uniformes entre si. Além desses parâmetros, é obtido um valor para crescimento (growth), referente à soma do número de pixels/plântula, representando o total obtido para as plântulas analisadas pelo software. SISTEMA COMPUTADORIZADO DE ANÁLISE DE IMAGENS O procedimento para a condução e interpretação dos resultados do SVIS, como é baseado no desenvolvimento de plântulas, deve seguir os cuidados ressaltados por Marcos Filho et al. (1987), Nakagawa (1999) e TeKrony (2003), pois a obtenção de resultados consistentes exige atenção para evitar desvios acentuados das condições adequadas, principalmente quanto à temperatura, disponibilidade de água, grau de umidade e tamanho das sementes. A metodologia para a realização da análise automatizada do vigor de sementes via SVIS, compreenda as seguintes etapas: 1. Germinação As sementes são colocadas para germinar de acordo com instruções existentes nas Regras para Análise de Sementes (Brasil, 2009), quanto ao substrato, temperatura e adição de água. Geralmente, há preferência pela utilização de temperatura constante e, se utilizado papel-toalha, a semeadura é efetuada no terço superior da superfície do

10 42 substrato. Quando são avaliadas sementes menores, como as de hortaliças, a semeadura é efetuada sobre papel-chupão colocado no interior de caixas de plástico. Em ambos os casos, são utilizadas repetições de 20 ou 25 sementes, procurando obter plântulas suficientemente individualizadas para facilitar a identificação correta de cada uma delas pelo software e interpretação correta dos resultados. As amostras são colocadas em posição praticamente vertical (ângulo aproximado de 80 o a 85 o ) nas prateleiras do germinador, para que as plantas permaneçam eretas e obedeçam ao geotropismo. 2. Captação de imagens das plântulas Geralmente são avaliadas plântulas com três ou quatro dias de idade, dependendo da espécie; o desenvolvimento deve ser suficiente para a correta identificação pelo software e permitir a diferenciação do vigor. Se a germinação for conduzida em papel de coloração clara, as plântulas normais de cada repetição são transferidas para uma folha de cartolina de coloração preta com 30cm x 22cm (correspondente ao tamanho da área útil atingida pelo escaner), colocada sobre a plataforma interna de uma caixa de alumínio (60cm x 50cm x 12 cm) onde está montado um escaner; este é posicionado de maneira invertida e operado por software Photosmart, com resolução 100 dpi. A escolha correta do nível de resolução é importante para permitir a determinação direta do comprimento das plântulas, em milímetros, sem necessidade de correção de unidade. Antes de acionar o escaner, há necessidade de verificar a individualidade das plântulas; se houver plântulas com partes superpostas, a separação deve ser efetuada manualmente, para evitar problemas no reconhecimento durante a análise. 3. Ajustes do software Antes da análise das imagens de plântulas de cada amostra, há necessidade de proceder ajustes em dois parâmetros essenciais para a precisão e confiabilidade dos resultados: a) Definição do tamanho das plântulas (mm): permite que o software efetue os cálculos do índice de vigor e da uniformidade de desenvolvimento com base no máximo tamanho estimado para o desenvolvimento das plântulas no período pré-estabelecido (3 ou 4 dias). Esse valor pode ser determinado mediante amostragem após a retirada das plântulas do germinador ou recorrendo ao banco de dados já computados em avaliações anteriores de sementes da espécie em questão. b) Definição das proporções da participação do crescimento e da uniformidade de desenvolvimento das plântulas na composição do índice de vigor calculado pelo software: de um modo geral, tem sido adotada a proporção 70% crescimento : 30% uniformidade, pois as informações obtidas até o momento indicam essa direção.. 4. Processamento das imagens em computador As imagens escaneadas são salvas em pasta criada e muito bem identificada do disco rígido e, em seguida, analisadas pelo software Seed Vigor Imaging System (SVIS ) instalado em computador cuja configuração mínima inclui um processador Pentium III, com CPU de 1,0 GHz, 256 MB RAM e HD de 40Gb, operado por sistema Windows XP. Nessa análise, o eixo raiz/hipocótilo de cada plântula ou, separadamente, a raiz primária e o hipocótilo (como em plântulas de alface e outras hortaliças semelhantes) são marcados em coloração vermelha e/ou verde. Na maioria das plântulas o software executa corretamente essa identificação, mas em certos casos há necessidade de corrigir manualmente os erros (com auxílio do mouse). As correções mais comuns incluem a complementação de partes de plântulas identificadas parcialmente, a exclusão de plântulas com anormalidades extremas ou a inclusão de plântulas não reconhecidas pelo software. O período compreendido entre o escaneamento e o final da análise de cada amostra é, geralmente, inferior a 5 minutos, de modo que é comum a análise de aproximadamente nove amostras (incluindo 4 repetições de cada uma) em 45 a 60 minutos. 5. Resultados e interpretação Depois de computados os valores referentes ao índice de vigor e uniformidade de desenvolvimento (ambos de 0 a 1000), o cursor é posicionado sobre cada plântula e acionado, indicando automaticamente o valor correspondente ao comprimento da plântula demarcada, em milímetros; esses valores são apresentados em janela situada abaixo das imagens das plântulas ou à direita da tela do computador (software para análise em alface ou outras hortaliças de sementes pequenas). Exemplos dessa expressão dos resultados encontram-se nas Figuras 1 e 2, para alface e soja, respectivamente. Na tabela 1, observamse dados obtidos em análises SVIS em plântulas de soja, indicando o desempenho inferior do lote 10, de maneira semelhante ao teste de envelhecimento acelerado (EASS).

