Inibição da germinação e crescimento radicular de alface (Lactuca sativa)

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1 Faculdade de Ciências da Universidade do Porto Inibição da germinação e crescimento radicular de alface (Lactuca sativa) Sara Freitas Departamento de Biologia, Faculdade de Ciências da Universidade do Porto Rua do Campo Alegre, S/N, Janeiro 2011 Resumo O presente trabalho tem como objectivo o estudo da toxicidade de NaCl, através da análise da taxa de germinação e da inibição do crescimento radicular de sementes de alface (Lactuca sativa) perante diferentes concentrações de cloreto de sódio (NaCl). Para este ensaio, foram utilizadas como medidas de toxicidade o NOEC (máxima concentração na qual não se registam diferenças significativas em relação ao controlo), o LOEC (concentração mínima na qual se registam diferenças significativas em relação ao controlo) e o CE 50 (concentração ou dose que produz efeito adverso (efeito tóxico) em 50% dos organismos teste) para cada uma das respostas seleccionadas. O estudo desenvolveu-se colocando grupos de sementes em placas de Petri com diferentes concentrações do tóxico (NaCl), onde foram mantidas por um período de 7 dias, ao abrigo da luz e a uma temperatura constante de 22 o C. Os resultados obtidos depois da realização de uma análise estatística utilizando o programa SPSS, mostram que o cloreto de sódio produz efeitos tóxicos em determinada concentração quer para o crescimento radicular quer para a germinação das sementes, sendo esse efeito verificado em concentrações mais baixas para a inibição do crescimento radicular do que para a germinação da alface. Palavras-chave: Lactuca sativa, NaCl, toxicidade, crescimento radicular, germinação. 1

2 Introdução A poluição ambiental exerce uma pressão negativa sobre os recursos biológicos como plantações agrícolas o que constitui um problema para o abastecimento da população humana. Um dos factores que pode influenciar a produção agrícola é a alta salinidade alta concentração de sais minerais dissolvidos na água e nos solos. Esta dificulta não só a cinética da absorção da água, mas também facilita a entrada de iões em quantidades tóxicas nas sementes em embebição (Santos et al., 1992) os principais solutos encontrados no solo são os catiões sódio (Na + ), cálcio (Ca2 + ), magnésio (Mg2 +) e potássio (K + ) e os aniões cloreto (Cl - ), sulfato (SO42 - ), bicarbonato (HCO3 - ), carbonato (CO32 - ) e nitrato (NO3). Quando a concentração destes nas águas utilizadas para irrigação é elevada e o sistema de drenagem é inadequado, a salinidade pode alcançar níveis prejudiciais para as plantas (Klar, 1988; Taiz & Zeiger, 2002) os sais contidos na água precipitam após evaporação desta, levando a acumulação dos mesmos. Uma das causas da poluição de águas subterrâneas, que são usadas para regar plantações agrícolas, deve-se exactamente ao NaCl proveniente da água do mar que preenche o espaço vazio subterrâneo deixado após o excessivo uso de águas subterrâneas. Outra das causas de poluição ambiental devido ao cloreto de sódio, afectando não só os recursos hídricos, como também o solo, é a colocação de cloreto de sódio nas estradas e passeios, quando neva. E embora a sua concentração não seja bastante elevada de forma a afectar a saúde humana, tem um efeito tóxico sobre a vida vegetal e animal (Sapon & Zellner). O cloreto de sódio (NaCl) possui, portanto, um efeito tóxico sobre as plantas, quando presente em concentrações elevadas, inibindo o seu crescimento e o seu desenvolvimento, pois causa um aumento da pressão osmótica que impede a entrada de água para a semente (Éneas Filho et al., 1995; Dodd & Donovan, 1999), bem como mudanças de mobilização de reservas armazenadas (Bouaziz & Hicks, 1990) e alterações na organização estrutural ou síntese de proteínas em embriões (Ramagopal, 1990). Neste trabalho, utilizou-se sementes de alface (Lactuca sativa) como modelo para avaliar a toxicidade do NaCl sobre as plantas, através de um ensaio que avalia a inibição do crescimento radicular e a propensão para a germinação. A escolha destas sementes e não de qualquer outro material biológico, deve-se ao facto de estas apresentarem particular sensibilidade a químicos tóxicos. 2

