Pró-Reitoria de Graduação Curso de Biomedicina Trabalho de Conclusão de Curso

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1 Pró-Reitoria de Graduação Curso de Biomedicina Trabalho de Conclusão de Curso Importância da introdução do NAT (Nucleic Acid Test) HIV/HCV nos serviços de hemoterapia do Brasil Autor: Diego Ramos Azevedo Orientadora: Profa. Esp. Simone Cruz Longatti Co-orientador: Prof. Msc. Fernando Vianna Cabral Pucci DIEGO RAMOS AZEVEDO Brasília DF 2014

2 DIEGO RAMOS AZEVEDO IMPORTÂNCIA DA INTRODUÇÃO DO NAT HIV/HCV NOS SERVIÇOS DE HEMOTERAPIA DO BRASIL Artigo apresentado ao curso de graduação em Biomedicina da Universidade Católica de Brasília como requisito parcial para obtenção do título de Bacharel em Biomedicina. Orientadora: Profa. Esp. Simone Cruz Longatti Co-orientador: Prof. Msc. Fernando Vianna CabralPucci Brasília 2014

3 Artigo de TCC II, de autoria de Diego Ramos Azevedo, intitulado Importância da introdução do NAT HIV/HCV nos serviços de hemoterapia do Brasil, apresentado como requisito parcial para a obtenção do grau de Bacharel em Biomedicina da Universidade Católica de Brasília, em 20/05/2014, defendida e aprovada pela banca examinadora abaixo assinada: Profa. Esp. Simone Cruz Longatti Orientadora Curso de Biomedicina UCB Prof. Msc. Fernando Vianna Cabral Pucci Co-orientador Curso de Biomedicina UCB Profa. Dra. Cintia do Couto Mascarenhas Curso de Biomedicina UCB Dra. Liz Maria Teles Fundação Hemocentro de Brasília FHB Brasília 2014

4 Dedico esse trabalho a todos os amigos e familiares que caminharam comigo nessa longa, cansativa e prazerosa jornada universitária. E também aos professores, mestres e doutores que dispuseram seu tempo e conhecimento.

5 AGRADECIMENTO Primeiramente agradeço a Deus por me proporcionar entrar e viver uma universidade, pela saúde e pela minha vida, e também por colocar ao meu redor pessoas especiais e imprescindíveis para o meu crescimento pessoal e profissional. Agradeço aos meus pais Washington Silva Azevedo e Rosane Rosas Ramos Azevedo por me apoiarem incondicionalmente e pela invalorável importância que têm em minha vida. Aos meus irmãos, amigos e namorada que souberam me aturar nos momentos difíceis, dizendo frases de apoio ou de conforto ou pela simples companhia que foi o mais importante. Aos colegas de universidade por compartilharem ideias, expectativas, conhecimentos e erros, ou seja, tudo aquilo que provoca crescimento pleno. Aos professores da Universidade Católica de Brasília que nunca hesitaram em me ajudar quando era necessária minha ausência devido a competições esportivas, e em especial aos professores Simone Cruz Longatti e Fernando Vianna Cabral Pucci, que não mediram esforços para que minha formação fosse completada com êxito, por isso serei eternamente grato pelos conselhos e confiança depositada em mim. Por fim, agradeço também as pessoas que apareceram ao longo desse último semestre e ajudaram de alguma forma, como a doutora Liz Maria Teles e o mestre Agenor de Castro da Fundação Hemocentro de Brasília (FHB) e também a todos os funcionários do banco de sangue do Hospital de Base do Distrito Federal (HBDF) que com todo carinho e paciência permitiram que meu conhecimento fosse abrangido através do deles, me fornecendo materiais e experiências chaves para a conclusão deste trabalho.

6 (...) Biomédicos, Sem palco Sem luzes ofuscantes Sem cenários deslumbrantes Às vezes sem nenhum aplauso Heróis anônimos Que brilham nos bastidores Criando scripts e roteiros de amor a vida. Fábio de França Martins