11 43 TABELA 1 Valores médios obtidos em testes de germinação, envelhecimento acelerado com solução saturada de sal, emergência de plântulas e índices de vigor, uniformidade e comprimento de plântulas de soja determinados em análises SVIS de cinco lotes de sementes de soja, cultivar Pintado (Marcos Filho et al., 2009). Lotes Germinação (%) EASS 72 h (%) Emerg. Plântulas (%) SVIS (índice de vigor) SVIS (uniformidade) SVIS (compr. plântulas/mm.) 1 93 AB (*) 93 A 96 A 978 A 927 A 96 A 2 93 AB 93 A 91 A 976 A 921 A 91 A 3 96 A 88 AB 93 A 979 A 932 A 93 A 4 92 AB 92 AB 97 A 980 A 934 A 97 A 5 87 B 84 B 82 B 976 A 922 A 82 B (*) Comparação de médias dentro de cada coluna (teste de Tukey, p< 0,05) FIGURA 1. Resultado de análise do vigor de sementes de alface utilizando o SVIS. FIGURA 2. Resultado de análise do vigor de sementes de soja utilizando o SVIS.

12 44 Considerando-se que há influência significativa do genótipo sobre o crescimento de plântulas, as comparações devem se restringir à detecção de possíveis diferenças entre lotes do mesmo cultivar. Dependendo do potencial fisiológico dos lotes avaliados, podem ser verificadas diferenças na sensibilidade dos índices de vigor, de uniformidade de desenvolvimento e comprimento de plântulas ou de suas partes. A Ohio Crop Improvement Association, entidade certificadora de sementes no estado de Ohio/EUA, realizando análises SVIS em amostras sementes de soja, desenvolveu uma escala em que sementes de alto vigor originam índices de 800 a 1000 em plântulas com três dias de idade. As de baixo vigor geram valores inferiores a 300. A utilização do SVIS tem permitido a avaliação segura do vigor de sementes de várias espécies, representando um avanço significativo na determinação do desempenho de plântulas, por envolver procedimentos simples, reduzir a subjetividade, a interferência humana na interpretação dos resultados e o período necessário para a condução do teste (comparado à avaliação manual do crescimento de plântulas). A continuidade da pesquisa certamente permitirá o desenvolvimento de procedimentos confiáveis para outras espécies, além de permitir a identificação de alternativas mais amplas para a utilização desse software para a ampliação do conhecimento nas áreas de Fisiologia e de Avaliação do Potencial Fisiológico de Sementes. REFERÊNCIAS BAALBAKI, R; ELIAS, S.; MARCOS FILHO, J., McDONALD, M.B. Seed vigor testing handbook. Association of Official Seed Analysts. Contribution N o 32 to the Handbook on Seed Testing p. BRASIL, Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento. Regras para análise de sementes. Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento Secretaria de Defesa Agropecuária. Brasília, DF: Mapa/ACS, p. GENEVE, R. L.; KESTER, S. T. Evaluation of seedling size following germination usingcomputer-aided analysis of digital images from a flat-bed scanner. Hort Science, v. 36, n. 5, p , HAMPTON, J.G.; TEKRONY, D.M., ed. Handbook of vigour test methods. Zurich, International Seed Testing Association. 3 a ed. 117 p., HOFFMASTER, A.L.; FUJIMURA, K.; McDONALD, M.B.; BENNETT, M.A. An automated system for vigor testing three-day old soybean seedlings. Seed Science and Technology, v. 31, n.3, p , HOWARTH, M.S.; STANWOOD, P. C.. Measurement of seedling growth rate by machine vision. Transactions of American Society of Agricultural Engineering, v. 36, n. 3, p , MARCOS FILHO, J.; CICERO, S.M.; SILVA, W.R. Avaliação da qualidade das sementes. Piracicaba, FEALQ, p. MARCOS FILHO, J; KIKUTI, A.L.P.; LIMA, L.B. Métodos para avaliação do vigor de sementes de soja, incluindo análise computadorizada de imagens. Revista Brasileira de Sementes, v.31, n.1, p , MARCOS FILHO, J.; BENNETT, M.A.; McDONALD, M.B.; EVANS, A.F.; GRASSBAUGH, E.M. Assessment of melon seed vigour by an automated computer imaging system compared to traditional procedures. Seed Science and Technology, v. 34, n.2, p , McCORMAC, A.C.; KEFFE, P.D.; DRAPER, R.S. Automated vigour testing of field vegetables using image analysis. Seed Science and Technology, v.18, n.1, p , NAKAGAWA, J. Testes de vigor baseados no desempenho de plântulas. In: KRZYZANOWSKI, F.C., VIEIRA, R.D. E FRANÇA NETO, J.B. (Ed.). Vigor de sementes: conceitos e testes. Londrina:, OTONI, R.R.; McDONALD, M.B. Moisture and temperature effects on maize and soybean seedlings using the seed vigor imaging system. Seed Technology, v. 27, n. 2, p , TEKRONY, D.M. Precision is an essential component in seed vigor testing. Seed Science and Technology, v.31, n.2, p , SAKO, Y.; McDONALD, M.B.; FUJIMURA, K.; EVANS, A.F.; BENNETT, M.A. A system for automated seed vigour assessment. Seed Science and Technology, v. 29, n. 3, p , 2001.

