ATIVIDADE DA ISOCITRATO-LIASE DURANTE A GERMINAÇÃO DE SEMENTES DE SOJA 1

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1 ATIVIDADE DA ISOCITRATO-LIASE DURANTE A GERMINAÇÃO DE SEMENTES DE SOJA 1 CARLOS ALBERTO O. MARTINS, CARLOS S. SEDIYAMA 3, MARIA GORETI DE A. OLIVEIRA, INÊS CHAMEL JOSÉ 5, MAURÍLIO A. MOREIRA, MÚCIO S. REIS 3 E VALTERLEY S. ROCHA 3 RESUMO - A atividade da enzima isocitrato-liase foi avaliada durante a germinação de sementes de soja (Glycine max (L.) Merrill) das cultivares e, após serem submetidas às condições de estresse, do teste de frio e do envelhecimento acelerado. As sementes submetidas aos dois testes apresentaram perfis da atividade enzimática muito semelhantes, atingindo um máximo no sexto dia de germinação, sendo mais acentuada na cultivar. Observou-se que as sementes submetidas aos testes de estresse não provocaram variações na taxa de degradação enzimática das reservas lipídicas das sementes. Esses dados indicam que a enzima é altamente estável na semente de soja, evidenciando a importância do ciclo do glioxilato para o processo germinativo. Termos de indexação: isocitrato-liase, germinação, lipídios, Glycine max (L.) Merrill.. ISOCITRATE-LYASE ACTIVITY DURING SOYBEAN SEED GERMINATION ABSTRACT - The enzyme activity (isocitrate-lyase) was evaluated during the germination of soybean seeds (Glycine max (L.) Merrill) from cultivars e, after have been submitted to stress conditions of cold test and accelerated aging. In both seed stress conditioning, the aspects presented by the enzymatic activities were very similar, reaching a maximum in the sixth day of germination, being greater in the cultivar. Different seeds stress conditioning did not affect the enzymatic degradation tax from the lipidic stock of the seeds. These data indicate that the enzyme is highly stable in soybean seeds, showing the importance of the glyoxylate cycle in the germinative process. Index terms: isocitrate-lyase, germination, lipids, Glycine max (L.) Merrill. INTRODUÇÃO As sementes de soja armazenam grande quantidade de lipídios e proteínas em seus cotilédones, os quais são usados como nutriente para a germinação, crescimento e desenvolvimento da nova plântula (Harrington, 197). Proporcionalmente, as sementes de soja armazenam % de proteínas, % de lipídios, 9% de açúcares e 15 a 1% de hemicelulose, 1 Aceito para publicação em..; suporte financeiro PADCT/FINEP para M.A.M. e BIOAGRO/UFV. Eng o. Agr o. Parte da dissertação de Mestrado em Fitotecnia (UFV); bolsista da CAPES 3 Eng os. Agr os., Ph.D., Prof. do Depto. de Fitotecnia. Licenciada e Bacharel em Química (D.S.) e Eng o. Agr o. (Ph.D.); Profs. do Depto. de Bioquímica e Biologia Molecular. 5 Técnico de Nível Superior do Núcleo de Biotecnologia Aplicada à Agropecuária (BIOAGRO)/UFV; Av. P. H. Holfs s/n o , Viçosa-MG. sendo que as proteínas, lipídios e carbohidratos compreendem cerca de 7% da matéria seca das sementes de soja (Bils & Howell, 193). Em sementes de soja, a isocitrato-liase e malato-sintase são enzimas chaves na regulação do ciclo do glioxilato e envolvidas no metabolismo de lipídios armazenados nas sementes oleaginosas, e no desenvolvimento das atividades no glioxissomos. As atividades dessas enzimas aumentam durante a germinação das sementes, obtendo-se valores máximos quando ocorre o máximo da proporção de lipídios degradados e na síntese de sacarose (Bewley & Black, 199). Neste ciclo, os lipídios insolúveis das sementes se transformam em açúcares solúveis (sacarose), os quais são facilmente deslocados para os meristemas radiculares e apicais (Cioni et al., 191). Ambas as enzimas são sintetizadas de novo após o início do processo germinativo. Neste trabalho a rota fisiológica do ciclo do glioxilato foi investigada durante a germinação de sementes de soja, Revista Brasileira de Sementes, vol., nº 1, p.-,