7 6 IMPORTÂNCIA DA INTRODUÇÃO DO NAT HIV/HCV NOS SERVIÇOS DE HEMOTERAPIA DO BRASIL DIEGO RAMOS AZEVEDO Resumo: Diante dos grandes avanços na hemoterapia, o suporte transfusional, com uso racional do sangue, tem se tornado cada vez mais importante na medicina, sendo ainda um grande desafio. Nesse contexto o período em que os anticorpos são indetectáveis, chamado de janela imunológica, é um dos grandes problemas enfrentados na triagem laboratorial do sangue doado. Entretanto, as técnicas moleculares têm contribuindo de maneira eficaz na diminuição desse problema. O Nucleic Acid Test (NAT) se baseia na amplificação de regiõesalvo do RNA viral e na detecção do número de cópias a partir da PCR em tempo real, reduzindo a janela de detecção do HIV de 22 para 11 dias, e do Vírus da Hepatite C (HCV) de 70 para dias. O desenvolvimento e implantação desse método para triagem de outros patógenos, como o vírus da Dengue e o da hepatite B, vêm sendo discutido no Brasil. Apesar do uso dessa tecnologia acarretar em um aumento de custo, em médio e longo prazo traz importantes benefícios para o receptor devido a qualidade dos hemocomponentes produzidos. Palavras-chave: NAT HIV. NAT HCV. Soroconversão. Segurança do Sangue. Medicina transfusional. 1. INTRODUÇÃO Por definição todo processo transfusional sempre traz riscos, como reações imediatas ou tardias (1). A transfusão se caracteriza como uma potencial via de contágio, e dentre os vírus de importância na transmissão por transfusão destacam-se o vírus da imunodeficiência humana adquirida (HIV) e o vírus da hepatite C (HCV) devido às complicações como a severa imunossupressão e infecções oportunistas, além do surgimento de cirrose hepática e carcinoma hepatocelular, respectivamente (1,2). O vírus da hepatite C (HCV) pertence à família Flaviviridae, e tem tropismo por células hepáticas, mas também podem infectar células mononucleadas do sangue, o que ocasiona distúrbios imunológicos. Já o HIV pertence à família Retroviridae, possui em seu maquinário a transcriptase reversa (capaz de transformar o RNA em fita de DNA para posterior incorporação ao material genético do hospedeiro) e apresenta tropismo por células T CD4+ causando, após a evolução da doença, a síndrome da imunodeficiência humana adquirida (AIDS ou SIDA) quando a contagem de T CD4+ caem em um nível inferior a 200/µl. O HIV se divide em 3 subtipos: HIV-1, HIV-2 e HIV-O, eles se diferem entre si por mutações genéticas que levam a proteínas estruturais diferentes (6). O HIV-1 tem uma evolução mais rápida e com a carga viral maior do que quando comparados aos outros dois tipos anteriormente citados, além de ser mais prevalente no Brasil (4,7). A SIDA tornou-se rapidamente uma doença de grande impacto no cenário mundial e no Brasil, sendo notificada na década de 80 e alcançando cerca de pessoas em 2009 (8). Em um dos maiores e mais antigos centros de hemoterapia do Brasil, o Hemocentro de São Paulo, foi verificada uma prevalência de HIV-1 de 0,17% no período de 1995 a 2001 e

8 7 uma incidência de soroconversão em doadores de repetição de 25,9 a cada pessoas/ano, e de 26,9 a cada pessoas/ano em primeira doação. Já para o HCV verificou-se uma incidência de 51 a cada pessoas/ano no hemocentro de Santa Catarina (8). Em um estudo realizado no banco de sangue do Pará (HEMOPA) foi verificado que no período de 2008 a 2010, entre doações de sangue, foram constatados 42 casos de HIV. Essas taxas são consideradas altas quando comparadas ás encontradas nos Estados Unidos: de 2,92/ pessoas; Canadá 1/ ; Austrália 1,1/ ; e outras regiões da Europa ocidental, 1,8/ (9,10). A Agency for Helthcare Research and Quality (AHRQ), responsável por investigar a qualidade dos procedimentos médicos americanos, mostrou que procedimentos de transfusão de sangue foram realizados em 10% dos pacientes internados em 2007, demonstrando um aumento de 140% desde 1995 (3,4). Devido isso a preocupação e discussão acerca da segurança transfusional vêm ganhando força tanto no uso racional de hemocomponentes quanto na evolução de técnicas de triagem cada vez mais sensíveis e específicas, como é o caso do Nucleic Acid Test (NAT) (4,5). Visando melhorar a segurança transfusional no Brasil, a Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA) publicou o regulamento sanitário para serviços que desenvolvem atividades relacionadas ao ciclo produtivo do sangue humano, seus componentes e procedimentos transfusionais por meio da RDC nº 57 de 16 de Dezembro de Assim como a portaria nº de 12 de Novembro de 2013 do Ministério da Saúde, que define o regulamento técnico de procedimentos hemoterápicos e atinge todos os estabelecimentos públicos e privados do Sistema Nacional do Sangue (SINASAN). Segundo a legislação vigente, há obrigatoriedade da triagem clínica e da triagem laboratorial do doador (11,12). Entretanto, algumas evidências mostram que nesse processo existem lacunas decorrentes da omissão de informações em relação a comportamentos de risco, como o comportamento sexual questionável e uso de drogas injetáveis (3), ou doadores que buscam diagnóstico rápido, gratuito e confiável, desconhecendo os riscos que podem levar aos receptores dos produtos oriundos do sangue (13). Um estudo mostra que em São Paulo cerca de 1 em cada 11 doadores procuram os serviços hemoterápicos com tal finalidade (14). Na tentativa de minimizar os riscos aos receptores, a triagem laboratorial visa detectar bolsas contaminadas que são incapazes de serem descobertas na triagem clínica. Atualmente são utilizados: ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay) de 4ª geração e quimioluminescência (15) capazes de detectar anticorpos IgG e IgM anti-hcv após cerca de 70 dias de contato com o agente infeccioso, assim como para anticorpo anti-hiv que começam a aparecer a partir do 22º dia de exposição ao vírus, juntamente com a detecção do antígeno nuclear p24 que diminui a detecção para cerca de dias (detecção combinada) (16, 17). Para os serviços de hemoterapia a desvantagem da utilização de testes sorológicos convencionais, como o ELISA e em especial para o rastreamento de HIV e HCV, é a chamada janela imunológica. Este é o período em que há presença do vírus, mas a quantidade de anticorpos produzidos até então é indetectável por esse método, tornando impossível a identificação da presença viral nesse período (15, 16, 17). Aí reside a importância da introdução do NAT nos serviços de hemoterapia por ser uma técnica de triagem capaz de reduzir esse período de janela, diminuindo assim o risco de transmissão por transfusão desses agentes (18). 2. DESENVOLVIMENTO 2.1. BENEFICIOS DA INTRODUÇÃO DO NAT HIV/HCV