13 45 UTILIZAÇÃO DA ANÁLISE DE IMAGEM - CONCEITOS, METODOLOGIAS E USOS MARIA LAENE MOREIRA DE CARVALHO 1 INTRODUÇÃO Um das mais antigas formas de relação do homem com o mundo é a imagem. Do latim, imago é um artefato que reproduz a forma de um objeto. A Análise de imagens é a extração de informações significativas dessas formas, principalmente a partir de imagens digitais por meio de técnicas de processamento que possibilitem a visualização ou a transmissão a um computador. O uso da análise de imagem pode ser tão simples como ler etiquetas com código de barras ou tão sofisticado como identificar a face de uma pessoa. A análise de imagem tem se revelado uma técnica promissora, principalmente pelo seu estágio de evolução tecnológica, que se reflete em avanços na capacidade de captura, tratamento e interpretação de imagens. Essa rapidez na detecção de imagens digitais e no processamento de dados informatizados, a crescente diminuição dos custos tem tornado sistemas de análise de imagem mais atraentes na avaliação automática da qualidade e classificação de produtos agrícolas. Além disso, a combinação das técnicas envolvendo o uso de raios X e da análise de imagem computadorizada pode automatizar procedimentos de classificação de sementes e o desenvolvimento de sofisticados métodos não destrutivos. Técnicas de processamento de imagens digitais propiciam uma sensibilidade maior de análise, inerentes a processamento computacional, permitindo a aquisição de características que seriam humanamente impossíveis de serem observadas. Na área de sementes a análise de imagem é extremamente útil, já que o desenvolvimento de métodos simples, rápidos e não destrutivos para avaliação da qualidade das sementes, que possibilitem uma estimativa do seu potencial de armazenamento ou de desenvolvimento em campo, é de grande importância para o estabelecimento de programas de controle de qualidade dinâmicos e eficientes. Uma imagem só pode ser processada em um computador se estiver no formato digital. A imagem digital é uma representação de uma cena por meio de um conjunto de elementos discretos e de tamanhos finitos, chamados de pixels, colocados em um arranjo bidimensional. A cada pixel é associado um valor, no caso de imagens de tons de cinza, ou um conjunto de três valores (R red, G green, B - blue) para se representar uma cor. A imagem pode ser criada a partir de softwares de desenho ou adquirida por meio de algum dispositivo. A área de processamento de imagens se refere à manipulação destes pixels visando a melhoria na apresentação da imagem, o realce ou eliminação de certas características e a extração de informações (Gonzales 2000). Em linhas gerais, as principais operações a serem realizadas no processamento de imagens são: a aquisição da imagem por meio de algum dispositivo, o pré-processamento, a segmentação, a identificação e o reconhecimento dos objetos ou regiões. Na etapa de pré-processamento procurase minimizar a presença de ruídos na imagem decorrentes da aquisição ou ainda realçar características importantes tornando a etapa de segmentação mais eficiente. Para se realizar a digitalização de imagens são utilizados dispositivos que convertem a radiação incidente em unidades de informações. Exemplos destes dispositivos são os scanners e as câmeras CCD (Couple Charged Device). A análise de imagens radiográficas de sementes se iniciou na década de 50 com os trabalhos de Simack e Gustafsson que utilizaram raios-x como um método alternativo para o uso dos testes de excisão, com o objetivo de avaliar a qualidade de sementes de algumas coníferas. (Simack e Gustafsson,1953; Simack e Sahlen, 1981, Simack,1984) O teste do raio-x é hoje, indicado nas Regras para análises de Sementes nacionais e internacionais para diferenciação entre sementes cheias, vazias, danificadas por insetos e danificadas fisicamente e utilizado rotineiramente nos laboratórios para verificação da qualidade fisiológica de sementes de olericolas e florestais.(liu et al.,1993; Chavagnat, 1987; ISTA, 2009; Brasil 2009). As primeiras informações sobre o uso da analise digital na área de sementes tiveram grande impulso na década de 80, 1 Eng. Agr. Dr. Prof., Departamento de Agricultura, Setor de Sementes, (UFLA) Lavras - MG,

