UNIVERSIDADE DE MOGI DAS CRUZES LUCI AVEIRO CRIVELLARO. SÍNTESE E CARACTERIZAÇÃO ESTRUTURAL DE CITOCROMO c MODIFICADO COM UMA 4-AMINO-1,8-NAFTALIMIDA

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1 UNIVERSIDADE DE MGI DAS CRUZES LUCI AVEIR CRIVELLAR SÍNTESE E CARACTERIZAÇÃ ESTRUTURAL DE CITCRM c MDIFICAD CM UMA 4-AMIN-1,8-NAFTALIMIDA Mogi das Cruzes, SP 2007

2 Livros Grátis Milhares de livros grátis para download.

3 UNIVERSIDADE DE MGI DAS CRUZES LUCI AVEIR CRIVELLAR SÍNTESE E CARACTERIZAÇÃ ESTRUTURAL DE CITCRM c MDIFICAD CM UMA 4-AMIN-1,8-NAFTALIMIDA Dissertação apresentada ao mestrado em Biotecnologia da Universidade de Mogi das Cruzes, como parte dos requisitos para obtenção do título de Mestre em Biotecnologia. Área de Concentração: Ciências Biológicas rientador: Prof. Dr. Sergio Brochsztain Co-rientadora: Profª Drª. Iseli Lourenço Nantes Mogi das Cruzes, SP 2007

4 FINANCIAMENT: FAEP UMC - Fundação de Amparo ao Ensino e Pesquisa da Universidade de Mogi das Cruzes. Secretaria da Educação do Governo do Estado de São Paulo

5 FICHA CATALGRÁFICA Universidade de Mogi das Cruzes - Biblioteca Central Crivellaro, Luci Aveiro Síntese e caracterização estrutural de citocromo c com uma 4-AMIN-1,8-NAFTALIMIDA / Luci Aveiro Crivellaro f. Dissertação (Mestrado em Biotecnologia) - Universidade de Mogi das Cruzes, 2007 Área de concentração: Ciências Biológicas rientador: Prof. Dr. Sergio Brochsztain 1. Citocromo c 2. Imidazol 3. Fluorescência I. Título II. Brochsztain, Sergio CDD 572.6

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7 LUCI AVEIR CRIVELLAR SÍNTESE E CARACTERIZAÇÃ ESTRUTURAL DE CITCRM c MDIFICAD CM UMA 4-AMIN-1,8-NAFTALIMIDA 2007

8 DEDICATÓRIA Dedico este trabalho aos meus pais, os responsáveis diretos pelo meu sucesso, devido ao amor incondicional e aos valores morais incutidos desde sempre e ao meu filho, Renato, a verdadeira razão de minha vida.

9 AGRADECIMENTS Agradecer é uma tarefa difícil quando se trata de citar todos aqueles que colaboraram para que eu pudesse realizar este trabalho. Inicialmente agradeço a compreensão, dedicação e companheirismo do meu eterno amigo Rinaldo por todas as horas difíceis que juntos passamos, sempre me apoiando de maneira tão generosa. As minhas irmãs e amigas Virgínia e Valéria por tudo que fizeram por mim e pelo meu filho durante esta fase de mil necessidades diferentes e de momentos difíceis. Aos meus amigos do CIIB que das mais variadas formas colaboraram para o sucesso do meu trabalho. A Kátia, a Daniela, Cíntia e Tatiana que dispuseram muitas vezes do seu tempo para me ajudar, agradeço de coração por tudo que aprendi com vocês. Rodrigo, Vanessa, Rafael, Fabiane, Barbara, Felipe, Fabrício, Carolina, Juliana Conrado, Priscila, Juliana Mafra, Juliana Casares, Gabriel e Débora pelo carinho e atenção. Aos meus orientadores Prof Sergio e Profª Iseli que me deram a oportunidade de desenvolver minhas habilidades, pela atenção e estímulo necessários em um trabalho como este. Ao Profº Ivarne Tersariol pela oportunidade de aprimorar meu trabalho e de ter acreditado no meu potencial. Aos demais pesquisadores, Profº Caíres, Profº Thiago, Profº Flávio e Profª Claudia pela atenção e por tudo que aprendi durante este período. Agradeço também as supervisoras Izabel e Denise da Diretoria de Ensino de Mauá pela atenção, carinho e paciência em todos os momentos. Aos colegas do E.E. Dom José Gaspar, especialmente a Gisele, Daniela, Silvana, Suzemar, Leonor, Tereza e a equipe gestora: Fátima, Ivete e Vilma pelo carinho e atenção, ouvindo minhas histórias, colaborando de todas as maneiras, me apoiando e incentivando. Ao apoio financeiro da FAEP - UMC e da Secretaria da Educação do Estado de São Paulo.

