Marcador faflp na identificação da diversidade genética de mini-roseiras

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1 REVISTA DE BIOLOGIA E CIENCIAS DA TERRA ISSN Volume 6- Número 1-1º Semestre 2006 Marcador faflp na identificação da diversidade genética de mini-roseiras RESUMO Márkilla Zunete Beckmann 1 *, Francisco Joaci de Freitas Luz 1, Kathia Fernandes Lopes Pivetta 2 As variedades comerciais de mini-rosas no Brasil são diferenciadas apenas pela coloração das flores e conhecidas por nomes populares, não se sabendo ao certo qual sua origem. Neste sentido, o trabalho objetivou dar início ao estudo da diversidade genética existente entre mini-roseiras utilizadas em cultivo comercial no Brasil mediante um teste de primers pelo marcador faflp. Foi extraído o DNA de cinco acessos de mini-roseiras ( pink, vermelha, branca, lilás e rosa claro). Foram amplificadas 216 bandas, sendo 177 bandas polimórficas, com oito pares de primers, sendo que destes, os melhores resultados foram E-ACA/M-CAG, E-ACA/M-CAC e E-ACA/M-CTG, com 36, 45 e 48 bandas polimórficas, respectivamente. A análise de agrupamento mostrou a formação de um único grupo, sendo RB e RRc, os que apresentaram a maior similaridade genética (0,96). Conclui-se a técnica faflp é eficiente na identificação da variabilidade genética existente entre mini-roseiras, utilizando-se apenas três pares de primers. Palavras-chave: Rosa sp., variabilidade genética, primers ABSTRACT Commercial varieties of miniature roses in Brazil are just differentiated by the flowers coloration and known by popular names and not knowing for sure the origin. In these sense, the aim of the study was to give beginning to genetic diversity of miniature rose used in commercial production in Brazil by testing primers through faflp markers. The primers combination had detected 216 amplification bands and 177 were polymorphic, with eight primers pair and of these, the best results were obtained by E-ACA/M-CAG, E-ACA/M-CAC e E-ACA/M with 36, 45 and 48 polymorphic bands, respectively. The cluster showed only one group and RB and RRc presented the highest similarity (0,96). The obtained results led to the conclusion that faflp markers is efficient to identify the genetic variability among the miniature roses analyzed with only three primers pair. Keywords: Rosa sp., faflp, genetic variability, primers 1 - INTRODUÇÃO A roseira pertence ao gênero Rosa, família Rosaceae, sendo cultivada desde os tempos remotos. Segundo Boettcher (1991), o gênero apresenta cerca de 200 espécies silvestres e mais de mil variedades, produtos de cruzamento e retrocruzamentos. Dentre esta gama de variedades de roseira, encontram-se o grupo das mini-rosas, que são de crescimento compacto, floração intensa e se destacam pela grande durabilidade de suas flores, que tem tamanho de pequeno a médio (Boettcher, 1991). Porém, em relação às variedades utilizadas no cultivo comercial de mini-roseiras no Brasil não se têm referências sobre sua origem genética. O Catálogo de Flores e Plantas Ornamentais (VEILING HOLAMBRA, 2002), destaca somente quatro variedades de mini-roseiras, sendo diferenciadas somente pela coloração das pétalas. Segundo Cubero et al. (1995), as variedades de roseiras normalmente são identificadas visualmente por meio de descrições morfológicas, porém requer-se muito esforço e dedicação do avaliador, e a expressão gênica pode estar sujeita às variações do ambiente. Desta forma, métodos que não 139

