IDENTIFICAÇÃO DE COMPOSTOS VOLÁTEIS DE MAÇÃS (Malus domestica) CULTIVAR FUJI, POR CROMATOGRAFIA GASOSA-ESPECTROMETRIA DE MASSAS 1

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1 IDENTIFICAÇÃO DE COMPOSTOS VOLÁTEIS DE MAÇÃS (Malus domestica) CULTIVAR FUJI, POR CROMATOGRAFIA GASOSA-ESPECTROMETRIA DE MASSAS 1 Natália S. JANZANNTTI 2, Maria Regina B. FRANCO 2,*, Fernando M. LANÇAS 3 RESUMO Os compostos voláteis da maçã cultivar Fuji foram estudados durante 2 anos consecutivos (1994 e 1995). O isolamento dos compostos voláteis da maçã Fuji foi feito utilizando-se uma técnica de enriquecimento dos voláteis do "headspace" em Porapak Q e eluição com hexano. Foram detectados 84 componentes voláteis na maçã Fuji, por cromatografia gasosa de alta resolução, dos quais trinta foram identificados por cromatografia gasosaespectrometria de massas, aliada aos índices de Kovats. Os compostos majoritários foram os ésteres acetato de butila, acetato de 2-metil butila, acetato de hexila e o terpeno -farneseno. A classe química predominante, entre compostos voláteis na maçã Fuji, foi a dos ésteres. Palavras-chave: cromatografia gasosa; espectrometria de massas; compostos voláteis; maçã. SUMMARY IDENTIFICATION OF THE VOLATILE COMPOUNDS OF FUJI APPLES (Malus domestica) BY HIGH RESOLUTION GAS CHROMATOGRAPHY MASS SPECTROMETRY. Volatile compounds

2 from the Fuji cultivar of apples were studied during two consecutive years (1994 and 1995). Headspace volatile compounds of Fuji apple were captured on Porapak Q traps and eluted with hexane. Eighty-four volatile compounds were detected in the Fuji apple by high resolution gas chromatography, of which thirty compounds were identified by CG-MS and Kovats indices. Butyl acetate, 2-methyl butyl acetate, hexyl acetate and -farnesene were the major volatiles in the fresh fruit. The predominant class of compounds was that of the esters. Keywords: gas chromatography; mass spectrometry; volatile compounds; apple. 1 INTRODUÇÃO A maçã (Malus domestica) é uma das principais frutas comercializadas no Brasil, tendo grande importância no faturamento anual das vendas de frutas frescas brasileiras. Os Estados da região Sul são os principais produtores de maçãs, sendo as principais variedades comercializadas a Gala e a Fuji, cujo sabor tanto agradam os consumidores europeus e americanos [1]. Os compostos voláteis são responsáveis pelo aroma e sabor característico da maçã e variam de acordo com a cultivar. Desde que tais compostos são termicamente instáveis e que a produção crescente de maçãs no Sul do país tem atraído o setor industrial para a elaboração de produtos processados, tornase interessante caracterizar os componentes voláteis da fruta brasileira. A pesquisa dos constituintes voláteis do sabor pode fornecer informações que irão orientar medidas adequadas ao processamento e à comercialização, para a obtenção de um produto final de alta qualidade. O presente trabalho teve como objetivo caracterizar os compostos voláteis da maçã cultivar Fuji (safras de 1994 e 1995), cultivada no Brasil. Concomitantemente fez-se o estudo das mudanças na composição de voláteis nas etapas de processamento do suco clarificado de maçã, o qual será publicado em um próximo trabalho.

3 2.1 Seleção da matéria prima 2 MATERIAL E MÉTODOS Foram utilizadas maçãs da cultivar Fuji procedentes do Estado de Santa Catarina, região de Friburgo, adquiridas na CEASA de Campinas, em caixas de 18Kg e com graduação entre 130 e 165, o que significa o número de frutas por caixa. As maçãs estavam em estágio adequado de maturação, de acordo com a aparência. Estudou-se as safras referentes aos anos de 1994 e A primeira safra foi analisada em julho de 1994 e a segunda em maio de Para cada safra empregou-se 72Kg de maçãs, que após homogeneização, foram divididas em 4 lotes, sendo 3 lotes de 20Kg empregados para o processamento do suco (em triplicata) e os 12Kg restantes empregados para a análise dos voláteis da fruta "in natura", também em triplicata. 2.2 Preparo da amostra Para o preparo da amostra, 15 maçãs (aproximadamente 1,5Kg) sofreram quarteamento e as partes opostas foram cortadas em cubos de aproximadamente 1cm 3, após eliminação do miolo e pêndulo. Trezentos gramas de amostra foram então colocados no balão do sistema de coleta de voláteis e misturados com NaClp.a. 30%p/p, para inibição enzimática [3]. 2.3 Isolamento dos compostos voláteis O isolamento dos voláteis foi realizado pelo método de enriquecimento dos vapores do "headspace" em polímero poroso por sucção [3]. O polímero usado foi Porapak Q, mesh, cujo condicionamento foi feito a 180º C por no mínimo 8h, sob fluxo de nitrogênio ultra puro de 30mL/min. Em estudo realizado anteriormente [5], a avaliação sensorial em conjunto com a análise cromatográfica dos extratos permitiu a padronização das condições ótimas para a obtenção de um isolado com o aroma original do produto investigado. Os voláteis do headspace de maçãs, cultivar Fuji, foram coletados por 2 horas em Porapak Q e eluídos com hexano grau cromatográfico. 2.4 Cromatografia gasosa de alta resolução

