Syphilis Total Ab 1 placa placas

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1 Syphilis Total Ab 1 placa placas KITS PARA DETEÇÃO QUALITATIVA DE ANTICORPOS DE TREPONEMA PALLIDUM EM SORO OU PLASMA HUMANOS, UTILIZANDO UMA TÉCNICA DE IMUNOENSAIO ENZIMÁTICO /11

2 ÍNDICE 1. APLICAÇÃO RESUMO E EXPLICAÇÃO DO TESTE PRINCÍPIOS DO PROCEDIMENTO REAGENTES AVISOS E PRECAUÇÕES AMOSTRAS PROCEDIMENTO LIMITAÇÃO DO TESTE CARATERÍSTICAS DE DESEMPENHO REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

3 1. APLICAÇÃO Estes kits devem ser s por pessoal devidamente formado e qualificado para deteção qualitativa de anticorpos de Treponema pallidum em soro e plasma humano. O produto poderá ser para rastreio de dadores de sangue e para auxiliar no diagnóstico de pacientes com suspeita de infeção por sífilis. 2. RESUMO E EXPLICAÇÃO DO TESTE A sífilis é uma infeção crónica que progride por diferentes fases de infeção: primária, secundária, latente e tardia. Estas fases produzem sintomas clínicos diversos, produzindo, habitualmente, úlceras iniciais, conhecidas como cancros. Em seguida surge uma erupção cutânea sifilítica, seguida por longos períodos sem sintomas. A infeção não tratada poderá eventualmente resultar em problemas cardiovasculares e neurossífilis. A infeção é causada pela espiroqueta Treponema pallidum e adquire-se habitualmente por contacto sexual, embora a doença possa também ser transmitida por uma transfusão de sangue infetado. Pode ocorrer também uma infeção intrauterina. Comprovou-se que é praticamente impossível que o organismo se desenvolva em meios artificiais e o diagnóstico da infeção depende habitualmente da demonstração de anticorpos no sangue, que aparece pouco depois da infeção inicial e podem persistir por muitos anos. Os testes para deteção de sífilis encaixam em quatro categorias: exame microscópico direto, testes de anticorpos treponémicos, testes de anticorpos não treponémicos e testes de antigénios diretos. Devido aos longos períodos sem sintomas e à natureza não específica dos testes não treponémico, os métodos que detetam anticorpos não treponémico específicos em amostras de sangue tornaramse cada vez mais populares para o rastreio. O Syphilis Total Ab é um desses testes. 3. PRINCÍPIOS DO PROCEDIMENTO O Syphilis Total Ab utiliza três antigénios recombinantes num ensaio de tipo sandwich. Os antigénios detetarão IgG, IgM e IgA específicas de T. pallidum, permitindo que o teste detete anticorpos durante todas as fases da infeção. As cavidades são revestidas por uma mistura de antigénios recombinantes de T. pallidum 15Kd, 17Kd e 47Kd. Os anticorpos específicos em amostras de soro ou combinam-se com estes antigénios e com os mesmos antigénicos conjugados com peroxídase de rábano-silvestre quando é adicionado conjugado a uma cavidade onde a amostra tenha incubada. Após a remoção do material não reagido através de lavagem, é revelada a presença enzima ligada, indicando a presença de anticorpos específicos na amostra, através de uma alteração de cor na mistura de substrato/cromogéneo. A intensidade da cor é comparada com a cor presente em cavidades de controlo, para determinar a presença ou ausência de anticorpos específicos. [PT] 2