9 8 Com o advento de métodos de biologia molecular como o NAT, o risco estimado da transmissão de HIV por transfusão nos serviços de hemoterapia americanos, que era de 1 para pessoas, caiu de 1 para pessoas, sendo a janela imunológica de apenas 10 a 12 dias. Na transmissão do HCV por transfusão o risco residual também foi diminuído, tendo uma queda de 1 em para 1 em pessoas, com uma janela de 10 a 12 dias, como mostrado na figura 1 (19, 20). Figura 1: Período de detecção viral, em dias, quando em métodos sorológicos e pelo NAT. Estudos sobre a efetividade, que representa o número de pacientes detectados com a presença do RNA viral através do NAT e com sorologia negativa, ainda não foram realizados no Brasil em grande escala, mas podem ser observados em outros países (21), como mostrado na tabela 1. Tabela 1: Efetividade a cada 1 milhão de doações. País Efetividade/milhão HIV HCV Itália 1,8 2,37 Espanha - 2,37 França 0,33 0,65 Canadá 0,31 0,45 Na Alemanha, no período de 1999 a 2007, foram identificados para HCV 92 casos de efetividade em 40,8 milhões de doações (1/ pessoas), e 11 de HIV em 17,1 milhões de doações (1/ pessoas), mas foi identificado também dois casos de transmissão por transfusão: 1 para HIV e 1 para HCV, devido ao período mesmo que reduzido (10 a 12 dias), da janela de detecção do método (baixa viremia) (22). Um estudo sueco mostra que, se amostras do ano de 2008 fossem testadas apenas por métodos sorológicos, o país teria um custo de cerca de 6,25 milhões de dólares, porém se

10 9 introduzido o NAT (individual) esse custo aumentaria para 8,5 milhões. Mesmo com o custo aumentado, o risco de doença infecciosa viral por ano, apenas com as dosagens sorológicas, é de 83%, enquanto que, com o NAT, o risco diminuiria para a cada quatro ou cinco anos (23). Esses dados mostram como a introdução da tecnologia em todo o mundo, mesmo demandando reorganizações laboratoriais e treinamento técnico altamente avançado, se tornou de alta relevância para a segurança transfusional dos receptores e reitera cada vez mais a importância dos estudos de efetividade e de rendimento dessa técnica no Brasil (20, 21, 22, 23) PRINCÍPIO DO MÉTODO A técnica do NAT para vírus de RNA baseia-se na detecção do material genético do vírus após transcrição reversa e amplificação por PCR em tempo real, ou qpcr. A reação da polimerase em cadeia (PCR) consiste basicamente em amplificar uma sequência alvo, sendo a primeira fase a transcrição reversa do RNA para o DNA, por meio da atividade da transcriptase reversa (Figura 2). Posteriormente ocorre à elevação da temperatura fazendo com que as fitas se desnaturem do mesmo modo que os fragmentos iniciadores de ligação específica (primers), e então a temperatura é reduzida novamente para que os primers anelem em regiões de homologia no fragmento alvo, e possibilitando assimque a enzima polimerase estenda a fita complementar de DNA (cdna) a partir da extremidade 3 livre dos primers, usando os nucleotídeos livres (dntp s) que estão presentes na reação. Esse ciclo se repete por várias vezes fazendo com que a sequência de interesse seja duplicada a cada ciclo (24). Figura 2: Esquema de ciclagem na real time PCR após transcição reversa. A PCR em tempo real utiliza o princípio da PCR convencional, porém a detecção e quantificação do material genético amplificado são realizadas ao final de cada ciclo basicamente por duas maneiras: moléculas intercalantes ou sondas específicas (24). As moléculas intercalantes possuem a característica de ligação à dupla fita de DNA gerada fazendo com que sua propriedade fluorescente aumente concomitantemente com o aumento do numero de cópias da sequencia alvo, onde a cada ciclo a florescência detectada aumenta. Contudo, os primers definirão a especificidade da reação. Basicamente existem três moléculas intercalantes fluorescentes: a SybrGreen, LCGreen e EvaGreen. Como essas moléculas são capazes de se ligar a qualquer molécula fita dupla, possuem característica de alta sensibilidade e de baixa especificidade, podendo se intercalar aos dímeros de primers ou a