4 A separação e detecção dos compostos voláteis foram realizadas em cromatógrafo a gás Varian, modelo 3300, com detector de ionização de chama, injetor do tipo "split/splitless" e coluna capilar de sílica fundida de fase líquida SE-54 de 50m de comprimento, 0,21mm de diâmetro interno, a 20psi. As condições cromatográficas foram: gás de arraste, hidrogênio, com velocidade linear de 45cm/s; "make-up", nitrogênio, com fluxo de 30mL/min; fluxo de hidrogênio e de ar no detector: 30mL/min e 300mL/min, respectivamente; temperatura do detector: 250º C; temperatura do injetor: 200º C; tipo de injeção "splitless" de Grob [4]; período "splitless", 0,5min; volume injetado 2µ L; programação da coluna, 50º C por 10min, 2º C/min até 75º C, 3º C/min até 150º C e 5º C/min até 200º C. Os dados sobre tempos de retenção e as porcentagens relativas dos compostos voláteis foram obtidos através de um integrador Varian, modelo 4290, acoplado ao cromatógrafo. A quantificação foi feita por normalização. Os compostos voláteis foram identificados por espectrometria de massas e índice de Kovats. 2.5 Cromatografia gasosa espectrometria de massas Foi utilizado cromatógrafo a gás Hewlet-Packard modelo 5890, acoplado a um espectrômetro de massa HP-MSD A separação foi feita em coluna de sílica fundida LM 5, de 30m e 0,25mm de diâmetro interno, nas mesmas condições utilizadas anteriormente (item 2.4). Os parâmetros foram os seguintes: gás de arraste, He ultra puro, com velocidade linear de 32 cm/seg; temperatura injetor, 250º C; temperatura detector, 280º C; fonte de impacto de elétrons, 70eV; injetor, split a uma razão de divisão de 1:20; volume injetado, 3µ L. O analisador utilizado foi o quadrupolo e integrador HP Os espectros de massa obtidos foram comparados com os da literatura [6]. 2.6 Índices de Kovats Foi empregada uma mistura de padrões de alcanos C 8 -C 16 adicionada à solução dos voláteis, para aplicação da fórmula:

5 onde I é o índice de retenção na fase líquida a na temperatura b, e t R (N) e t R (N+n) são os tempos de retenção corrigidos dos hidrocarbonetos de números de átomos de carbono (N) e (N+n) que são respectivamente, menor e maior do que o tempo de retenção corrigido do composto desconhecido, t R (A). Os índices de Kovats obtidos foram comparados aos descritos na literatura [6]. 3 RESULTADOS E DISCUSSÃO Foram detectados 84 compostos voláteis na maçã Fuji, por cromatografia gasosa de alta resolução e a Figura 1 mostra os cromatogramas dos compostos voláteis referente as safras de 1994 e Trinta compostos voláteis foram identificados na maçã Fuji por espectrometria de massas, conjuntamente com os dados cromatográficos de retenção (índices de Kovats). A Tabela 1 mostra os principais fragmentos de massas dos compostos voláteis identificados, obtidos por cromatografia gasosa-espectrometria de massas.

