Parecer Relator Liberação Comercial Processo: Requerente: CNPJ: Endereço: Assunto: Extrato Prévio: 1. Identificação do OGM 2. Proteínas expressas

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1 Processo: / Requerente: Monsanto do Brasil Ltda. CNPJ: / Endereço: Av. das Nações Unidas, º andar Centro Empresarial das Nações Unidas (CENU) Torre Norte Brooklin Novo, São Paulo SP Assunto: Liberação Comercial de Algodão Geneticamente modificado resistente a insetos Extrato Prévio: 1075/2007, publicado em 28/06/ Identificação do OGM Designação do OGM: Algodão Bollgard II Espécie: Gossypium hirsutum Característica Inserida: Resistência a certos insetos praga Método de introdução da característica: transformação de plantas por aceleração de partículas Uso proposto: liberação no meio ambiente, comercialização, consumo e quaisquer outras atividades relacionadas a esse OGM e seus derivados 2. Proteínas expressas Cry1Ac confere resistência a insetos NPTII neomicina fosfotransferase tipo II; marcador de seleção de plantas transformadas Cry2Ab2 confere resistência a insetos GUS β-d-glucoronidase; marcador de seleção de células transformadas 3. Área de Restrição Ambiental O Nordeste do Brasil é o centro de origem de Gossypium mustelinum. G. hyrsutum é considerado exótico no Brasil, visto que seu centro de origem são áreas mais áridas da América Central. A Portaria nº 21 do Ministério da Agricultura Pecuária e Abastecimento MAPA, publicada no Diário Oficial da União em 16 de fevereiro de 2006, oficializa as Zonas de Exclusão para o plantio de sementes ou caroços de algodão herbáceo (G. hirsutum) geneticamente modificado ou de algodão herbáceo convencional com traços de eventos de transformação genética. No Brasil, são encontradas algumas espécies nas formas silvestres (selvagem ou asselvajadas). G. mustelinum tem o centro de origem no Nordeste do Brasil. G. hirsutum var. marie galante não possui centro de origem no Brasil, mas sua distribuição é ampla, sendo encontrada no Nordeste semi-árido, onde 1-1 -

2 foi bastante cultivada, conhecida como algodoeiro mocó ou arbóreo. Essa raça possui distribuição sobreposta com G. barbadense e G. mustelinum, o que possibilita o fluxo gênico entre essas espécies, que são cultivadas no Nordeste e no Norte do Brasil. G. barbadense possui duas variedades encontradas no Brasil na forma semidomesticada (Rim-de-boi e Inteiro). Ambas são arbóreas, perenes e adaptadas a altitudes acima de 600 m na região semi-árida ou em áreas próximas ao litoral. Esse algodoeiro desenvolve-se não apenas em áreas de cerrado mas também em terras mais baixas no semi-árido nordestino, por apresentarem precipitação insuficiente para o desenvolvimento da planta (Freire, 2000). 4. Observações da Secretaria Executiva: Em 12/05/2008, a Monsanto do Brasil Ltda. protocolou na a adequação à RN Fundamentação Técnica: O algodão Bollgard II evento 15985, foi desenvolvido por modificação genética do algodão Bollgard variedade DPSOB utilizando a metodologia de aceleração de partículas para a introdução dos genes cry2ab2 (confere resistência a insetos) e uida em seu genoma. O algodão Bollgard, por sua vez foi gerado pela transformação genética da variedade convencional de algodão Coker 312 através da metodologia mediada por Agrobacterium tumefaciens utilizando os genes cry1ac (resistência a insetos), nptii e aad (genes marcadores de seleção). Assim, o algodão Bollgard por transformação gerou o algodão MON 15985, que passou a conter além dos genes exógenos cry1ac, nptii e aad, também os genes cry2ab2 e uida. O algodão MON expressa as proteínas Cry1Ac, NPTII (essas duas também expressas também no algodão Bollgard), Cry2Ab2 e GUS. Como o promotor do gene aad dirige a expressão apenas em células procarióticas, a proteína AAD não é produzida no algodão Bollgard e, por conseguinte, no algodão MON A presença destes genes foi conferida por caracterização molecular através das metodologias Southern blot e PCR. O algodão MON confere proteção à lagarta-do-cartucho (Spodoptera fugiperda) em adição às pragas controladas pelo algodão Bollgard. Curuquerê-do-algodoeiro Alabama argillacea Lagarta rosada Pectinophora gossypiella Lagarta-das-maçãs Heliothis virescens e Helicoverpa zea Lagarta do cartucho Spodoptera fugiperda 2-2 -