4 4. REAGENTES 4.1. Descrição Identificação no rótulo R1 R2 R3 R4 R6 Microplate Concentrated Washing Solution (20X) Negative control Positive control Conjugate Descrição Microplaca 12 tiras de 8 cavidades cada, revestidas com antigénios recombinantes T. pallidum (rag) Número ID específico = 97 Solução de lavagem concentrada (20x) Tampão Tris NaCl ph 7,4 Conservante: ProClin 300 (0,04%) Controlo negativo Tampão Tris com BSA (albumina de soro bovino) Conservante: ProClin 300 (0,1%) Controlo positivo (humano) Soro humano contendo anticorpos de T.pallidum negativo para HIV1/2, HBs Ag e HCV diluído em tampão Tris contendo BSA (albumina de soro bovino) Conservante: ProClin 300 (0,1%) Conjugado T.pallidum rag/peroxídase Conservante: ProClin 300 (0,05%) Apresentação/ Preparação placa 70 ml Para diluição 2,1 ml 1,6 ml 8 ml Apresentação/ Preparação placas 235 ml Para diluição 2,1 ml 1,6 ml 30 ml R8 Substrate buffer Tampão de substrato Solução de ácido cítrico e acetato de sódio, ph 4,0, com H 2 O 2 (0,015%) e DMSO (4%) 60 ml Para reconstituição 60 ml Para reconstituição R9 R10 Chromogen: TMB solution (11X) Stopping solution Cromogéneo: Solução TMB (corde-rosa) Solução contendo 3,3, 5,5 tetrametilobenzeno (TMB) Solução de paragem Solução de ácido sulfúrico (H 2 SO 4 1N) 5 ml Para diluição 28 ml 5 ml Para diluição 28 ml 4.2. Requisitos de armazenamento e manuseamento Este kit deve ser armazenado a pelo menos +2-8 C. Cada item do kit preservado a +2-8 C pode ser usado até à data de validade indicada na embalagem (salvo indicação em contrário). Após a abertura e na ausência de contaminação, os reagentes R3, R4, R6, R8, R9 e R10 conservados a +2-8 C podem ser s até a data de validade indicada na etiqueta. [PT] 3

5 Identificação R1 R2 R8+R9 Conservação Após a abertura do saco selado a vácuo, as tiras de microcavidades armazenadas a +2-8 C podem ser utilizadas durante 1 mês no respetivo saco original selado novamente com cuidado. A solução de lavagem diluída pode ser armazenada a C durante 2 semanas. A solução de lavagem concentrada (R2) pode ser armazenada a C. Após a reconstituição, os reagentes armazenados num local escuro podem ser s durante 6 horas à temperatura ambiente (18-30 C). 5. AVISOS E PRECAUÇÕES Para utilização em diagnóstico in vitro. Para utilização por profissionais de saúde Precauções de saúde e segurança: Este kit de teste apenas deve ser manuseado por pessoal qualificado, com formação em procedimentos laboratoriais e familiarizado com os respetivos potenciais perigos. Use vestuário de proteção adequado, luvas e proteção ocular/facial e manuseie de forma adequada de acordo com as Boas Práticas Laboratoriais exigidas. O kit de teste contém componentes de sangue humano. O material de origem humana usado na preparação de reagentes foi testado e considerado não reativo para o antigénio de superfície da hepatite B (HBs Ag), anticorpos contra vírus da imunodeficiência humana (HIV-1 e HIV-2 Ab) e anticorpos contra o vírus da hepatite C (HCV). Nenhum método de teste conhecido pode oferecer total garantia da ausência de agentes infeciosos. Por conseguinte, todos os derivados de sangue humano, reagentes e amostras humanas devem ser manuseados como meios capazes de transmissão de doença infeciosa, cumprindo as Precauções Universais recomendadas para agentes patogénicos transmissíveis pelo sangue, conforme definido pelos regulamentos locais, regionais e nacionais. Salpicos biológicos: Os salpicos de material de origem humana devem ser tratados como potencialmente infeciosos. Os salpicos que não contenham ácido devem ser imediatamente descontaminados, incluindo a área salpicada, os materiais e quaisquer superfícies ou equipamento contaminados, com um desinfetante químico apropriado eficaz para resíduos biológicos potencialmente perigosos das amostras envolvidas (normalmente, uma diluição de 1:10 de lixívia de uso doméstico, 70-80% de etanol ou isopropanol e iodofor como Wescodyne Plus a 0,5% etc.), devendo ser secos com um pano. Salpicos que contenham ácido devem ser absorvidos adequadamente (limpos com um pano) ou neutralizados e a área deve ser enxaguada e limpa com um pano até ficar seca; poderá ser necessário eliminar os materiais s para limpar os salpicos como resíduos biologicamente perigosos. Em seguida, a área deverá ser descontaminada com um dos desinfetantes químicos. NOTA: Não coloque soluções que contenham lixívia na autoclave! Elimine todas as amostras e materiais s para realizar o teste como se estes contivessem um agente infecioso. Os resíduos laboratoriais, químicos ou biológicos perigosos devem ser manuseados e eliminados em conformidade com todos os regulamentos locais, regionais e nacionais. Para obter recomendações relativas a perigos e precauções relacionadas com alguns componentes químicos neste kit de teste, consulte as ilustrações indicadas nos rótulos e as informações fornecidas no final das instruções de utilização. A Ficha de Dados de Segurança encontra-se disponível em [PT] 4