2 ATIVIDADE DA ISOCITRATO-LIASE NA GERMINAÇÃO DE SEMENTES DE SOJA 3 previamente submetidas às condições de estresses do teste de frio e do envelhecimento acelerado para medir a atividade da isocitrato-liase. MATERIAL E MÉTODOS No presente estudo, utilizaram-se sementes das cultivares e, provenientes do programa de melhoramento de soja da Universidade Federal de Viçosa, da safra 1993/199. Foram realizados os seguintes testes: germinação - foram semeadas sementes, divididas em quatro rolos de papel-toalha com 5 sementes cada, colocados em germinador à temperatura de 5 C e 1% de umidade relativa (Brasil, 199). O papel substrato foi previamente embebido em água deionizada em,5 vezes o peso do papel. Foram feitas duas contagens, aos cinco e aos oito dias após a semeadura; de frio - sementes, subdivididas em quatro subamostras de 5 sementes cada, foram colocadas em rolos de papel germitest, umedecido em torno,5 vezes o seu peso. Os rolos foram colocados dentro de sacos plásticos e submetidos a baixa temperatura (1±,3 C), durante sete dias (Loeffler et al., 195) e após este período, foram submetidas ao teste de germinação, como descrito anteriormente; envelhecimento acelerado - sementes foram colocadas sobre uma tela adaptada em caixa de gerbox, contendo ml de água desmineralizada. A seguir, as caixas foram lacradas e transferidas para uma estufa incubadora, por horas, à temperatura de 1 C e 1% de umidade relativa, conforme Krzyzanowski et al. (1991). Após este período foram submetidas ao teste de germinação, como descrito anteriormente; determinação do grau de umidade - as sementes foram moídas e cerca de 1g foi colocada em placas de petri e depois transferida para a estufa, previamente ajustada à temperatura de 15±3 C, onde permaneceu por 3,5 horas. A soja moída foi pesada e repetiu-se o procedimento anterior até atingir peso constante, de acordo com o procedimento descrito em Instituto Adolfo Lutz (195), sendo os dados expressos em percentagem de matéria seca; determinação da atividade da isocitrato-liase - foi determinada em cotilédones de sementes de soja após,, e dias de germinação. O extrato proteico foi obtido pela maceração de 3g de cotilédones em almofariz previamente resfriado a C, contendo 9ml de tampão fosfato,5m, ph,, MgCl,1M e -mercap-toetanol 5mM, e centrifugado a 7.g por 3 minutos. Em seguida o filtrado foi utilizado para análise, a leitura foi realizada tomando-se,1ml do sobrenadante do filtrado e adicionandose,9ml da solução substrato (contendo tampão fosfato,5m, ph,; cloreto de magnésio,1m; -mercaptoetanol,5m, fenilidrazina 3,3mM e isocitrato de sódio 1,7mM). A atividade da isocitrato-liase foi obtida pela leitura de absorbância a 3nm, em espectrofotômetro, durante 1 minutos e a 37 C (Tester, 197); determinação de proteínas - utilizou-se o método Kjeldahl, conforme recomendado pela AOAC (1975), tendo como fator de conversão nitrogênio/ proteína de,3; determinação de lipídios - foram determinados em extrator soxhlet, utilizando éter de petróleo como solvente por 1 horas, segundo o procedimento descrito em Instituto Adolfo Lutz (195). O delineamento experimental utilizado foi um fatorial x 3 x (duas cultivares, três estados de condicionamento de sementes e quatro períodos de coleta de cotilédones), em blocos cazualizados com três repetições. Foram feitas análises de variância e de regressão, para atividade específica, teores de proteínas e teores de lipídios. Utilizando o teste t com 5% e 1% de significância. RESULTADOS E