3 Para avaliar a toxicidade foi feito um estudo dose-resposta no qual se assume que as sementes de alface demonstrarão efeitos evidentes em diferentes concentrações, de modo a determinarem-se as seguintes medidas de toxicidade: concentração sem efeito observável (NOEC), isto é, concentração máxima na qual não se registam diferenças significativas em relação ao controlo; concentração com menor efeito observável (LOEC), ou seja, concentração mínima na qual não se registam diferenças significativas em relação ao controlo e concentração efectiva mediana (CE50), que corresponde a concentração que produz efeito adverso (efeito tóxico) em 50% dos organismos teste (Pestana & Gageiro, 2008). Material e Métodos Para testar a toxicidade do NaCl, o material biológico teste será sementes de Lactuca sativa. Começa-se por tratar as sementes, caso estas não sejam de origem comercial, lavando-as em lixívia a 20% durante 20 minutos. Assegura-se, assim, que não haverá microrganismos a actuar durante a experiência. Ao fim desse tempo, deve-se passar as mesmas sementes por água destilada cinco vezes, para retirar os resíduos de lixívia. As sementes serão colocadas a germinar em placas de Petri com papel de filtro embebido em soluções teste de NaCl. Para preparar as placas de Petri, recorta-se 21 círculos de papel de filtro com um diâmetro ligeiramente inferior ao da placa, de modo a que fique perfeitamente encaixado no interior da mesma. Serão, portanto usadas 21 placas de Petri, ou seja, 3 réplicas por cada uma das 7 concentrações a serem testadas. As soluções teste serão preparadas a partir de uma solução stock de NaCl na concentração de 24g/L, por sucessivas diluições de 1:1, a fim de se obter soluções finais nas respectivas concentrações de g/L, 6.000g/L, 3.000g/L, g/L, 1.750g/L, 0.375g/L e ainda uma solução controlo na concentração de 0.000g/L. Para se obter estas soluções, pipeta-se 5ml de água destilada para cada um dos 7 tubos de ensaio. Começase por preparar a solução teste na concentração de g/L pipetando 5ml da solução stock a g/L para um tubo de ensaio devidamente identificado e já com a água destilada. Após a homogeneização desta primeira preparação, procedemos de igual modo para obtermos as soluções seguintes, retirando os 5ml de NaCl dissolvido da solução teste com a concentração imediatamente acima daquela que se pretende 3

4 preparar. A solução teste que irá ser usada no controlo é composta unicamente por 10ml de água destilada. Dispondo agora de todo o material necessário, pipeta-se 2ml de cada solução teste para os vários conjuntos de 3placas (réplicas) devidamente identificadas com a respectiva concentração a testar e distribuem-se, homogeneamente, 5 sementes de Lactuca sativa pelo papel de filtro já embebido com a solução teste. O distanciamento homogéneo e mais alargado possível das sementes é importante para que elas não interfiram na germinação umas das outras. Por fim, fecha-se as placas de Petri com a tampa e veda-se com parafilme, evitando, assim, perdas de água por evaporação. Estas devem ser colocadas na obscuridade a uma temperatura de sensivelmente 22ºC durante 7dias. Terminado este período, abrem-se as placas para se efectuar a contagem das sementes germinadas e não germinadas e, ainda, medir o tamanho da raiz das que germinaram, como se pode visualizar na fig. 1. Com estes dados, calcula-se, respectivamente, a percentagem de germinação face ao controlo e a percentagem de inibição do crescimento radicular, também face ao controlo. O tratamento dos dados será realizado com o auxílio do SPSS, um programa informático/estatístico. Imagem 1 Semente germinada de Lactuca sativa, evidenciando o comprimento da raiz 4

5 Resultados e Discussão Para o tratamento dos dados no programa informático SPSS, estes foram organizados em duas tabelas, uma que apresenta os resultados relativos a 4 réplicas de cada concentração testada (cada réplica correspondente a uma turma diferente) e outra que apresenta todos os dados fidedignos recolhidos das diferentes turmas, o que equivale a mais do que 4 réplicas por concentração. Teoricamente, a primeira tabela seria mais adequada para a análise da taxa de germinação, mas, como se irá constatar na prática, em alguns testes realizados os resultados obtidos eram mais aceitáveis usando a segunda tabela. Para a análise da percentagem da inibição do crescimento radicular, a tabela a utilizar será a que contém o maior número de réplicas por concentração testada. TAXA DE GERMINAÇÃO Gráfico 1 Representação gráfica dos dados em pontos de dispersão (scatter dot). Gráfico 2 Representação gráfica dos dados em barras de erro (error bar). Perante a distribuição dos dados nos gráficos 1 e 2, verifica-se que quanto mais elevada for a concentração de NaCl maior será o número de sementes não germinadas, ou seja, menor a taxa de germinação. Pode-se, assim, inferir sobre a toxicidade do NaCl, afirmando que este, embora seja abundante no ambiente e em usos antropogénicos, também pode ser considerado tóxico a determinados níveis e concentrações. 5