6 5.2. Precauções relacionadas com o procedimento Preparativos A fiabilidade dos resultados depende da implementação correta das Boas Práticas Laboratoriais que seguintes Práticas: Não utilize reagentes expirados. Não misture nem associe reagentes de diferentes lotes num único teste. Antes da utilização, aguarde 30 minutos até que os reagentes estabilizem à temperatura ambiente (18-30 C). O nome do teste, bem como um número de identificação específico para o teste, é indicado na estrutura de cada microplaca. O número de identificação específico é indicado também em cada tira. Syphilis Total Ab: Número ID específico = 97 Verifique o número de identificação específico antes da utilização. Se o número de identificação estiver em falta ou for diferente do número indicado correspondente ao ensaio a testar, a tira não deve ser utilizada. OBSERVAÇÃO: Para a solução de lavagem (R2, identificação da etiqueta: 20X coloração verde), tampão de substrato peroxídase (R8, identificação da etiqueta: tampão TMB, coloração azul), cromogéneo (R9, identificação da etiqueta: TMB 11X, coloração púrpura) e solução de paragem (R10, identificação da etiqueta: 1N coloração vermelha), é possível utilizar outros lotes para além daqueles incluídos no kit, desde que o mesmo lote seja na execução de um determinado teste. Estes reagentes podem ser s com alguns dos outros produtos da nossa empresa. Contacte o nosso serviço técnico para obter informações detalhadas. Reconstitua cuidadosamente os reagentes, evitando qualquer contaminação. Utilize vidros de laboratório minuciosamente lavados e enxaguados com água desionizada ou, de preferência, material descartável. Não deixe que a microplaca seque entre o final da operação de lavagem e a distribuição de reagente. A reação enzimática é muito sensível a iões metálicos. Por conseguinte, não permita que qualquer elemento metálico entre em contacto com as várias soluções de conjugado ou de substrato. A solução de desenvolvimento (tampão de substrato + cromogéneo) deve ter coloração cor-de-rosa. A modificação desta coloração cor-de-rosa no intervalo de alguns minutos após a reconstituição indica que o reagente não pode ser e deve ser substituído. A preparação da solução de desenvolvimento pode ser realizada numa bandeja de plástico limpa, descartável e de utilização única ou num recipiente de vidro que primeiramente tenha sido pré-lavado com 1N HCl, enxaguado minuciosamente com água destilada e seco. Este reagente deve ser armazenado num local escuro. Nunca utilize o mesmo recipiente para distribuir o conjugado e a solução de desenvolvimento Processamento Não altere o procedimento de ensaio. Não realize o teste na presença de vapores reativos (vapores ácidos, alcalinos ou aldeídicos) ou de poeiras que possam alterar a atividade enzimática do conjugado. Utilize uma ponta de distribuição nova para cada amostra. A lavagem da cavidade é um passo crítico neste procedimento: respeite o número de ciclos de lavagem recomendado, certificando-se de que todas as cavidades estão completamente cheias e, em seguida, são completamente esvaziadas. Uma lavagem incorreta pode levar a um resultado incorreto. Siga cuidadosamente os procedimentos de lavagem descritos de modo a obter o máximo desempenho do teste. Com alguns instrumentos, poderá ser necessário otimizar o procedimento de lavagem (aumentar o número do ciclo da fase de lavagem e/ou o volume do tampão de lavagem para cada ciclo) para obter um nível aceitável de fundo DO para a amostra negativa. Contacte a nossa empresa para obter informações sobre adaptações e procedimentos especiais. [PT] 5