3 Taxonomia do algodão O algodão pertence ao gênero Gossypium, descrito por Linneus em meados do século XVII. O gênero Gossypium compreende atualmente 50 espécies bastante diversas, sendo que os algodoeiros oriundos da América são alotetraplóides e os da África, Ásia e Austrália são diplóides (Freire, 2000). (Freire, E.C. Distribuição, Coleta, Uso e Preservação das Espécies Silvestres de Algodão do Brasil Embrapa Campina Grande, 2000). Quatro espécies possuem importância agronômica e possuem fibras de valor comercial, sendo duas espécies diplóides do Velho Mundo (G. arboreum e G. herbaceum) e duas alotetraplóides do Novo Mundo (G. barbadense e G.hirsutum). Estas duas espécies alotetraplóides respondem por aproximadamente 98% da produção mundial de algodão. Os cultivares de G. hirsutum são classificados em quatro tipos principais: Eastern, Acala, Delta e Plain (Niles e Feaster, 1984). O tipo Eastern é de especial interesse pois inclui a variedade Coker 312 que foi utilizada na transformação genética gerando o algodão Bollgard que foi potencialmente transformado para gerar o algodão MON Os centros de origem de G.hirsutum encontram-se no México e Guatemala enquanto os da G. barbadense, no Peru e na Bolívia (Stepheus, 1967). Características reprodutivas e fluxo de pólen O algodão é usualmente apresentado como uma cultura de polinização cruzada parcial, embora muitos melhoristas tratem a planta como completamente autofértil e autopolinizadora, exceto por polinização cruzada através de insetos polinizadores. Freire (2000) afirma que a planta de algodão apresenta um sistema reprodutivo intermediário entre aquele encontrado nas plantas alógamas e nas autógamas, com taxas de polinização cruzada variando entre 5% e 95%. A polinização cruzada, ou cruzamento natural, mantém um grau de heterozigose a partir de F1 (Simpson, 1954). A autopolinização é a forma de hibridação que ocorre preferencialmente na cultura do algodão, embora o cruzamento natural possa ocorrer (Niles e Feaster, 1984). A polinização controlada no algodoeiro é simples e consiste em utilizar métodos que impeçam a abertura das flores. O cruzamento é também facilmente realizável, fazendo-se a emasculação e a proteção do estigma na véspera e a polinização no dia seguinte. A produção de sementes é de 20 a 30 por fruto quando o cruzamento e a autopolinização são bem realizados (Fuzatto, 1999). O tempo de florescimento do algodoeiro pode variar de acordo com as condições ambientais e a variedade, mas geralmente se inicia aos 50 dias após a emergência e prolonga-se até 120 dias ou mais, com pico da curva ao redor de 70 ou 80 dias. Os procedimentos de autopolinização e cruzamento devem ser realizados na época mais propícia, com 30 a 40 dias de florescimento

4 O melhoramento genético exige polinização controlada e manutenção da pureza por barreiras físicas ou isolamento por distância. Os grãos de pólen são pesados e viscosos, o que torna a dispersão pelo vento bastante improvável. A transferência do pólen é feita por insetos, em particular por abelhas selvagens, abelhas mamangava (Bombus sp.) e abelhas produtoras de mel (Apis mellifera) que chegam às flores recém-abertas. No Brasil, os programas de melhoramento genético do algodão procuram reunir as características mais desejáveis, de acordo com a região de plantio, levando em consideração os componentes da produção e de adequação agrícola, de qualidade da fibra e do fio, assim como as características do produto para fins especiais (Fuzatto, 1999). O algodão normalmente não se propaga vegetativamente, mas sim através das maçãs ou sementes (Freire, 2000). O cruzamento natural pode ocorrer através de insetos polinizadores, uma vez que não há dispersão do pólen pelo vento. Entretanto, o alcance do pólen tende a limitar-se entre flores de algodão muito próximas, cercada por colônias de abelhas. O movimento de pólen é pequeno, apenas 1,6% das flores recebem material de outras plantas. Os insetos polinizadores são utilizados como ferramenta em programas de melhoramento para a obtenção de novas variedades. Assim, a polinização cruzada que é considerada detrimental para a produção de sementes de algodão é hoje apresentada como uma forma de geração de variabilidade genética exclusivamente nos programas de melhoramento genético (McGregor, 1976). Um dos efeitos mais importantes do cruzamento, referido como heterose ou vigor híbrido, pode ser o resultado de cruzamento interespecífico, intraespecífico e intervarietal. A utilização do vigor híbrido em algodão mostrou-se interessante depois da observação de que o excesso de introgressão (autopolinização) causa efeitos detrimentais (Simpson e Duncan, 1953). A taxa de cruzamento natural detectada no Brasil tem variado de 1% a 100% no Nordeste e de 0% a 71% no Centro-Oeste. Taxas de cruzamento diferentes em regiões próximas são explicadas pela presença de matas nativas e de insetos polinizadores, principalmente abelhas produtoras de mel. É importante enfatizar que os índices de cruzamentos nas lavouras do cerrado sempre foram baixos, isto é, em torno de 6%. Mas, nas regiões de cerrado, com grande ocorrência de vegetação nativa, as taxas variam de 19% a 42%, e nas áreas cultivadas por pequenos agricultores, os índices são mais elevados (45% a 69%) em razão da preservação das matas e da alta população de abelhas (Freire, 2002). Ecologia, tendência populacional e capacidade invasiva O algodão pode ser encontrado em regiões que compreendem desde zonas semi-úmidas e úmidas com temperaturas baixas até zonas tropicais muito secas e florestas úmidas. O algodão G. hirsutum 4-4 -