6 Tabela 1 Resultados do teste de normalidade para a percentagem de sementes não germinadas. % sementes não germinadas Efectuado o teste da normalidade, pode-se verificar que a Significância é, em todas as concentrações, inferior a 5%. Desta forma, rejeita-se a hipótese nula, isto é, os resultados tabelados relativos às diferentes concentrações não apresentam uma distribuição normal. Uma das premissas da análise de variância paramétrica não foi, então, cumprida. NaCl (mg.l-1) dim ensi on1 a. Lilliefors Significance Correction Kolmogorov-Smirnov a Shapiro-Wilk Statisti c df Sig. Statisti c df Sig. 0,387 15,000,658 15,000,375,365 16,000,697 16,000,750,347 16,000,645 16,000 1,500,329 16,000,718 16,000 3,000,391 16,000,700 16,000 6,000,346 16,000,701 16,000 12,00 0,275 16,002,769 16,001 Tabela 2 Resultados do teste de homogeneidade de variâncias para a taxa de germinação. Levene Statistic df1 df2 Sig. T8, ,000 Pelo teste da homogeneidade de variâncias, observa-se que a significância é de 0%, logo rejeita-se a hipótese nula, ou seja, as variâncias não são homogéneas. Não se cumpre, assim, mais uma premissa da análise de variância paramétrica (ANOVA). Perante estes resultados, deveria recorrer-se a uma análise não paramétrica, que não se realizou por ser muito pouco prática. No entanto, como em ensaios com mais de 30 amostras se pode recorrer a uma análise de variância paramétrica, foi usado o teste ANOVA. Tabela 3 Resultados do teste ANOVA para a taxa de germinação. Sum of df Mean Square F Sig. Squares Between Groups 31499, ,835 4,625,000 Within Groups , ,032 Total ,

7 No teste ANOVA, a significância é inferior a 5%. Rejeita-se, portanto, a hipótese nula na qual se afirma serem iguais as médias dos resultados em cada concentração. Concluise, desta forma, que os resultados são estatisticamente significativos, o que significa que o cloreto de sódio inibiu a germinação das sementes de alface. Tabela 4 Determinação dos valores do NOEC (a amarelo) e do LOEC (a vermelho) para a taxa de germinação, através da análise Post-hoc. (I) NaCl (mg.l-1) (J) NaCl (mg.l-1) Mean Difference (I-J) Std. Error Sig. 95% Confidence Interval Lower Upper dimension2 0 dimension3,375-6,833 12,108,998-43,24 29,57,750-5,583 12,108,999-41,99 30,82 1,500-6,833 12,108,998-43,24 29,57 3,000-19,333 12,108,685-55,74 17,07 6,000-24,333 12,108,415-60,74 12,07 12,000-53,083 * 12,108,001-89,49-16,68,375 dimension3 0 6,833 12,108,998-29,57 43,24,750 1,250 11,911 1,000-34,57 37,07 1,500,000 11,911 1,000-35,82 35,82 3,000-12,500 11,911,941-48,32 23,32 6,000-17,500 11,911,762-53,32 18,32 12,000-46,250 * 11,911,003-82,07-10,43,750 dimension3 0 5,583 12,108,999-30,82 41,99,375-1,250 11,911 1,000-37,07 34,57 1,500-1,250 11,911 1,000-37,07 34,57 3,000-13,750 11,911,909-49,57 22,07 6,000-18,750 11,911,699-54,57 17,07 12,000-47,500 * 11,911,002-83,32-11,68 1,500 dimension3 0 6,833 12,108,998-29,57 43,24,375,000 11,911 1,000-35,82 35,82,750 1,250 11,911 1,000-34,57 37,07 3,000-12,500 11,911,941-48,32 23,32 6,000-17,500 11,911,762-53,32 18,32 12,000-46,250 * 11,911,003-82,07-10,43 3,000 dimension3 0 19,333 12,108,685-17,07 55,74,375 12,500 11,911,941-23,32 48,32,750 13,750 11,911,909-22,07 49,57 1,500 12,500 11,911,941-23,32 48,32 6,000-5,000 11,911 1,000-40,82 30,82 12,000-33,750 11,911,078-69,57 2,07 6,000 dimension3 0 24,333 12,108,415-12,07 60,74,375 17,500 11,911,762-18,32 53,32,750 18,750 11,911,699-17,07 54,57 1,500 17,500 11,911,762-18,32 53,32 3,000 5,000 11,911 1,000-30,82 40,82 12,000-28,750 11,911,203-64,57 7,07 12,000 dimension3 0 53,083 * 12,108,001 16,68 89,49,375 46,250 * 11,911,003 10,43 82,07,750 47,500 * 11,911,002 11,68 83,32 1,500 46,250 * 11,911,003 10,43 82,07 3,000 33,750 11,911,078-2,07 69,57 6,000 28,750 11,911,203-7,07 64,57 *. The mean difference is significant at the 0.05 level. Confrontando as diferentes concentrações com o controlo (C=0mg/L) (tabela 4), determina-se o NOEC (concentração máxima sem efeito observável) e o LOEC 7