10 RESUM Citocromo c é uma hemoproteina envolvida em eventos importantes da célula: a cadeia respiratória e a apoptose. No processo de apoptose o citocromo c liberta-se do interior da membrana mitocondrial e alcança o citosol, mas, devido à proteína não ser fluorescente, há dificuldade em seguir seu tráfego interno na célula através de técnicas microscópicas de fluorescência. objetivo do presente trabalho é o de acoplar o composto fluorescente 4-amino- 1,8-naftalimida (4-ANI) covalentemente ao citocromo c de maneira que se possa monitorar o fluxo da proteína durante o processo de apoptose. Realizou-se dois métodos para a inserção do fluoróforo: (i) incubação da proteína com carbodiimida (EDAC) como agente acoplador (ii) usando o anidrido, precursor da 4-ANI, em imidazol fundido. sucesso das reações de inserção foram monitoradas por espectrometria UV/vis, dicroísmo circular, cromatografia de camada delgada (TLC) e espectrometria de massas (MALDI-ToFF). método com imidazol fundido foi o mais eficiente para modificar o citocromo c. citocromo c modificado não exibiu alterações significativas estruturais em seu grupo heme e, portanto deve manter algumas propriedades biológicas. Entretanto, foi observado que o grupo heme promove uma significativa supressão de fluorescência da imida. Estes resultados sugerem o uso desta proteína fluorescente modificada para os estudos de ligação em membrana e talvez para monitorar o trânsito do citocromo c na célula. Palavras-chave: citocromo c, imidazol, fluorescência.

11 ABSTRACT Horse heart cytochrome c (cyt c) is a hemoprotein involved in two important cell events: the respiratory chain and the apoptosis. In the apoptosis process cyt c detaches from the inner mitochondrial membrane and attains the cytosol, but, because the protein is not fluorescent, it is difficult to follow its traffic inside the cells by fluorescence microscopy techniques. Therefore, the aim of the present work is to attach fluorescent 4-amino-1,8-naphthalimides (ANI) to the cyt c structure in a manner that preserves its native conformation. Coupling of the precursor 4-amino- 1,8-naphthalic anhydride with cyt c was attempted by using three techniques: (i) incubation of the protein with the anhydride in molten imidazole; (ii) sonication of the mixture in water; (iii) using a carbodiimide (EDAC) as coupling agent. According to fluorescence spectrophotometric, chromatographic and mass spectrometric analysis, the use of molten imidazole was the most efficient method to modify cyt c. ANI-modified cyt c did not exhibit significant structural alterations and potentially should maintain some biological properties. However, significant quenching of the attached imide fluorescence by the heme group was observed. The quenching intensity was attenuated by the association of the protein with membranes. These results point to the use of this modified fluorescent protein as a probe for membrane binding studies and perhaps for monitoring cell traffic. Key-words: cytochrome c, imidazole, fluorescent.

12 LISTA DE ILUSTRAÇÕES Figura 1 Representação esquemática de uma mitocôndria Figura 2 Estrutura do citocromo c de coração de cavalo destacando os 18 resíduos de lisina e o grupo heme Figura 3 grupo Representação heme... dos.... diferentes estados de... spin.... dos... íons.... Fe e.. Fe do citocromo c resultantes da interação com lipossomos modelos..... Figura Espectros de.. absorção do.. citocromo c. em suas formas alto spin 21 e baixo spin Figura 5 Respiração aeróbia a partir da glicose Figura 6 Reações envolvidas no transporte de elétrons na cadeia 23 respiratória Figura 7 Cadeia respiratória Figura 8 Seqüência de eventos envolvidos no processo apoptótico Figura 9 Mecanismo proposto para a reação entre citocromo c e DPAA. 29 Figura 10 Estruturas de imidas aromáticas relevantes Figura 11 Reação geral de obtenção de imidas aromáticas Figura 12 Mecanismo geral de formação de imidas Figura 13 Estrutura das 1,8 naftalimidas Figura 14 Espectros de absorção e de emissão de 4-bromo-N-(2- fosfonoetil)- 1,8-naftalimida (BNIP) e da 4-amino-N-(2-fosfonoetil)-1,8- naftalimida (ANIP) em acetonitrila e suas respectivas estruturas Figura 15 Transição do tipo CT intramolecular nas 4-ANI Figura 16 Preparação do derivado Ru(bpy)2(dcbpy)-citocromo c Figura 17 Estrutura da fluoresceína Figura 18 Estrutura do corante Lúcifer Figura 19 Preparação da 4-amino-N-carboetoxi-1,8-naftalimida (4-48 ANI-GLI) Figura 20A Espectro de 1H-RMN da 4-ANI-GLI em DMS-d Figura 20B Ampliação da região dos prótons aromáticos do espectro da 49 Fig. 20A Figura 20C Espectro de 1H-RMN do imidazol Figura 21 Espectros de absorção UV/vis da 4-ANI-GLI Figura 22 Espectros de absorção da 4-ANI-GLI em diferentes ph Figura 23 Espectros de emissão da 4-ANI-GLI Figura 24 Espectros de emissão da 4-ANI-GLI em diferentes ph Figura 25 Estados de protonação da 4-ANI-GLI em água Figura 26 Mecanismo de reação entre o citocromo c e a 4-ANI-GLI por 56 acoplamento com EDAC