11 10 outras moléculas de DNA presentes, sem ser a de interesse. O uso delas exige uma otimização extensa da análise que se quer estudar a fim de se validar os resultados (24). As sondas específicas, por sua vez, se baseiam na ideia de emissão de fluorescência após a ligação de uma sonda homóloga na etapa de anelamento dos primers. Basicamente as sondas possuem duas moléculas, uma doadora (repórter) e uma que absorve esse sinal fluorescente (Quencher) devido a sobreposição de comprimentos de onda e pela distância física entre ambas, chamado de FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer). As sondas TaqMan então são quebradas na etapa de extensão do fragmento devido a atividade de exonuclease da TaqPolimerase, e isso faz com que as moléculas repórter e quencher se separem ocorrendo emissão de fluorescência, que é quantificada (24). Essa detecção então deve ultrapassar um limiar mínimo designado pelo aparelho, tendo a finalidade de excluir os ruídos, ou seja, a pequena fluorescência que ocorre sem a positividade da amostra. Esse limite é chamado de threshold (24). A quantificação então se torna possível na avaliação do ciclo em que a curva de amplificação exponencial ultrapassa o limiar, o thresholdcycle (CT) (25,26) O MÉTODO NACIONAL O primeiro teste de NAT aceito pelo órgão regulamentador e fiscalizador dos Estados Unidos o FDA (Food and Drugs Administration) para a triagem em serviços de hemoterapia no mundo foi o Procleix da Novartis Diagnostics, que tem como princípio a separação do material genético por campo magnético e detecção dos amplicons ao final da reação através da hibridização de sondas homólogas fluorescentes (3,27,28,29). A partir de então, houve o desenvolvimento de um novo método para o NAT baseado em TaqMan, o cobas multiplex s 201 system da Roche, que permitia análise de amostras em pool de 6, porém sem a identificação de qual vírus positivava o grupo de amostras, sendo necessária nova análise individual para HIV e HCV de cada amostra presente no grupo reagente (30). Avaliando a importância da introdução do NAT nos serviços de hemoterapia, o Ministério da Saúde publicou a portaria nº 112, de 29 de Janeiro de 2004, que trata sobre a implantação obrigatória da tecnologia do NAT nos centros hemoterápicos brasileiros, visando aumentar a segurança transfusional. Porém, a falta de metodologias nacionais atrasou de certa forma a implementação da metodologia no Brasil devido ao alto custo até então dos kits importados, cerca de US$ 30,00 por bolsa de sangue (8,31). Em estudo de custo-benefício em 2007 foi avaliado o custo anual, desse método importado, de cerca de R$ 172 milhões/ano ( doações), se utilizada taxa de câmbio de 1,89/dólar (21). Esse elevado custo mobilizou o desenvolvimento de um kit nacional, viável para a realidade brasileira, através de um consórcio entre a Bio-Manguinhos/FIOCRUZ e o Ministério da Saúde. A metodologia foi aprovada e incorporada à triagem de bolsas de sangue para HIV e HCV no SINASAN e no Sistema Único de Saúde (SUS) através da portaria nº 25 de 12 de Junho de 2013 (32). O kit com tecnologia brasileira tem a capacidade de 96 reações, sendo 4 controles (2 negativos e 2 positivos para HIV e HCV), possuindo assim 92 reações para as amostras em teste. Cada poço de reação é composto por um minipool de 6 amostras caracterizando então dosagem de, no máximo, 552 amostras por placa. Em casos de positividade de um poço, deve-se realizar novos testes, individualizando as 6 amostras inicialmente contidas no pool, a fim de detectar quais amostras estão positivando o teste. O desenvolvimento desse tipo de tecnologia favorece a sua introdução no mercado brasileiro devido ao custo muito reduzido quando comparado a tecnologias importadas, tendo um custo médio de triagem inicial de US$ 4,30 por bolsa quando negativa, pois se positivo é necessária nova pesquisa individual, aumentando consequentemente o custo (8).

12 11 A plataforma NAT multiplex para HIV/HCV nacional se utiliza do princípio de PCR em tempo real multiplex (amplificação de mais de uma sequência de interesse), no qual permite uma avaliação qualitativa do material genético viral (8). Basicamente o processo de identificação é baseada na detecção de fluorescência emitida pela amplificação de regiões altamente conservadas (região C-terminal do gene da integrase para o HIV e região 5 não traduzida para o HCV 5 UTR) através da metodologia de TaqMan. Utilizam-se três sondas TaqMan com fluoróforos que emitem fluorescência de comprimentos de ondas diferentes, o VIC para o HIV, o FAM para o HCV, e o DYE para a partícula calibradora, tornando possível a detecção de qual agente positiva o minipool (33,34). A detecção consiste em 4 momentos, como ilustrado na figura 3: o primeiro ocorre no equipamento Janus da PerkinElmer (preparo do pool, confecção da mistura de PCR e pipetagem no poço da reação). O preparo do pool com 6 amostras utiliza-se de 100µl de cada, incluindo 10 µl partícula calibradora (IPC) que serve para validação da amplificação em cada poço, sua amplificação deve ocorrer entre os valores de Ct de 30,53 a 35,47. O IPC é um vírus HIV/HCV mimético biosseguro capaz de identificar se a reação é verdadeiramente negativa ou se trata de um falso-negativo devido a algum inibidor (uréia, detergentes, acetato de sódio, heparina, fenol e outros componentes orgânicos). Quando isso acontece as amostras devem ser identificadas e posteriormente analisadas separadamente (single) (33,34). A segunda etapa ocorre no BioRobotMDx, da Qiagen, que é responsável pela extração do material genético do pool anteriormente preparado, através da lise do capsídio viral, utilizando-se o tampão de lise e poteases a 56ºC, então a adição do etanol aumenta a afinidade do RNA à membrana de sílica, esse é adsorvido por vácuo, passando então por três etapas de lavagem sob vácuo se utilizando dos tampões de lavagem 1 e 2. Ao final o material genético da coluna é eluido com o tampão de eluição, tornando o produto de extração livre de albumina sérica, nucleases, sais e possíveis interferentes (33, 34). Na terceira etapa, o material extraído volta ao equipamento Janus para pipetagem da mistura de PCR, também chamada de PCR setup. E, por fim, a quarta etapa consiste na amplificação e detecção do sinal em si através do termociclador ABI 7500 da Applied Biosystems (8) que faz a variação de temperatura anteriormente citada e também a leitura de fluorescência emitida, em que a emissão de luz é diretamente proporcional a quantidade de amplicons a cada ciclo, permitindo a detecção em tempo real (8,30). Este teste nacional é capaz de detectar em 95% das vezes 600 UI/ml para HCV e 600 cópias/ml para HIV na amostra individual do doador (33,34). Figura 3: Esquema do teste NAT da Bio-Manguinhos /Fiocruz NAT NA IDENTIFICAÇÃO DE NOVOS PATÓGENOS VIRAIS