7 6. AMOSTRAS Recolha as amostras de sangue de acordo com as práticas correntes. Os testes devem ser realizados em soro não diluído ou plasma (recolhido em EDTA, citrato de sódio, heparina de sódio ou ACD) As amostras que contêm agregados devem ser clarificadas por centrifugação, antes do teste. As amostras devem ser armazenadas a +2-8 C se o teste for realizado num prazo de 7 dias ou armazenado a -20 C para um período mais longo. Não repita mais de 5 ciclos de congelação/descongelação. Foram utilizadas amostras com um tratamento térmico a 56 C durante 1/2 hora. As amostras que contenham até 120 g/l de albumina, 200 mg/l de bilirrubina, 33 g/l de trioleína ou 2 g/l de hemoglobina não afetam os resultados. Contudo, não é recomendada a utilização de soro ou plasma hiperlipémico ou hiperhemolisado. As amostras devem ser descongeladas e bem misturadas antes de testar. Se as amostras se destinam a ser transportadas, devem ser acondicionadas em conformidade com as regulamentações em vigor relativamente ao transporte de agentes etiológicos e de preferência transportadas congeladas. 7. PROCEDIMENTO 7.1. Materiais necessários, mas não fornecidos Água destilada. Hipoclorito de sódio (lixívia de uso doméstico) e bicarbonato de sódio. Papel absorvente. Luvas descartáveis. Óculos de segurança. Tubos descartáveis. Pipetas ou multipipetas ajustáveis ou predefinidas, automáticas ou semiautomáticas, para medir e dispensar 50 μl, 1 ml e 10 ml. Cilindros graduados com uma capacidade de 100 ml e 1 L. Sistema lavador de microplacas automático, semiautomático ou manual (*). Incubador de microplacas com termóstato ajustado para 37 C ± 1 C (*). Recipiente para resíduos biologicamente perigosos. Leitor de microplacas equipado com filtros de 450, 490 nm e nm (*). (*) Contacte-nos para informação detalhada sobre o equipamento recomendado pelo nosso departamento técnico Preparação dos reagentes Reagentes prontos a utilizar Reagente 1 (R1): Microplaca Cada estrutura de apoio contendo 12 tiras é envolta numa bolsa de alumínio selada. Corte a bolsa usando uma tesoura ou um bisturi 0,5 a 1 cm acima do selo. Abra a bolsa e retire a estrutura. Coloque as tiras não utilizadas na bolsa. Feche a bolsa cuidadosamente e volte a armazená-la a +2-8 C. Reagente 3 (R3): Controlo negativo Reagente 4 (R4): Controlo positivo Reagente 6 (R6): Conjugado Homogeneíze invertendo antes da utilização. Reagente 10 (R10): Solução de paragem [PT] 6

