Pró-Reitoria de Graduação Curso de Biomedicina Trabalho de Conclusão de Curso

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1 CC O que é auto-imunidade? O que é auto-anticorpos? Quais doenças são produzidas? Doadores de sangue? Pró-Reitoria de Graduação Curso de Biomedicina Trabalho de Conclusão de Curso ANÁLISE DE METODOLOGIAS LABORATORIAIS PARA DIAGNÓSTICO DE ANEMIA FALCIFORME Autor: Wellington Vali Duarte Orientador: Prof. Esp. Fábio de França Martins Brasília - DF 2012

2 WELLINGTON VALI DUARTE ANÁLISE DE METODOLOGIAS LABORATORIAIS PARA DIAGNÓSTICO DE ANEMIA FALCIFORME Trabalho de conclusão de curso apresentado ao curso de graduação em biomedicina da Universidade Católica de Brasília, como requisito parcial para obtenção do título de graduado em biomedicina. Orientador: Prof. Esp. Fábio de França Martins Brasília 2012

3 O trabalho de conclusão de curso, de autoria de Wellington Vali Duarte, intitulado ANÁLISE DE METODOLOGIAS LABORATORIAIS PARA DIAGNÓSTICO DE ANEMIA FALCIFORME, apresentado como requisito parcial para obtenção do grau de Bacharel em Biomedicina da Universidade Católica de Brasília, em 20 de novembro de 2012, defendida e aprovada pela banca examinadora abaixo assinada: Prof. Esp. Fábio de França Martins Orientador Biomedicina UCB Profa. Esp. Simone Cruz Longatti Biomedicina UCB Profa. MsC. Flávia Ikeda e Araújo Biomedicina UCB Brasília 2012

4 AGRADECIMENTOS Agradeço primeiramente a Deus por me dar a oportunidade de me formar em um curso em que poucos ingressam e sem ele nada seria possível; por me dar saúde, calma, sabedoria e paciência. Agradeço também ao meu pai, Amilton Vali Duarte e minha mãe, Maria de Lourdes Goulart Duarte pelo apoio incondicional, compreensão, carinho, amor e com os quais sei que posso contar a qualquer momento. Aos meus irmãos Amilton e Irvington pelo apoio. Aos meus grandes e eternos amigos que me relacionei por toda minha vida assim como aos amigos que fiz na graduação e que me proporcionaram momentos que ficarão para sempre em minha memória. A todos os colegas de turma que compartilhei trabalhos, aprendizado e conhecimento, o meu muito obrigado. Ao meu orientador Fábio de França Martins que me guiou em tão pouco tempo para a realização deste trabalho final. A todos os professores e funcionários, os quais respeito, admiro e considero como profissionais cruciais para a minha graduação, deixo minha eterna gratidão.

5 RESUMO DUARTE, Wellington Vali. Análise de metodologias laboratoriais para diagnóstico de anemia falciforme pag. Monografia (Biomedicina) - Universidade Católica de Brasília, Brasília-DF, A anemia falciforme é certamente um problema de saúde pública no Brasil. Presente em 4% da população brasileira, a hemoglobina S é a origem desta classe de anemia e atinge até 10% dos afrodescendentes com a média de nascimentos de crianças portadoras da anemia falciforme, por ano no Brasil.. Das complicações associadas aos portadores de doença falciforme destaca-se: crises dolorosas, acidente vascular cerebral, síndrome torácica aguda, osteonecrose e maior risco de infecções. Devido à expressão clínica da anemia falciforme, o uso de metodologias laboratoriais adequadas é essencial. Atualmente, usam-se as seguintes técnicas: Teste de solubilidade; Dosagem de hemoglobina Fetal; Dosagem de Hemoglobina A2; Hemograma completo; Eletroforese de hemoglobinas em ph alcalino e também em ph ácido; Cromatografia líquida de alta performance (HPLC); Focalização Isoelétrica; Teste de falcização. Metodologias mais atuais vêm sendo desenvolvidas, permitindo que façamos comparações entre técnicas laboratoriais para diagnóstico de anemia falciforme levando em consideração variantes como: custo, economia de tempo, capacitação profissional, sensibilidade e adequação à necessidade do paciente. Esta revisão de literatura compara as técnicas laboratoriais para diagnóstico de anemia falciforme considerando as variantes mencionadas e buscando determinar a mais eficiente. Se tratando de diagnóstico para anemia falciforme torna-se difícil eleger uma das metodologias mencionadas neste trabalho, como a melhor, sem que o contexto do diagnóstico seja levado em consideração. Se por um lado, fatores como facilidade, praticidade, rapidez na execução, estabilidade, durabilidade dos reagentes e a fácil capacitação de profissionais para execução da técnica justificam a utilização de métodos com sensibilidade e especificidade boas para triagem, mas não ideais para diagnóstico, por outro o uso de técnicas mais onerosas, que exijam maior capacitação dos profissionais e investimento tecnológico retribuem ao serviço laboratorial uma melhor confiabilidade, especificidade e sensibilidade no diagnóstico das anemias falciformes. Palavras-chave: Pacientes, anemia falciforme, diagnóstico laboratorial

6 ABSTRACT The sickle cell anemia is certainly a public health concern in Brazil. Present in 4% of the Brazilian population, the hemoglobin S is the origin of this class of anemia, affecting up to 10% of the afrodescendants and is shown to be present in 3500 newborns a year in Brazil. Out of the complications associated with the carriers of the sickle cell mutation, it is prominent to highlight painful seizures, cerebral vascular accident, acute thoracic syndrome, ostenecrosis and higher risk for infections. Due to the clinical expression of sickle cell anemia, the use of suitable laboratorial methodologies is crucial. Currently, the following techniques have been used: solubility test, fetal hemoglobin dosage, hemoglobin A2 dosage, complete blood count, hemoglobin electrophoresis in alkaline or acid ph, high-performance liquid chromatography (HPLC), isoeletric focusing and falcization test. More recent techniques have been developed, allowing us to make comparisons with the ongoing laboratorial methods for sickle cell anemia diagnosis, considering variants such as costs, time-saving strategies, professional qualification, sensibility and suitability in accordance to patients needs. This literature review compares the laboratorial techniques used for diagnosing sickle cell anemia, highlighting the variants mentioned herein and looking forward to determining the most effective method. When it comes to sickle cell anemia diagnosis, it has shown to be impossible to determine one out of the methodologies mentioned as the most effective test without taking into account the context in which the diagnosis takes place. On one hand, factors such as facility, practicality, execution quickness, stability, durability of the reagents and professional qualification, live up to the use of less sensitive methods during screening. On the other hand, the use of burdensome techniques, which demand higher professional qualification, rewards the laboratorial labor with better reliability and sensitivity. Keywords: Patients, sickle cell anemia, laboratory diagnosis