2 dependam das condições ambientais e que permitam a identificação e seleção de plantas, redução de custo e de tempo são necessários. Os marcadores moleculares têm sido empregados extensivamente e com sucesso na análise genética de plantas e na caracterização da variabilidade existente entre os indivíduos. Várias pesquisas que envolvem técnicas moleculares têm sido realizadas com roseiras, como RLFP por Ballard et al. (1995); RAPD por Torres et al. (1993), Cubero et al. (1995), Reynders-Aloisi & Bollereau (1995) e Gallego & Martinez (1996); e AFLP por Debener & Mattiesch (1999), Crespel et al. (2001), Zhang et al. (1999) e Zhang et al. (2001). Porém, dentre todas estas, AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism ou Polimorfismo de Comprimento de Fragmentos Amplificados) tem sido utilizada com muito sucesso, devido às vantagens que apresenta para estudos sistemáticos: ela é reproduzível, rápida e confiável, além de haver um número ilimitado de marcadores (Kardolus et al., 1998). Com o desenvolvimento dessas ferramentas para as análises genéticas em nível molecular, tornou-se possível examinar em maiores detalhes a origem evolucionária dos genomas vegetais, assim como acessar o grau de variabilidade genética relatado em grupos de plantas. Neste sentido, este trabalho teve como objetivo dar início ao estudo da diversidade genética existente entre mini-roseiras utilizadas em cultivo comercial no Brasil mediante um teste de primers pelo marcador faflp. 2 - MATERIAL E MÉTODOS O trabalho foi desenvolvido no Laboratório de Micropropagação do Departamento de Produção Vegetal e Laboratório de Bioquímica de Microorganismos e Plantas do Departamento de Tecnologia da Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias da Universidade Estadual Paulista (UNESP- FCAV), Jaboticabal, SP. O material vegetal foi coletado de plantas presentes no Viveiro Experimental de Plantas Ornamentais e Florestais da UNESP-FCAV, oriundos de Holambra-SP. Os acessos utilizados estão identificados na Tabela 1. Tabela 1. Identificação dos 5 acessos de mini-roseiras utilizados na análise de faflp. Jaboticabal-SP, Amostra Descrição Código Origem 1 Rosa sp. Pink RP Holambra-SP 2 Rosa sp Vermelha RV Holambra-SP 3 Rosa sp. Branca RB Holambra-SP 4 Rosa sp. Lilás RL Holambra-SP 5 Rosa sp. Rosa Claro RRc Holambra-SP Foram coletadas, aleatoriamente, 10 a 20 folhas jovens e sadias de uma planta de cada acesso. A extração do DNA genômico foi realizada de acordo com a metodologia descrita por Ferreira & Grattapaglia (1998). A quantificação do DNA das amostras foi realizada com auxílio de biofotômetro. Além da concentração de DNA, observou-se a relação entre as absorbâncias 260 e 280nm (ácidos nucléicos/proteínas) para a verificação da qualidade do DNA. Foi realizada também a verificação da integridade do DNA das amostras por meio dos testes em gel de agarose 0,8%. A análise com marcadores faflp (técnica AFLP com a utilização de iniciadores com corantes fluorescentes) foi realizada de acordo com o AFLP "Plant Mapping Protocol" da Applied Biosystems (1997), seguindo quatro etapas: 1) Digestão: o DNA foi digerido a partir da reação com enzimas de restrição utilizandose 500ng de DNA (10µL). Foram adicionados 1,25µL de tampão React 1 (500mM Tris-HCl ph 8,0; 100mM MgCl 2 ), 5U de EcoRI (0,5µL) e 1,5U de MseI (0,3µL). A reação foi incubada no termociclador por 14h a 37 C e, após esse período, as enzimas foram inativadas a 65 C por 10min. 2) Ligação dos adaptadores: retiraramse 3,67µL da reação de digestão e acrescentaram-se 1µL de tampão T 4 DNA ligase, 0,5 µl da enzima T 4 DNA ligase, 0,33µL do adaptador para o corte da EcoRI e 0,33µL do adaptador para o corte da MseI (ambos previamente pareados a 95 C por 5min). A ligação ocorreu por 2h a 20 C, no termociclador e, em seguida, a amostra foi diluída em 10 vezes. 3) Amplificação pré-seletiva: das amostras diluídas preparadas a partir das reações de digestão e ligação dos adaptadores, 140