8 (concentração mínima com efeito observável) que se encontram, respectivamente, nas concentrações de 6.000mg/L e de mg/L. Isto é, até à concentração de 6.000mg/L de NaCl não se observa qualquer efeito na taxa de germinação da espécie em estudo, e a uma concentração de mg/L de NaCl verifica-se o mínimo efeito observável que o tóxico poderá exercer. Tabela 5 Determinação dos grupos homogéneos para a taxa de germinação. NaCl (mg.l-1) N Subset for alpha = dimension ,67, ,25, ,50 1, ,50 3, ,00 30,00 6, ,00 35,00 12, ,75 Sig.,400,081 Means for groups in homogeneous subsets are displayed. a. Uses Harmonic Mean Sample Size = 15,849. b. The group sizes are unequal. The harmonic mean of the group sizes is used. Type I error levels are not guaranteed. Através da análise da tabela 5, nota-se que os grupos homogéneos, ou seja, grupos em que as médias dos efeitos das diferentes concentrações não diferem significativamente, são os seguintes: das concentrações 0.0mg/L a 6.000mg/L (1) e das concentrações 3.000mg/L a mg/L (2); existem, então, duas concentrações que estão presentes em ambos os grupos. Tabela 6 Informações dos dados resultantes da análise de regressão linear sobre os resultados transformados (transformação log-probit). N of Cases Valid 96 Rejected Missing 1 LOG Transform Cannot be Done 0 Number of Responses > Number of Subjects 0 Control Group 15 8

9 Tabela 7 Informações de convergência resultantes da análise de regressão linear sobre os resultados transformados (transformação log-probit). Number of Iterations Optimal Solution Found PROBIT 12 Yes Tabela 8 Estimativas dos parâmetros, obtidas com a análise de regressão linear sobre os resultados transformados (transformação log-probit). Parameter Estimate Std. Z Sig. 95% Confidence Interval Error Lower Upper PROBIT a NaCl (mg.l-,856,028 30,695,000,801,910 1) Intercept -,852,018-47,180,000 -,870 -,833 a. PROBIT model: PROBIT(p) = Intercept + BX (Covariates X are transformed using the base 10,000 logarithm.) A tabela 8 apresenta os resultados da análise de regressão linear sobre os resultados transformados (transformação log-probit), indicando o valor estimado (Estimate), o desvio padrão (Std. Error), o nível de significância (Sig.) e intervalo de confiança (95% Confidence Interval) dos respectivos coeficientes de regressão b0 (Intercept, Parameter) e b1 (Concentração, Parameter) da equação da recta Y=b0+b1X. Como a significância é menor que 5%, o coeficiente de regressão b1 é estatisticamente significativo, rejeitandose a hipótese nula de que não existe uma correlação linear entre as duas variáveis transformadas, concentração (logaritmo da concentração) e percentagem de germinação (Probit), mostrando que há de facto um efeito causado pela concentração de NaCl na germinação das sementes. Tabela 9 Teste do qui-quadrado aplicado na percentagem de sementes não germinadas. Chi-Square df a Sig. PROBIT Pearson Goodness-of-Fit Test 6077,680 94,000 b a. Statistics based on individual cases differ from statistics based on aggregated cases. b. Since the significance level is less than,150, a heterogeneity factor is used in the calculation of confidence limits. Pela análise da tabela 9, verificamos que o 2 tem uma significância menor que 5%. Isto permite concluir que o teste 2 é significativo e que a regressão log-probit não se adequa aos resultados obtidos. É, portanto, necessário recorrer a um factor de correcção para o cálculo de intervalos de confiança. 9