14 46 principalmente para identificar e caracterizar as cultivares ( ), no desenvolvimento de técnicas de reconhecimento de padrões para identificação e classificação de grãos de cereais.( Lai et al. (1986 )e as sementes de plantas daninhas (Granitto, 2002) com base em diferenças na morfologia das sementes, cor e textura. VIEIRA JUNIOR (1998) desenvolveu um protocolo para a determinação do comprimento e da largura de sementes de milho. Essas técnicas se basearam em medidas geométricas do tamanho, ângulo entre arcos, formato entre outras (Zayas et al., 1986); Hawk et al., 1970 ; Luo et al. (1999) e Newman (1989a e b) já utilizaram um sistema de diferenciação de cores para identificar os grãos danificados.outros pesquisadores também utilizaram procedimentos para o estudo de danos mecânicos em sementes como (Cicero et al., 1998; Carvalho et al., 1999; Cicero e Banzatto-Junior, 2003; Girardin et al 1993). GUNASEKARAN et al. (1988) avaliaram danos provocados por patógenos em sementes de soja e milho e mais recentemente a análise de imagens vem sendo utilizada para avaliação de plântulas. KEYS et al. (1984) desenvolveram um sistema automático para estimar o vigor de sementes,denominado de CASAS ( Computerized Automated Seed Analysis System ). Para sementes pequenas como as de alface, cenoura e beterraba MCCORMAC et al. (1990) propuseram uma alteração, via métodos digitais na mensuração do comprimento do sistema radicular para o teste de prancheta inclinada na tentativa de aperfeiçoamento do teste. Um ótimo exemplo da aplicação da análise de imagens se refere a sua utilização para avaliação do vigor de lotes. SAKO et al. (2001) desenvolveram um sistema para indexar automaticamente o vigor de sementes a partir da análise computadorizada de imagens de plântulas de alface e a partir daí aperfeiçoaram o sistema para outras culturas como a soja. O uso de alta velocidade de detecção de imagem digital, do processamento das imagens e da informatização de dados é crescente e vem contribuindo para melhorar os métodos tradicionais para a análise da qualidade das sementes. As técnicas de análise de imagem (algoritmos, softwares e hardwares) e o conhecimento sobre seu comportamento se desenvolveram muito na última década e hoje se encontram numa situação que proporcionam um excelente background para pesquisadores e engenheiros desenvolverem suas pesquisas. A diminuição dos custos e o aumento do poder dos hardwares e softwares para processamento de imagem fizeram com que os sistemas de análise de imagem ficassem mais atraentes como métodos para inspeção automática de diferentes aspectos da avaliação da qualidade e classificação de produtos agrícolas (Chen e Sun, 1991). Não são totalmente utilizadas de maneira independente das demais técnicas experimentais, mas diminuem em muito a necessidade de realizar tais ensaios físicos, muitas vezes caros e/ou demorados. A análise de imagens radiográficas e computadorizadas pode automatizar procedimentos de classificação de sementes e possibilitar o desenvolvimento de sofisticados métodos não-destrutivos. REFERÊNCIAS BRASIL. Ministério da Agricultura e Reforma Agrária. Secretaria Nacional de Defesa Agropecuária. Departamento Nacional de Produção Vegetal. Coordenação de Laboratório Vegetal. Regras para análise de sementes. Brasília, DF, p. CARVALHO, M.L.M.; VAN AELST, A.C.; VAN ECK, J.W.; HOEKSTRA, F.A. Pre harvest stress cracks in maize (Zea mays L.) kernels as characterized by visual, X-ray and low temperature scanning electron microscopical analysis: effect on kernel quality. Seed Science Research, v.9, n.3, p , CHAVAGNAT, A. Use of soft X-ray radiography for studying seed quality in horticulture, Acta Hortic. 215 (1987), pp ,1987. CÍCERO, S. M.; VAN DER HEIJDEN, G.W.A.M., VAN DER BURG W.J., BINO, R.J. Evaluation of mechanical damages in seeds of maize (Zea mays L). by X ray and digital imaging. Seed Science and Technology, v.26, n. p , CICERO, S.M.; BANZATTO-JUNIOR, H.L. Avaliação do relacionamento entre danos mecânicos e vigor, em sementes de milho, por meio da análise de imagens. Revista Brasileira de Sementes, v.25, n.1, p.29-36, GIRARDIN, P.; CHAVAGNAT, A.; BOCKSTALLER, C. Determination des charactéristiques des sementes de mais grace a la radio graphie rayons X. (Determination of characteristic of corn seed by X-ray). Seed Science and Technology, v.21, n.3, p , GONZALEZ, R.C. e WOODS, R.E. Processamento de Imagens Digitais. São Paulo: Edgard. GUNASEKARAN, S.; COOPER, T.M.; BERLAGE, A.G. Evaluating quality factors of corn and soybeans using a computer vision system. Transactions of the ASAE, v.31, n.4, p , 1988.

