ANÁLISE DA D IVERSIDADE DE ESPÉCIES E CARACTERIZAÇÃO DO DNA MITOCONDRIAL DE ABELHAS DO PARQUE ECOLÓGICO DA CACHOEIRINHA (IPORÁ, GO)

Transcrição

1 ANÁLISE DA DIVERSIDADE DE ESPÉCIES E CARACTERIZAÇÃO DO DNA MITOCONDRIAL DE ABELHAS DO PARQUE ECOLÓGICO DA CACHOEIRINHA (IPORÁ, GO) Leandro Rodrigues Santiago 1,4 ; Flávio de Oliveira Francisco 2,4 ; Rute Magalhães Brito 3,4,5 ; Maria Cristina Arias 5 1 Bolsista PBC/UEG 2 Pesquisador Orientador 3 Pesquisadora Voluntária 4 Curso de Ciências Biológicas, Unidade Universitária de Iporá, UEG. 5 Pesquisadora Instituto de Biociências, USP. RESUMO - As abelhas possuem grande importância econômica e ecológica. Tendo o pólen e o néctar como suas principais fontes de energia e proteínas, as abelhas realizam cerca de 40 a 90% da polinização de fanerógamas em diversos ecossistemas, influenciando diretamente a diversidade vegetal. A ação antrópica vem causando a diminuição de abelhas e de sua distribuição geográfica, levando a uma preocupação em se estudar a diversidade da apifauna brasileira. Neste trabalho, foi realizado um levantamento da diversidade apícola do Parque Ecológico da Cachoeirinha (Iporá, GO), bem como a análise molecular através do PCR+RFLP do DNA mitocondrial (DNAmt), para o reconhecimento de sua diversidade genética. Essa técnica permite a comparação interespecífica de sítios de restrição de regiões do DNAmt. Foram realizadas 10 horas de coleta na primavera, 24 horas no verão e 24 horas no outono. No total foram coletadas 945 abelhas. Os resultados mostraram grande diversidade de espécies e predominância de abelhas da tribo Meliponini. A proximidade entre os ninhos é a provável explicação para esta predominância, pois algumas abelhas apresentam comunicação intensa e específica ao encontrarem alimento, assim forrageando em grupo, acabam influenciando no número de indivíduos coletados. Três enzimas de restrição foram utilizadas na análise de fragmentos mitocondriais amplificados via PCR. Grande variabilidade genética foi observada no DNAmt entres as seis espécies estudadas, encontrado-se cinco haplótipos distintos. Palavras-chave: abelhas, diversidade, DNAmt. 1. INTRODUÇÃO 1.1. Abelhas - No Brasil, as abelhas em geral, principalmente os meliponíneos, terminologia usada para as abelhas sem ferrão, têm sido criadas para a produção de mel, cera, própolis, entre outros. Contudo pode-se dizer que o seu principal produto e função, é a polinização, pelo fato do néctar e do pólen das flores serem suas principais fontes de energia e proteínas, Nogueira-Neto (1997). Abelhas estão diretamente ligadas ao seu ecossistema e são