13 Figura 27 Espectro de absorção UV/vis do CIT-ANI-GLI Figura 28 Reação entre citocromo c nativo e anidrido 4-amino-1,8- naftálico em presença de imidazol fundido Figura 29 Resultados de cromatografia em camada delgada em sílica gel de citocromo c Figura 30 Espectros UV/vis registrados para determinação da 62 concentração do CIT-ANI em solução aquosa, após diálise Figura 31 Espectros UV/vis, normalizados, do citocromo c nativo e do citocromo c tratado com imidazol fundido Figura 32 Espectros de emissão do CIT-ANI-7 e da 4-ANI-GLI Figura 33A Efeito do citocromo c no espectro de emissão da 4-ANI- GLI Figura 33B Gráfico de Stern-Volmer para a supressão de emissão da 4- ANI-GLI pelo citocromo c Figura 34 Espectros de IR (infravermelho) em ATR Figura 35 Espectros no visível por CD de citocromo c em imidazol Figura 36 Espectros por CD em alfa-hélice de citocromo c nativo Figura 37 Espectro de massa MALDI ToF CIT-ANI Figura 38 Perfil eletroforético do citocromo c modificado (CIT-ANI) Figura 39 Decurso da reação entre citocromo c 4µM (nativo e modificado) em tampão fosfato de sódio 25mM ph7 com adição de DPAA 0,2 mm em etanol Figura 40 Decurso da reação entre citocromo c 4µM (nativo e modificado) em tampão hidróxido de amônio ph10 com adição de DPAA 0,2 mm em etanol Figura 41 Decurso da reação entre citocromo c 4µM (nativo e modificado) em tampão fosfato de sódio 25 mm ph7,4 com adição de t- BuH 2 mm Figura 42 Decurso da reação entre citocromo c 4µM (nativo e modificado) em tampão fosfato de sódio 25 mm ph10 com adição de t- BuH 2 mm

14 LISTA DE TABELAS Tabela 1 Rendimento quântico de fluorescência de 1,8-naftalimidas com diferentes substituintes Tabela 2 - Dados espectrais para a 4-ANI-GLI em solventes de diferentes polaridades...52 Tabela 3 Rendimento quântico de fluorescência, λ max abs, λ max em e absortividade molar da 4- ANI-GLI em diferentes phs Tabela 4 - Descrição sumarizada das condições empregadas na síntese pelo método por acoplamento com EDAC... 56

15 LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS 1H-RMN 4-ANI 4-ANI-GLI AAN ADP ANIP ATP BNIP Cit c CIT-ANI CIT-ANI-7 CN - Co-Q redutase DMF DMS DNA DPAA EDAC FADH 2 Fe 2+ Fe 3+ HRP Lys MAA MB N 3 - NAD + NADH Pi t-buh UV/vis ressonância magnético nuclear de hidrogênio 4-amino-1,8-naftalimidas 4-amino-N-carboetoxi-1,8-naftalimida anidrido 4-amino-1,8-naftálico adenosina difosfato 4-amino-N-(2-fosfonoetil)-1,8-naftalimida Adenosina trifosfato 4-bromo-N-(2-fosfonoetil)-1,8-naftalimida Citocromo c citocromo c modificado equimolar citocromo c modificado com excesso de AAN Cianeto coenzima Q redutase dimetilformamida dimetilsulfóxido ácido desoxirribonucléico difenilacetaldeído N-(3-dimetilaminopropil)-N-etilcarbodiimida flavina adenina dinucleotídeo cátion ferro II cátion ferro III hidroperoxidase Lisina 3-metilacetoacetona azul de metileno Nitreto cátion nicotinamida adenina nicotinamida adenina dinucleotídeo fosfato inorgânico t-butilhidroperóxido espectroscopia ultravioleta e vísivel

16 LISTA DE SÍMBLS kda quilo Dalton Eº Gº abs λ max em λ max Φ F ε máx Et(30) R f variação de potencial padrão de redução variação de energia livre padrão comprimento de onda máximo de absorção comprimento de onda máximo de emissão rendimento quântico de fluorescência coeficiente de absortividade molar máximo parâmetro empírico de polaridade fator de referência µm micromolar K sv constante de Stern-Volmer