8 Reagente para reconstituir Reagente 2 (R2): Solução de Lavagem concentrada (20x) Dilua 1:20 em água destilada para obter a solução de lavagem pronta a utilizar. Prepare 800 ml para uma placa de 12 tiras. Reagente 8 (R8) + Reagente 9 (R9): Solução de desenvolvimento de enzimas Dilua a 1:11 o cromogéneo (R9) no Tampão de Substrato (por ex.: 1 ml de reagente R ml de reagente R8) visto que 10 ml são a quantidade necessária e suficiente para tratar 12 tiras. Homogeneíze Procedimento de ensaio Siga rigorosamente o procedimento. Utilize soros de controlo negativos e positivos para cada teste de modo a validar a qualidade do teste. Siga as Boas Práticas Laboratoriais que se seguem: 1) Estabeleça cuidadosamente o plano de identificação e distribuição de amostras. 2) Prepare a solução de lavagem R2 diluída 3) Retire a estrutura de apoio da embalagem de proteção e o número necessário de tiras (R1). Volte a colocar as tiras não utilizadas na embalagem. Feche a embalagem e volte a colocá-la a +2-8 C. 4) Distribua na cavidade pela seguinte ordem (distribuição de placa recomendável): 50 μl de controlo negativo (R3) em A1, B1, C1 50 μl de controlo positivo (R4) na cavidade D1, E1 50 µl de amostra não diluída em cada cavidade, F1, G1, etc 50 μl de conjugado (R6) em cada cavidade Dependendo do sistema, é possível modificar a posição dos controlos ou a ordem de distribuição. Homogeneíze a mistura de reação com pelo menos 3 aspirações ou com um agitador de microplacas durante 5 segundos. OBSERVAÇÃO: A distribuição de amostras e controlos pode ser controlada visualmente neste passo da manipulação, existe uma diferença de coloração entre a cavidade vazia e a cavidade que contém a amostra. Dispense conjugado num prazo de 5 minutos após a distribuição de amostra. Existe uma clara diferença de coloração entre uma cavidade vazia e uma cavidade que contém a solução de conjugado vermelho (R6) (consulte 7.7) 5) Quando possível, cubra a placa com fita adesiva nova. 6) Incube a microplaca durante 30 a 35 minutos a 37 C ± 1 C. 7) Se necessário, retire a fita adesiva. Aspire o conteúdo de todas as cavidades para um recipiente de líquido evacuado e adicione, pelo menos, 370 µl de solução de lavagem em cada cavidade. Aspire novamente e repita a lavagem, no mínimo, 4 vezes (5 ciclos de lavagem efetuados no total). O volume residual deve ser inferior a 10 μl (se necessário, seque as tiras virando-as ao contrário em papel absorvente). Caso possua um sistema de lavagem automático, siga o mesmo ciclo operacional. OBSERVAÇÃO: Prossiga para o passo de lavagem num espaço de 20 minutos. 8) Prepare a solução de desenvolvimento (reagente R8 + R9). 9) Distribua rapidamente em cada cavidade 50 μl da solução de desenvolvimento (R8+R9), preparada imediatamente antes da utilização. Deixe que a reação se desenvolva no escuro durante 25 a 35 minutos à temperatura ambiente (18-30 ºC). Não aplique fita adesiva durante esta incubação. OBSERVAÇÃO: A distribuição da solução de desenvolvimento, com coloração cor-de-rosa, pode ser controlada visualmente nesta fase da manipulação. Existe uma clara diferença de coloração entre a cavidade vazia e a cavidade que contém a solução de substrato cor-de-rosa. (Consulte 7.7). [PT] 7

9 10) Adicione 50 μl da solução de paragem (R10) utilizando a mesma sequência e razão de distribuição utilizadas para a solução de substrato. Homogeneíze a mistura de reação. OBSERVAÇÃO: A distribuição da solução de paragem incolor pode ser controlada visualmente nesta fase de manuseamento. A cor do substrato, cor-de-rosa (para amostras negativas) ou azul (para amostras positivas), desvanece das cavidades, que se tornam incolores (para amostras negativas) ou amarelas (para amostras positivas) após a adição da solução de paragem. 11) Limpe cuidadosamente o fundo de cada placa. Aguarde pelo menos 4 minutos após a adição da solução de paragem e no espaço de 30 após a paragem da reação, leia a densidade ótica a 450/ nm usando um leitor de placas. 12) Verifique a conformidade entre as leituras do espectrofotómetro e as leituras visuais e compare com distribuição da placa e da amostra e o plano de identificação Controlo de qualidade Utilize os controlos negativos (R3) e positivos (R4) para cada execução, para validar os resultados dos testes. (Consulte 7.5) Critérios de validação do teste Este teste é validado se as condições abaixo forem respeitadas: 1) Para o controlo negativo R3: DO R3 0,080 Se um valor de controlo estiver acima deste valor, elimine-o e efetue o cálculo com os dois valores de controlo negativos restantes. 2) Para o controlo positivo R4: DO R4 0, Cálculo/interpretação dos resultados O corte é determinado com o controlo negativo R3: Calcule o valor de absorvância médio medido para o controlo negativo R3 e calcule o valor de corte (COV) da seguinte forma: COV = DO R3 média + 0,100 Amostras com DO inferior a COV são consideradas negativas pelo Syphilis Total Ab. Os resultados que fiquem imediatamente abaixo do valor de corte (COV -10% <DO <COV) devem, contudo, ser interpretados com cuidado. É aconselhável voltar a testar as amostras correspondentes em duplicado quando os sistemas e os procedimentos laboratoriais o permitirem. As amostras com DO superior ou igual ou a COV são consideradas positivas pelo Syphilis Total Ab e devem ser testadas novamente em duplicado antes da interpretação final. As amostras testadas novamente que se encontrem acima de COV em pelo menos um duplicado são consideradas positivas e devem ser investigadas. As amostras que se encontrem abaixo do corte em ambos os duplicados são consideradas negativas. Em caso de densidade ótica muito reduzida para amostras testadas (DO negativa) e quando a presença de amostras e de reagentes for controlada, os resultados podem ser interpretados como negativos. É recomendado que confirme as amostras positivas seguindo os algoritmos e recomendações nacionais atuais. [PT] 8