2 2 responsáveis, de acordo com o mesmo, por 40 a 90% da polinização de fanerógamas, Kerr et al. (1996), o que acaba refletindo na diversidade vegetal. As abelhas também possuem importância econômica, já que o mel é usado como matéria-prima em vários produtos, Nogueira-Neto (1997). Sabe-se hoje da grande importância em se estudar a diversidade de abelhas, visto a sua relação direta com a diversidade vegetal. Atualmente, existem poucos estudos sobre a biologia e a diversidade da apifauna brasileira e o crescente aumento na devastação da flora, em especial o bioma cerrado, região Centro-Oeste, onde as abelhas realizam 60% a 75% da polinização, Silberbauer-Gottsberger e Gottsberger (1988), dificulta ainda mais esse tipo de estudo, visto que seu habitat é destruído, causando assim um isolamento de colônias, fazendo com que elas fiquem restritas a manchas de vegetação, que são insuficientes para o seu completo desenvolvimento, Viana e Melo (1987). Muitas abelhas dependem de substratos como ocos de árvores para a nidificação e, devido à falta deles, muitas constróem seus ninhos em frestas de muros ou paredes localizadas nas cidades ou em construções abandonadas nas manchas vegetais, fazendas, etc. Kerr et al. (1996). Esse isolamento promove a distância entre as diversas colônias, impedindo o fluxo gênico e favorecendo a endogamia, que diminui a variabilidade genética, Aidar (1996). Essa constante devastação ambiental e conseqüente diminuição na apifauna brasileira traz a cada dia a necessidade de se realizar um estudo da diversidade de abelhas, que é um dos objetivos deste trabalho, visto a sua importância e urgência para a expansão do conhecimento da apifauna já existente O DNA mitocondrial - Em abelhas Apis mellifera, estudos como análise morfométrica e molecular tem sido muito empregados, sendo que o DNA mitocondrial (DNAmt), se mostrou muito eficiente como marcador em estudos de detecção de polimorfismos a nível populacional e intersubespecífico em A. mellifera; Arias e Sheppard (1996). A caracterização do DNAmt envolvendo abelhas brasileiras é recente e está restrita a alguns gêneros, Francisco et al. (2001); Arias et al. (2003); Weinlich et al. (2004). A descrição de marcadores moleculares baseados na PCR, tais como PCR+RFLP, aumentou a eficiência de detecção de polimorfismos no nível do DNA, traduzida em redução do tempo de execução dos experimentos, do seu custo e da sua complexidade, Matioli e Passos-Bueno (2001). O fato da molécula de DNAmt apresentar uma alta taxa de evolução, ser circular, pequena e de estrutura gênica simples faz com ela seja muito utilizada em estudos de caráter evolutivo e filogenético, Brown (1985); Harrison (1989).

3 3 Em vista de características mencionadas como: fácil extração a partir de tecidos preservados e alto polimorfismo, utilizamos o PCR+RFLP para a caracterização do DNAmt de algumas das espécies coletadas com o intuito de ampliarmos nosso conhecimento sobre essa molécula nesse grupo de organismos e se ter uma noção de sua diversidade genética no Parque Ecológico da Cachoeirinha (Iporá, GO). 2. MATERIAL E MÉTODOS 2.1. Área de estudo Toda a área de estudo deste trabalho, possui aproximadamente 5 ha (H.F. Cunha, comunicação pessoal), apresentando uma mata ciliar abundante e várias cachoeiras. Há apenas 6 anos esta área foi entregue à Prefeitura Municipal de Iporá e transformada no Parque Ecológico da Cachoeirinha, destinado ao lazer, estudos e pesquisas acadêmicas Metodologia de coleta - As abelhas foram coletadas de acordo com a metodologia proposta por Sakagami et al. (1967), também foi utilizado o sistema de varredura sobre as plantas. As coletas foram realizadas entre 6:30 e 18:30 horas, de acordo com as condições do tempo, não havendo coletas em dias chuvosos. As abelhas coletadas foram colocadas em sacolas plásticas e estas, em potes, cada um representando um horário e uma área de coleta. Depois de coletadas, foram congeladas preservando-se a morfologia e o DNA mitocondrial para a identificação e análise molecular. A identificação morfoespecífica foi feita por um especialista. No total foram realizadas 58 horas de coleta, divididas por estação do ano da seguinte maneira: primavera (10 horas), verão (24 horas) e outono (24 horas), não houve coleta no inverno Análise ecológica - A abundância relativa das várias espécies foi representada segundo o procedimento de PRESTON, Laroca (1995). O programa BIO-DAP, Magurran (1988) foi utilizado para o cálculo da diversidade de espécies usando-se o índice de SHANNON-WIENER, Zar (1974). O índice de similaridade de SORENSEN também foi calculado pelo mesmo programa Análise genética - Para a análise molecular foram escolhidas seis espécies (Trigona recursa, Tetragona clavipes, Augochloropsis sp.2, Melipona sp., Bombus sp. e Centris lútea), e de cada uma foi retirada uma perna para a extração do DNA. O DNA foi isolado seguindo o protocolo de Walsh et al. (1991). Para a amplificação do DNA mitocondrial foram utilizados