3 retiraram-se 2µL e acrescentaram-se 0,5µL da mistura dos primers pré-seletivos AFLP EcoRI e MseI e 7,5µL de AFLP Core Mix. As amostras foram colocadas no termociclador com o seguinte programa: um ciclo de 2 a 72 C; seguido de 20 ciclos de 20 a 94 C + 20 ciclos de 30 a 56 C + 20 ciclos de 2 a 72 C; finalizando com um ciclo de 30 a 60 C. Os produtos amplificados na reação pré-seletiva foram diluídos 2 vezes. 4) Amplificação seletiva: retirou-se 1,5µL da reação pré-seletiva diluída e acrescentaram-se 7,5µL do AFLP Core Mix, 0,7µL do primer AXX da EcoRI (marcado por fluorescência) e 0,7µL do primer CXX da MseI (não marcado por fluorescência). Após o preparo das reações, as amostras foram colocadas no termociclador com o seguinte programa: 1º) um ciclo de 2 a 94 C; 2 ) um ciclo de 20 a 94 C + um ciclo de 30 a 66 C + um ciclo 2 a 72 C; 3 ) um ciclo de 20 a 94 C, 30 a 65 C e 2 a 72 C, sendo que até o 10 passo foram marcados pela diminuição em 1 C do ciclo intermediário da fase anterior até chegar à temperatura de 57 C, e o restante igual; 11 ) 21 ciclos de 20 a 94 C, 30 a 56 C e 2 a 72 C; finalizando com um ciclo de 30 a 60 C. Retirou-se 1,5µL da reação seletiva e foi adicionado 1,6µL de um mix contendo 1,5µL de formamida deionizada, 0,9µL de blue dextran e 0,3µL do padrão interno de peso molecular GeneScan-500 [ROX] marcado por fluorescência vermelha. No termociclador, desnaturou-se a reação a 95 C por 5min. Foi aplicado 1,5µL de cada amostra num gel 5% desnaturante Long-ranger usando como tampão de corrida TEB 1x. Os pares de primers utilizados no teste de primers encontram-se na Tabela 2. Tabela 2. Combinação de primers (EcoRI-MseI) utilizados na técnica faflp para caracterização de mini-rosas. Jaboticabal-SP, Combinação EcoRI-MseI Combinação EcoRI-MseI Combinação EcoRI-MseI FAM a NED b JOE c E-ACA M-CAA E-AGC M-CAA E-AGG M-CAA E-ACA M-CAC E-AGC M-CAC E-AGG M-CAC E-ACA M-CAG E-AGC M-CAG E-AGG M-CAG E-ACA M-CTG E-AGC M-CTG E-AGG M-CTG a FAM = fluorescência azul; b NED = fluorescência amarela; c JOE = fluorescência verde; O desenvolvimento da eletroforese para visualização dos fragmentos de DNA foi realizado no seqüenciador ABI PRISM 377 DNA Sequencer. Após a amplificação, os dados foram obtidos por meio do software Gene-Scan Analysis (Applied Biosystems ). Para avaliação da distância genética entre os acessos, foi construída uma tabela binária, analisando-se a presença (1) e ausência (0) de bandas com auxílio do software Genotyper DNA Fragment Analysis (Applied Biosystems ). Em seguida, construiu-se uma matriz de distância com auxílio do software Paup [4.0b10] com bootstrap de 1000 vezes. Com esta matriz, foi plotado o dendrograma pelo padrão de agrupamento Neighbor-Joining por meio do software Mega (Kumar et al., 2004), para verificar a diversidade genética entre os materiais RESULTADOS E DISCUSSÃO Dos doze pares de primers utilizados no trabalho em apreço, oito combinações revelaram um total de 216 bandas amplificadas que variaram de 50 a 500 pb, das quais 177 foram polimórficas, o que representa 82% de polimorfismo. Observa-se que o primer EcoRI tem importante função na qualidade do perfil gerado pela técnica faflp, o que pode ser detectado na Tabela 3, em que somente uma combinação do primer E-AGC mostrou bandas polimórficas. Os primers E-ACA e E-AGG apresentaram o maior número de combinações que amplificaram fragmentos, no entanto, somente três combinações de primers mostraram valores significativos que possam acessar o polimorfismo entre os acessos de mini-roseiras do presente estudo. 141