10 7.7. Verificação espetrofotométrica da amostra e pipetagem do conjugado (opcional) Amostras e controlos A presença de amostras e controlos na cavidade pode ser verificada através de leitura automática a 450/620 nm. Uma cavidade com amostra adicionada terá uma DO entre 0,050 e 1,100. Conjugado O conjugado tem coloração vermelha. A presença de conjugado nas cavidades pode ser controlada através de leitura automática a 450/620 nm. Uma cavidade com amostra e conjugado terá uma DO 1,200. Verificação da pipetagem da solução de desenvolvimento É possível verificar a presença de solução de desenvolvimento cor-de-rosa na cavidade através de leitura automática a 492 nm. Uma cavidade com solução de desenvolvimento deve ter uma densidade ótica superior >0,100 (uma DO inferior indica uma dispensa insuficiente da solução de desenvolvimento). 8. LIMITAÇÃO DO TESTE Tal como nos testes serológicos para sífilis, a interpretação de resultados obtidos com o ensaio EIA Syphilis Total Ab EIA deve ser utilizada em conjunto com os sintomas clínicos, com o histórico médico e com outras conclusões laboratoriais do paciente, para produzir um diagnóstico clínico geral. Não está disponível um único teste único nem um único padrão de referência definitivo para cada fase da doença. Assim, o diagnóstico da sífilis baseia-se essencialmente em testes serológicas, necessitando dos resultados de métodos treponémicos e de métodos não treponémicos. Nenhum teste de diagnóstico oferece total garantia de que uma amostra não contém níveis baixos de anticorpos de T. pallidum, como os que se encontram presentes numa fase muito inicial da infeção. Por esse motivo, um resultado negativo num determinado momento não exclui a possibilidade de exposição a uma infeção por sífilis. Qualquer técnica ELISA pode produzir falsas reações positivas. É recomendável verificar a especificidade da reação de qualquer amostra que se considere um positivo reproduzível, de acordo com os critérios de interpretação do kit Syphilis Total Ab, utilizando um método adequado: Teste de hemoaglutinação para Treponema pallidum. Todos os resultados de testes treponémicos tendem a permanecer reativos no seguimento da infeção treponémica, por isso não devem ser s para avaliar a resposta à terapia. Devido à persistência da reatividade, em geral, para a vida do paciente, os testes treponémicos não têm qualquer valor na determinação de recidiva ou reinfeção num paciente com um resultado reativo. Neste caso, recomenda-se que utilize outros ensaios: Syphilis IgM EIA, RPR e TPHA. O método do espectrofotómetro para verificação da amostra, a deposição da solução de desenvolvimento do conjugado não permite verificar a precisão do volume de amostras e conjugado dispensado. Este método só mostra a presença da amostra e do conjugado. A taxa de erro com este método está intimamente ligada à precisão do sistema (um coeficiente acumulado de variação de dispensa e leitura acima de 10% o que diminui de forma significativa a qualidade deste passo.) [PT] 9