7 LISTA DE ABREVIATURAS cgmp: Guanosina Monofosfato Cíclica CHCM: Concentração de Hemoglobina Corpuscular Média DHL: Desidrogenase Láctica FE: Fase estacionária FIE: Focalização Isoelétrica GTP: Guanosina Trifosfato Hb: Hemoglobina HCM: Hemoglobina Corpuscular Média HPLC: Cromatografia Líquida de Alta Performance/Pressão/resolução/Eficiência HU: Hidroxiuréia ICAM: Molécula de Adesão Intercelular IFN: Interferon IL: Interleucina NO: Óxido Nítrico P.I.: Ponto Isoelétrico ph: Potencial Hidrogeniônico PS: Fosfatidilserina RDW: Red cell Distribution Width (Variação de tamanho de eritrócitos) RN: Recém Nascido VCAM-1: Molécula de Adesão Celular Vascular VCM : Volume Corpuscular Médio

8 SUMÁRIO 1 INTRODUÇÃO REVISÃO DA LITERATURA OBJETIVOS MATERIAL E MÉTODO CONCLUSÃO REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS... 32

9 8 1 INTRODUÇÃO O problema de saúde pública oriundo da presença da anemia falciforme em muitos indivíduos no Brasil é uma realidade. Tendo a hemoglobina S como origem da doença, a anemia falciforme está presente em 4% da população brasileira e até 10% dos afrodescendentes com a média de nascimentos de crianças portadoras da anemia falciforme, por ano no Brasil 1. A doença falciforme representa um grupo de doenças oriundas da herança da hemoglobina S, podendo ser em homozigose (SS), o que caracteriza a anemia falciforme; duplas heterozigoses como hemoglobinopatias SC e SD ou juntamente com talassemias, tais como S -talassemia e doença falciforme com -Talassemia 1. O gene da hemoglobina S é um gene que foi trazido para as Américas por meio da migração forçada de escravos africanos a partir do século XVI. No Brasil a doença possui maior presença nas regiões sudeste e nordeste 2. A doença falciforme apresenta suas raízes na síntese da hemoglobina. As hemoglobinas ocupam grande parte do eritrócito e tem como principal papel o transporte de oxigênio para os tecidos do organismo. Sua composição é basicamente de um tetrâmero com duas cadeias alfa e duas cadeias não alfa, cada uma delas ligada com um grupo heme, este último sendo a junção de ferro e protoporfirina 1. A síntese das globinas alfa inicia-se no cromossomo 16 e a das outras globinas, como beta e gama, no cromossomo 11. A hemoglobina S resulta de uma troca de bases nitrogenadas que acabam codificando o aminoácido valina ao invés do ácido glutâmico na globina beta. Na falta de oxigênio, a valina agora presente interage com aminoácidos de outras globinas beta, o que caracteriza o processo de polimerização, o que dá o formato de foice ao eritrócito 1. Das complicações associadas aos portadores de doença falciforme destacam-se: crises dolorosas, acidente vascular cerebral, síndrome torácica aguda, osteonecrose e maior risco de infecções. A raiz dessas complicações está no fato de que a polimerização da hemoglobina S altera a morfologia eritrocitária e lesa a membrana, prejudicando a travessia dos eritrócitos mal formados por vasos de pequeno calibre, que como consequência pode gerar vaso oclusão, que por sua vez facilita o aparecimento das complicações citadas 1.

10 9 Quando o indivíduo possui a hemoglobina SS, isto é, quando recebeu o gene para hemoglobina S tanto do pai quanto da mãe, a condição é caracterizada como anemia falciforme, onde o eritrograma se apresenta, geralmente, com índices hematimétricos condizentes com uma anemia normocítica e normocrômica, podendo haver macrocitose de acordo com a presença de reticulócitos. A citologia das hemácias na anemia falciforme apresenta vários eritrócitos em forma de foice, evidenciando uma anisocitose. Por ser uma doença hemolítica, comumente se observa policromasia e eritroblastos no sangue periférico. Estes últimos acabam sendo contados como linfócitos na leucometria por contadores automatizados 1. A seguir a figura de um eritrócito maduro, evidenciando drepanócitos em lâmina microscópica. Estas células falciformes se apresentam alongadas devido à polimerização da hemoglobina anormal, geralmente faltando a área pálida central 3. Figura 1 Drepanócitos em lâmina Fonte: ANDERSON, A anemia falciforme é uma doença monogênica que possui diferentes níveis de agravamento de acordo com os mecanismos moduladores. Devido ao volume eritrocitário estar fatidicamente alterado na anemia falciforme a relação de hidratação e desidratação é também alterada. As células com hemoglobina corpuscular média elevada têm pouca afinidade pelo oxigênio, alta viscosidade, com provável polimerização quando em hipóxia 4.

11 10 Em termos de características laboratoriais vários dados estão presentes na anemia falciforme, assim como mostra a seguir Hemoglobina S = 90 a 98% 2- Hemoglobina fetal = 2 a 10% 3- Anemia hemolítica com hemoglobina de 5 a 9g/dL, com VCM normal. 4- Morfologia eritrocitária representada por células falcizadas, anisocitose, poiquilocitose, eritroblasto, células em alvo, esferócitos, corpos de Howell-Jolly. 5- Reticulócitos aumentados de 5 a 30% durante as crises 6- Plaquetas aumentadas com formas anormais 7- Fragilidade osmótica diminuída 8- Bilirrubina indireta elevada (aproximadamente 6mg/dL) 9- Urobilinogênio urinário e fecal elevados 10- Hematúria frequente 11- Ácido úrico sérico pode estar elevado 12- Fosfatase alcalina sérica elevada nas crises 13- Medula óssea com hiperplasia das células eritróides A hemoglobinopatia S também pode possuir formas associadas. Por exemplo, é possível que se tenha a hemoglobina S associada à talassemia (HbS/thal) tanto com o genótipo homozigoto S S quanto com o heterozigoto A S. No caso do primeiro genótipo, a clínica é mais severa em relação as associações heterozigóticas. A seguir as combinações genéticas possíveis para a associação de hemoglobina S e talassemia, uma vez que talassemias podem ser alfa e beta 5 : Hb S S / thal normal ( homozigótico S)