15 47 HAWK, A.L, KAUFMANN, H.H, WATSON, C.A. Reflectance characteristics of various grain. Cereal Sci Today. 1970;15(11): ISTA - INTERNATIONAL RULES FOR SEED TESTING. Seed Science and Technology p. Supplement. KEYS, R.D.; MARGAPURAM, R.G.;REUSCHE, G.A. Automated seedling length measurement for germination/ vigor estimation using a CASAS (Computerized Automated Seed Analysis System). Journal of Seed Technology, v.9, n.1, p.40-53, LAI, F.S.; ZAYAS I.; POMERANZ Y. Application of pattern recognition techniques in the analysis of cereal grains. Cereal Chemistry. v.63 n2,pag , 1986 LIU, Y. et al. X-ray studies on changes in embryo and endosperm morphology during priming and imbibition of tomato seeds. Seed Science Research, v.3, p , 1993 LUO, X.; JAYAS, D.S.; SYMONS, S.J. Identification of damaged kernels in wheat using a color machine vision. Journal of Cereal Science.;30(1):45 59, doi: / jcrs MCCORMAC, A. C., P. D. KEEFE, and S. R. DRAPER Automated vigour testing of field vegetables. NEUMAN, M.; SAPIRSTEIN, H.D.; SHWEDYK, E.; BUSHUK, W. Wheat grain color analysis by digital image processing: I. Methodology. J Cereal Sci. v.10, pag NEUMAN, M, SAPIRSTEIN, H.D., SHWEDYK, E, BUSHUK, W. Wheat grain color analysis by digital image processing: II. Wheat class determination. J Cereal Sci. 10: ; PABLO, M.; GRANITTO, P.M.; NAVONE, H. D.; VERDES, P.F.; CECCATTO, H.A. Weed seeds identification by machine vision Computers and Electronics in Agriculture.v 33 n1; pag , 2002 SAKO, Y.; McDONALD, M.B.; FUJIMURA, K.; EVANS, A.F.;BENNETT, M.A. A system for automated sees vigour assessment. Seed Science &Technology, v.29, p , SIMACK, M; SAHLEN, K. Comparison between the X-radiography and cutting tests used in seed quality analysis. Science and technology, v9,n1, p , SIMACK, M.; GUSTAFSSON, A. X-ray photography and sensitivity in forest tree species Hereditas 39p , SIMAK, M. A method for removal of filled-dead seeds from a sample of Pinnus contorta, Science and technology, v12, n3, p , SIMAK, M. Testing of forest tree and shrub seeds by X-radiography. In: Tree and shrub seed handbook.chapter 14. International Seed Testing Association. (ISTA) Zurich, Switzerland ZAYAS I.; LAI FS.; POMERANZ, Y. Discrimination between wheat classes and varieties by image analysis. Cereal Chemistry.v.63, n1,pag

16 48 APLICAÇÃO DE IMAGENS RADIOGRÁFICAS NO CONTROLE DE QUALIDADE DE SEMENTES SILVIO MOURE CICERO 1 INTRODUÇÃO A utilização de raios X em programas de controle de qualidade de sementes é uma possibilidade muito interessante e importante, pois é um método de grande precisão, onde as sementes podem ser examinadas individualmente em imagens ampliadas e capazes de indicar, com detalhes, a localização e a extensão das estruturas danificadas ou alteradas. Por se tratar de método não destrutivo, as sementes em análise podem ser submetidas a testes fisiológicos (germinação e vigor) e, desta forma, permitir o estabelecimento de relações entre os danos ou alterações observados e os prejuízos causados ao potencial fisiológico das sementes. Embora o teste de raios X em sementes tenha sido introduzido na Suécia, na década de 50, como um método para avaliar a qualidade de sementes de algumas coníferas (Simak e Gustafsson, 1953) e indicado pela International Seed Testing Association (ISTA), desde os anos 80, para detecção de sementes cheias, vazias, danificadas mecanicamente ou infestadas por insetos, no Brasil a referida técnica teve grande impulso a partir dos anos 90, com a publicação do trabalho realizado por Cicero et al. (1998), com o objetivo de avaliar danos mecânicos em sementes de milho. Do ano de 1998 em diante, houve muitas contribuições científicas envolvendo a utilização de raios X na avaliação da qualidade de sementes de diversas espécies; os trabalhos foram conduzidos, na sua maior parte, no Laboratório de Análise de Imagens do Departamento de Produção Vegetal da Escola Superior de Agricultura Luiz de Queiroz, Universidade de São Paulo, e no Setor de Sementes do Departamento de Agricultura da Universidade Federal de Lavras, os quais estão devidamente equipados para realizar pesquisas utilizando a referida técnica. Com as informações de pesquisa disponíveis atualmente, é possível utilizar imagens radiográficas em programas de controle de qualidade de sementes de milho, soja, amendoim, arroz, feijão, embaúba, acerola, aroeirabranca, arnica, abóbora, pinhão-manso, canafístula, ipêamarelo, ipê-roxo, Tecoma stans L., espécies florestais de Lauraceae, entre outras. Assim, serão abordadas, a seguir, as principais aplicações de imagens radiográficas no controle de qualidade de sementes, envolvendo danos mecânicos, danos causados por insetos, danos causados por secagem, danos por umidade e morfologia interna. DANOS MECÂNICOS Os danos mecânicos em sementes têm sido relatados como uma das causas mais importantes de perda de potencial fisiológico, resultando, muitas vezes, no descarte de lotes de sementes. A avaliação precisa dos referidos danos, assumem, desta maneira, grande importância na tomada de decisão quanto ao destino do lote em avaliação: utilização como sementes ou como grãos. As análises rotineiramente realizadas para a avaliação de danos mecânicos, testes de coloração