10 Tabela 10 Determinação do CE50 (roxo) para a taxa de germinação. Probability 95% Confidence Limits for NaCl (mg.l-1) 95% Confidence Limits for log(nacl (mg.l-1)) b Estimate Lower Upper Estimate Lower Upper PROBIT a dimension1,010,019,000,109-1,724-4,067 -,963,020,039,000,178-1,405-3,408 -,749,030,063,001,245-1,203-2,991 -,611,040,089,002,311-1,051-2,678 -,507,050,118,004,378 -,927-2,424 -,422,060,151,006,448 -,822-2,209 -,349,070,186,010,520 -,730-2,020 -,284,080,225,014,594 -,647-1,852 -,226,090,268,020,673 -,572-1,699 -,172,100,314,028,755 -,503-1,560 -,122,150,608,103 1,237 -,216 -,989,093,200 1,027,280 1,909,012 -,553,281,250 1,610,622 2,948,207 -,206,470,300 2,412 1,165 4,766,382,066,678,350 3,507 1,883 8,227,545,275,915,400 5,002 2,741 14,965,699,438 1,175,450 7,054 3,750 28,069,848,574 1,448,500 9,892 4,957 53,668,995,695 1,730,550 13,873 6, ,414 1,142,809 2,019,600 19,561 8, ,624 1,291,919 2,317,650 27,903 10, ,712 1,446 1,031 2,629,700 40,570 13, ,344 1,608 1,145 2,960,750 60,761 18, ,919 1,784 1,267 3,319,800 95,273 25, ,833 1,979 1,401 3,721, ,940 35, ,891 2,207 1,556 4,190, ,284 56, ,478 2,493 1,749 4,782, ,051 62, ,813 2,562 1,796 4,926, ,037 70, ,350 2,638 1,846 5,081, ,029 79, ,723 2,720 1,902 5,253, ,378 91, ,106 2,812 1,963 5,444, , , ,008 2,918 2,034 5,662, , , ,639 3,041 2,116 5,919, , , ,954 3,194 2,218 6,234, , , ,836 3,396 2,352 6,654, , ,355 2,070E7 3,714 2,564 7,316 a. A heterogeneity factor is used. b. Logarithm base = 10. Através da tabela 10, na linha de probabilidade 0,500, conhece-se o CE 50 (concentração que produz efeito adverso em 50% dos organismos teste) e o seu intervalo de confiança, que são, respectivamente, as concentrações de 9.892mg/L, 4.957mg/L e mg/L. Ou seja, a uma concentração de 9.892mg/L metade dos organismos em estudo manifestam algum efeito tóxico proporcionado pelo NaCl, variando o valor de acordo com o intervalo de confiança. 10

11 Gráfico 3 Representação gráfica dos dados obtidos com a transformação LOG.Probit. TAXA DE INIBIÇÃO RADICULAR Gráfico 4 Representação gráfica dos dados em pontos de dispersão (scatter dot). Gráfico 5 Representação gráfica dos dados em barras de erro (error bar). Perante a distribuição dos dados nos gráficos 4 e 5, verificamos que, quanto mais elevada for a concentração de NaCl, menor é o crescimento da radícula, ou seja, maior a taxa de inibição radicular. Podemos, assim, inferir sobre a toxicidade do NaCl, 11

12 afirmando que este, embora seja abundante no ambiente e em usos antropogénicos, também pode ser considerado tóxico a determinados níveis e concentrações. Tabela 11 Resultados do teste de Normalidade para a taxa de inibição. % inibição NaCl (mg.l-1) Kolmogorov-Smirnov a Shapiro-Wilk Statistic df Sig. Statistic df Sig. dimension1 0,143 12,200 *,970 12,911,375,242 12,051,911 12,217,750,173 12,200 *,954 12,690 1,500,145 12,200 *,963 12,824 3,000,173 11,200 *,952 11,665 6,000,144 11,200 *,926 11,373 12,000,134 9,200 *,961 9,806 a. Lilliefors Significance Correction *. This is a lower bound of the true significance. Efectuado o teste da normalidade, pode-se verificar que a Significância é, em todas as concentrações, superior a 5%. Desta forma, não se rejeita a hipótese nula, isto é, os resultados tabelados relativos às diferentes concentrações apresentam uma distribuição normal. Uma das premissas da análise de variância paramétrica foi, então, cumprida. Tabela 12 Resultados do teste de homogeneidade de variâncias para a taxa de inibição. Levene Statistic df1 df2 Sig. 1, ,079 Pelo teste da homogeneidade de variâncias, observa-se que a significância é superior a 5%, logo não se rejeita a hipótese nula, ou seja, as variâncias são homogéneas. Cumprese, assim, mais uma premissa da análise de variância paramétrica (ANOVA). Tabela 13 Resultados do teste ANOVA para a taxa de inibição. Sum of df Mean Square F Sig. Squares Between Groups 84629, ,913 17,347,000 Within Groups 58544, ,114 Total , No teste ANOVA, a significância é de 0%. Rejeita-se, portanto, a hipótese nulaem que se afirma serem iguais as médias dos resultados em cada concentração. Conclui-se, 12