6 A Tabela 2 apresenta os íons característicos provenientes do rearranjo de Mac Lafferty e do rearranjo de 2 átomos de hidrogênio, conhecido também como rearranjo de "Mac Lafferty + 1" que devem ser formados pelos ésteres identificados neste trabalho. Deve-se ressaltar que alguns íons formados a partir desses rearranjos não estão incluídos entre os 8 fragmentos de maior abundância, mas estão presentes no espectro obtido neste estudo e na literatura [6]. Os íons formados por esses rearranjos são íons chaves na interpretação do espectro de massas de ésteres. O primeiro deles leva à formação de um "odd eletron íon", que quando não possui nitrogênio na molécula, apresenta massa par. O segundo rearranjo, envolvendo 2 átomos de hidrogênio, leva à quebra de 3 ligações químicas, e portanto, não possuindo nitrogênio na molécula, exibe massa ímpar. Apesar de nem sempre formarem íons de alta abundância no espectro, estes rearranjos constituem uma característica bastante útil para a interpretação de ésteres. O primeiro desses rearranjos é, freqüentemente, o processo dominante. O rearranjo de Mac Lafferty pode formar mais de um íon, dependendo do número de átomos de carbono na molécula, possibilitando a formação do anel intermediário de 6 átomos e estericamente favorável, a partir de uma extremidade ou outra da molécula. Além disso, o mecanismo poderá favorecer a retenção da carga (clivagem β ) ou então a migração da carga (clivagem indutiva). Todos os ésteres ( ) com R 2 de átomos de carbono, sofrem o rearranjo de Mac Lafferty + 1 [8]. Na Tabela 2 foi incluído apenas o íon mais estável, e portanto o mais intenso no espectro. Aldeídos também podem exibir o rearranjo de Mac Lafferty, pois contêm um grupo carbonílico, portanto podem sofrer rearranjo do átomo de hidrogênio g. Porém, não apresentam o rearranjo de Mac Lafferty + 1 [8]. A Tabela 3 apresenta os índices de Kovats teóricos e os obtidos neste estudo. Apesar das condições experimentais serem diferentes e portanto, os valores dos Índices de Kovats diferirem para o mesmo composto, estes demonstram a mesma seqüência de eluição na fase líquida SE-54. Não se fez o cálculo

7 experimental dos índices de Kovats, nas condições de programação de temperatura utilizadas neste experimento, para os compostos (picos 4, 5, 6, 7, 8, 9 e 10) eluídos antes do hidrocarboneto C 8, pois o hidrocarboneto C 7 eluiu juntamente com o solvente hexano. Quando utilizou-se a programação de temperatura sugerida por JENNINGS & SHIBAMOTO [6], o hidrocarboneto C 9 também eluiu com o solvente hexano. As condições utilizadas por estes autores foram temperatura inicial de 80ºC e programação de 2 º C/min até 200ºC. Todos os compostos voláteis identificados já foram relatados anteriormente,

8 como componentes voláteis da maçã [7, 9]. Este fato pode ser utilizado como um terceiro critério de identificação dos voláteis, além de cromatografia gasosa espectrometria de massas e índices de Kovats, confirmando à identidade assinalada aos compostos neste trabalho. Os compostos voláteis identificados compreenderam aproximadamente 97% da área relativa. A porcentagem relativa média dos componentes voláteis da maçã Fuji, referente a 3 amostras analisadas em cada safra, assim como os desvios padrões estão apresentados na Tabela 4. Não foram incluídos nesta tabela compostos voláteis não identificados, que estavam presentes na amostra em quantidades traços e que atingiram no máximo 0,1% de área relativa. A variabilidade encontrada, demonstrada pelos desvios padrões, foi esperada e inerente à análise de frutas frescas.

9 Os compostos voláteis majoritários, nas duas safras, foram os ésteres acetato de 2-metil butila, acetato de butila e acetato de hexila e o terpeno -farneseno (Figura 1), que juntos, contribuíram com aproximadamente 71% da área relativa. O acetato de butila foi detectado como traços em um dos 3 lotes na safra de 1995, porém, apresentou alta porcentagem relativa nos outros 5 lotes, e portanto, foi considerado majoritário. Um outro componente não identificado (pico 70, Figura 1) também apresentou alta porcentagem relativa (17%), porém em apenas uma amostra da safra de 1994, enquanto nas outras cinco, ele não foi detectado ou o foi apenas em traços. A maçã Fuji caracterizou-se por uma elevada quantidade de ésteres, compreendendo aproximadamente 68% da área relativa. De acordo com DIMICK & HOSKIN [2], este grupo funcional é formado principalmente no estágio de amadurecimento da fruta, proveniente da casca da maçã. Estes autores sugeriram que o aroma de maçã requer a presença de ésteres, com peso molecular entre 100 e 130. O único trabalho encontrado na literatura que identificou os compostos