13 12 A ampliação do teste NAT para o vírus da hepatite B (HBV) em escala mundial ressalta a importância de que novos microrganismos sejam aderidos a essa nova técnica, agregando mais qualidade à segurança transfusional. Alguns estudos internacionais mostram que a introdução do NAT HBV poderia prevenir até 117 hemocomponentes potencialmente infectados e de infecções clinicamente graves por HBV (36). Entretanto, a sua introdução, mesmo diminuindo o período de janela imunológica em cerca de 25 a 36 dias (NAT single) e de 9 a 11 dias (NAT multiplex) (35), não excluirá as dosagens sorológicas de anti-hbc e HBsAg devido às características virais, em que, no período de cronicidade, os níveis de DNA viral no soro podem estar indetectáveis (36, 37). Fica ainda mais evidente a importância da incorporação desse vírus a pesquisa do NAT no Brasil devido à notificação de um aumento de casos confirmados de hepatite B, de 473 pessoas em 1999 para em 2009, juntamente com o fato que cerca de 77,2% dessas pessoas possuem a doença de forma crônica ou ignorada e que a transfusão representa uma porcentagem considerável de transmissão (38). De acordo com isso, atualmente, os debates para a implementação desse teste, concomitantemente com o do vírus da dengue na metodologia nacional, vêm ganhando força (39). Baseia-se no método NAT multiplex, reduzindo a janela do HBV de 50 para dias (35, 36, 37) NAT POR SYBRGREEN/MELTING CURVE Alternativamente ao método TaqMan utilizado no kit do NAT nacional (Bio- Manguinhos) para a triagem laboratorial, a utilização de moléculas intercalantes (SybrGreen) com posterior análise da curva de derretimento (melting curve) vêm mostrando certa eficiência, além de possuir baixo custo e maior sensibilidade (cerca de 50 UI/ml para HCV) e também diminui os erros devido a mutações em regiões de anelamento das sondas (25, 40, 41). Porém devido a inespecificidade de ligação das moléculas intercalantes (ligação em todo tipo de DNA dupla fita, mesmo não sendo o cdna de análise), algumas otimizações devem ser realizadas, como a concentração do co-fator MgCl 2 para que a enzima polimerase atue da sua melhor forma, e a quantidade de primers para garantir que menor número de dímeros ocorram (25). A especificidade da reação para todos os vírus é relacionada ao tamanho do amplicon como também a homogeneidade da sua sequencia de bases nitrogenadas (25). Após a amplificação, ocorre a etapa de detecção por melting curve que determinará o vírus que positiva a reação (40, 41). A curva de derretimento, ou melting curve, pode ser traduzida em uma etapa de aumento gradual da temperatura para que as fitas se dissociem e assim a emissão de fluorescência diminua (Pico do gráfico mostra a temperatura em que estão separadas metade das fitas, consequentemente metade da fluorescência inicial também). Uma relação de densidade de Citosina (C) e Guanina (G) é observada, ou seja, quanto maior a densidade de (CG) maior também a temperatura necessária para dissociação da fita (Tm). Então, se comparada a amostra a um controle, cada fragmento específico de detecção terá uma temperatura de melting específica, o que possibilita a detecção de qual vírus amplificou na etapa anterior (25, 40, 41). 3. CONCLUSÃO A evolução mundial dos procedimentos de triagem, através de técnicas ainda mais sensíveis, tem despertado a responsabilidade política diante de questões que visam garantir maior qualidade e segurança das transfusões ao receptor. Devido às características virais do

14 13 HIV e do HCV é importante salientar sobre o período de janela sorológica em que os níveis de anticorpos são indetectáveis mesmo com a presença do vírus no organismo. Desse modo,o desenvolvimento e a introdução da tecnologia nacional são de extrema importância, uma vez que possibilitam uma triagem laboratorial mais confiável, e consequentemente bolsas mais seguras para transfusões, com custo cerca de 3 a 4 vezes menor quando comparado às tecnologias importadas, além da possibilidade da diferenciação do tipo viral já na primeira análise. A extensão do método nacional, com a introdução da triagem de outros vírus, como o da hepatite B e o da dengue, assim como a melhoria da tecnologia, têm sido abordados recentemente e reitera a importância da exploração cada vez maior dessa tecnologia para os serviços hemoterápicos. Importance of introduction of NAT HIV/HCV on the services of hemotherapy in Brazil Abstract: The process of transfusion has become increasingly important in therapeutic medicine and the safe use of blood components is a big challenge. The window period, period of time during which the antibodies are undetectable, is one of the biggest problems in laboratory screening. Therefore, the molecular techniques have, as objective, to reduce this problematic situation. Nucleic Acid Test (NAT) is based on the amplification of target regions of viral RNA and its real-time detection, reducing the detection window of the human immunodeficiency virus (HIV), from 22 to days and the Hepatitis C virus (HCV), from 70 to days. The development of this method for screening other pathogens, such as dengue and hepatitis B viruses, are currently on ruling in Brazil. In overview, the implementation of this technology, even resulting on a cost increase, brings, to medium and long term, benefits to the receiver due to better quality of blood products produced. Keywords: NAT HIV. NAT HCV. Seroconversion. Blood Safety.Transfusion Medicine.