5 desenvolve-se bem quando a precipitação anual fica em torno de 600 mm a 800 mm (bem repartidos ao longo do ciclo), temperaturas médias uniformes entre 21º e 22º C e ph do solo entre 4,5 e 8,4. No Brasil, são encontradas algumas espécies nas formas silvestres (selvagem ou asselvajadas). O estudo de Freire (2000) reúne dados sobre a distribuição, a coleta, o uso e a preservação dessas espécies silvestres brasileiras. Gossypium mustelinum tem o centro de origem no Nordeste. G. hirsutum var. marie galante não possui centro de origem no Brasil, mas sua distribuição é ampla, sendo encontrada no Nordeste semiárido, onde foi bastante cultivada, conhecida como algodoeiro mocó ou arbóreo. Essa raça possui distribuição sobreposta com G. barbadense e G. mustelinum, o que possibilita o fluxo gênico entre essas espécies, que são cultivadas no Nordeste e no Norte do Brasil. Apesar de ter chegado a mais de 2 milhões de hectares nos anos 70, a área de cultivo de G. hirsutum var. marie galante diminuiu drasticamente com as infestações pelo bicudo a partir de Atualmente, os tipos nativos ou asselvajados estão restritos às serras do Seridó do Rio Grande do Norte. Usos do algodão na alimentação humana e animal O principal objetivo do cultivo do algodão é a produção de fibras para a confecção de tecidos, utilizados principalmente como vestuário. Entretanto, alguns de seus subprodutos obtidos a partir do caroço são largamente utilizados na alimentação de animais ruminantes, sendo que a presença do composto tóxico denominado gossipol restringe a concentração desses produtos na alimentação de outros animais e inviabiliza o uso do caroço na alimentação humana. Após a extração do óleo do caroço de algodão, que é utilizado na alimentação humana, obtém-se a torta de algodão, que representa a segunda mais importante fonte protéica disponível para a alimentação animal, superada apenas pela soja. De todos os subprodutos de algodão, os farelos da torta são os mais conhecidos e utilizados. Estes resultam da remoção do óleo, que pode ser feita tanto pelo esmagamento mecânico do caroço como através do uso de solventes. Os caroços de algodão possuem teores de proteína de 22% a 25%. O farelo de algodão tem sido cada vez mais utilizado na nutrição animal, como fonte de proteínas em rações, principalmente em dietas para ruminantes. Além de uma importante fonte de proteína para alimentação animal, o algodão apresenta o óleo comestível como outro importante subproduto utilizado na alimentação humana. Alergenicidade e toxicidade do algodão O algodão não se encontra no grupo de oito alimentos (leite, trigo, ovos, peixes, crustáceos, amendoim, soja e nozes) que respondem por aproximadamente 90% das alergias em humanos. Entretanto, a presença do gossipol (composto tóxico natural) na semente do algodão inviabiliza seu uso na alimentação humana 5-5 -