4 4 primers universais para insetos mtd7 + mtd9 (Simon et al., 1994), e primers derivados de Apis mellifera 16SR + 16SF (Hall e Smith, 1991; Arias et al., 1998). Duas regiões do genoma mitocondrial foram amplificadas via PCR, as regiões 16S (subunidade ribossômica menor) e COI (citocromo c oxidase subunidade 1) e digeridas com simples digestões overnight, segundo o descrito em Francisco (2002), com três enzimas de restrição, Rsa I (GT/AC), Hinf I (G/ANTC) e PSt I (CTGCA/G), que reconhecem 4, 5 e 6 pares de bases, respectivamente. 3. RESULTADOS E DISCUSSÃO 3.1. Análise ecológica - Foram coletados 945 indivíduos pertencentes a cinco famílias, 25 gêneros e 42 espécies (Tabela 1). A abundância relativa do número de indivíduos e espécies (entre parêntesis) por famílias de abelhas coletadas foi o seguinte: Andrenidae 0,1% (2,4%); Apidae 98,3% (75,6%); Colletidae 0,53% (9,7%); Halictidae 0,84% (7,3%); Megachilidae 0,21% (4,9%). A maior abundância de Apidae pode ser explicada pelo fato de que as abelhas dessa família formam colônias e por isso são muito mais numerosas do que as abelhas solitárias. Com relação à estação climática, as abundâncias relacionadas ao total de indivíduos coletados e de espécies (entre parêntesis) foram: primavera 17,3% (24,4%); verão 31,5% (63,4%); outono 51,1% (63,4%). O menor valor encontrado na primavera pode ser explicado pelo menor número de horas de coleta realizada nessa estação. As espécies mais abundantes foram Apis mellifera (12,2%), Tetragona clavipes (15,4%), Trigona recursa (16,7%) e Trigona spinipes (29,1%). Tais resultados indicam um grande número de ninhos de Trigona no local de coleta, assim como uma menor especificidade de horário e ambiente por essas abelhas. A proximidade entre os ninhos também é um fato relevante, pois algumas abelhas, incluindo Trigona, apresentam comunicação intensa e específica ao encontrarem alimento, assim forrageando em grupo, acabam influenciando no número de indivíduos coletados. A curva de distribuição de freqüência entre espécies e indivíduos em oitavas de abundância demonstra que a maior parte das espécies está representada por menos de quatro indivíduos podendo ser consideradas como raras (Figura 2). Tab. 1: Número de espécimes para cada espécie coletada em três estações de 2004 a 2005 no Parque Ecológico da Cachoerinha (Iporá, GO). Família Tribo Espécie Primavera Verão Outono TOTAL Andrenidae Oxaea sp. 1 1 Apidae Apini Apis mellifera Apidae Bombini Bombus atratus 3 3 Apidae Bombini Bombus morio 1 1 Apidae Bombini Bombus sp. 2 2

5 5 Apidae Centridini Centris lutea 7 7 Apidae Centridini Centris nitens 3 3 Apidae Centridini Centris sp. 3 3 Apidae Centridini Centris sp Apidae Centridini Epicharis iheringi 2 2 Apidae Euglossini Euglossa melanotricha 1 1 Apidae Exomalopsini Exomalopsis sp Apidae Exomalopsini Exomalopsis sp Apidae Meliponini Frieseomelitta trichocerata Apidae Meliponini Melipona sp. 4 4 Apidae Meliponini Partamona sp. 1 1 Apidae Meliponini Plebeia sp Apidae Meliponini Scaptotrigona postica Apidae Meliponini Scaura latitarsis 1 1 Apidae Meliponini Scaura longula Apidae Meliponini Tetragona clavipes Apidae Meliponini Tetragonisca angustula Apidae Meliponini Trigona branneri Apidae Meliponini Trigona recursa Apidae Meliponini Trigona sp. 4 4 Apidae Meliponini Trigona spinipes Apidae Meliponini Trigonisca sp. 1 1 Apidae Tapinotaspidini Paratetrapedia sp. 1 1 Apidae Tetrapediini Tetrapedia sp. 1 1 Apidae Tetrapediini Tetrapedia sp Apidae Xylocopini Xylocopa grisescens 4 4 Apidae Xylocopini Xylocopa vestita 1 1 Colletidae Colletes sp Colletidae Colletes sp Colletidae Hylaeus sp. 2 2 Colletidae Ptiloglossa sp. 1 1 Halictidae Agapostemon sp Halictidae Augochloropsis sp Halictidae Augochloropsis sp Megachilidae Megachile sp Megachilidae Megachile sp TOTAL no. de espécies no. de indivíduos (oitavas) Fig. 2: Distribuição do número de espécies de abelhas por classes de número de indivíduos, em oitavas (log 2 ) no Parque Ecológico da Cachoeirinha (Iporá, GO)