15 14 4. REFERÊNCIAS 1. Neto, VA. Atualizações, orientações e sugestões sobre imunizações. 1ª ed. São Paulo: Segmento Farma, p. 2. Brasil. Ministério da Saúde. Secretaria de Atenção a Saúde. Caderno de atenção básica a saúde nº 18: HIV/AIDS, hepatites e outras DST. Brasília Gonçalez TT, Oliveira CL, Carneiro-Proietti ABF, Moreno EC, Miranda C, Larsen N, et. al. Motivation and social capital among prospective blood donors in three large blood centers in Brazil. Transfusion. 2013; 53(6): Shander A, Gross I, Hill S, Javidroozi M, Sledge S. A new perspective on best transfusion practices. Blood Transfusion. 2013; 11(2): Fang CT, Field SP, Busch MP, Heyns, AP. Human immunodeficiency virus-1 and hepatitis C virus RNA among South African blood donors: estimation of residual transfusion risk and yield of nucleic acid testing. VoxSanguinis. 2003; 85(1): Harmening DM. Técnicas modernas em banco de sangue e transfusão. 4ª ed. São Paulo: Revinter; p. 7. Malagutti W. Imunização, imunologia e vacinas. Rio de Janeiro: Rubio; p. 8. Brasil. Ministério da Saúde. Departamento de Gestão e Incorporação de Tecnologias em Saúde da Secretaria de Ciência, Tecnologia e Insumos Estratégicos. Relatório nº 26 - Teste de amplificação de ácidos nucleicos (NAT) para detecção dos vírus da imunodeficiência humana (HIV) e da hepatite C (HCV). Brasília Costa ASL, Brasiliense DM. HIV seroconversion in blood donors from coordinating blood bank in the state of Pará. RevistaBrasileira de Hematologia e Hemoterapia. 2011; 33(5): Sabino EC, Gonçalez TT, Sarr M. HIV prevalence, incidence and residual risk or transmission by transfusions at REDS-II blood centers in Brazil. Transfusion. 2013; 52(4): Brasil. Agência Nacional de Vigilância Sanitária. RDC nº 57 de 16 de Dezembro de Determina o Regulamento Sanitário para Serviços que desenvolvem atividades relacionadas ao ciclo produtivo do sangue humano e componentes e procedimentos transfusionais. Diário Oficial da União, Brasília, DF, 17 de Dezembro de 2010, seção 1, pg Brasil. Ministério da Saúde. Portaria nº 2.712, de 12 de novembro de Redefine o regulamento técnico hemoterápico. Diário Oficial da União, Brasília, DF, 13 de novembro de 2013, seção 1, pg Carrazone FVC, Brito AM, Gomes YM. Importância da avaliação sorológica prétransfusional em receptores de sangue. RevistaBrasileira de Hematologia e Hemoterapia. 2004; 26(2): Goncalez T, Sabino E, Sales N, Chen Y, Chamone D, Busch M, et. al. HIV testseeking blood donors in a large blood bank in São Paulo, Brazil. Transfusion. 2010; 50(8): Mitchell EO, Stewart G, Bajzik O, Ferret M, Bentsen C, Shriver MK. Performance comparison of the 4th generation Bio-Rad Laboratories GS HIV Combo Ag/Ab EIA on the EVOLIS TM automated system versus Abbott ARCHITECT HIV Ag/Ab Combo, Ortho Anti-HIV EIA on VitrosECi and Siemens HIV-1/O/2 enhanced on Advia Centaur. Journal of Clinical Virology. 2013; 58(1): Chavez P, Wesolowski L, Patel P, Delaney K, Owen SM. Evaluation of the performance of the Abbott ARCHITECT HIV Ag/Ab Combo Assay. Journal of Clinical Virology. 2011; 52(1):52-55.

16 17. Dubravac T, Gahan TF, Pentella MA. Use of the Abbott Architect HIV antigen/antibody assay in a low incidence population. Journal of Clinical Virology. 2013; 58(1): Busch MP, Glynn SA, Stramer SL, Stramer SL, Strong DM, Caglioti S, et al. A new strategy for estimating risks of transfusion transmitted viral infections based on rates of detection of recently infected donors. Transfusion. 2005; 45(2): Pomper GJ, Wu YY, Snyder EL. Risks of transfusion-transmitted infections: Current Opinion in Hematology. 2003; 10(6): Wiedmann M, Kluwick S, Walter M, Fauchald G, Howe J, Bronold M, et. al. HIV- 1, HCV and HBV seronegative window reduction by the new Roche cobastaqscreen MPX test in seroconverting donors. Journal of Clinical Virology. 2007; 39(4): Brasil. Ministério da Saúde. Rede Brasileira de Avaliação de Tecnologias em Saúde. O teste de amplificação de ácidos nucléicos (NAT) e as demais estratégias para detecção dos vírus HIV-1 e HCV na triagem de sangue doado. Boletim Brasileiro de Avaliação de tecnologias em Saúde nº 3. Brasília, Nübling CM, Heiden M, Chudy M, Kress J, Seitz R, Keller-Stanislawski B, et. al. Experience of mandatory nucleic acid test (NAT) screening across all blood organizations in Germany: NAT yield versus breakthrough transmissions. Transfusion. 2009; 49(9): Davidson T, Ekermo B, Gaines H, Lesko B, Åkerlind B. The cost-effectiveness of introducing nucleic acid testing to test for hepatitis B, hepatitis C, and human immunodeficiency virus among blood donors in Sweden. Transfusion. 2011; 51(2): Applied Biosystems. Real-Time PCR systems: Presence/Absence Experiments. [Internet] 2010 [citado em 20 de mar 2014]. Disponível em: <http://www3.appliedbiosystems.com/cms/groups/mcb_support/documents/general documents/cms_ pdf>. 25. Oliveira TMS. PCR em tempo real: métodos e aplicações [tese]. Aveiro: Universidade de Aveiro; p. 26. Shazamani K, Sabahi F, Merat S, Sadeghizadeh M, Lashkarian HE, Rezvan H, et. al. Rapid Low-cost Detection of Hepatitis C Virus RNA in HCV infected Patients by Real-time RT-PCR using SYBR Green I. Archives of Iranian Medicine. 2011; 14(6): Novartis Vaccines and Diagnostics, Inc. Food and Drugs Administration. Procleix HIV-1/HCV Assay. [Internet] 2007 [citado em 25 de mar 2014]. Disponível em:<http://www.fda.gov/downloads/biologicsbloodvaccines/bloodbloodproducts/ap provedproducap/licensedproductsblas/blooddonorscreening/infectiousdisease/ucm pdf>. 28. Xiao X, Zhai J, Zeng J, Tian C, Wu H, Yu Y. Comparative evaluation of a triplex nucleic acid test for detection of HBV DNA, HCV RNA, and HIV-1 RNA, with the Procleix Tigris System. Journal of Virological Methods. 2013; 187(2): McCormick MK, Dockter J, Linnen JM, Kolk D, Wu Y, Giachentti C. Evaluation of a new molecular assay for detection of human immunodeficiency virus type 1 RNA, hepatitis C virus RNA, and hepatitis B virus DNA. Journal of Clinical Virology. 2006; 36(3): Margaritis AR, Brown SM, Seed CR, Kiely P, D Agostino B, Keller AJ. Comparison of two automated nucleic acid testing systems for simultaneous detection of human immunodeficiency virus and hepatitis C virus RNA and hepatitis B virus DNA. Transfusion. 2007; 47(1):