12 11 Hb A S / thal normal ( heterozogoto S e thal ) Hb S thal o / Hb S thal + / As formas heterozigóticas Hb A S / thal normal e A S normal normal apresentam evolução próxima de ser assintomática, mesmo apresentando hemácias falcizadas, hemácias em alvo, hipocromia e microcitose 5. Outra possibilidade de heterozigose é a ocorrência do traço falciforme. Quando o indivíduo herda o gene para a hemoglobina S e outro para a hemoglobina A. Esta associação genética causa sintomas mais brandos nos portadores da condição, sendo geralmente assintomáticos, sem alteração na expectativa de vida. O hemograma se apresenta normal. Os sinais clínicos que podem estar presentes em pacientes com o traço falciforme aparecem apenas se os portadores se submeterem a condições de hipóxia, desidratação ou acidez, que propiciam o processo de falcização. Já foram relatados casos mais raros onde portadores do traço apresentaram complicações como infarto esplênico, complicações renais e do trato urinário, infecções e até morte 6. Para se ter o diagnóstico para o traço falciforme deve-se identificar a presença da heterozigose AS da hemoglobina. Neste sentido, a eletroforese em ph alcalino, com o teste de falcização, são opções, apesar de que atualmente a cromatografia líquida de alta resolução tem substituído métodos anteriores Fatores moduladores na anemia falciforme A destruição das hemácias leva à liberação de hemoglobina no plasma sendo que esta converte o NO em nitrato inativo. A lise de eritrócitos também libera arginase que destrói L- arginina, cuja função é a produção de NO. O resultado dessas lises é a diminuição da concentração de NO. Neste sentido é preciso lembrar que o NO é cofator da enzima guanilato-ciclase, conversora de GTP (trifosfato de guanosina) em cgmp (monofosfato de guanina cíclica), sendo que este último gera relaxamento dos músculos lisos vasculares e vasodilatação. Deste modo, podemos entender como a baixa disponibilidade de NO é

13 12 importante, no sentido de que altera a homeostasia vascular, altera o equilíbrio entre vaso constrição e relaxamento, o que aumenta o risco de vaso oclusão na anemia falciforme 7. Com o formato de foice, as hemácias se tornam rígidas e estagnadas em locais onde a circulação sanguínea é lenta, o que pode levar a anóxia. Uma consequência deste fato é a formação de trombos, e posteriormente enfarte do tecido desfavorecido pela presença de trombo. Os próximos acontecimentos são a fibrose e até mesmo calcificações. Um exemplo é o acometimento do baço, órgão com fluxo sanguíneo lento que na presença de trombo gera dores intensas. As plaquetas também contribuem para a adesão de eritrócitos ao endotélio, estando em atividade, elas liberam trombospondina. Este processo ativa a coagulação, favorecendo a formação de trombos 5. Em nível de membrana celular, algumas alterações como fosforilação anormal, anomalia da bomba Na/K e auto-oxidação gera fagocitose por macrófagos. Em ambientes pobres em oxigênio a membrana é lesada, com perda de água e potássio, configurando uma desidratação 5. A vasoclusão não se explica somente pelo fato de haver eritrócitos falcizados, mas por fatores de aderência. Por exemplo, há um processo de aderência anormal de eritrócitos e neutrófilos, anormalmente estimulados, durante as crises, contribuindo para a vasoclusão. As crises intensificam a atividade moduladora de VCAM-1, ICAM-1, E e P-selectinas, que são moléculas de adesão, assim como a citocina IL-6. O aumento de IFN-alfa, outro fator de aderência, intensifica a atividade dos monócitos nas crises vasculares, sendo estas células as produtoras de tal citocina. Infecções agudas e processos inflamatórios também são contribuintes para crises vasoclusivas, estimulando a aderência de neutrófilos e eritrócitos ao endotélio 5. Alguns fatores agravam as infecções, como por exemplo, a capacidade fagocítica, sendo mediada por opsoninas, é afetada pela agressão ao baço causada pelas células falcizadas ao passarem pelo órgão. Também se tem a produção de anticorpos afetada em consequência do mesmo fato 8. A explicação para a agressão sofrida pelo baço em pacientes portadores da doença está no fato de que na infância deve ocorrer esplenomegalia devido ao fato de que a polpa vermelha se congestiona ao sequestrar eritrócitos falcizados, que leva para a evolução de trombos podendo até gerar infarto no órgão, tendo a atrofia e a fibrose do órgão como

14 13 consequências do processo. Tal mecanismo é denominado auto-esplenectomia, ocorrendo na infância geralmente até os 5 anos 9. Neste sentido a ocorrência de infecções é esperada, e pior, instala-se um ciclo onde infecções originadas pelo processo de falcização desencadeiam processos trombóticos, podendo gerar maior dano ao baço com consequente aumento de infecções, continuando o ciclo. O que ratifica a periculosidade deste ciclo é que a infecção, por si, estimula a produção de citocinas inflamatórias, aumentando assim, a expressão das moléculas de adesão endoteliais e a adesão das células falciformes e dos polimorfonucleares no endotélio vascular, como já comentado 10. De acordo com Lorenzi (2006) podemos descrever o quadro clínico de um paciente homozigoto para HbSS da seguinte forma: - Tromboses desencadeadas por infecções, estresse, frio e desidratação que geram a falcização de eritrócitos; - Sintomatologia geralmente dolorosa devido a obstrução de pequenos vasos culminando na necrose de dedos, cabeça do fêmur, ou até mesmo cegueira pela obstrução de vasos do olho; - Possibilidade de enfarte de pulmão e de mesentério; - Dores musculares, abdominais, dores no peito e priaprismo; - Dactilite em crianças; - Úlceras nas pernas; - Anemia e icterícia; - Crise de insuficiência renal; - Leucopenia; - Crise de sequestração O tratamento da anemia falciforme se baseia no combate à dor, na hidratação e oxigenoterapia. Aplica-se também a antibioticoterapia, uma vez que as crises hemolíticas são geralmente desencadeadas por infecções. Aplica-se vacinas para S.pneumoniae, uma vez que