13 desta forma, que os resultados são estatisticamente significativos, o que significa que o cloreto de sódio inibiu o crescimento das radículas de alface. Tabela 14 Determinação dos valores do NOEC (a amarelo) e do LOEC (a vermelho) para a taxa de inibição, através do teste Post-hoc. (I) NaCl (mg.l-1) (J) NaCl (mg.l-1) Mean Difference (I-J) Std. Error Sig. 95% Confidence Interval Lower Upper dimension2 0 dimension3,375-2,546 11,641 1,000-37,86 32,76,750,570 11,641 1,000-34,74 35,88 1,500-8,380 11,641,991-43,69 26,93 3,000-30,675 11,903,149-66,78 5,43 6,000-60,582 * 11,903,000-96,69-24,48 12,000-96,213 * 12,574, ,35-58,07,375 dimension3 0 2,546 11,641 1,000-32,76 37,86,750 3,117 11,641 1,000-32,19 38,43 1,500-5,833 11,641,999-41,14 29,48 3,000-28,129 11,903,229-64,23 7,98 6,000-58,035 * 11,903,000-94,14-21,93 12,000-93,667 * 12,574, ,81-55,53,750 dimension3 0 -,570 11,641 1,000-35,88 34,74,375-3,117 11,641 1,000-38,43 32,19 1,500-8,950 11,641,987-44,26 26,36 3,000-31,245 11,903,134-67,35 4,86 6,000-61,152 * 11,903,000-97,26-25,05 12,000-96,784 * 12,574, ,92-58,64 1,500 dimension3 0 8,380 11,641,991-26,93 43,69,375 5,833 11,641,999-29,48 41,14,750 8,950 11,641,987-26,36 44,26 3,000-22,295 11,903,504-58,40 13,81 6,000-52,202 * 11,903,001-88,31-16,10 12,000-87,834 * 12,574, ,97-49,69 3,000 dimension3 0 30,675 11,903,149-5,43 66,78,375 28,129 11,903,229-7,98 64,23,750 31,245 11,903,134-4,86 67,35 1,500 22,295 11,903,504-13,81 58,40 6,000-29,907 12,159,190-66,79 6,97 12,000-65,538 * 12,817, ,41-26,66 6,000 dimension3 0 60,582 * 11,903,000 24,48 96,69,375 58,035 * 11,903,000 21,93 94,14,750 61,152 * 11,903,000 25,05 97,26 1,500 52,202 * 11,903,001 16,10 88,31 3,000 29,907 12,159,190-6,97 66,79 12,000-35,632 12,817,094-74,51 3,24 12,000 dimension3 0 96,213 * 12,574,000 58,07 134,35,375 93,667 * 12,574,000 55,53 131,81,750 96,784 * 12,574,000 58,64 134,92 1,500 87,834 * 12,574,000 49,69 125,97 3,000 65,538 * 12,817,000 26,66 104,41 6,000 35,632 12,817,094-3,24 74,51 *. The mean difference is significant at the 0.05 level. Comparando as diferentes concentrações com o controlo (C=0mg/L), determina-se o NOEC (concentração máxima sem efeito observável) e o LOEC (concentração mínima com efeito observável) que se encontram, respectivamente, nas concentrações de 3.000mg/L e de 6.000mg/L. Ou seja, até à concentração de 3.000mg/L de NaCl não se 13