17 absorbânci a comprim entodeonda(nm) SUMÁRI 1. Apresentação Introdução Citocromos Citocromos c Imidas Aromáticas Modificadores fluorescentes de proteínas bjetivos Método Materiais Equipamentos Preparação do citocromo c modificado com imida aromática Resultados e discussão Síntese da 4-ANI-GLI Acoplamento do citocromo c com a 4-ANI-GLI Síntese do CIT-ANI pelo método de imidazol fundido Conclusões e Sugestões Referências

18 1 APRESENTAÇÃ A presente pesquisa destina-se a examinar diferentes métodos de preparação de citocromo c fluorescente bem como caracteriza-lo. Através deste estudo são descritos vários experimentos realizados para atingir tal objetivo, com a perspectiva de acoplar o composto fluorescente 4-amino-1,8-naftalimida covalentemente ao citocromo c, uma vez que se acredita na possibilidade do uso da referida proteína fluorescente para acompanhar o processo de apoptose celular.

19 15 2 INTRDUÇÃ s citocromos, moléculas cuja função foi elucidada em 1924 por David Keilin (KEILIN, 1966; SCTT,1996), são proteínas com atividade redox presentes em todos os organismos, exceto em poucos tipos de anaeróbios obrigatórios. Essas proteínas contêm grupos heme que alternam entre seus estados de oxidação Fe 2+ e Fe 3+ durante o transporte de elétrons. Dentre eles destacamos o citocromo c, o qual desde a sua descoberta muito tem sido estudado a respeito de sua estrutura e função, principalmente por se tratar de uma biomolécula importante na cadeia respiratória. Por ser também uma proteína estável, hidrossolúvel, fácil de manipular e um componente importante do sistema de transporte mitocondrial de elétrons, utilizamos neste projeto o citocromo c de coração de cavalo (SCTT,1996). 2.1 Citocromos s citocromos são proteínas que se localizam na membrana interna da mitocôndria e apresentam como característica uma intensa absorção da luz visível devido a seus grupos prostéticos heme que contêm ferro. As mitocôndrias contêm três classes de citocromos designados por a, b e c, que podem ser distinguidos pelas diferentes estruturas dos grupos heme, com conseqüentes alterações nos espectros de absorção de luz. s grupos heme dos citocromos a e b estão ligados às suas proteínas associadas de forma não-covalente. s grupos heme dos citocromos do tipo c, por outro lado, estão ligados covalentemente por meio de resíduos de cisteína (SCTT,1996). 2.2 Citocromos c A partir dos dados obtidos com o sequenciamento de aminoácidos do citocromo c foram definidas quatro classes dessa molécula: classe I, citocromo c mitocondrial, possui geralmente baixo-spin em sua forma oxidada, tem resíduos de histidina e metionina coordenados com o grupo heme, o

20 16 qual é único e está ligado próximo ao grupo N-terminal. A metionina é o sexto ligante e encontra-se próxima ao C-terminal. Atualmente, são conhecidos dezesseis subtipos dessa molécula; classe II, citocromo c bacteriano, são alto-spin, havendo somente a histidina coordenada ao heme, ou baixo-spin, onde aparece também a metionina coordenada ao heme próxima ao N-terminal; classe III, citocromos c que apresentam múltiplos grupos heme (três grupos em média) em sua estrutura, relacionados cada um com 30 a 40 aminoácidos e coordenação com múltiplas histidinas; classe IV, podem ter de um a quatro grupos heme, são grandes, ligados a cadeias polipeptídicas que podem variar de 20 a 35 kda (SCTT,1996) Estrutura do citocromo c mitocondrial A mitocôndria é responsável por processar e converter oxigênio e glicose em energia, sob a forma de ATP (adenosina trifosfato). As mitocôndrias são constituídas de uma membrana externa lisa e de uma membrana interna extensamente invaginada conforme pode ser observado na Figura 1. Membrana Interna Membrana Externa Cristas Matriz Figura 1 - Representação esquemática de uma mitocôndria.