6 e, por conseguinte, relatos de reações alérgicas causadas pelo uso do caroço de algodão como alimento não são encontrados. A presença da substância gossipol no caroço do algodão o torna não comestível para o ser humano podendo causar problemas metabólicos. O uso do farelo de algodão para suínos e aves é restrito devido à presença de gossipol, que é tóxico para esses animais. Os suínos, em especial, são muitos sensíveis a esse pigmento tóxico em níveis tão baixos quanto 0,002% de gossipol livre na ração. Em um trabalho recente, Lordelo et al. (2007) estudaram a alimentação de galinhas com dietas contendo as duas diferentes formas enantioméricas de gossipol existentes na natureza. O resultado mostrou que ovos de galinhas alimentadas com mais gossipol apresentavam menor coloração que as alimentadas com menos gossipol. Outro aspecto que em alguns casos limita o uso do farelo de algodão para suínos e aves é o teor de fibra desse ingrediente, que é superior ao do farelo de soja. Gene cry2ab2 O gene cry2ab2 que codifica a proteína Cry2Ab2 é derivado da bactéria Gram-positiva Bacillus thuringiensis amplamente presente no solo e utilizada desde 1958 para produzir formulações de atividade inseticida para uso na agricultura, inclusive em plantios orgânicos (US EPA, 1988). O B. thuringiensis subsp. kurstaki, presente em produtos microbianos para o controle de pragas, contém os genes cry2aa e cry2ab. O gene cry2a é expresso nesses produtos comerciais, mas o gene cry2ab é um pseudogene, o qual mesmo presente, não é expresso por possuir um promotor ineficiente (Dankocsik et al., 1990). Gene cry1ac O gene cry1ac codifica para a proteína inseticida Cry1Ac e faz parte da construção quimérica descrita. A região codificadora do gene cry1ac é derivada da bactéria de solo B. thuringiensis subsp. kurstaki. Gene uida O gene da -glucuronidase, designado uida, e também conhecido como gene gus ou gusa, é derivado da Escherichia coli cepa K12 (Jefferson et al., 1986). A seqüência foi totalmente caracterizada e está disponível no GenBank (Jefferson et al., 1986; Schlaman et al., 1994). Este gene codifica a expressão da enzima -D-glucuronidase (GUS) e, é usado como marcador. Gene nptii O gene nptii codifica a proteína NPTII (neomicina fosfotransferase tipo II) e funciona como um marcador 6-6 -

7 dominante de seleção nas estágios iniciais em laboratório, identificando células vegetais transformadoras (Horsch et al., 1984; DeBlock et al., 1984). A enzima NPTII utiliza adenosina-trifosfato (ATP) para fosforilar e inativar antibióticos aminoglicosídicos (tais como neomicina e canamicina), o que evita que eles causem injúria nas células que expressam NPTII quando elas são cultivadas em meio de cultura que contém esses agentes seletivos. O único objetivo na inserção do gene nptii no algodão Bollgard foi, portanto, a seleção de células transformadas que contêm o gene cry1ac (uma vez que os dois genes fazem parte da mesma construção gênica) na fase in vitro, sem nenhuma outra função ou propriedade inseticida. Gene aad A seqüência do gene aad não foi modificada em relação àquela encontrada na natureza. Esse gene é comumente encontrado em bactérias Gram-negativas como Escherichia coli (Fling et al., 1985). A expressão da proteína AAD não é esperada em plantas e não foi detectada no algodão Bollgard (Berberich et al., 1993; Bhalgat et al., 2001). Esse gene foi utilizado como marcador de seleção das bactérias E. coli e A. tumefaciens que contêm o vetor PV-GHBK04 em meio de cultura no qual os antibióticos espectinomicina e estreptomicina foram adicionados como agentes seletivos. O único objetivo da inserção do gene aad no algodão é a seleção de células bacterianas que contenham o vetor de interesse, não possuindo nenhuma propriedade inseticida. O algodão MON foi caracterizado através de técnicas moleculares tradicionais como Southerm blot e PCR (Doherty et al., 2000 ab). Herança Mendeliana e estabilidade do inserto no algodão MON Para determinar a estabilidade do evento MON nas gerações seguintes, uma série de testes de progênie foi conduzida com base no ensaio qualitativo de ELISA para a proteína Cry2Ab2 em quatro gerações, conforme resultados mostrados em tabela. Os dados indicam que os eventos MON 531 e MON são estáveis e independentes nas variedades de algodão MON Avaliações em tecidos coletados nos Estados Unidos Os níveis das proteínas Cry2Ab2, Cry1Ac, NPTII, GUS e AAd foram estimados em amostras de algodão MON 15985, Bollgard e convencional coletadas em oito locais representativos do cultivo de algodão com diferentes condições ambientais nos Estados Unidos em 1998 e 1999 (Kolwyck et al., 2000a; Kolwyck et al., 2000b)