6 6 A Figura 3 mostra que, de uma forma geral, os horários com maior número de espécimens coletados nas três estações do ano estudadas foram no meio da manhã e no meio da tarde. Número de abelhas :30-07:30 07:30-08:30 08:30-09:30 09:30-10:30 10:30-11:30 11:30-12:30 12:30-13:30 13:30-14:30 14:30-15:30 15:30-16:30 16:30-17:30 17:30-18:30 Horário Fig. 3: Número de abelhas coletadas por horário Primavera Verão Outono O índice de diversidade de Shannon-Wiener para o total da amostra de abelhas foi de 2,23 e a equabilidade foi 0,60. Nas diferentes estações do ano os dados foram: primavera (H=1,46 e E=0,63); verão (H=2,28 e E=0,70) e outono (H=2,21 e E=0,68). O índice Sorensen mostrou maior similaridade qualitativa em número de espécies coletadas entre o verão e o outono, o que contrasta com dados de Mateus (1998) que aponta maior riqueza de espécies na primavera. Novamente, o fato do número de horas de coleta ter sido menor na primavera pode ter influenciado nesse resultado Análise genética - Não foi encontrado nenhum polimorfismo de tamanho dos fragmentos amplificados entre as seis espécies estudadas. Os primers 16SR+16SF não amplificaram produto nas espécies Augochloropsis sp.2, Melipona sp. e Bombus sp. Pelo menos 5 haplótipos distintos foram encontrados com a análise de restrição dos fragmentos amplificados (Tabela 2). Tab. 2: Produtos amplificados e padrão de corte de restrição de seis espécies de abelhas estudadas. Espécie Enzimas de H Espécie Enzimas de restrição H restrição Trigona recursa Pst I Hinf I Rsa I Melipona sp. Pst I Hinf I Rsa I 16SR+16SF A 16SR+16SF n n N D mtd7+mtd mtd7+mtd Tetragona clavipes Pst I Hinf I Rsa I Centris lutea Pst I Hinf I Rsa I 16SR+16SF B 16SR+16SF E mtd7+mtd mtd7+mtd

7 7 Augochloropsis sp.2 Pst I Hinf I Rsa I Bombus sp. Pst I Hinf I Rsa I 16SR+16SF n n n C 16SR+16SF n n N D mtd7+mtd9 1 1? mtd7+mtd : presença de sítio de restrição; 0: ausência de sítio de restrição; n: não amplificou?: não foi digerido. H: Haplótipo Os primers acima (Tab. 2), foram escolhidos por estarem em regiões teoricamente mais conservadas, o que permitiria a amplificação em organismos não intimamente relacionados. Contudo, quanto mais conservada uma região, menor deveria ser seu polimorfismo. Isso não foi encontrado neste trabalho, visto que 5 haplótipos distintos foram observados entre as seis espécies estudadas. Grande variabilidade genética seria esperada se os grupos não fossem filogeneticamente próximos, o que não foi o caso, pois três das espécies analisadas pertencem a tribo Meliponini e apresentaram haplótipos distintos. Curioso foi o fato do haplótipo encontrado em Melipona sp. ser o mesmo do encontrado em Bombus sp. Provavelmente o uso de mais enzimas de restrição nos fragmentos amplificados diferenciaria essas duas espécies. 4. CONCLUSÕES A diversidade ecológica e a diversidade genética das abelhas encontradas no Parque Ecológico da Cachoeirinha (Iporá, GO) foram altas. Isso nos surpreendeu, pois a área estudada já foi muito alterada em relação à sua vegetação original, além de estar sofrendo muito com a ação antrópica. Estes resultados sugerem que a biodiversidade desse parque deve ser conservada o quanto antes, para a manutenção das variabilidades de espécies e genética. 5. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS AIDAR, D. S. A mandaçaia: biologia de abelhas, manejo e multiplicação artificial de colônias de Melipona quadrifasciata Lep. (Hymenoptera, Apidae, Meliponinae). Ribeirão Preto: Sociedade Brasileira de Genética ARIAS, M. C. ; SHEPPARD, W. S. Molecular phylogenetics of honey bee subspecies (Apis mellifera L.) inferred from mitochondrial DNA sequence. Molecular Phylogenetics and Evolution, v. 5, p , ARIAS, M. C. ; FRANCISCO, F. O. ; SILVESTRE, D. O DNA mitocondrial em estudos populacionais e evolutivos de meliponíneos. In: MELO, G. A. R. ; ALVES-DOS-SANTOS, I. (eds) Apoidea Neotropica: homenagem aos 90 anos de Jesus Santiago Moure.