21 17 citocromo c de coração de cavalo é uma proteína hidrossolúvel fortemente catiônica, com ponto isoelétrico 10. Está localizado na parte externa da membrana interna da mitocôndria, é uma hemoproteína composta de 104 aminoácidos que apresenta o grupo heme ligado covalentemente à proteína por meio de ligações tioéter de dois resíduos de cisteína (Figura 2) (BRAUTIGAN, 1978). s resíduos positivamente carregados do citocromo c são predominantemente lisinas (Lys), compreendendo 18% do total de resíduos, além de duas argininas e três histidinas. Vários resíduos de Lys invariáveis no citocromo c localizam-se na forma de anel ao redor da extremidade exposta do grupo heme (Figura 2A). Esses resíduos constituem um sítio de ligação identificado por meio de um tratamento do citocromo c com anidrido acético (que acetila os resíduos de Lys do citocromo c) (SCTT,1996). A estrutura secundária do citocromo c, determinada por análise de difração de raio-x, apresenta três α-hélices maiores e duas menores que correspondem a cerca de 40% do polipeptídeo. Suas α-hélices estão interligadas pela porção de cadeias polipeptídicas. Estas contem curvaturas, voltas, segmentos estendidos ou enrolados irregularmente, que envolvem o grupo heme em um arranjo esférico (SCTT, 1996). Estudos demonstram que o número e a natureza dos ligantes coordenados ao átomo de ferro central, o tipo de ligação entre o heme e a proteína, a geometria do complexo e a natureza dos aminoácidos presentes nas cadeias circunvizinhas ao sítio ativo são aspectos de grande relevância para a compreensão da estrutura e das funções de uma hemoproteína e de suas propriedades redox. ferro hemínico oxidado no citocromo c está octaedricamente coordenado com quatro átomos de nitrogênio do anel tetrapirrólico da porfirina, estando a 5ª e a 6ª posições ocupadas pelo resíduo de metionina 80 e de histidina 18, respectivamente, na cadeia da proteína (Figura 2B) (SCHEJTER, 1988 SHERFF,1980).

22 18 A B Met 80 S N+ N Fe + N N N N His 18 C Figura 2 Estrutura do citocromo c de coração de cavalo destacando os resíduos de lisina e o grupo HEME. A: Estrutura secundária destacando sítio A (Lys 72 e Lys 73) e sítio L (Lys 22, Lys 25 e Lys 27); B: HEME anel pirrólico com os 5º e 6º ligantes coordenados com o átomo de ferro; C: HEME evidenciando as ligações tioéter nos resíduos de Cisteína 14 e 16.

23 19 enxofre da metionina 80 e o nitrogênio da histidina 18 formam ligações do tipo ligantes fortes e mantêm o heme em um estado de baixo spin quando na forma oxidada (Fe 3+ ). Entretanto, a sexta coordenação, em razão de não ser muito estável, pode ser quebrada facilmente pelo aumento de ph ou da temperatura, ou pode ter seu enxofre substituído por ligantes aniônicos como CN -, N - 3 ou ainda pelo imidazol. A ruptura desta ligação promove a transição do estado de spin do átomo de ferro hemínico do citocromo c, de baixo spin para alto spin. estado de alto spin favorece a atividade peroxidásica do citocromo c em reações que geram radicais do tipo peroxil, alcoxil e alquil, os quais possuem potencial para propagar danos biológicos, exercendo papel importante no estresse oxidativo, além de expor o grupo heme, fato este que também facilita o processo de transporte de elétrons (LIU, 1996; BANCI, 2001; MILLER, 1978; MRE, 1980) Citocromo c mitocondrial e seus diferentes estados de spin A mecânica quântica considera que o elétron apresenta tanto características de partícula como de onda. De acordo com o princípio de Pauling, cada orbital pode conter um ou dois elétrons, que possuem spins (rotações de partículas) opostos. comportamento magnético da matéria é conseqüência do conjunto de seus spins eletrônicos. Se elétrons estiverem submetidos a um campo magnético, seus spins tornam-se alinhados. citocromo c no seu estado férrico (Fe 3+ ) ou ferroso (Fe 2+ ) apresenta orbitais com a configuração 3d 5 e 3d 6, respectivamente, estando seus elétrons distribuídos conforme representado na Figura 3. A interação do ferro hemínico do citocromo c com seus ligantes promove a redistribuição eletrônica e o desdobramento de seus orbitais d, possibilitando a existência da forma baixo e alto spin, 1/2 e 5/2, respectivamente, para o ferricitocromo c (Fe 3+ ). Conforme pode ser visto na Figura 3, tanto a forma baixo spin como a forma alto spin apresentam número ímpar de elétrons com spins desemparelhados. Porém, no ferrocitocromo c (Fe 2+ ), como existem seis elétrons para serem distribuídos nos orbitais d, tanto na forma alto como baixo spin, não há número ímpar de elétrons com spins desemparelhados (ZUCCHI,2001).

24 20 Spin alto Spin Intermediário Spin Baixo S=5/2 S=3/2 S=1/2 5 elétrons 3d-Fe 3+ S=2 S=1 S=0 6 elétrons 3d-Fe 2+ Figura 3 Representação dos diferentes estados de spin dos íons Fe 2+ e Fe 3+ do citocromo c resultantes da interação com lipossomos modelos (ZUCCHI, 2001). A Figura 4 mostra os espectros de absorção do citocromo c em suas formas alto e baixo spin, oxidado e reduzido, com bandas características. Uma metaloproteína, como o citocromo c, por exemplo, apresenta duas transições eletrônicas em seu espectro de absorção: a banda Q, na região entre 550 e 600 nm (baixa intensidade) e a banda Soret, entre 380 e 450 nm (alta intensidade). Alterações neste espectro podem revelar mudanças na estrutura da proteína devido a sua interação com o ambiente (SCTT, 1996).