11 9. CARATERÍSTICAS DE DESEMPENHO 9.1. Medição Precisa A reprodutibilidade e precisão intermédia foram determinadas utilizando amostras com diferentes concentrações de anticorpos de Sífilis. As amostras foram testadas 30 vezes durante a mesma série de testes para determinar a repetibilidade. As amostras foram também testadas em duplicado durante 20 dias a uma taxa de 2 testes por dia. As médias de rácios, os desvios padrão e os coeficientes de variação (CV) foram calculados Repetibilidade: Amostras N Média de rácios Desvio padrão CV% Negativa fraca 30 0,14 0,014 9,5% Negativa alta 30 0,68 0,051 7,5% Syphilis ab positiva fraca 30 1,90 0,070 3,7% Syphilis ab positiva 30 3,76 0,130 3,5% Os CV obtidos nas amostras positivas são inferiores a 10% Precisão intermédia Amostras N Média de rácio Reprodutibilidade Intra-análise Interanálise/operador Interdia total DP CV% DP CV% DP CV% DP CV% Negativa fraca 80 0,15 0,035 22,5% 0,023 14,7% 0,017 10,9% 0,045 29,0% Negativa alta 80 0,74 0,038 5,1% 0,074 10,0% 0,006 0,8% 0,084 11,2% Syphilis ab positiva fraca Syphilis ab positiva 80 2,30 0,112 4,9% 0,312 13,5% 0,099 4,3% 0,346 15,0% 80 4,13 0,180 4,3% 0,543 13,1% 0,195 4,7% 0,604 14,6% Os CV obtidos nas amostras positivas são iguais ou inferiores a 15% Desempenho clínico O desempenho clínico do ensaio Syphilis Total Ab foi determinado testando amostras de estudos prospetivos e retrospetivos: Estudo prospetivo: amostras de dadores de sangue aleatório; amostras de pacientes em quem havia suspeita de Sífilis Estudo retrospetivo: positivas de pacientes com DST. Os estudos foram realizados em 2 bancos de sangue, num centro para DST (Doenças Sexualmente Transmissíveis) e na Bio-Rad. [PT] 10

12 Especificidade do diagnóstico O estudo foi realizado em amostras de soro e plasma EDTA colhidas em 2 bancos de sangue em doadores aleatórios, em França. Também foi realizado um estudo de especificidade em amostras provenientes de pacientes. Todos os resultados foram comparados com os resultados obtidos com outros testes de Sífilis com marcação CE. Tabela 1: Teste de especificidade (IR = inicialmente reativa; RR= Repetitivamente reativa) População Local Tipo de amostra Número total de amostras Inicialment e reativa (IR) Repetitiva mente reativa (RR) Especificid ade de RR (%) 95% CI (%) Dadores de sangue #1 + #2 Soro SST * 3125/3125 Plasma EDTA K * 2066/2066 Total * Pacientes #3 Soro % 5191/ ,72% 350/351 99,93% - 100% 98,42 100% *Amostras repetitivamente reativas consideradas positivas com outro EIA com marcação CE Ensaio de Sífilis foi excluído do cálculo de especificidade do diagnóstico Sensibilidade do diagnóstico Estudo retrospetivo: O estudo foi realizado em 350 amostras congeladas, das quais 2 amostras foram declaradas negativas e 348 foram confirmadas positivas com ensaios de Sífilis com CE. Entre estas 348 amostras positivas, 7 amostras eram de pacientes numa fase inicial da infeção. Todas as 348 amostras foram consideradas positivas com o ensaio Syphilis Total Ab da Bio-Rad. Estudo prospetivo: Um total de 460 amostras novas foi avaliado com o ensaio Syphilis Total Ab da Bio-Rad e comparado com testes de Sífilis com marcação CE. 348 foram consideradas negativas com os testes de referência e com os testes da Bio-Rad (com duas amostras classificadas como falsos positivos com referência a testes EIA) 109 foram consideradas positivas com ambos os testes do ensaio. 3 amostras apresentaram resultados discrepantes (depois de testar novamente com o ensaio da Bio- Rad): 1 amostra positiva com o ensaio da Bio-Rad e negativa alta com os testes de referência. Esta amostra com baixa taxa de sífilis encontrava-se no valor de corte limite para ambos os testes EIA: 1 amostra positiva com testes de referência, negativa com o ensaio da Bio-Rad (de 1 paciente sem sinais) 1 amostra positiva com os testes de referência, IR negativa e positiva e novos testes com o ensaio da Bio-Rad, Estudos retrospetivos e prospetivos: A sensibilidade de diagnóstico global é igual a 99,56% (457/459) com um intervalo de confiança situado em 95% de [98,44%- 99,95%]. Sensibilidade Clínica A sensibilidade clínica também foi estudada em 3 painéis comerciais e 1 painel de seroconversão. O ensaio Syphilis Total Ab da Bio-Rad foi comparado com ensaios de sífilis com marcação CE. A deteção de cada amostra dos painéis é equivalente entre o ensaio da Bio-Rad e o ensaio de referência da sífilis. [PT] 11