8 8 Criciúma: UNESC, BROWN, W. M. The mitochondrial genome of animals. In: MACINTYRE, T. J. (ed) Molecular evolutionary genetics. New York: Plenus Press, FRANCISCO, F. O.; SILVESTRE, D. ; ARIAS, M. C. Mitochondrial DNA characterization of five species of Plebeia (Apidae: Meliponini): RFLP and restriction maps. Apidologie, v. 32, p , FRANCISCO, F. O. Diversidade genética de populações da abelha sem ferrão Plebeia remota: análise do DNA mitocondrial e microssatélites. Dissertação de Mestrado. São Paulo: Departamento de Biologia, Instituto de Biociências, Universidade de São Paulo HALL, H. G. ; SMITH, D. R. Distinguishing African and European honeybee matrilines using amplified mitochondrial DNA. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA, v. 88, p , HARRISON, R. G. Animal mitochondrial DNA as a genetic marker in population and evolutionary biology. Trends in Ecology and Evolution, v. 4, p. 6-11, KERR, W. E. ; CARVALHO, G. A. ; NASCIMENTO, V. A. Abelha urucu: biologia, manejo e conservação. Belo Horizonte: Fundação Acangaú, LAROCA, S. Ecologia: príncipios e métodos. Petrópolis: Editora Vozes, MAGURRAN, A. E. Ecological diversity and its measurement. Princeton: Princeton University Press, 1988 MATEUS, S. Abundância relativa, fenologia e visita às flores pelos Apoidea do cerrado da estação ecológica de Jataí Luiz Antônio SP. Dissertação de Mestrado. Ribeirão Preto: Universidade de São Paulo MATIOLI S. R. ; PASSOS-BUENO M. R. S. Métodos baseados em PCR para análise de polimorfismos de ácidos nucléicos. In MATIOLI, S. R. (ed) Biologia Molecular e Evolução. Ribeirão Preto: Holos Editora, NOGUEIRA-NETO, P. Vida e criação de abelhas indígenas sem ferrão. São Paulo: Editora Nogueirapis, SAKAGAMI, S. F. ; LAROCA, S. ; MOURE, J. S. Wild bee biocoenotics in São José dos Pinhais (PR), South Brazil preliminary report. Journal of the Faculty of Science, Hokkaido University, Ser. IV, Zoology, v. 16, p , SHEPPARD, W. S. ; RINDERER, T. E. ; MAZZOLI, J. ; STELTZER, J. A. ; SHIMANUKI, H. Gene flow between African- and European-derived honey bee populations in Argentina. Nature, v. 349, p , 1991 a. SHEPPARD, W. S. ; SOARES, A. E. E. ; DEJONG, D. ; SHIMANUKI, H. Hybrid status of

9 9 populations near the historic origin of Africanization in Brazil. Apidologie,,v. 22, p , 1991 b. SILBERBAUER-GOTTSBERGER, I. ; GOTTSBERGER, G. A polinização das plantas do cerrado. Revista Brasileira de Biologia, v. 48, p , VIANA, L. S. ; MELO, G. A. R. Conservação de abelhas. Informe Agropecuário, v. 13, p , WALSH, P. S. ; METZEGER, D. A. ; HIGUCHI, R. Chelex 100 as a medium for simple extraction of DNA for PCR-based typing from forensic material. Biotechniques, v. 10, p , WEINLICH, R. ; FRANCISCO, F. O. ; ARIAS, M. C. Mitochondrial DNA restriction and genomic maps of seven species of Melipona (Apidae: Meliponini). Apidologie, v. 35, p , ZAR, J. H. Bioestatistical Analysis. Englewood Cliffs: Prentice-Hall, 1974.