8 Segundo a proponente, os resultados confirmaram que as proteínas Cry2Ab2 e GUS são expressas no algodão MON 15985, em níveis detectáveis pelos métodos analíticos utilizados. Os resultados também demonstram que estas novas proteínas não afetam a expressão das outras proteínas, ou seja, Cry1Ac e NPTII, também expressas no algodão MON 15985, em comparação ao algodão Bollgard. A proteína AAD não foi detectada em nenhuma das amostras analisadas para a presença desta proteína, uma vez que o gene aad encontra-se sob controle de um promotor procariótico. Avaliações em tecidos coletados no Brasil Experimentos de campo com o algodão MON foram conduzidos em três locais no Brasil na safra 2005/2006, com o objetivo de gerar amostras para a quantificação das proteínas Cry2Ab2, Cry1Ac, NPTII e GUS em tecidos de folhas e caroços (Mozaffar e Silvanovich, 2007). As Estações experimentais onde os experimentos foram realizados se localizam em Santa Cruz das Palmeiras (SP), Santa Helena de Goiás (GO) e Sorriso (MT). As amostras foram analisadas quanto ao conteúdo dessas proteínas através do método de ELISA. Os níveis das proteínas para os dois tipos de tecidos analisados foram calculados em microgramas (µg) por grama (g) de tecido fresco. Insetos e eficácia Os insetos foram observados durante os experimentos em 1998 e O monitoramento de insetos foi extensivo nesses ensaios e realizado uma vez por semana após o inicio das infestações por lagartas lepidópteras. Os insetos monitorados foram Heliothis virescens, Spodoptera ornithogolli, Pseudoplusia includens, Trichoplusia ni, Lygus lineolaris, Anthonomus grandis e Apis spp.. As observações qualitativas de insetos foram realizadas mais de 530 vezes durante as duas safras. Os resultados mostraram que o tecido de folha do algodão MON foi menos atacado por lagarta rosada (Pectinophora gossypiella). Como o algodão Bollgard já produz esse tipo de controle em condições de campo, esses dados demonstram que o algodão MON continua fornecendo o mesmo controle. Estudos realizados no Brasil Segundo os relatos, o algodão MON tem demonstrado alta eficácia no controle do curuquerê-doalgodoeiro (Alabama argillacea), lagarta rosada (Pectinophora gossypiella); lagarta-das-maçãs (Heliothis virescens e Helicoverpa zea) e espodóptera (Spodoptera fugiperda), pragas comumente encontradas na cultura do algodoeiro no Brasil (Mullins et al., 2005)

9 Eficácia Segundo relata a proponente, a eficácia do algodão MON no controle do curuquerê-do-algodoeiro (Alabama argillacea), lagarta rosada (Pectinophora gossypiella); lagarta-das-maçãs (Heliothis virescens e Helicoverpa zea) e espodóptera (Spodoptera fugiperda) foi comparativamente avaliada com controle destas lagartas utilizando inseticidas químicos nas condições de cultivo brasileiras. Os experimentos foram conduzidos nas estações experimentais da Monsanto do Brasil Ltda. em Santa Cruz das Palmeiras (SP), Santa Helena de Goiás (GO) e Sorriso (MT) durante a safra 2005/2006. Os resultados mostraram que o algodão MON é capaz de controlar o curuquerê-do-algodoeiro, lagarta rosada, lagarta-das-maçãs e espodóptera, sem a necessidade de aplicações complementares de inseticidas químicos, atingindo níveis de eficácia significativamente superiores quando comparados aos tratamentos padrões inseticidas (Tukey p 5%) nas condições do experimento. A produtividade dos tratamentos com o algodão MON foi significativamente superior ao proporcionado pelo cultivar convencional DP50 sem inseticidas para lepidópteros em Sorriso (MT). Em Santa Cruz das Palmeiras (SP) e Santa Helena de Goiás (GO), os níveis de produtividade dos tratamentos foram semelhantes nas condições dos experimentos segundo relato da proponente. Comparação nutricional - Amostra coletada nos Estados Unidos As análises mostraram que a composição do algodão MON foi comparável à composição do algodão convencional e de outras variedades comerciais de algodão, além de ser nutricionalmente comparável na avaliação alimentar com vacas leiteiras, bagres e codornas. Os resultados suportam a conclusão de que o algodão MON é tão seguro e nutritivo quanto o algodão convencional para uso em alimento e ração (Hamilton et al., 2004). Três classes de compostos tóxicos diferentes foram avaliadas no algodão MON em relação ao algodão controle e variedades comerciais: gossipol e ácidos graxos ciclopropenóides produzidos em semente de algodão, e aflatoxinas produzidas por agentes infecciosos, como fungos. O gossipol é um aldeído da classe dos sesquiterpenos, e é da família de compostos terpenóides produzidos pela tribo de plantas Gossypiae (Fryxell, 1979). Esse composto é produzido em glândulas das sementes, folhas, ramos e raízes da planta de algodão e fornecem proteção natural contra insetos. Diferenças estatisticamente significativas nos níveis de gossipol não foram observadas quando se fez a comparação dos resultados encontrados para o algodão MON e para o algodão Bollgard (DP50B) e o valor médio ficou dentro do intervalo de valores encontrado na literatura para variedades comerciais convencionais