15 14 com o baço em funcionamento ineficaz, devido a vasoclusões durante as crises, se aumenta a probabilidade de infecções por bactérias capsuladas, sendo adotado também o uso de penicilina nos casos em que há ausência total de função esplênica 5. Na linha de tratamento faz-se o monitoramento de condições de acidose e desidratação, a fim de evitá-las. Transfusões de hemocomponentes são recomendadas em caso de aplasia medular, crises de hipersequestração esplênica ou hepática, e crises dolorosas de peito. As úlceras de membros inferiores são tratadas com medicação tópica antiinflamatória 5. Por fim, tem-se o transplante de medula óssea como opção para a cura. Mesmo assim devem ser levados em consideração os riscos de mortalidade e de complicações oriundas do procedimento 5. Um medicamento que tem sido utilizado e recomendado para pacientes com um quadro severo de anemia falciforme é a HU (hidroxiuréia). Este composto diminui a expressão da fosfatidilserina (PS), que por sua vez reduz o número de neutrófilos e também o número de moléculas de adesão em linfócitos e monócitos 5. Juntamente com o teste de falcização, contribuem para o diagnóstico de anemia falciforme os seguintes testes 11. Eletroforese alcalina em acetato de celulose Eletroforese ácida em agar ou agarose Teste de solubilidade Dosagem de Hemoglobina Fetal Dosagem de Hemoglobina A2 Hemograma completo Eletroforese de hemoglobinas em ph alcalino e também em ph ácido. Cromatografia líquida de alta performance (HPLC) Focalização Isoelétrica Teste de falcização

16 Técnicas atualmente utilizadas a) Eletroforese alcalina e Eletroforese para identificação de hemoglobina S: Em termos de princípio metodológico, a eletroforese de hemoglobina em fita de acetato de celulose, assim como a eletroforese em agarose, é uma técnica que permite a migração de hemoglobinas, carregadas negativamente, em uma velocidade característica desta molécula, para o pólo positivo. Desta forma, identificam-se diferentes tipos de hemoglobinas de acordo com o padrão de suas migrações 12. A seguir, figuras representando corridas eletroforéticas exibindo freqüentes alterações em que poderiam ser identificados em neonatos e após o sexto mês de vida 11. Figura 2 - Padrão de genótipos de recém nascidos em Eletroforese Fonte: ANVISA, 2002 Figura 3 - Padrão de genótipos após 6 meses de vida em Eletroforese Fonte: ANVISA, 2002

17 16 b) Teste de solubilidade: O teste de solubilidade visa reduzir a hemoglobina S, pois esta é insolúvel em tampão inorgânico. Considerando que outras hemoglobinas são solúveis, esta seria uma forma de isolar a hemoglobina S. O princípio do teste se baseia no fato de que quando há desoxigenação, ocorre o deslocamento lateral das cadeias beta, ao contrário do que ocorre na oxigenação, com as cadeias beta retornando ao eixo. A lise dos eritrócitos, quando na mistura de ditionito de sódio no teste de solubilidade, libera hemoglobina desoxigenada e a cadeia beta de cada molécula se desloca lateralmente, causando opacidade na leitura do teste 6. c) Dosagem de Hemoglobina Fetal: Teste realizado utilizando solução alcalina em concentração de hemolisado conhecido. Aplica-se sulfato de amônio para bloquear a desnaturação, diminuindo o ph e precipitando a hemoglobina,agora, desnaturada. Pelo processo de filtragem detecta-se a quantidade de hemoglobina alterada, ou seja, a hemoglobina fetal 13. d) Hemograma completo: Teste de rotina para triagem e monitoramento. Realiza leitura de índices hematimétricos, contagem diferencial para a linhagem branca, contagem de plaquetas 14. A contagem diferencial para leucócitos possui grande importância para a clínica da anemia falciforme, sendo comumente contados Leucócitos, Neutrófilos, Segmentados, Bastonetes, Linfócitos, Monócitos, Eosinófilos e basófilos. Estes são liberados em valores absolutos e percentual. Os valores de referência variam de acordo com idade, sexo e população. Para a linhagem eritrocítica, são quantificados hemácias, hemoglobina, hematócrito, Volume Corpuscular Médio, Hemoglobina Corpuscular Média e RDW ( Red cell distribution Width ), para um hemograma completo. São realizados também exames correlacionados como contagem de reticulócitos e capacidade de ligação do ferro 14. e) HPLC: Técnica analítica utilizada por indústrias químicas e farmacêuticas. Utiliza-se partículas de fases estacionárias (FE) e móveis que permitem gerar colunas seletivas e

18 17 estáveis química e mecanicamente. O desenvolvimento da cromatografia líquida de alta performance, é boa alternativa devido à necessidade de análises mais rápidas,sem comprometer o desempenho cromatográfico 15. A HPLC é de cromatografia que utiliza um líquido como fase móvel, sendo este injetado na coluna cromatográfica a altas pressões e diferentes tipos de fase estacionária. A variação estará de acordo com aquilo que se quer analisar. Os elementos da fase estacionária, em geral se encontram altamente particionados, o que gera uma separação mais eficiente. Os reservatórios para os reagentes são basicamente bombas que propulsionam a fase móvel a altas pressões, injetor de amostra, coluna cromatográfica e um detector acoplado a um computador. A Cromatografia Líquida de Alta Performance é a base para o raciocínio da realização de outras técnicas como a cromatografia gasosa e de troca iônica 16. f) IEF: A carga do composto anfotérico, durante o teste, permanece alterada e migra através do gradiente de ph, alcançando sua posição de equilíbrio, ou seja, alcança sua posição de equilíbrio, em outras palavras, alcança a região onde o PI (ponto isoelétrico) e ph (potencial hidrogeniônico) são iguais 17. g) Teste de falcização: É um teste que utiliza meta bissulfito, cujo princípio baseia-se na polimerização da hemoglobina sob hipóxia e hipertonicidade. O resultado prático deste fato é a cristalização da Hb que falciza os eritrócitos, que são identificados microscopicamente. Destaca-se que o processo de falcização deve ser confirmado com outros métodos, como HPLC, por exemplo 14. Para a diferenciação dos tipos de hemoglobinas tem-se a eletroforese de hemoglobinas em ph alcalino e também em ph ácido. Atualmente utiliza-se a cromatografia líquida de alta performance (HPLC) como alternativa eficiente para este fim 18. Como já citado, a hemoglobina S pode estar associada a outras hemoglobinas, como por exemplo, a Hb C. Neste sentido, o uso de técnicas eletroforéticas alcalina e ácida é decisivo para o correto diagnóstico. Desaconselha-se o uso exclusivo de testes de solubilidade, uma vez que não se pode diferenciar indivíduos AS, SS ou SC, podendo até