DISCUSSÃO As determinações da atividade da isocitrato-liase sobre o isocitrato de sódio, em cotilédones de sementes de soja, das cultivares e, durante a germinação, estão na Figura 1A, B e C. Ocorreu aumento da atividade enzimática à partir do o dia de germinação, para ambas as variedades, nos três tratamentos. Os cotilédones das sementes de soja da cultivar submetidas ao estresse de frio e de envelhecimento acelerado apresentaram perfis da atividade enzimática muito semelhantes, onde o maior valor da atividade ocorreu no o dia de germinação (Figura 1A e B). No teste de germinação o maior valor da atividade ocorreu no o dia de germinação (Figura 1C). Na cultivar, os cotilédones de sementes de soja submetidas ao estresse de frio e ao teste de germinação, apresentaram maior atividade no o dia de germinação (Figura 1A e C), enquanto que no envelhecimento acelerado o maior valor da atividade ocorreu no o dia de germinação (Figura 1B). Os valores da atividade da isocitratoliase se apresentaram maiores na variedade quando comparados com os valores obtidos na cultivar, nos três tratamentos. Vale a pena ressaltar que as sementes da cultivar normalmente apresenta maior qualidade fisiológica, quando comparada com outras sementes de outras cultivares de soja, como as cultivares Uberaba e Rio Doce (Costa, 19). Tester (197) também observou um aumento na atividade da isocitrato-liase antes do o dia de germinação em cotilédondes de sementes de soja da cultivar Essex, tendo ainda observado um decréscimo no 1 o dia. Polanowski & Revista Brasileira de Sementes, vol., nº 1, p.-,

3 1 A 1 B 1 C Germinação (dias) FIG. 1. Atividade da isocitrato-liase em sementes de soja submetidas ao teste de frio [A] e ao envelhecimento acelerado [B] e sementes normais (C), no teste de germinação. Obendorf (1991) verificaram um gradual aumento na atividade enzimática da isocitrato-liase em cotilédones de soja do cultivar Maple após a germinação e durante o crescimento da plântula, tendo observado maiores valores da atividade no período entre o 5 o e o 11 o dia da germinação. Estes autores também detectaram atividade enzimática durante as primeiras horas de germinação, porém, a atividade não foi mais detectada após o 1 o dia de germinação. Revista Brasileira de Sementes, vol., nº 1, p.-,

4 ATIVIDADE DA ISOCITRATO-LIASE NA GERMINAÇÃO DE SEMENTES DE SOJA 5 As determinações da atividade específica, estão na Figura A, B e C. Quando os valores da atividade foram divididos pela concentração de proteína pode-se observar, com maior evidência, maiores valores da atividade na variedade em relação a. Os perfis da atividade específica da isocitrato-liase das cultivares e foram seme- Atividade 1específica (nm.s/kg) 1i Atividade 1específica (nm.s/kg) i Atividade específica (nm.s/kg) Atividade específica (nm.s/kg) Atividade específica (nm.s/kg) A Atividade específica (mm.s -1 /mg) Atividade específica (mms -1 /mg) Atividade específica (mm.s -1 /mg) Germinação (dias) FIG.. Atividade específica da isocitrato-liase em sementes de soja submetidas ao teste de frio [A] e ao envelhecimento acelerado [B] e sementes normais [C], no teste de germinação. B C Revista Brasileira de Sementes, vol., nº 1, p.-,