4 Tabela 3. Combinação de primers ( ) que produziram o melhor perfil nos acessos de mini-roseiras, por meio do faflp. Jaboticabal-SP, EcoRI Primers MseI Primers M-CAA M-CAC M-CAG M-CTG E-ACA E-AGC E-AGG Os pares de primers que apresentaram os melhores resultados foram E-ACA/M-CAG, E- ACA/M-CAC e E-ACA/M-CTG. O número de bandas polimórficas geradas foi de 36, 45 e 48 bandas, respectivamente. Estes resultados estão de acordo com Zhang et al. (2001) em que realizaram um estudo com 106 variedades modernas de roseira. Também confirmaram a importância do primer EcoRi na detecção do polimorfismo, pois as combinações com E-AGC e E-AAG não produziram nenhuma marca polimórfica. Dentre os 11 pares de primers que selecionaram para realizar o trabalho, também fizeram uso do E- ACA/M-CAG, E-ACA/M-CTG e E-ACA/M- CAC, que amplificaram 28, 38 e 45 bandas polimórficas. Crespel et al. (2001) estimaram a heterogozidade em duas espécies de rosas com a técnica AFLP, utilizando oito combinações de primers, dentro estes, também E-ACA/M-CAG, E-ACA/M-CTG e E-ACA/M-CAC. Os dados do presente trabalho mostram a eficiência do marcador faflp em detectar alto nível de polimorfismo molecular entre os acessos de mini-roseiras, com média de 43 bandas/par de primer, assim como é comprovado por Zhang et al. (1999) e Zhang et al. (2001) quando obtiveram médias de 27 e 36 bandas polimórficas por combinação de primer, respectivamente. De acordo com Vos et al. (1995), um grande número de bandas polimórficas evidencia a potencialidade do marcador AFLP em detectar a variabilidade genética existente entre os indivíduos. A eficiência da técnica AFLP também pode ser confirmada em trabalhos realizados com outras culturas, como girassol (Hongtrakul et al., 1997), milho (Marsan et al., 1998) e maracujazeiro-amarelo (Ganga et al., 2004). Quanto ao alto polimorfismo detectado entre os acessos de mini-rosas, também pode ser confirmado por outras técnicas moleculares ao serem aplicadas em espécies de rosas, como RLFP (Hubbard et al., 1992) e RAPD (Cubero et al., 1995). A análise de agrupamento com base nas distâncias genéticas (Figura 1), a partir dos três melhores pares de primers, mostrou a formação de um único grupo, porém, observa-se que os acessos codificados como RB e RRc, foram os que apresentaram a maior similaridade genética (0,96). Possivelmente, estes dois acessos possuam um ancestral em comum. Figura 1. Dendrograma de 5 acessos de mini-roseiras, baseado na técnica faflp, utilizando o padrão de agrupamento Neighbor-Joining. Jaboticabal-SP, Face ao exposto, este estudo de diversidade genética entre acessos de mini-rosas permitiu a obtenção de informações úteis ao seu manejo, pois na literatura não há relatos sobre trabalhos que tenham quantificado a variabilidade existente entre mini-roseiras com 142

5 técnicas tão consistentes, gerando resultados precisos por não terem influencia do meio ambiente. Tais resultados poderão auxiliar na definição de estratégias mais eficientes para serem utilizados em programas de melhoramento genético. 4 - CONCLUSÕES A técnica molecular AFLP é eficiente na identificação da variabilidade genética existente entre mini-roseiras. Três pares de primers (E-ACA/M-CAG, E-ACA/M-CAC e E-ACA/M-CTG) são suficientes para caracterizar mini-roseiras. 5 - AGRADECIMENTOS Ao Laboratório de Micropropagação, do Departamento de Produção Vegetal (Horticultura) e ao Laboratório de Bioquímica de Microrganismos e Plantas da UNESP-FCAV, em especial a Profa. Leila Trevizan Braz e Profa. Eliana Gertrudes de Macedo Lemos, pela infra-estrutura fornecida para a realização do estudo em apreço. 