14 observa qualquer efeito na percentagem de inibição do crescimento radicular da espécie em estudo, e a uma concentração de 6.000mg/L de NaCl verifica-se o mínimo efeito observável que o tóxico poderá exercer. Tabela 15 Determinação dos grupos homogéneos para a taxa de inibição. NaCl (mg.l-1) N Subset for alpha = dimension1, , ,24, ,69 1, ,86 3, ,44 14,44 6, ,34 44,34 12, ,98 Sig.,144,182,061 Means for groups in homogeneous subsets are displayed. a. Uses Harmonic Mean Sample Size = 11,177. b. The group sizes are unequal. The harmonic mean of the group sizes is used. Type I error levels are not guaranteed. Através da análise da tabela, observa-se que os grupos homogéneos, ou seja, grupos em que as médias dos efeitos das diferentes concentrações não diferem significativamente, englobam, respectivamente, as concentrações: 0.0, 0.375, 0.750, e (1); e (2); e (3). Existe, portanto, uma concentração partilhada pelos grupos 1 e 2 e outra partilhada pelo grupo 2 e 3. Tabela 16 Informações dos dados resultantes da análise de regressão linear sobre os resultados transformados (transformação log-probit). N of Cases Valid 38 Rejected Missing 42 LOG Transform Cannot be Done 0 Number of Responses > Number of Subjects 0 Control Group 4 Tabela 17 Informações de convergência resultantes da análise de regressão linear sobre os resultados transformados (transformação log-probit). Number of Iterations Optimal Solution Found PROBIT 9 Yes 14

15 Tabela 18 Estimativas dos parâmetros, obtidas com a análise de regressão linear sobre os resultados transformados (transformação log-probit). Parameter Estimate Std. Error Z Sig. 95% Confidence Interval Lower Upper PROBIT a NaCl 1,277,054 23,492,000 1,171 1,384 (mg.l-1) Intercept -,948,040-23,838,000 -,988 -,908 a. PROBIT model: PROBIT(p) = Intercept + BX (Covariates X are transformed using the base 10,000 logarithm.) A tabela 18 apresenta os resultados da análise de regressão linear sobre os resultados transformados (transformação log-probit), indicando o valor estimado (Estimate), o desvio padrão (Std. Error), o nível de significância (Sig.) e intervalo de confiança (95% Confidence Interval) dos respectivos coeficientes de regressão b0 (Intercept, Parameter) e b1 (Concentração, Parameter) da equação da recta Y=b0+b1X. Como a significância é menor que 5%, o coeficiente de regressão b1 é estatisticamente significativo, rejeita-se a hipótese nula de que não existe uma correlação linear entre as duas variáveis transformadas, concentração (logaritmo da concentração) e percentagem de inibição (Probit), mostrando que há de facto um efeito causado pela concentração de NaCl na taxa da inibição radicular. Tabela 19 Teste do qui-quadrado aplicado na percentagem de inibição do crescimento radicular. Chi-Square df a Sig. PROBIT Pearson Goodness-of-Fit Test 771,759 36,000 b a. Statistics based on individual cases differ from statistics based on aggregated cases. b. Since the significance level is less than,150, a heterogeneity factor is used in the calculation of confidence limits. Pela análise da tabela, verifica-se que o 2 tem uma significância menor que 5%. Isto, permite concluir que o teste 2 é significativo e que a regressão log-probit não se adequa aos resultados obtidos. É, portanto, necessário recorrer a um factor de correcção para o cálculo de intervalos de confiança. 15