17 31. Lajolo CP, Langhi JDM, Marques JFC. HIV ELISA negativo com NAT positivo: Uma realidade em hemoterapia. Revista Brasileira de Hematologia e Hemoterapia. 2008; 30(4): Brasil. Ministério da Saúde. Portaria nº 25, de 12 de Junho de Decisão de incorporar o procedimento para possibilitar a testagem de amostra de sangue de doadores pelo teste de amplificação de ácidos nucleicos (NAT) para detecção dos vírus da imunodeficiência humana (HIV) e da hepatite C (HCV) no âmbito do Sistema Nacional de Sangue, Componentes e Hemoderivados no Sistema Único de Saúde - SUS. Diário Oficial da União, Brasília, DF, 13 de Junho de 2013, seção 1, pg. 69; 33. Fiocruz. Bio-Manguinhos. Bula kit NAT HIV/HCV. Rio de Janeiro Fiocruz. Bio-Manguinhos. Fundação Oswaldo Cruz. Guia de treinamento para kit Nat HIV/HCV. Divisão de atendimento ao cliente e pós-marketing. Rio de Janeiro Busch MP. Should HBV DNA NAT replace HBsAg and/or anti-hbc screening of blood donors? Transfusion Clinique etbiologique. 2004; 11(1): Yang Z, Xu L, Liu L, Feng Q, Zhang L, Ma W, et. al. Routine screening of blood donations at Qingdao central blood bank, China, for hepatitis B virus (HBV) DNA with a real-time, multiplex nucleic acid test for HBV, hepatitis C virus, and human immunodeficiency virus Types 1 and 2. Transfusion. 2013; 53(10): Kuhns MC, Busch MP. New strategies for blood donor screening for hepatitis B virus: nucleic acid testing versus immunoassay methods. Molecular diagnosisandtherapy. 2006; 10(2): Brasil. Ministério da Saúde. Secretaria de Vigilância em Saúde. Hepatites virais. Boletim epidemiológico nº 1. Brasília, Ferreira AGP. Bio-Manguinhos. Fundação Oswaldo Cruz. Ensaio real triplex para HBV e Dengue, visando ampliação de alvos do kit NAT HIV/HCV Bio- Manguinhos. [Internet] 2013 [Citado em 26 de mar 2014]. Disponível em: <http://sact.bio.fiocruz.br/trabalhos/13-antonio-pinto.pdf>. 40. Cousins MM, Swan D, Magaret CA, Hoover DR, Eshleman SH. Analysis of HIV using a high resolution melting (HRM) diversity assay: automation of HRM data analysis enhances the utility of the assay for analysis of HIV incidence. PLoS One. 2012; 7(12):e Becker CE, Kretzmann NA, Mattos AA, Veiga AB. Melting curve analysis for the screening of hepatitis B virus genotypes A, D and F in patients from a general hospital in southern Brazil. Arquivos de Gastroenterologia. 2013; 50(3):

18 17 - ANEXO I - Information for Authors The Revista Brasileira de Hematologia e Hemoterapia, ISSN , theofficialscientificpublicationofthe Associação Brasileira de Hematologia, Hemoterapia e Terapia Celular, Sociedade Brasileira de Transplante de Medula Óssea, AssociazioneItalo-Brasiliana diematologiaand Sociedade Brasileira de Oncologia Pediátrica aimstopromotescientificdevelopment in Hematology, Transfusion Medicine andrelatedareas. All manuscripts, after initial acceptance by the editors, will be sent for analysis by two peer reviewers. Anonymity is guaranteed throughout the evaluation process. When considered necessary, a list of modifications will be sent to authors to correct their work or justify their decision not to do so. The responsibility for opinions expressed in articles is solely of the authors. Manuscripts should not be submitted simultaneously to more than one journal. This is an Open Access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution Non-Commercial License (http://creativecommons.org/licenses/by/3.0/) which permits unrestricted non-commercial use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original work is properly cited. Reproduction, in full or partial, translated into other languages requires prior permission of the editors. The journal publishes the following sessions: Original Article, Special Article, Review Article, Updates in the Specialty, Case report, Letter to the Editor, Images in Clinical Hematology, Editorial, Scientific Comment and What is the Evidence. Other types of publications of interest in the area will be published at the discretion of the editors. All articles will be published in English however at the start of the review process manuscripts can be submitted in Portuguese or English. Preparation of the manuscript General information For any manuscript to be evaluated, it must be accompanied by the following documentation: Conflict of interest: Situations that may improperly influence the development or the conclusions of the work such as participation in drug- or equipment-producing companies cited or used in the work, as well as competitors of these companies should be mentioned. Financial assistance, payments received for consultancies, relationships related to employment, etc. are also considered sources of conflict. Approval of the study by a Research Ethics Committee recognized by the National Research Ethics Committee (CONEP); Articles that deal with clinical research involving human beings must include a statement in the Methods Section that all study participants signed an informed consent form. Authors should also confirm that the study was conducted in accordance with the Helsinki Declaration as revised in 2008;