19 18 mesmo serem apresentados resultados negativos em neonatos devido à pequena concentração da Hb S 11. Neste Trabalho de Conclusão de Curso foi escolhido o tema Análise de metodologias laboratoriais para diagnóstico de Anemia falciforme, devido à importância, abrangência do assunto e o grau de acometimento da doença, aliando a área de diagnóstico laboratorial com o caráter clínico. Neste Trabalho de Conclusão de Curso II espera-se elucidar qual é a melhor metodologia para diagnóstico de anemia falciforme levando em considerações variáveis como sensibilidade, tempo, investimento tecnológico, viabilidade econômica, confiabilidade, adequação ao laboratório e ao paciente. Serão comparadas as técnicas de Hemograma, Teste de Solubilidade, Teste de Falcização, Eletroforese alcalina, Eletroforese ácida, Teste do Pezinho, PCR e enzimas de restrição, Focalização Isoelétrica e Cromatografia Líquida de Alta Performance.

20 19 2 REVISÃO DA LITERATURA Para se diagnosticar hemoglobinopatias, variantes como dados clínicos, herança genética, idade, tempo de estocagem da amostra, assim como condições de armazenamento da mesma devem ser levadas em consideração. Estas duas últimas variantes, se não bem controladas, podem interferir no exame devido a uma possível desnaturação da hemoglobina 6. A princípio, espera-se o seguinte padrão de evolução da hemoglobina. Tabela 1 - Padrão de prevalência de hemoglobinas Fonte: FERRAZ & MURAO, 2007 A anemia falciforme, por sua vez, apresenta a hemoglobina S prevalecendo na medida em que a hemoglobina fetal vai desaparecendo. Para avaliar se há alguma hemoglobinopatia vários testes podem ser empregados, porém, sempre deve-se fazer um teste confirmatório após o sexto mês de vida, etapa na qual a HbS já pode ser identificada com mais clareza se presente 6. Dentre os métodos para detecção de hemoglobinas anormais estão o teste de solubilidade, eletroforese em p.h alcalino e ácido, focalização isoelétrica, eletroforese de cadeias globínicas e (HPLC). Cada uma destas técnicas apresentam limitações e vantagens no processo de determinação de hemoglobinas 19. O procedimento para detecção de isoformas da hemoglobina em eletroforese em ph alcalino é rotineiramente utilizado em laboratórios. Entretanto, esta técnica é um procedimento de rastreamento inicial, uma vez que tal metodologia permite a migração de hemoglobinas semelhantes. A eletroforese em ph alcalino pode diferenciar as hemoglobinas A da F das variantes mais frequentes, como as hemoglobinas S e C, mas não faz a diferenciação das hemoglobinas A2 da C, O e E. Desta forma, metodologias complementares devem ser realizadas 19.

21 20 Em termos de diagnóstico deve-se levar em consideração que a eletroforese de ph alcalino tem vantagens quando se lida com amostra de período neonatal. A hemoglobina é uma proteína carregada negativamente, logo, o fato da migração ocorrer para o pólo positivo é a base da eletroforese de hemoglobina em ph alcalino.desta forma, a diferença no padrão de migração é certamente resultado de uma diferente estruturação molecular da globina, que por sua vez possui aminoácidos com diferentes posicionamentos 20. Sabe-se que a grande presença de hemoglobina fetal prejudica a eficácia desta técnica, por tal razão a eletroforese em ph ácido reduz este problema, uma vez que é capaz de separar as frações S da D, e a C da E, que correm na mesma faixa na eletroforese em ph alcalino. 20. O teste de solubilidade, baseado no uso de ditionito de sódio, assim como o teste de falcização, que utiliza metabisulfito de sódio não são muito precisos na detecção de HbS no período neonatal uma vez que a hemoglobina fetal, está presente em grande quantidade. Neste sentido, a ocorrência de resultados falsos negativos é frequente. Portanto, um teste de solubilidade negativo deve ser interpretado com cautela. Devido à grande quantidade de Hb F no período neonatal, que funciona como efeito diluidor, este teste pode se apresentar falso negativo. O mesmo pode ser dito em relação ao teste de falcização. Entretanto, vale lembrar que o teste de solubilidade possui boa sensibilidade para a triagem da Hb S de outras faixas etárias, além de ter um menor custo, se comparado à eletroforese, e também oferece facilidade de execução 20. O teste de solubilidade não é específico, uma vez que não diferencia anemia falciforme, de traço falciforme, nem mesmo de outras variantes da HbS. Sua utilização se baseia na aplicação de ditionito de sódio em eritrócitos lisados, visando reduzir a hemoglobina S. A turvação da solução é consequência da presença da hemoglobina S, e a ausência de turvação está presente tanto em negatividade quanto em outras hemoglobinas. Apesar dos aspectos negativos citados, esta técnica ainda se faz muito útil na triagem 14. Da mesma forma que outras metodologias, o teste de solubilidade pode apresentar resultados falsos positivos, assim como falsos negativos. Os resultados falsos negativos são devidos à hemoglobina a baixo de 7g/dL, presença de hemoglobina fetal em recém-nascidos, baixa quantidade de hemoglobina S e uso de fenotiazina. Os falsos positivos decorrem de amostras lipêmicas, gama globulinas anormais, policitemia, grande quantidade de corpúsculo de Heinz e grande quantidade de eritrócitos nucleados 14.

22 21 Os métodos de eletroforese por focalização isoelétrica e cromatografia líquida de alta resolução são boas alternativas de substituição de métodos convencionais para triagem neonatal. São metodologias que proporcionam alta precisão. Mesmo assim, após um resultado positivo uma repetição do teste é necessária. A sensibilidade e a especificidade devem sempre ser almejadas de forma que se por algum motivo o resultado se mostre inconclusivo após a realização de um teste, este deve ser confirmado com o uso de outra técnica cabível no laboratório, sendo que resultado de ambas deve ser reportado no laudo 6. Segundo Liane Esteves Daudt et al, quando comparada com a eletroforese em acetato de celulose, a focalização isoelétrica se mostra superior no quesito resolução, separação de HbS da HbF de forma mais evidente. Também menciona que mesmo que o preço do equipamento para a análise por focalização isoelétrica seja caro, os seus reagentes possuem o mesmo custo, com a vantagem de se realizar 72 testes a cada seis horas. Atualmente, na avaliação laboratorial para identificação de diferentes hemoglobinas são frequentemente utilizados os métodos de eletroforese de hemoglobinas em ph alcalino e a cromatografia líquida de alta pressão. A seguir uma figura ilustrando a utilização da eletroforese alcalina de hemoglobinas 18. Figura 4 - Amostras para identificação de hemoglobinas em Eletroforese Fonte: NAOUM, 2010 O ph nesta situação é de 9,0. O resultado da corrida eletroforética mostrou que a amostra sete apresentou o genótipo SS, que corresponde a anemia falciforme. As outras