10 voláteis de maçã da cultivar Fuji foi o de Kakiuchi et al [7]. As principais classes de compostos encontradas na fruta por estes pesquisadores foram as dos álcoois e as dos ésteres. O composto mais abundante foi álcool hexílico, seguido pelo álcool trans-2-hexenílico, álcool 2-metil butílico, álcool butílico, trans-2-hexenal, acetato de 2-metil butila, acetato de hexila, 2-metil butanoato de hexila, hexanal, acetato de butila, álcool amílico, trans,trans- -farnesene, caproato de butila, álcool isobutílico e acetato de etila. Houve, portanto, uma predominância de álcoois na maçã Fuji procedente do Japão. Estes pesquisadores utilizaram um método de isolamento dos voláteis que empregava destilação à pressão reduzida a 35 º C por 6 horas, seguida da extração do destilado aquoso com éter etílico, desidratação do extrato etéreo com MgSO 4, evaporação em rotaevaporador e dissolução do resíduo em hexano. Potanto neste método, o calor foi empregado por tempo prolongado, além de ocorrer muita manipulação da amostra. 4 CONCLUSÕES Foram detectados 84 componentes voláteis na maçã cultivar Fuji, dos quais trinta foram identificados por cromatografia gasosa espectrometria de massas conjuntamente com os dados cromatográficos de retenção (índices de Kovats). Os compostos majoritários foram α -farneseno, acetato de 2-metil butila, acetato de butila e acetato de hexila. A classe química predominante de compostos voláteis da maçã Fuji foi a dos ésteres, compreendendo, butanoato de metila, acetato de isobutila, 2-metil butanoato de metila, butanoato de etila, propionato de propila, acetato de butila, 2-metil butanoato de etila, acetato de 2-metil butila, butanoato de propila, valerato de etila, propionato de butila, acetato de amila, hexanoato de metila, 2-metil butanoato de propila, butanoato de butila, hexanoato de etila, acetato de hexila, acetato de ciclo hexila, 2-metil butanoato de butila, hexanoato de propila, propionato de hexila, 2-metil butanoato de amila, hexanoato de butila, butanoato de hexila, 2-metil butanoato de hexila, hexanoato de isoamila, hexanoato de hexila e octanoato de isoamila. O terpeno -farneseno e o aldeído hexanal também foram identificados entre os compostos voláteis. As duas safras estudadas mostraram a variabilidade esperada, inerente às frutas frescas. 5 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS [1] ALVES, M. Maçã rende US$ 100 mi em Fraiburgo. Folha de São Paulo, São Paulo, 8 mar Caderno Agrofolha, p. 1.

11 [2] DIMICK, P.S. & HORKIN, J.C. Review of apple flavor - state of the art. CRC Crit. Rev. Food Sci. Nutr., S.l., v. 18, n. 4, p , [3] FRANCO, M.R.B.; RODRIGUEZ-AMAYA, D.B. Trapping of soursop (Annona muricata) juice volatiles on Porapak Q by suction. J. Sci. Food Agric., S.l., v. 34, n. 3, p , [4] GROB, K.Jr.; ROMANN, A. Sample transfer in splitless injections in capillary gas chromatographic. J. Chromatogr., S.l., n. 214, p. 118, [5] JANZANTTI, N.S. I. Composição de voláteis de maçãs (Malus domestica) cultivar Fuji. II. Efeito do processamento e do armazenamento na composição de voláteis de suco clarificado de maçã Fuji. Campinas, p. Tese (Mestre em Ciência de Alimentos) - Faculdade de Engenharia de Alimentos, Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP). [6] JENNINGS, W.; SHIBAMOTO, T Qualitative analysis of flavor and fragance volatiles by glass capillary gas chromatography. Academic Pres, New York. 472p. [7] KAKIUCHI, N. et al. Changes in the composition and amounts of volatiles compounds of apple juice associated with thermal processing. Nippon Shokuhin Kogyo Gakkaishi, S.l.., v. 34, n. 2, p , [8] MCLAFFERTY, F.W et al Interpretation of Mass Spectra. Mill Valley, California. 371p. [9] PAILLARD, N.M. The Flavour of Apples, Pears and Quinces. In: MORTON, I.D. & MacLEOD, A.J. The Favours of Fruits. New York. Elsevier Inc., p AGRADECIMENTOS À Fapesp pelo auxílio financeiro, processo n o 94/2548-0, ao CNPq e FAEP pelas bolsas concedidas para a realização deste trabalho. Ao Laboratório de Cromatografia Instituto de Química de São Carlos/USP pela obtenção dos espectros de massas. 1 Recebido para publicação em 18/05/99. Aceito para publicação em 04/07/00. 2 Departamento de Ciência de Alimentos Faculdade de Engenharia de Alimentos/UNICAMP. C.P. 6121, CEP , Campinas-SP. franco@fea.unicamp.br 3 Instituto de Química de São Carlos/USP. * A quem a correspondência deve ser enviada.