10 Os ácidos graxos ciclopropenóides (estercúlico, dihidroestercúlico e malválico) são ácidos graxos especiais encontrados em algodão e são considerados componentes antinutricionais indesejáveis. As diferenças não foram consideradas biologicamente significativas segundo o relato da proponente. A aplicação da equivalência substancial também foi adotada, para estudos toxicológicos realizados com animais, baseados em padrões de segurança alimentar para o homem. Esses padrões são derivados de níveis de ingestão segura para animais, onde o fator de segurança de 100 é geralmente adotado para contornar as diferenças entre as espécies e as variações individuais (Kuiper et al., 2001). A avaliação da toxicidade potencial, para seres humanos e animais, em estudos de toxicidade oral aguda realizado com vacas, demonstrou que o desempenho das vacas leiteiras não foi alterado e nenhuma diferença significativa foi observada em relação ao algodão MON e o convencional (Tab. 2 pág. 216) (Castillo et al., 2001; Hamilton et al., 2004). Estudos com bagres e codornas, conduzidos pelo Thad Cochran National Warmwater Aquaculture Center (Mississipi State University) e Wildlife International Laboratories, alimentados com ração de caroço de algodão (Tab , pág ), também não mostraram diferenças no consumo de alimento ou no ganho de peso dos animais que se alimentaram da dieta contendo o algodão. Os peixes alimentados com a dieta do algodão MON não apresentaram alteração na composição da carne (umidade, gordura, cinzas e proteínas) (Hamilton et al., 2004). A avaliação do valor nutricional de dietas para frangos de corte contendo o algodão MON em relação a variedades convencionais mostrou que o ganho de peso corporal, a ingestão de alimentos e a eficiência em conversão de alimentos não foram significativamente afetados pela alimentação contendo o algodão MON Análises de digestibilidade e alergenicidade das proteínas Cry2Ab2, Cry1Ac e NPTII e GUS mostraram que elas não codificam alérgenos conhecidos e podem ser facilmente degradadas, minimizando qualquer potencial de absorção em um sistema intestinal. As proteínas, quando comparadas a seqüências alergênicas de bancos de dados de domínio público, não compartilharam de similaridade de seqüências estruturalmente significativa entre os alérgenos identificados e seqüências de aminoácidos (maior que sete aminoácidos contíguos idênticos) com potencial relevante. Sistemas de fluidos gástricos (SGF) e intestinal simulados (SIF), utilizados para avaliar a digestibilidade das quatro proteínas mostraram que mais de 90% das proteínas são digeridas ou perdem a atividade rapidamente. As aflatoxinas são um grupo de micotoxinas produzidas por Aspergillus flavus e Aspergillus parasiticus que podem contaminar produtos alimentares e ração (Jorgensen e Price, 1981). A semente de algodão é

11 uma das comodities mais contaminadas por aflatoxinas (Bagley, 1979). Os níveis das quatro aflotoxinas primárias (B1, B2, G1, G2) foram indetectáveis em sementes de algodão MON 15985, do controle DP50B, do controle convencional DP50 e das referências comerciais no limite de detecção LOD = 0,1 mg/g peso fresco. Segurança das Proteínas O algodão MON expressa quatro novas proteínas: Cry2Ab2 e Cry1Ac, que conferem resistência a certas espécies de insetos lepidópteros; NPTII (neomicina transferase tipo II), que confere tolerância a antibióticos aminoglicosilados; e GUS, que permite a detecção de transformantes durante o processo de transformação genética. Apesar de o gene aad estar presente no algodão MON 15985, a proteína AAD não é expressa na planta. A segurança das proteínas expressas no algodão MON foi testada e para tal os estudos foram realizados com as proteínas purificadas e com tecidos do algodão MON 15985, assim como o algodão Bollgard (parental no processo de transformação para geração do algodão MON 15985). As proteínas purificadas utilizadas nos estudos de segurança foram produzidas em bactéria (E. coli), um sistema alternativo para produção de proteínas equivalentes às da planta, porém em quantidades adequadas para a realização das avaliações. O modo de ação especifico, mediado por receptores embasa a segurança alimentar e ambiental das proteínas Cry. Além da falta de receptores em mamíferos e outros organismos não-alvo, a segurança das proteínas Cry é comprovada pelo longo histórico de uso seguro de produtos microbianos que contêm essas proteínas. Proteína NPTII A proteína NPTII, é expressa no algodão MON porque é expressa no algodão Bollgard parental. O objetivo de ser expressa foi apenas estabelecer um sistema eficiente de seleção de potenciais plantas transformadas no processo de modificação gênica. Proteína GUS A expressão da enzima GUS é usada para detectar eventos de transformação em cultura de tecidos durante o processo de modificação genética de várias culturas aprovadas para comercialização em vários países, sem que efeitos adversos tenham sido observados até o momento (Miki e McHugh, 2004). Manejo de Resistência de Insetos (MRI) para o algodão MON A resistência de insetos a táticas de controle é um fenômeno natural e pré-adaptativo, podendo ocorrer em qualquer espécie-praga submetida a uma pressão de seleção. Conforme relata Georghiou e Lagunes- Tejeda (1991) há vários casos de resistência de artrópodos pragas a defensivos agrícolas. Existe o relato