25 21 xidado xidado Reduzido Reduzido Figura 4 Espectros de absorção UV/vis do citocromo c em suas formas alto spin (a) e baixo spin (b). espectro de absorção do citocromo c oxidado e reduzido na forma alto spin (a) mostrando banda evidente de absorbância em torno de 550 nm enquanto que a baixo spin (b) mostra duas bandas ao redor de 525 nm e 556 nm (ZUCCHI, 2001) Funções fisiológicas do citocromo c citocromo c faz parte do transporte de elétrons da cadeia respiratória, na superfície externa da membrana mitocondrial interna. utras funções do citocromo c referem-se à sua participação na apoptose celular e atividade oxidase/peroxidase sobre vários substratos, incluindo t-butilhidroperóxido (t-buh), difenilacetaldeído (DPAA) e 3-metilacetoacetona (MAA) (NANTES,2001) Citocromo c e a cadeia respiratória A respiração celular compreende três etapas básicas: glicólise, ciclo de Krebs e cadeia respiratória (também chamada de cadeia de transporte de elétrons). A Figura 5 mostra a seqüência dos processos envolvidos na respiração celular, tanto na fase anaeróbia, que ocorre no

26 22 citosol,quanto na fase aeróbia, na mitocôndria, organela que contem o citocromo c (LEHNINGER,2006; MARZCC, 1999; VET, 1995). A cadeia respiratória consiste num sistema de transferência de elétrons provenientes dos transportadores NADH (nicotinamida adenina dinucleotídeo) e FADH 2 (flavina adenina dinucleotídeo) até a molécula de oxigênio. Também designada cadeia de transporte de elétrons, é formada por um conjunto de proteínas denominadas citocromos. Esse conjunto de carregadores de elétrons, está disposto linearmente na membrana interna da mitocôndria. processo de transporte de elétrons tem início quando os elétrons do NADH são transferidos para a primeira molécula da cadeia, a coenzima CoQ-redutase. Nessa etapa, o íon H + (próton hidrogênio) é liberado para a matriz mitocondrial e o NAD + torna-se apto para receber mais elétrons e íons H + do ciclo de Krebs. Figura 5 - Respiração aeróbia a partir da glicose (UFMT, 2006).

27 23 s elétrons provenientes do NADH são transferidos de um complexo proteico para outro da cadeia respiratória. Durante esse fluxo de elétrons, ocorre transferência de íons H + dispersos na matriz, para o espaço inter membranas, gerando um gradiente de concentração. Esse mecanismo de bombeamento de H +, acoplado a um sistema de transferência de elétrons, é denominado quimiosmose, fenômeno também presente na fotossíntese. Esse gradiente de concentração que se estabelece, no espaço intermembranas, é uma forma de armazenar energia, pois os íons H + tendem a voltar para a matriz, onde sua concentração é menor. processo denominado fosforilação oxidativa refere-se a passagem dos íons H + através do complexo da enzima ATP sintase, determinando a formação de ATP a partir de adenosina difosfato (ADP) e fosfato inorgânico (Pi). oxigênio só participa na etapa final da cadeia respiratória, em que desempenha a função de aceptor final de elétrons e dos íons H + presentes na matriz mitocondrial, formando moléculas de água. No caso de não haver oxigênio disponível, não há retirada dos elétrons da cadeia e, portanto, os citocromos permanecem com os elétrons, o bombeamento de elétrons cessa e o processo é interrompido. A Figura 6 mostra, com mais detalhes, a série de complexos protéicos contendo centros redox com afinidade progressiva por elétrons, ou seja, com aumento do potencial de redução padrão, promovendo a oxidação do NADH e FADH 2. s elétrons são passados através dessa cadeia, do menor ao maior potencial de redução padrão. s elétrons são carregados do Complexo I e do Complexo II para o Complexo III pela coenzima Q (CoQ ou ubiquinona) e do Complexo III para o Complexo IV pelo citocromo c. Complexo I: NADH + CoQ(oxidada) NAD + + CoQ(reduzida) Eº = 0,360 v Gº = -69,5 kj.mol -1 Complexo II: FADH 2 + CoQ (oxidada) FAD + CoQ (reduzida) Eº = 0,085 v Gº = - 16,4 kj.mol -1 Complexo III: CoQ(reduzida) + cit c(oxidado) CoQ(oxidada) + cit c(reduzido) Eº = 0,190 v Gº = -367,5 kj.mol -1 Complexo IV: cit c(reduzido) + ½ 2 cit c(oxidado) + H 2 Eº = 0,580 v Gº = -112 kj.mol -1 Figura 6 Reações envolvidas no transporte de elétrons na cadeia respiratória, os respectivos potenciais padrão de redução de cada espécie ( Eº ) e os valores de energia livre de Gibbs ( Gº ) (VET,1995).