23 22 hemoglobinas puderam ser identificadas de acordo com a avaliação de seus posicionamentos após a corrida. Os padrões encontrados foram AA, AA2 diminuída, AC, AGC, SC, SF,SS e AS 18. A identificação de hemoglobinas normais e anormais é rotineiramente realizada por eletroforese, utilizando o acetato de celulose em ph alcalino.poucos laboratórios utilizam outros sistemas de auxílio a esta técnica, como géis de Agar, Agarose, mistura Agar-amido em ph ácido, alcalino ou neutro. De fato, as metodologias normalmente utilizadas em laboratório para diagnóstico de hemoglobinopatias nem sempre fornecem uma resolução adequada para a avaliação das hemoglobinas. A seguir, algumas situações que podem prejudicar a sensibilidade dos testes Frações com concentrações inferiores a 1%; 2- Frações que migram na mesma posição, quer seja em ph Alcalino, quer em p.h ácido; 3- Frações de hemoglobinas instáveis que se desnaturam pelos métodos usuais de obtenção do hemolisado com solventes orgânicos; 4- Frações que, em recém nascidos, apresentam concentrações ínfimas e de difícil visualização; 5- Frações de mutantes de cadeia alfa que migram de forma rápida. Se o laboratório puder contar com a metodologia de focalização isoelétrica (FIE), certamente este terá boa confiabilidade no que diz respeito à interpretação, realização e resolução na diferenciação do fenótipo das bandas de vários tipos de hemoglobinas de acordo, claro, com o ponto isoelétrico P.I de cada fração. Este fato demonstra que a FIE tem alta especificidade 17. A técnica de focalização isoelétrica fornece também vantagens nos seguintes quesitos: 1- Possibilidade de se utilizar pouca quantidade e hemácias 2- Aplicação de muitas amostras concomitantemente (até 80) 3- Obter o hemolisado tanto do sangue total, como de cartões de papel de filtro (Similar aos utilizados no teste do pezinho)

24 23 A cromatografia líquida automatizada de alta resolução, (HPLC), apresenta vantagens bem relevantes sobre a eletroforese convencional. Primeiramente, temos que lembrar que o analisador é automático, o que logo poupa trabalho manual assim como tempo. Assim sendo, o processamento de amostras em número é aumentado em grandes proporções. Outra vantagem está no fato de que a máquina consegue trabalhar com volumes ínfimos da amostra, até cinco microlitros. Este fato torna interessante o uso da HPLC na Neotologia. Está técnica também é capaz de identificar e quantificar hemoglobinas normais e variantes simultaneamente 22. Os métodos de imagem auxiliam o diagnóstico e principalmente a identificação de complicações oriundas da condição clínica da anemia falciforme, com facilidade na percepção das complicações musculoesqueléticas. Por exemplo, a radiografia simples revela aspectos resultantes da condição, como estriações perpendiculares e vértebra em H, infartos ósseos em estágios avançados. Também com suas vantagens, a ressonância magnética detecta alterações osteoarticulares, além de ser boa ferramenta para monitorar infecções e infartos musculares 23. De qualquer forma a análise citológica, com eletroforese de hemoglobinas e HPLC formam um grupo efetivo de técnicas para o diagnóstico da anemia falciforme. Importante lembrar também que testes usualmente utilizados para a identificação de anemias hemolíticas, como é o caso da anemia falciforme, são a contagem de reticulócitos, bilirrubina indireta, DHL e haptoglobina 18. A eletroforese que utiliza como suporte o ágar em ph ácido ou procedimentos semelhantes tem sido realizada apenas em alguns laboratórios e na diferenciação de hemoglobinas que migram na mesma posição em ph alcalino, como é o caso das hemoglobinas S e D e das C e E. Entretanto, na população brasileira, são mais freqüentes as hemoglobinas S e C(1, 14, 24, 25), o que, de uma forma errônea, conclui-se que esse teste não apresenta a validade devida no auxílio diagnóstico laboratorial 17. Devido ao seu alto poder de resolução, a IEF tornou-se a mais promissora e versátil metodologia para o estudo de sistemas polimórficos, incluindo-se as hemoglobinopatias, como também para a descoberta de novas variantes genéticas 17. Importante lembrar também que o hemograma é essencial no suporte do diagnóstico da anemia falciforme. As características laboratoriais mais presentes na doença já foram citadas neste trabalho 1.

25 24 A metodologia laboratorial é certamente dependente do grupo populacional em questão, sendo que as ferramentas fornecidas por cada método dependerá da combinação dos métodos aplicados para triagem e confirmação dos suspeitos. A população brasileira caracteriza se por apresentar grande heterogeneidade genética, derivada da contribuição dos seus grupos raciais formadores 24. O teste do pezinho para Triagem neonatal, também conhecido como Teste de Guthrie, é um método utilizado para a triagem de hemoglobinopatias, como a anemia falciforme e apresenta vantagens como baixo custo e a simplicidade de realização. Porém, outros métodos quantitativos possibilitam a automatização e têm a grande vantagem de ser mais sensíveis e específicos, ou seja, produzem menos casos falsos positivos e negativos 25. É importante lembrar que a prematuridade, assim como a ocorrência de transfusão de sangue no recém-nascido pode influenciar os resultados do teste para hemoglobinopatias, como é o caso da anemia falciforme. Portanto, recomenda-se uma coleta nos primeiros dias de vida 26. Segundo o Manual de Normas Técnicas e Rotinas Operacionais do Programa de Triagem Neonatal do Ministério da Saúde 27, sempre que houver resultado inconclusivo na técnica escolhida, técnicas complementares devem ser implementadas, com o objetivo de melhorar a sensibilidade e a especificidade. Quanto ao controle da doença, a divulgação da informação, o diagnóstico neonatal, assim como o aconselhamento genético, desempenham papéis fundamentais. É importante a utilização de uma tecnologia adequada que inclua testes laboratoriais seletivos e de confirmação, estudo familial, assim como profissionais capacitados 24. Orlando et al 24 em um estudo comparativo entre as metodologias incluiu os testes de solubilidade, de gel-centrifugação e eletroforese de hemoglobina, sendo a última capaz de detectar o maior número de amostras positivas para o gene S. No estudo este teste não foi capaz de detectar uma amostra positiva. Orlando et al 24 compararam o teste de solubilidade, o de falcização e o de gelcentrifugação. Estes não mostraram evidente discrepância entre eles em 28 amostras de HbAS analisadas de um total de 836 amostras de pacientes de pré-natal estudadas.