com tintura iodo e verde rápido (para gramíneas) e imersão em hipoclorito de sódio (para leguminosas) não têm apresentado resultados satisfatórios, pois avaliam apenas os danos que são possíveis de serem observados externamente. Por outro lado, o teste de raios X, permite avaliar internamente, com detalhe, a localização e a extensão do dano. Em trabalhos de pesquisa realizados com sementes de milho (Cicero et al., 1998; Cicero e Banzatto Junior, 2003; Gomes Junior e Cicero, 2010) foi verificado que quando ocorre dano mecânico longitudinalmente na região intermediária da semente, com ruptura superficial (pericarpo), sem atingir o eixo embrionário, a plântula se desenvolve normalmente; por outro lado, ruptura profunda na mesma região, mesmo sem atingir o eixo embrionário, resultará em plântula anormal ou em semente morta, pois a translocação de nutrientes do endosperma para o eixo embrionário é afetada. Os mesmos autores constataram que 1 Eng. Agr. Dr. Prof., Departamento de Produção Vegetal (USP/ESALQ), Piracicaba - SP,

17 49 ruptura profunda, afetando o eixo embrionário resulta em plântula anormal ou em semente morta. Em sementes de feijão foi possível, com utilização de raios X, a identificação de danos mecânicos e relacioná-los com os prejuízos ocasionados à germinação (Forti et al., 2008). Por outro lado, Mondo et al. (2009), com imagens radiográficas de sementes de feijão, cultivar IAC Carioca, submetidas a diferentes números e pressões de impactos mecânicos, concluíram que o aumento do número e da pressão de impacto está diretamente relacionado à diminuição do potencial fisiológico da semente, sendo que o aumento da intensidade proporciona decréscimos maiores e imediatos. Em sementes de soja, Flor et al. (2004) concluiu que a utilização de raios X para a avaliação de danos mecânicos mostrou-se como uma eficiente alternativa em relação a outros métodos utilizados para o mesmo fim, com a vantagem de se poder comprovar os efeitos dos danos por meio de testes fisiológicos, por se tratar de método não destrutivo. Em outro trabalho, Pinto et al. (2009a) concluiu que a análise de imagens radiográficas permite identificar, com eficiência, danos mecânicos em sementes de soja, havendo correlação positiva com os resultados obtidos pelo teste de tetrazólio. Trabalhando com sementes de amendoim, Marchi e Cicero (2010) verificaram que com o teste de raios X é possível relacionar os danos mecânicos com as plântulas anormais ou com as sementes mortas resultantes do teste de germinação. Com sementes de pinhão-manso, Pinto et al. (2009b) verificaram, em imagens radiográficas, que danos mecânicos observados no endosperma, interferindo na translocação de nutrientes para o eixo embrionário, causam prejuízo para a germinação. DANOS CAUSADOS POR INSETOS Resultados obtidos em trabalhos de pesquisa com sementes de soja indicam que a análise de imagens de raios X permite identificar, com eficiência, danos causados por percevejos (Flor et al., 2004; Pinto et al., 2009a) e que existe correlação positiva com os resultados obtidos no teste de tetrazólio (Pinto et al., 2009a). DANOS CAUSADOS POR SECAGEM Imagens radiográficas de sementes de milho (Carvalho e Flor, 2002) e de arroz (Menezes et al., 2005) foram utilizadas, com sucesso, para avaliar os efeitos da secagem sobre o potencial fisiológico das sementes. DANOS POR UMIDADE Em sementes de soja foi possível, com a utilização de imagens radiográficas, avaliar os danos causados por umidade (Flor et al., 2004; Pinto et al., 2007; Forti et al., 2010) e que a eficiência da avaliação é similar ao teste de tetrazólio, tradicionalmente utilizado nesta avaliação (Pinto et al., 2007). MORFOLOGIA INTERNA O maior número de trabalhos de pesquisa com raios X em sementes, realizados no Brasil, envolveram estudos de morfologia interna e sua relação com o potencial fisiológico de sementes de diversas espécies. Assim, em canafístula, Oliveira et al. (2003) verificaram que os danos na morfologia interna, visualizados em radiografias, apresentando mais de 50% da área do embrião danificada, afetam drasticamente a germinação. Trabalhando com aroeira-branca, Machado e Cicero (2003) radiografaram as sementes e as classificaram com base na proporção do embrião em relação à cavidade embrionária, em 0%, <50%, 50-75% e 100%, sendo a última classe dividida quanto à morfologia do embrião, em normal e anormal; concluíram que as sementes em que a proporção embrião/cavidade embrionária foi inferior a 100%, não germinaram, e aquelas pertencentes à classe radiográfica de embriões morfologicamente anormais, resultaram em plântulas anormais ou sementes não germinadas, evidenciando a eficiência da técnica de raios X para avaliar a qualidade das sementes. Em pesquisa similar, Oliveira et al. (2004) radiografaram sementes de ipê-amarelo e de ipê-roxo e concluíram que os defeitos internos, detectados nas radiografias, afetam a germinação. Ainda, na mesma linha de pesquisa, Nassif e Cicero (2006) verificaram que a técnica de raios X permite a detecção de danos e anormalidades em embriões de sementes de acerola que são prejudiciais à germinação. Em trabalho realizado com o objetivo de estudar os efeitos de diferentes posições da semente de milho na espiga sobre o potencial fisiológico, Mondo e Cicero (2005) verificaram, com o teste de raios X, que as sementes das posições proximal e intermediária da espiga apresentam qualidade semelhante e superiores às da posição distal e que as sementes esféricas com eixos embrionários apresentando torções, porém não alterados (sem deterioração), não tem sua qualidade diminuída; no entanto, as alterações no eixo embrionário, caracterizadas por manchas escuras e