28 24 Complexo I catalisa a oxidação de NADH pela CoQ, enquanto que o Complexo II catalisa a oxidação de FADH 2 pela CoQ. Complexo III catalisa a oxidação da CoQ(reduzida) pelo citocromo c (cit c), que transfere elétrons para o Complexo IV que catalisa a oxidação do citocromo c reduzido pelo 2, o aceptor terminal de elétrons do processo de transporte de elétrons. Conforme um par de elétrons atravessa, sucessivamente, os Complexos I, III e IV, é liberada energia livre suficiente em cada uma das etapas para gerar a síntese de uma molécula de ATP (Figura 7). A reação redox do Complexo II, não libera energia livre suficiente para sintetizar o ATP; ela serve somente para injetar os elétrons a partir do FADH 2 na cadeia de transporte de elétrons (LEHNINGER, 2006; VET, 1995). Figura 7 - Cadeia respiratória : CoQ coenzima Q(círculo lilás) e citocromo c(círculo vermelho) (VET,1995). A síntese endergônica de ATP a partir de ADP e Pi na mitocôndria, é catalisada por uma ATP-sintase (também conhecida como Complexo V), dirigida pelo processo de transporte de elétrons. A energia livre do transporte de elétrons, através dos Complexos I ao IV (Figura 7), deve ser conservada em uma forma que a ATP-sintase possa utilizá-la, chamada de energia de acoplamento (VET,1995).

29 Citocromo c e apoptose A apoptose é definida como morte celular programada ocorrida sem reação inflamatória. A apoptose é uma forma de morte celular ativa, necessária tanto para processos que envolvem desenvolvimento de órgãos, como por exemplo, no controle de diferenciação de tecidos (na formação das fendas interdigitais nos membros superiores e regressão do timo no ser humano) quanto para destruir células que representem uma ameaça à integridade do organismo (RIBEIR, 2004). A apoptose é um processo fisiológico no desenvolvimento de animais e plantas, sendo tão importante quanto o processo de mitose, pois garante indivíduos com quantidade e qualidade celular para a manutenção da vida. Por ser um processo ativo, a apoptose é caracterizada por uma seqüência bem definida e repetitiva de alterações morfológicas, que envolvem núcleo, citoplasma e membrana plasmática, assim produzem como resultados contração da célula, drástica reorganização nuclear e fragmentação celular. As células apoptóticas aglomeram-se perdendo contato com as células vizinhas. A morfologia do processo apoptótico inclui diminuição do tamanho celular e condensação da cromatina no núcleo, permanecendo preservadas as membranas e as endomembranas. Nesta fase do processo, não é possível corá-las com Azul de Tripan em um procedimento de contagem de células, porque este só cora células mortas, ou seja, aquelas cujas membranas tenham sido alteradas. A apoptose é iniciada através da depleção de um fator de crescimento, pela interação de citocinas ou outros ligantes com receptores de superfície da célula. Entretanto, células danificadas por substâncias químicas, radiação, calor ou outras tensões também podem ativar apoptose (LEINICK,2001). Estudos apontam o citocromo c como uma proteína envolvida na iniciação da apoptose por ativar caspases, sendo sua liberação para o citosol um passo importante nesta ativação. No citosol o citocromo c liga-se a proteína Apaf-1 (proteína adaptadora), a qual se liga a procaspase 9, ativando-a. complexo chamado apoptossomo [citocromo c, Apaf-1, caspase 9 e ATP] depende de energia para ser formado, e irá se agregar no citosol. Desta maneira, a caspase cliva e ativa outras caspases. Essa ativação seqüencial de uma caspase por outra, cria uma cascata de atividade