5 lhantes nos três tratamentos. Em ambas as cultivares, os cotilédones de sementes de soja submentidos ao estresse de frio e ao teste de germinação, apresentaram maior valor da atividade específica no o dia de germinação (Figura A e C), enquanto que no envelhecimento acelerado, o maior valor da atividade específica foi observado no o dia da germinação (Figura B). Comparando-se as Figuras 1 e, há padrões distintos entre as atividades da isocitrato-liase para ambas as cultivares, para os três testes avaliados. Os resultados demonstram que a atividade da isocitrato-liase não foi afetada pelo estresse de frio e de envelhecimento acelerado. Smith & Fites (1973) trabalharam com sementes de algodão, sensíveis a baixa temperatura e sementes de mamona, que foram tolerantes ao estresse. Foi possível detectar uma redução na atividade da isocitrato-liase em sementes de algodão, o que não foi encontrado nas sementes de mamona, quando foram previamente submetidas ao teste de frio. No entanto, a isocitrato-liase e malato-sintase são enzimas chaves na regulação do ciclo do glioxilato e envolvidas no metabolismo de lipídios armazenados nas sementes oleaginosas. As atividades dessas enzimas aumentam durante a germinação das sementes, obtendo-se valores máximos quando ocorre o máximo de lipídios degradados que são convertidos em sacarose (Bewley & Black, 199). Através da determinação de lipídios foi observado que houve diminuição da concentração de lipídios nas duas cultivares e a concentração de lipídios foi maior na cultivar do que na cultivar. CONCLUSÕES Pode-se determinar a atividade da isocitrato-liase, em cotilédones, durante a germinação de sementes de soja previamente submetidas ao estresse de frio ou de envelhecimento acelerado. Este fato mostra que ocorreu consumo de lipídios durante o processo germinativo. Além disso, mostra que a enzima é estável em sementes de soja, participando do ciclo do glioxilato e auxiliando o processo de germinação das sementes, respondendo à condições de estresse de frio e de envelhecimento acelerado, através do aumento da atividade enzimática. REFERÊNCIAS AOAC - ASSOCIATION OF OFFICIAL ANALYTICAL CHEMISTS. Official methods of analysis. Washington, p. BEWLEY, J.D. & BLACK, M. Seeds physiology of development and germination. New York: Plenum Press, p. BILS, R.F. & HOWELL, R.W. Biochemical and cytological changes in developing soybean cotyledons. Crop Science, Madison, v.3, n., p.3-3, 193. BRASIL. Ministério da Agricultura e Reforma Agrária. Regras para análise de sementes. Brasília, SNDA/DNDV/CLAV, p. CIONI, M.; PINZAUTI, G. & VANNI, P. Comparative biochemistry of the glyoxylate cycle. Comparative Biochemestry and Physiology, Oxford, v.7, n.1, p.1-, 191. COSTA, A.F.S. Avaliação da qualidade fisiológica das sementes de genótipos de soja (Glycine max (L.) Merrill), produzidas em cinco localidades de Estado de Minas Gerais. Viçosa: UFV, p. (Dissertação Mestrado). HARRINGTON, J.F. Seed storage and longevity. In: KOZLOWSKI, T.T. (ed.). Seed biology. New York: Academic Press, 197. p KRYZANOWSKI, F.C., FRANÇA-NETO, J.B. & HENNING, A.S. Relato dos testes de vigor disponíveis para grandes culturas. Informativo ABRATES, Londrina, v1, n., p.15-5, LOEFFLER, N.L.; MEIER, J.L. & BURRIS, J.S. Comparison of two cold test procedures for use in maize drying studies. Seed Science and Technology, Wageningen, v.13, n.3, p.53-5, 195. INSTITUTO ADOLFO LUTZ. Normas analíticas do Instituto Adolfo Lutz: métodos químicos e físicos para análise de alimentos. 3.ed. São Paulo, p. POLANOWSKI, A.J. & OBENDORF, R.L. Soybean isocitrate lyase: purification, properties, immunoassays and N-Terminal sequence. Plant Physiology and Biochemistry, Cambridge, v.9, n., p , SMITH, E.W. & FITES, R.C. The influence of chilling temperature alteration of glyoxysomal succinate levels on isocitratase activity from germinating seedlings. Biochemistry and Biophysics Research Communication, New York, v.55, n.3, p.7-5, TESTER, C.F. Control of the formation of isocitrate lyase in soybean cotyledons. Plant Science Letters, Amsterdam, v., n., p , 197.!"!"! Revista Brasileira de Sementes, vol., nº 1, p.-,