16 Tabela 20 Determinação do CE50 (a roxo) para a taxa de inibição. Probability 95% Confidence Limits for NaCl (mg.l-1) 95% Confidence Limits for log(nacl (mg.l-1)) b Estimate Lower Upper Estimate Lower Upper PROBIT a dimension1,010,083,006,265-1,079-2,225 -,577,020,136,013,379 -,865-1,872 -,422,030,186,022,475 -,730-1,649 -,323,040,235,033,564 -,628-1,481 -,248,050,285,045,649 -,545-1,344 -,188,060,335,059,732 -,475-1,229 -,136,070,386,075,813 -,413-1,127 -,090,080,439,092,894 -,358-1,036 -,049,090,493,111,975 -,307 -,954 -,011,100,548,132 1,056 -,261 -,879,024,150,853,271 1,477 -,069 -,568,169,200 1,212,474 1,944,083 -,324,289,250 1,638,760 2,485,214 -,119,395,300 2,147 1,145 3,141,332,059,497,350 2,759 1,644 3,974,441,216,599,400 3,499 2,262 5,088,544,354,707,450 4,405 2,993 6,650,644,476,823,500 5,525 3,832 8,906,742,583,950,550 6,930 4,788 12,221,841,680 1,087,600 8,723 5,895 17,168,941,770 1,235,650 11,066 7,213 24,718 1,044,858 1,393,700 14,219 8,838 36,640 1,153,946 1,564,750 18,636 10,927 56,428 1,270 1,038 1,751,800 25,188 13,761 91,783 1,401 1,139 1,963,850 35,784 17, ,593 1,554 1,253 2,211,900 55,665 24, ,415 1,746 1,396 2,526,910 61,934 26, ,737 1,792 1,430 2,602,920 69,547 29, ,758 1,842 1,467 2,685,930 79,003 32, ,785 1,898 1,507 2,776,940 91,090 35, ,672 1,959 1,553 2,878, ,149 40, ,574 2,030 1,604 2,994, ,670 46, ,005 2,113 1,664 3,131, ,943 54, ,397 2,215 1,738 3,299, ,918 68, ,770 2,350 1,837 3,523, ,009 97, ,253 2,563 1,991 3,877 a. A heterogeneity factor is used. b. Logarithm base = 10. Através da tabela 20, na linha de probabilidade 0,500, conhecemos o CE50 e o seu intervalo de confiança, que são, respectivamente, as concentrações 5.525mg/L, 3.832mg/L e 8.906mg/L. Isto mostra que a uma concentração de 5.525mg/L, metade dos organismos em estudo evidencia efeito tóxico proporcionado pelo NaCl, variando o valor de acordo com o intervalo de confiança. 16

17 Gráfico 6 Representação gráfica dos dados obtidos após a transformação LOG- Probit, para a taxa de inibição. Após a observação de todos resultados e respectivas discussões, é possível afirmar em relação à percentagem de inibição do crescimento radicular da Lactuca sativa, que os dados estão de acordo com o esperado, ou seja, os valores que se obtiveram nos testes do SPSS, são os resultados normalmente previstos. Por outro lado, na análise estatística referente à taxa de germinação, devido á alteração da tabela de dados a utilizar, nem todos os resultados obtidos pelos testes do SPSS, são os normalmente previstos, havendo alguns pouco significativos. No entanto efectuou-se essa alteração, pois os resultados alusivos ao valor do NOEC, LOEC, e, principalmente, CE 50, obtinham valores mais correctos com a tabela de dados que tinha mais réplicas por concentração. Pode-se, então, concluir que o reconhecimento destes valores (NOEC, LOEC e CE 50 ) é de grande importância ecológica, ambiental e biológica, pois são estes os valores que iram permitir o controlo da poluição e quais as suas principais consequências para o meio ambiente e para as espécies que lá se encontram (nomeadamente a Lactuca sativa, utilizada neste estudo). 17

18 Bibliografia BOUAZIZ, A. & HICKS, D. R. (1990). Consumption of wheat seed reserves during germination and early growth as affected by soil water potential. Plant and Soil Journal. 128: DODD, G.L. & DONOVAN, L. A. (1999). Water Potential and ionic effects on germination and seedling growth of two cold desert shrubs. American Journal of Botany. 86: ENÉAS FILHO, J., BRILHANTE de OLIVEIRA NETO, O., TARQUININIO PRISCO, J., GOMES FILHO, E. & MONTEIRO NOGUEIRA, C. (1995). Effects of salinity in vivo and in vitro on cotyledonary galactosidases from Vigna unguiculata (L.) walp during seed germination and seedling stablishment. Revista Brasileira de Fisiologia Vegetal. 7: KLAR, A. E. (1988). A água no sistema solo planta atmosfera. 2ª edição, Nobel. São Paulo. PESTANA, M. H. & GAGEIRO, J. N. (2008). Análise de dados para ciências sociais a complementaridade do SPSS. 5ª edição, Edições Silabo. Lisboa. RAMAGOPAL, S. (1990). Inhibition of seed germination by salt and its subsequent effect on embryonic protein synthetis in barley. Journal of Plant Physiology. 136: SAPON, G. & ZELLNER, N.; Soil Pollution: Sodium Chloride Concentration in the soil on the Edgewood College Campus. p SANTOS, V. L. M., CALIL, A. C., RUIZ, H. A., ALVARENGA, E. M. & SANTOS, C. M. (1992). Efeito do estresse salino e hídrico na germinação e vigor de sementes de soja. Revista Brasileira de Sementes, Brasília. 14: TAIZ, L. & ZEIGER, E. (2002). Plant Physiology. 3rd edition, Editions Sinauer Associates. Sunderland, Massachusetts. 18