26 25 Em outro estudo comparativo entre as metodologias, Giovelli et al, detectou, utilizando o teste de solubilidade, uma sensibilidade de 93,8% e uma especificidade de 100%. Com estes dados em vista, variáveis como facilidade, praticidade e rapidez na execução, estabilidade e durabilidade dos reagentes e a fácil capacitação de profissionais para execução da técnica justificam a utilização destes métodos menos sensíveis para triagem, contanto que se utilizem testes sensíveis e quantitativos como confirmatórios. Esta necessidade é certamente importante quando há procura de HbS no período neonatal, uma vez que a HbF ainda em alto número diminuirá a eficiência da técnica de solubilidade. Faz-se essencial considerar condições clínicas que podem gerar falsos positivos, como policitemia, mieloma múltiplo, transfusão recente e insuficiência renal crônica. Da mesma forma, resultados falsos negativos podem ser consequência de uma baixa quantidade de hemoglobina 29. Desta forma, a avaliação de custo-benefício deve ser levada em consideração. A eletroforese de hemoglobinas exige maior tempo para a execução com um custo um pouco mais elevado. Entretanto, Giovelli et al, enfatiza sua importância quando se trata de diagnóstico para triagens em bancos de sangue, para impedir a ocorrência de resultado falsos. O teste de falcização é uma técnica bastante utilizada devido ao seu baixo custo. Este serve como metodologia para diagnóstico de doença falciforme, traço falciforme, hemoglobinas não falciformes, heterozigose dupla de certas variantes, como HBS/HBD (Los Angeles), entre outras. Apesar das vantagens mencionadas, há a possibilidade de resultados falsos positivos e falsos negativos. Os falsos positivos podem decorrer de tranfusões de eritrócitos com traço falciforme, concentração excessiva de metabissulfito de sódio, poiquilocitose, entre outros. Os resultados falsos negativos podem acontecer devido a transfusões de eritrócitos normais, aquecimento, contaminação bacteriana, lavagem prolongada com salina, presença de hemoglobina fetal em recém-nascidos, baixa quantidade de hemoglobina S ou reagentes fora da validade 14. Outra técnica de alta relevância é a PCR (reação em cadeia da polimerase). Em situações onde há presença de hemoglobinas semelhantes esta técnica é fundamental. Entre as possíveis hemoglobinas semelhantes estão HbS/β-tal., HbS/βδ tal. e HbS/PHHF (Persistência Hereditária de Hemoglobina Fetal) 12.

27 26 Em um de seus estudos Kangpu Xu et al, demostraram o uso em conjunto de PCR, enzimas e restrição e eletroforese em gel de acrilamida para diagnóstico de anemia falciforme. A seguir, uma figura com as bandas relativas à presença de genótipo para anemia falciforme (Bandas 7, 8, 9 e 10 são amostras) Figura 5 - Identificação de genótipos para traço falciforme utilizando PCR e enzimas de restrição. Fonte: KANGPU XU et al, 1999 Primeiramente, foram analisados os genótipos de um casal com utilização de PCR e enzimas de restrição, que confirmaram o traço falciforme para ambos após eletroforese. Em seguida, após fertilização in vitro, seis embriões tiveram amostras de seus blastômeros retiradas para processamento de PCR mais enzimas de restrição e leitura em eletroforese. O resultado segue na figura 6 30 :

28 27 Figura 6 - Identificação de genótipos para anemia falciforme utilizando PCR e enzimas de restrição. Fonte: KANGPU XU et al, 1999 O embrião cujo genótipo se apresentou normal foi implantado no útero da mãe, sendo este o primeiro caso relatado em que a fertilização in vitro com identificação de genótipo por PCR, enzimas de restrição com posterior leitura em eletroforese, evoluiu para gravidez não afetada por anemia falciforme, mesmo com pais portadores de traço falciforme. O uso da PCR seguida do uso de enzimas de restrição e eletroforese se mostrou eficiente, portanto, para o diagnóstico de anemia falciforme. Porém, estes métodos se mostram caros e consomem bastante tempo para a rotina laboratorial 30. De qualquer forma, é importante considerar medidas de controle, como o correto aconselhamento genético e educacional, seguido de acompanhamento médico da condição a fim de se diminuir a morbidade e a mortalidade 11. Baseado no fato de que neste trabalho foi estabelecido um total de nove metodologias como suporte para comparações e análise, tem-se a seguir um quadro-resumo confeccionado para resumir as vantagens e desvantagens mencionadas.

29 28 Tabela 2 - Resumo das metodologias revisadas neste trabalho Técnicas Vantagens Desvantagens Hemograma Fundamental para triagem e monitoramento. Não é um exame exclusivo; automação conta eritroblastos como leucócitos. Teste de Solubilidade Teste de Falcização Menor custo; Consumo de tempo; fácil preparação profissional. Baixo custo; fácil execução. Doença falciforme; traço falciforme; hemoglobinas não falciformes; heterozigose dupla de certas variantes. Inespecífico durante o período neonatal; falsos positivos e negativos; Ineficaz para diferenciação para traço falciforme. Falsos positivos e falsos negativos. HPLC Analisador automático; trabalho manual e tempo poupados;grande número de amostras processadas trabalha mesmo com volumes ínfimos da amostra, até cinco microlitros. Alto custo com Equipamento. IEF Teste do Pezinho PCR e Enzimas de restrição Eletroforese Ácida Resolução superior; HbS da HbF de forma mais evidente; alta especificidade; reagentes com mesmo preço para Eletroforese Alcalina; 72 testes a cada seis horas. Teste de Guthrie; Triagem neonatal; baixo custo; simplicidade de realização. Para hemoglobinas semelhantes; HbS/β-tal., HbS/βδ tal. e HbS/PHHF;eficiência para identificação de hemoglobinas em embriões. Diferenciação das hemoglobinas A2 da C, O e E. Alto custo com equipamento; consumo de tempo. Menos sensível e específico que a automação; prematuridade, transfusão de sangue no recém-nascido influenciam resultados; falsospositivos e negativos. Alto custo; Consumo de tempo para a realização. Consumo de tempo; Migrações em porções iguais. Eletroforese Alcalina Diferenciar hemoglobinas A da F das variantes frequentes; como as hemoglobinas S e C; eficaz no período neonatal. Não faz a diferenciação das hemoglobinas A2 da C, O e E; consumo de tempo.