18 50 sem definição (com deterioração), presentes em maior quantidade na posição distal da espiga, são responsáveis pela redução da qualidade das sementes. Em sementes de amendoim, Marchi e Cicero (2010) também observaram, em imagens radiográficas, que alterações no embrião, caracterizadas por manchas escuras (tecidos deteriorados) estão relacionadas com anormalidades de plântulas ou com as sementes mortas resultantes do teste de germinação. Com sementes de embaúba, Pupim et al. (2008) verificaram que o teste de raios X é eficiente para avaliar o nível de desenvolvimento das estruturas internas da semente e que existe relação entre o nível de formação ou da morfologia interna das sementes e os resultados do teste de germinação. Em trabalho realizado com sementes de Tecoma stans L., Socolowski e Cicero (2008) avaliaram, utilizando imagens radiográficas, as características morfológicas dos embriões pertencentes a diferentes classes de massa, sendo as sementes dentro de cada classe classificadas em quatro categorias conforme a morfologia interna do embrião: embrião sem defeito, embrião com pequenos defeitos, embrião deformado e semente sem embrião; verificaram que a maioria das sementes das classes de menor massa apresenta embriões deformados ou sem embriões, enquanto as de massa maior apresentam embriões sem defeitos, em sua maioria ou totalidade. Os autores também verificaram que praticamente a totalidade das sementes com embriões sem defeitos germina, porém, nem todas dão origem a plântulas normais. Em sementes de abóbora, Carvalho et al. (2009a) utilizaram o teste de raios X na avaliação da morfologia interna das sementes, as quais foram classificadas em sementes cheias, sementes danificadas e sementes translúcidas; destacaram que o referido teste é eficiente para identificar danos internos que afetam negativamente a sua qualidade fisiológica. Trabalhando com sementes de algumas espécies florestais de Lauraceae, Carvalho et al. (2009b) utilizaram imagens radiográficas na avaliação da morfologia interna das sementes, as quais foram classificadas de acordo com os danos observados nos embriões (aqueles que atingiram menos de 50% do embrião ou aqueles que atingiram, no mínimo, 50% do embrião), sementes infestadas por insetos e sementes com má formação do tecido cotiledonar e concluíram que os danos detectados pela análise radiográfica, independente da causa, afetam a germinação das sementes das espécies estudadas, com exceção daqueles de menores dimensões, distantes do eixo embrionário. Em pinhão-manso, Pinto et al. (2009) constataram, em imagens radiográficas, que as sementes que apresentam manchas escuras (tecidos deteriorados) em mais de 50% do endosperma e, ou no embrião, não germinam ou originam plântulas anormais. Segundo Melo et al. (2009), a arnica é uma espécie medicinal que apresenta um número elevado de aquênios mal formados por ocasião da frutificação, o que dificulta a produção de sementes necessárias para atender a demanda pela indústria farmacêutica. Em função do exposto, os autores estudaram a possibilidade de utilização de raios X na identificação de sementes mal formadas e verificaram que este método é eficiente na separação dos aquênios conforme sua morfologia interna, concluindo que no estádio de maturação dos capítulos com aquênios sem o papus interno são obtidas sementes com qualidade fisiológica superior. CONSIDERAÇÕES FINAIS A utilização de raios X em Tecnologia de Sementes no Brasil está, ainda, restrita aos trabalhos de pesquisa, que têm demonstrado o seu grande potencial para avaliar a qualidade de sementes. A pesquisa tem feito adequadamente o seu papel, ou seja, contribuído com informações técnicas e científicas sobre a viabilidade de utilização de imagens radiográficas em sementes; resta agora implementar a sua introdução em laboratórios de rotina, envolvidos em programas de controle de qualidade. REFERÊNCIAS CARVALHO, M.LM.; SILVA, C.D.; OLIVEIRA, L.M.; SILVA, D.G.; CALDEIRA, C.M. Teste de raios X na avaliação da qualidade de sementes de abóbora. Revista Brasileira de Sementes, v.31, n.2, p , 2009a. CARVALHO, L.R; CARVALHO, M.L.M.; DAVIDE, A.C. Utilização do teste de raios X na avaliação da qualidade de sementes de espécies florestais de Lauraceae. Revista Brasileira de Sementes, v.31, n.4, p.57-66, 2009b. CARVALHO, M.L.M.; FLOR, E.P.O. Uso de los rayos-x para evaluación de daños internos producidos por secamiento y sus efectos em la calidad de semillas de maiz (Zea mays L.). Revista Facultad Nacional de Agronomia, v.55, n.2, p , CICERO, S.M.; van der HEIJDEN, G.W.A.M.; van der BURG, W.J.; BINO, R.J. Evaluation of mechanical damage in seeds of maize (Zea mays L.) by X-ray and digital imaging. Seed Science and Technology, v.26, n.3, p , 1998.