6 - REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS APPLIED BIOSYSTEMS PE AFLP Plant Mapping Protocol. 45p. BALLARD, R.E.; RAJAPAKSE, S.; ABBOTT, A.G.; BYRNE, D. DNA markers in rose and their use for cultivar identification and genome mapping. Acta Horticulturae, Leuven, n.424, p , BOETTCHER, A. Sítios e jardins: rosas. São Paulo: Editora Europa, p. CRESPEL, L.; ZHANG, D.; MEYNET, J.; GUDIN, S. Estimation of heterozygosity in two botanic rose species using AFLP markers. Acta Horticulturae, Leuven, n.546, p , CUBERO, J.I.; MILLAN, T.; OSUNA, F. Varietal identification in Rosa by using isozyme and RAPD markers. Acta Horticulturae, Leuven, n.424, p , DEBENER, T.; MATTIESCH, L. Construction of a genetic linkage map for roses using RAPD and AFLP markers. Theoretical and Applied Genetics, Berlin, v.99, n.5, p , FERREIRA, M.E.; GRATTAPAGLIA, D. Introdução ao uso de marcadores moleculares em análise genética. 3.ed. Brasília: Embrapa- Cenargen, p. GALLEGO, F.J.; MARTINEZ, I. Molecular typing of rose cultivars using RAPDs. Journal of Horticultural Science, Warnick, v.71, n.6, p , GANGA, R.M.D.; RUGGIERO, C.; LEMOS, E.G.M.; GRILI, G.V.G.; GONÇALVES, M.M.; CHAGAS, E.A.; WICKERT, E. Diversidade genética em maracujazeiro-amarelo utilizando marcadores moleculares faflp. Revista Brasileira de Fruticultura, Jaboticabal, v.26, n.3, p , HONGTRAKUL, V.; HUESTIS, G.M.; KNAPP, S.J. Amplified fragment length polymorphisms as a tool for DNA fingerprinting sunflower germplasm: genetic diversity among oilseed inbred lines. Theoretical and Applied Genetics, Berlin, v.95, p , HUBBARD, M.; KELLY, J.; RAJAPAKSE, S.; ABBOTT, A.G.; BALLARD, R.E. Restriction fragment length polymorphisms in rose and their use for cultivar identification. HortScience, Alexandria, v.27, p , KARDOLUS, J.; ECK, H.; BERG, R. The potential of AFLP in biosystematics: a first application in Solanum taxonomy. Plant Systems Evolutive, v.2, p , KUMAR, S. et al. Mega3: integrated software for molecular evolutionary genetics analysis and sequence alignment. Briefing in Bioinformatics, 5:2, 2004 (In Press). MARSAN, P.A.; CASTIGLIONI, P.; FUSARI, F.; KUIPER, M.; MOTTO, M. Genetic diversity and its relationship to Irbid performance in maize as revealed by RFLP and AFLP markers. Theoretical and Applied Genetics, Berlin, v.96, p ,

6 REYNDERS-ALOISI, S.; BOLLEREAU, P. Characterization of genetic diversity in genus Rosa by random amplified polymorphic DNA. Acta Horticulturae, Leuven, n.424, p , TORRES, A.M.; MILLAN, T.; CUBERO, J.I. Identifying rose cultivars using random amplified polymorphic DNA markers. HortScience, Alexandria, v.28, n.4, p , VEILING HOLAMBRA. Catálogo de flores e plantas ornamentais. Holambra: Veiling Holambra, p. ZHANG, D.; GERMAIN, E.; REYNDERS- ALOISI, S.; GANDELIN, M.H. Development of amplified fragment length polymorphism markers for variety identification in rose. Acta Horticulturae, Leuven, n.508, p , ZHANG, D.; BESSE, C.; CAO, M.Q.; GANDELIN, M.H. Evaluation of AFLPs for variety identification in modern rose (Rosa hybrida L.). Acta Horticulturae, Leuven, n.546, p , Pós-graduandos(a) em Agronomia (Produção Vegetal), Universidade Estadual Paulista (UNESP), Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias (FCAV), Depto. Produção Vegetal, Via de Acesso Prof. Paulo Donato Castellane, s/n, CEP , Jaboticabal-SP, Brasil. E- mail: zunete@fcav.unesp.br; *Autor correspondente. 2 Prof. Dra. Titular, Depto. de Produção Vegetal, UNESP-FCAV, Jaboticabal-SP, Brasil. 144