30 29 3 OBJETIVOS Realizar uma análise comparativa, por meio de revisão bibliográfica, de metodologias laboratoriais para diagnóstico de anemia falciforme, estabelecendo, dentre os métodos estudados, o melhor teste para diagnóstico da doença. Espera-se que este trabalho sirva como fonte de aprendizado para estudantes, uma vez que as comparações aqui realizadas são encontradas de uma forma dispersa na literatura.

31 30 4 MATERIAL E MÉTODO Para a realização deste trabalho foram utilizados artigos e livros referenciados, assim como sites reconhecidos pelo meio acadêmico, como SCIELO (Scientific Library Online), ACT (Academia de Ciência e Tecnologia), ANVISA (Agência Nacional de Vigilância Sanitária) e Ministério da Saúde. Algumas referências serviram como fonte para ilustração, como ANDERSON, Shauna C.; POULSEN, Keila, Atlas de hematologia, NAOUM, 2010, Doenças que alteram os exames hematológicos, MANUAL de Diagnóstico e Tratamento de Doença Falciformes. Brasília: ANVISA, 2002 e XU, Kangpu, First unaffected pregnancy using preimplantation genetic diagnosis for sickle cell anemia. A confecção do trabalho foi dividida em duas etapas: 1) Projeto de Trabalho de conclusão de curso; 2) Realização da revisão bibliográfica para comparações de técnicas laboratoriais para diagnóstico de anemia falciforme. O trabalho foi, portanto, estruturado por Introdução e Revisão bibliográfica propriamente dita. Foram escolhidas as seguintes técnicas como fonte de comparação: Hemograma Teste de Solubilidade Teste de Falcização Eletroforese Ácida Eletroforese Alcalina Cromatografia Líquida de Alta Performance Focalização Isoelétrica Teste do Pezinho PCR e enzimas de restrição Foram procuradas fontes recentes para garantir que as informações apresentadas sejam atuais, salvo algumas referências mais antigas de grande pertinência para este Trabalho de Conclusão de Curso.

32 31 5 CONCLUSÃO Cada metodologia laboratorial possui sua vantagem e desvantagem, de acordo com o contexto em que o diagnóstico deverá ser realizado. Entretanto, atualmente, podemos considerar algumas metodologias mais confiáveis e sensíveis do que outras quando o assunto é a identificação de hemoglobina S para diagnóstico de anemia falciforme. Se por um lado o teste de falcização e de solubilidade oferecem menor confiabilidade para tal diagnóstico, os métodos de eletroforese por focalização isoelétrica e cromatografia líquida de alta resolução são ótimas alternativas para confirmação. É importante destacar que para avaliar se há alguma hemoglobinopatia vários testes podem ser empregados, porém, sempre se deve realizar um teste confirmatório após o sexto mês de vida. A análise citológica, com eletroforese de hemoglobinas e HPLC formam um grupo efetivo de técnicas para o diagnóstico da anemia falciforme. Entretanto, não são técnicas exclusivas e obrigatórias. Em vista a esses fatos, cada laboratório deve avaliar seu potencial para manutenção econômica da implementação e constante uso destas técnicas. Se tratando de diagnóstico para anemia falciforme, torna-se difícil eleger uma das metodologias mencionadas neste trabalho de conclusão de curso como a melhor sem que o contexto do diagnóstico seja levado em consideração. Se por um lado, fatores como facilidade, praticidade, rapidez na execução, estabilidade, durabilidade dos reagentes e a fácil capacitação de profissionais para execução da técnica justificam a utilização de métodos menos sensíveis para triagem, por outro o uso de técnicas mais onerosas, que exijam maior capacitação dos profissionais, retribuem o serviço laboratorial com melhor confiabilidade e sensibilidade.

33 32 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 1. NAOUM, Paulo C.; NAOUM, Flávio A. Hematologia laboratorial. São José do Rio Preto: Academia de Ciência e Tecnologia, BANDEIRA, Flávia Miranda Gomes de Constantino, et al. Características de recémnascidos portadores de hemoglobina S detectados através de triagem em sangue de cordão umbilical.jornal de pediatria, ANDERSON, Shauna C.; POULSEN, Keila. Atlas de hematologia. São Paulo: Santos, FABRY ME, KAUL DK. Sickle cell vaso-occlusion. Hematol/Oncol Clin N Am. 1991;5: Department of Medicine, Albert Einstein College of Medicine, Bronx, New York, LORENZI, Therezinha. Manual de hematologia: propedêutica e clínica. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, c FERRAZ, Maria Helena C.; MURAO, Mitiko. Diagnóstico laboratorial da doença falciforme em neonatos e após o sexto mês de vida. Rev. Bras. de Hematologia e Hemoterapia, Rio de Janeiro, v. 29, n. 3, p , FIGUEIREDO, Maria Stella. Fatores moduladores da gravidade da evolução clínica da anemia falciforme: modifiers factors of clinical severity in sickle cell anemia. Rev. bras. hematol. Hemoter., São José do Rio Preto, v.29, n.3,p , LOGGETO, Sandra R et al. Alterações imunológicas em pacientes com anemia falciforme. Revista brasileira de alergia e imunopatologia, HOKAMA, Newton. et. al. Interferência da malária na fisiologia e na fisiopatologia do eritrócito: parte 2: fisiopatologia da malária, da anemia falciforme e suas inter-relações. J. bras. de Medicina, Rio de Janeiro, v.83, n.2,p.40-48,ago DAYANA V. P. Di Nuzzo1, Silvana F. Fonseca2. Anemia falciforme e infecções: Sickle cell disease and infection. J. de Pediatria, Porto Alegre, v.80, n.5, p , MANUAL de Diagnóstico e Tratamento de Doenças Falciformes. Brasília: ANVISA, Disponível em: Acesso em: 30 out MARTINS, Fábio de França. Cromatografia líquida de alta performance como método de triagem de doadores de sangue. Ciência News., São José do Rio Preto, 2011.