12 de aproximadamente 504 espécies resistentes a defensivos agrícolas de diferentes grupos químicos, tais como piretróides, carbamatos e fosforados. A constatação da ocorrência de pragas resistentes a grupos químicos inseticidas mostra que há também a necessidade de adoção de medidas visando evitar ou retardar a evolução de insetos resistentes ao controle exercido pelas proteínas e os benefícios aos agricultores e ao meio ambiente. A presença simultânea de duas proteínas inseticidas no algodão MON é vista como um importante fator para evitar a evolução de resistência, uma vez que reduz drasticamente a sobrevivência das pragas alvo e consequentemente a probabilidade de seleção de indivíduos com pares de alelos recessivos para resistência simultânea às duas proteínas. Com base na literatura científica disponível, uma estratégia para o Manejo de Resistência de Insetos (MRI) para plantas resistentes a insetos como o algodão MON deve contemplar componentes como instalação de áreas de refúgio, ações educacionais e constante monitoramento da suscetibilidade de lepidópteros pragas submetidas ao fator de seleção, no caso as proteínas Cry1Ac e Cry2Ab2 (Roush, 1997; Gould, 1988). Estudos com organismos não-alvo Com o aumento da área cultivada com culturas geneticamente modificadas resistentes a insetos no mundo inteiro, a preocupação sobre o impacto dessa tecnologia em organismos não-alvo, incluindo organismos importantes no controle biológico, tem sido levantada com bastante influência. Estudos foram conduzidos com organismos indicadores não-alvo como aves, peixes e espécies invertebradas benéficas. Organismos não-alvo foram expostos a folhas ou sementes do algodão MON ou à proteína purificada Cry2Ab2 incorporada em dieta de cinco dias a oito semanas, dependendo do estudo. As doses foram escolhidas de forma a exceder a exposição ambiental prevista, aumentando assim a margem de segurança das conclusões geradas nos estudos. Os resultados demonstraram que a proteína Cry2Ab2 no algodão MON não impõe riscos antecipados para organismos não-alvo. Efeitos adversos não foram observados nas concentrações significativamente maiores que as concentrações previstas pela exposição no meio ambiente. Em todos os casos, a concentração de efeito não observado (NOEC) excede em muito a máxima concentração ambiental indicando risco mínimo da proteína Cry2Ab2. Codornas Bobwhite e bagres foram alimentados com semente de algodão MON a 10% e 20% em suas dietas, respectivamente, sendo que não houve mortalidade ou efeitos adversos sobre a sobrevivência, o desenvolvimento e o comportamento dos animais

13 Esses dados indicam que aves expostas à proteína Cry2Ab2 pelo consumo de sementes de algodão ou insetos, ou peixes alimentados com ração de semente de algodão como parte da dieta não foram afetados adversamente. A proteína Cry2Ab2 também foi avaliada em minhocas, assim como em cinco espécies de invertebrados terrestres benéficos representando classes de insetos que podem ser expostas à proteína Cry2Ab2 do algodão MON 15985: adultos e larvas de abelhas melíferas (Apis melífera), colêmbolos (Folsomia candida), lixeiro (Chrysomera carnea), joaninhas (Hippodamia convergens), vespas parasitóides (Nasonia vitripennis) e minhocas (Eisenia fétida). Os resultados dos estudos indicaram que a proteína Cry2Ab2 impõe risco mínimo para esses organismos benéficos não-alvo. Efeitos adversos não foram observados na máxima concentração prevista no meio ambiente para a qual esses organismos possam ser expostos. O potencial de proteínas Cry1 e Cry2 causar efeitos em lepidópteros não-alvo é bem conhecido, incluindo as lagartas de borboletas Monarca, assim como lepidópteros ameaçados ou em extinção. Resumo dos estudos de efeitos ecológicos da proteína Cry1Ac sobre organismos não-alvo indicadores. Material testado Organismo NOEL Referência Joaninha 20 ppm Palmer e Beavers, 1993a (H. convergens) Parasitóide himenóptero 20 ppm Palmer e Beavers, 1993b (N. vitripennis) Crisoídeo 20 ppm Palmer e Beavers, 1993c (C. carnea) Proteína Cry1Ac Larva de abelha melífera 20 ppm Maggi, 1993a purificada Semente de algodão Bollgard (expressa Cry1Ac) Folhas de algodão Bollgard (expressa Cry1Ac) (A. melífera) Adulto de abelha 20 ppm Maggi, 1993b melífera (A. melífera) Colêmbola (F. cândida e 200µg/g Sims e Martin, 1997 X. grisea) Camundongo albino mg/kg Naylor, 1993a Codornas Northern ppm Cambell e Beavers, 1993 Bobwhite Colêmbola (F. cândida) 0,4 g folha/ g solo Yu et al., 1997 Traça (O. nitens) 0,4 g folha/ g solo Yu et al., 1997 Resumo dos estudos de segurança para as proteínas Cry2Ab e Cry2Aa