13 9.3. Sensibilidade analítica A sensibilidade analítica foi avaliada em 2 normas NIBSC e calculada com o valor de corte utilizando uma regressão: 1. O limite de deteção para IgG/IgM foi avaliado em 3 lotes do ensaio Syphilis Total Ab e estimado em 0,53 miu/ml com CI 95% [0,10 miu/ml 1,30 miu/ml] utilizando a norma da OMS de IgM/IgG (código NIBSC: 05/132). 2. O limite de deteção para IgG foi avaliado em 1 lote do ensaio Syphilis Total Ab e estimado em 0,11 miu/ml com CI 95% [0,02 miu/ml 0,27 miu/ml] utilizando a norma da OMS de IgG (código NIBSC: 05/122) Especificidade analítica/estudo transversal da reatividade Foi testado um total de 125 amostras potencialmente interferentes contendo anticorpos contra agentes patogénicos que poderiam levar a doenças infeciosas (Lyme, Toxoplasmose, EBV, Leptospirose, SLE (lúpus), Anticorpo de Hepatite A, Anticorpo de Hepatite B, Anticorpo de Hepatite C, HTLV I/II e HIV), amostras de pacientes em grupos de risco (mulheres grávidas e mulheres multíparas) ou amostras de pacientes com distúrbios do sistema imunitário (fatores reumatoides) com o ensaio Syphilis Total Ab. Entre as 125 amostras testadas, 1 amostra foi considerada positiva reproduzível com o ensaio Syphilis Total Ab; esta amostra foi verificada como sendo um verdadeiro positivo com outros ensaios de confirmação e Syphilis EIA CE. A especificidade observada nesta população-alvo é igual a 100% (124/124) com um intervalo de confiança de 95% de [97,1% - 100,0%] Efeito de "hook" A existência de um possível efeito de "hook" foi estudada através do teste a 6 amostras positivas de Sífilis com elevadas titulações em diferentes diluições. A equivalência de resultados observada entre amostras não diluídas e amostras diluídas indica a ausência do efeito de "hook" nas amostras testadas. 10. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS. 1. Levinson SS. The Nature of Heterophilic Antibodies and Their Role in Immunoassay Interference. J. Clin. Immunoassay 15: , Norris S.J. Plypeptides of Treponema pallidum: Progress toward understanding their structural, functional and immunological role. Microbiological Reviews, Setpt Vol Larsen SA, Steiner BM, and Rudolph AH. Laboratory diagnosis and interpretation of tests for syphilis. Clin Microbiol Rev Jan; 8(1): Zrein M, Maure I, Boursier F, Soufflet L. Recombinant antigen-based enzyme immunoassay for screening of Treponema pallidum antibodies in blood bank routine. J Clin Microbol Mar; 33(3): Singh AE and Romanowski. Syphilis: Review with emphasis on clinical, epidemiological, and some biologic features. Clin Microbiol Rev Apr; 12(2): Stability of selected serum proteins after long-term storage in the Janus Serum Bank. Clin Chem Lab Med : International Journal of STD & AIDS 2009; 20: Screening donated Blood for Transfusion-Transmissible infections. World Health Organization M. J. Loeffelholz, and M. J. Binnicker, It Is Time to Use Treponema-Specific Antibody Screening Tests for Diagnosis of Syphilis, J Clin Microbiol, 50 (2012), 2-6. [PT] 12

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18 Bio-Rad 3, Boulevard Raymond Poincaré Marnes-la-Coquette França Tel.: +33 (0) Fax: +33 (0) / [PT] 17

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