19 51 CICERO, S.M.; BANZATTO JUNIOR, H.L. Avaliação do relacionamento entre danos mecânicos e vigor, em sementes de milho, por meio da análise de imagens. Revista Brasileira de Sementes, v.25, n.1, p.29-36, FLOR, E.P.O.; CICERO, S.M.; FRANÇA NETO, J.B.; KRZYZANOWSKI, F.C. Avaliação de danos mecânicos em sementes de soja por meio da análise de imagens. Revista Brasileira de Sementes, v.26, n.1, p.68-76, FORTI, V.A.; CICERO, S.M.; PINTO, T.L.F. Análise de imagens na avaliação de danos mecânicos e causados por percevejos em sementes de feijão. Revista Brasileira de Sementes, v.30, n.1, p , FORTI, V.A.; CICERO, S.M.; PINTO, T.L.F. Using image analysis technique to evaluate the evolution of weathering damage during the storage in soybean seeds. In: ISTA CONGRESS, 29, 2010, Cologne. Seed Symposium Abstracts. Bassersdorf: International Seed Testing Association, 2010, p.29. GOMES JUNIOR, F.G.; CICERO, S.M. Assessment of mechanical damage in sweet corn seed by image analysis. In: ISTA CONGRESS, 29, 2010, Cologne. Seed Symposium Abstracts. Bassersdorf: International Seed Testing Association, 2010, p.15. MACHADO, C.F.; CICERO, S.M. Aroeira-branca [Lithraea molleoides (Vell.) Engl. Anacardiaceae) seed quality evaluation by the X-ray test. Scientia Agricola, v.60, n.2, p , MARCHI, J.L.; CICERO, S.M. Using X-ray test to evaluate quality of peanut seeds treated with fungicide and insecticide. In: ISTA CONGRESS, 29, 2010, Cologne. Seed Symposium Abstracts. Bassersdorf: International Seed Testing Association, 2010, p.29. MELO, P.R.B.; OLIVEIRA, J.A.; CARVALHO, M.L.M.; GUIMARAES, R.M.; CARVALHO, B.O. Aplicação do teste de raios X no estudo da morfologia interna e da qualidade fisiológica de aquênios de arnica (Lychnophora pinaster Mart.). Revista Brasileira de Sementes, v.31, n.2, p , MENEZES, N.L.; CICERO, S.M.; VILLELA, F.A. Identificação de fissuras em sementes de arroz, após a secagem artificial, por meio de raios X. Ciência Rural, v.35, n.5, p , MONDO, V.H.V.; CICERO, S.M. Análise de imagens na avaliação da qualidade de sementes de milho localizadas em diferentes posições na espiga. Revista Brasileira de Sementes, v.27, n.1, p.9-18, MONDO,V.H.V.; GOMES JUNIOR, F.G.; PUPIM. T.L.; CICERO, S.M. Avaliação de danos mecânicos em sementes de feijão por meio da análise de imagens. Revista Brasileira de Sementes, v.31, n.2, p.27-35, NASSIF, D.S.P.; CICERO, S.M. Avaliação da viabilidade de sementes de acerola por meio de raios X. Revista Brasileira de Fruticultura, v.28, n.3, p , OLIVEIRA, L.M.; CARVALHO, M.L.M.; DAVIDE, A.C. Utilização do teste de raios X na avaliação da qualidade de sementes de canafístula (Pelthophorum dubium). Revista Brasileira de Sementes, v.25, n.1, p , OLIVEIRA, L.M.; CARVALHO, M.L.M.; DAVIDE, A.C. Avaliação da qualidade de sementes de Tabebuia serratifolia Vahl Nich. e T. impetiginosa (Martius Ex A. P. de Candolle) Standley- (Bignoniaceae) pelo teste de raios X. Revista Brasileira de Sementes, v.26, n.1, p , PINTO, T.L.F.; CICERO, S.M.; FORTI, V.A. Avaliação de danos por umidade, em sementes de soja, utilizando a técnica de análise de imagens. Revista Brasileira de Sementes, v.29, n.3, p.28-34, PINTO, T.L.F.; CICERO, S.M.; FRANÇA NETO, J.B.; FORTI, V.A. An assessment of mechanical and stink bug damage in soybean seed using X-ray analysis test. Seed Science and Technology, v.37, p , 2009a. PINTO, T.L.F.; MARCOS FILHO, J.; FORTI, V.A.; CARVALHO, C.; GOMES JUNIOR, F.G. Avaliação da viabilidade de sementes de pinhão manso pelo teste de tetrazólio e de raios X. Revista Brasileira de Sementes, v.31, n.2, p , 2009b. PUPIM, T.L.; NOVEMBRE, A.D.L.C.; CARVALHO, M.L.M.; CICERO, S.M. Adequação do teste de raios X para avaliação da qualidade de sementes de embaúba (Cecropia pachystachya Trec.). Revista Brasileira de Sementes, v.30, n.2, p.28-32, SIMAK, M.; GUSTAFSSON, A. X-ray photography and sensitivity in forest tree species. Hereditas, v.39, p , SOCOLOWSKI, F.; CICERO, S.M. Caracterização morfológica de embriões por imagens de raios X e relação com a massa e a qualidade fisiológica de sementes de Tecoma stans L. Juss. ex Kunth (Bignoniaceae). Revista Brasileira de Sementes, v.30, n.2, p , 2008.

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