14 Estudo Substância teste Resultados Degradação em sistema digestivo in Cry2Ab Meia vida 115 s em SGF 1 ; digerido ao núcleo vitro Similaridade com seqüências alergênicas Similaridade com seqüências tóxicas Degradação em sistema digestivo in vitro Toxicidade oral aguda em camundongos 1 SGF = fluido gástrico simulado 2 SIF = fluido instestinal simulado Cry2Aa Cry2Ab Cry2Aa Cry2Ab Cry2Aa Cry2Ab Cry2Aa tríptico estável no SIF 2 Meia vida 115 s em SGF 1 ; digerido ao núcleo tríptico estável no SIF 2 Sem homologia com alérgenos protéicos Sem homologia com alérgenos protéicos Sem homologia com toxinas conhecidas ou outras proteínas de preocupação para a saúde humana Sem homologia com toxinas conhecidas ou outras proteínas de preocupação para a saúde humana Meia vida 115 s em SGF 1 ; digerido ao núcleo tríptico estável no SIF 2 Meia vida 115 s em SGF 1 ; digerido ao núcleo tríptico estável no SIF 2 Cry2Ab Sem efeitos na mais alta dose testada 1450 mg/kg 3 Cry2Aa 3 Solubilidade da Cry2Ab no veículo de dose foi menor que da Cry2A2 Sem efeitos na mais alta dose testada 4011 mg/kg Conclusões sobre a segurança alimentar da proteína Cry1Ac para humanos e animais A proteína Cry1Ac é segura para o consumo animal e humano com base nos seguintes aspectos avaliados: Reconhecimento geral sobre a segurança das proteínas Cry, inclusive a Cry1Ac; Histórico de uso seguro de proteínas Cry de mais de 40 anos em formulações bacterianas de B. thuringiensis; Rápida digestão da proteína Cry1Ac em SGF e conversão para o núcleo tríptico esperado em SIF, como esperado para proteínas Cry; baixa exposição à proteína Cry1Ac do algodão MON 15985; Ausência da homologia da proteína Cry1Ac com alérgenos conhecidos; Ausência de homologia da proteína Cry1Ac com toxinas conhecidas ou outras proteínas associadas com efeitos adversos à saúde de mamíferos, inclusive humanos; Ausência de toxicidade oral aguda da proteína Cry1Ac para mamíferos, como demonstrado no estudo com camundongos em que a dose foi administrada por gavagem; Baixa exposição à proteína Cry1Ac na dieta pelo consumo de produtos alimentares do algodão MON Proteína NPTII Segurança da proteína NPTII para a saúde humana e animal

15 Ministério da Ciência e Tecnologia - MCT A conclusão é de que a proteína NPTII é segura para o consumo humano e animal, possui um histórico de uso seguro, possui rápida digestão, não apresenta homologia com alergenos conhecido ou a outras proteínas associadas com efeitos adversos à saúde de mamíferos inclusive humanos. Proteína GUS- A quantificação da proteína GUS foi realizada através de ELISA nas folhas e caroços do algodão MON Conclusões sobre a segurança alimentar da proteína GUS para humanos e animais Ocorrência natural da proteína GUS no trato digestivo humano e de outros organismos, incluindo alimentos, e histórico de uso seguro em alimentos; Ausência de potencial de alergenicidade da proteína GUS; Digestão rápida da proteína GUS em SGF e SIF; Ausência de homologia da proteína GUS com toxinas conhecidas; Ausência de toxicidade oral aguda da proteína GUS para mamíferos, como demonstrado no estudo com camundongos. 6. Parecer: Considerando os estudos apresentados e os dados da literatura encaminho para o deferimento da solicitação de liberação comercial do algodão Bollgard II, evento MON Data: Antônio Euzébio Goulart Sant Ana Membro da CTNBio Assessora Técnica: Vânia Gomes da Silva

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