19 18 For works involving animal experimentation, the authors should confirm in the Methods Section that the study followed the rules contained in the Ethical Code for Animal Experimentation of the Council for International Organizations of Medical Sciences (CIOMS) [WHO Chronicle 1985; 39 (2): 51-6] and the principles of the Brazilian College of Animal experimentation - COBEA (www.cobea.org.br). Authors must complete the Declaration - Statement of Human and Animal Rights. All randomized controlled trials and clinical trials submitted for publication must be registered in a clinical trials database. This is a guideline of the International Clinical Trial Registry Platform (ICTPR) of the World Health Organization (WHO) and the International Committee of Medical Journal Editors (ICMJE). The instructions for the registry are available at http: and registration can be attained in the Clinical Trials Database of the National Library of Medicine available at Technical requirements 1. Article identification: a) A concise however informative title; b) Complete names of authors without abbreviations and their institutions; c) Department and official name of the institution(s) to which the work should be attributed; d) Name, full address including telephone and of corresponding author; e) financial support (if any). 2. Abstract and keywords: Abstract in English of not more than 250 words. For Original Articles this should be structured with background, method, main results and conclusion. For the other article types, the abstract need not be structured but should contain information illustrating the importance of the work. Specify up to five keywords, which define the theme of the paper. The keywords should be based on MeSH (Medical Subject Headings) from the National Library of Medicine available at:http://www.sgponline.com.br/rbhh/sgp/naveg/mesh.asp. For clinical trials, indicate the International Clinical Trials Registry Number below the summary. 3.Manuscript content: a) Original Article: Used to publish the results of scientific research, it must be original and should comprise the following: Introduction, Objective, Method, Results, Discussion, Conclusion and References. The work should not exceed 4000 words (including references), up to 6 authors, up to 7 tables, illustrations and photos and up to 30 references; b) Special Article: With the same structure as original articles, Original Articles are reclassified by the Editor depending on their importance: C) Review Articles: narrative reviews addressing an important issue in the specialty. These articles should not exceed 5000 words (including references), a maximum of 7 tables, Figures and Photos and up to 60 references; d) Update in the Specialty: on a theme, method, treatment, etc. It must contain a brief history of the topic, its current state of knowledge and the reasons for the work; study methods (data sources, selection criteria), hypotheses, study lines, etc., criteria similar to review articles: e) Case Report: should have an introduction with a brief

20 19 literature review, a description of the case showing significant results for the diagnosis and differential diagnoses (if any), discussion or comments and references. It should not exceed 1800 words, two tables, illustrations and photographs, up to four authors and ten references: f) Letters to the Editor: a maximum of 1000 words (including references), three authors, and two illustrations: g) Images in Clinical Hematology: Maximum 100 words, two images, three authors and three references: h) Scientific comments: will only be accepted by invitation of the editors. 4 Acknowledgements: Should be addressed to collaborators who deserve recognition, but whose participation does not justify their inclusion as an author such as technical assistants, as well as financial support received. 5. References: References should always be numbered in the order they appear in the text. The format must be based on the "Uniform Requirements for Manuscripts Submitted to Biomedical Journals" guidelines proposed by the International Committee of Medical Journal Editors and updated in 2009, as follows: the titles of journals should be abbreviated following the List of Journals Indexed in Index Medicus of the National Library of Medicine (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez). Cite the first six authors after which add the words et al. Examples of references: Printed documents Journals: Padley DJ, Dietz AB, Gastineau DA. Sterility testing of hematopoietic progenitor cell products: a single-institution series of culture-positive rates and successful infusion of culture-positive products. Transfusion. 2007;47(4): Books: Chalmers J. Clinician s manual on blood pressure and stroke prevention. 3rd ed. London: Science Press; p. Richardson MD, Warnock DW. Fungal Infection Diagnosis and Management. 2nd ed. Oxford: Blackwell Science Ltd Editorial Offices; p. Book chapters: F. Reyes. Lymphocyte differentiation. In P Solal- Céligny, N Brousse, F Reyes, C Gisselbrecht, B Coiffier. Non- Hodgkin`sLymphomas. Paris: ÉditionsFrison-Roche; p Annals: Souza AM, Vaz RS, Carvalho MB, Arai Y, Hamerschilak N. Prevalência de testes sorológicos relacionados à hepatitis B e não-a, não- B em doadores de sangue. In: 19º Congresso Brasileiro de Hematologia e Hemoterapia / 26º Congresso da Sociedade Brasileira de Hematologia e Hemoterapia; 2003 Ago 6-9; São Paulo, Anais. p.103. Theses: Sandes AF. Caracterização imunofenotípica da diferenciação eritrocitária, granulocítica e megacariótica em pacientes com síndromes mielodisplásicas [thesis]. São Paulo: Universidade Federal de São Paulo;

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