30 26 proteolítica, que leva à digestão de proteínas estruturais no citoplasma com degradação do DNA cromossomal e morte da célula (SKULACHEV, 1998). A Figura 8 mostra a seqüência de eventos envolvidos no processo apoptótico. Há vários fatores que levam à liberação do citocromo c para o citosol: sobrecarga intramitocondrial de Ca 2+ (induzindo a abertura de um poro na parte interna, contribuindo para a dissipação do potencial elétrico da membrana e do inchamento mitocondrial); radiação ultravioleta e substâncias oxidantes (CAI, 1998). A iniciação do processo apoptótico sugere ser dependente de passos de ativação e inibição gênica, com efeito, em cascata, que resulta no balanço intracelular entre fatores letais e de sobrevivência. A existência de mecanismos, tanto inibidores como ativadores da apoptose, levam a crer que todas as células possuam uma capacidade intrínseca para sofrer tal processo. s primeiros reguladores de apoptose descritos, foram revelados por análises genéticas e pertencem a uma família de proteínas chamadas Bcl-2. Assim, em células não apoptóticas, as membranas externas das mitocôndrias expressam em sua superfície as proteínas Bcl-2 e Bcl-X (antiapoptóticas). Estas proteínas são importantes para manutenção da fisiologia mitocondrial, porque estão envolvidas no controle da impermeabilidade da membrana. A regulação da apoptose está diretamente relacionada à atividade dessas proteínas que são codificadas pelo gene bcl-2. A inibição da atividade da Bcl-2 (proteína anti-apoptótica) ou aumento na expressão de Bax (proteína da família Bcl-2, pró-apoptótica) leva a um aumento da permeabilidade da membrana mitocondrial, com o conseqüente aumento no volume da matriz da mesma, expansão e fragmentação de sua membrana interna. Esse evento favorece a liberação do citocromo c para o espaço intermembranas e para o citosol. Uma característica importante da apoptose é a fragmentação do DNA. Nos estágios iniciais, são produzidos fragmentos de 50 a 300 kb, apresentando a cromatina separada da matriz nuclear, isto é geralmente seguido por uma rápida fragmentação da dupla fita de DNA em sítios internucleossomais. As enzimas que catalisam esta fragmentação são, geralmente, endonucleases nucleares não-lisossomais. Em certas células elas são ativadas por Ca 2+ e Mg 2+ e inibidas por Zn 2+. DNA ativo é hidrolisado preferencialmente por estas enzimas, rompendo-se em longos fragmentos de oligonucleotídeos. Esses, quando submetidos à eletroforese, apresentam um padrão típico de 200 pares de base, correspondentes ao DNA com fragmentos internucleossomais.

31 27 A fragmentação do DNA pelas endonucleases foi inicialmente utilizada como diagnóstico de apoptose. No entanto, atualmente, já se sabe que nem todos os tipos de células mostram esta característica, ou seja, as mudanças nucleares pela apoptose podem ocorrer sem ativação de endonucleases ou produção de oligonucleotídeos (LEINICK, 2001). Estímulos apoptóticos p53 Mitocôndria Bax PUMA Bcl-2 Cyt c /ATP Smac Apaf-1 p53 Caspase-9 IAPs Caspase-3 Células Alvo Apoptose Figura 8 Seqüência de eventos envolvidos no processo apoptótico (WEIZMANN, 2007).

32 Reações do citocromo c Desde 1973, muitos pesquisadores têm realizado testes de reatividade do citocromo c a fim de avaliar seu potencial de redução. seu comportamento encontra-se descrito em relação a sua atividade peroxidase/oxidase sobre aldeídos, como difenilacetaldeído (DPAA), β-cetonas e hidroperóxidos, como o t-butilhidroperóxido (t-buh), assim como em presença de azul de metileno (MB) irradiado ou de β-mercaptoetanol (NANTES, 2001; ESTEVAM, 2004; MUGNL, 2004; PRIET, 2004; KAWAI, 2005) Reação com DPAA difenilacetaldeído (DPAA) é um aldeído hidrofóbico que se difunde livremente através de membranas biológicas e pode ser oxidado por várias hemoproteínas como citocromo c, além de outras como: peroxidase de raiz forte (HRP), mioglobina e hemoglobina. mecanismo proposto para esta reação é mostrado a seguir (Figura 9). A etapa (a) mostra as estruturas de ressonância do DPAA, sendo a forma enólica a que tem maior capacidade doadora de elétrons para o citocromo c, produzindo o radical alcoxil e o citcocromo c reduzido (cyt c Fe 2+ ) conforme descrito na etapa (b). radical alcoxil em meio aerado reage com oxigênio molecular e forma o radical peroxil que pode ciclizar para um intermediário dioxetano como mostrado na etapa (c). dioxetano é instável e sofre termólise a 37ºC produzindo benzofenona triplete e ácido fórmico, conforme etapa (d). A benzofenona triplete produzida nesta reação é uma espécie excitada de vida longa (100 µs), fonte potencial de oxigênio singlete em meio aerado por um processo de transferência colisional. A geração de oxigênio singlete para este sistema foi detectada durante a reação e suprimida por histidina, com a mesma constante de supressão determinada indicada para o oxigênio singlete. s dados da literatura de redução de citocromo c por DPAA sugerem a relação com a ionização das cadeias laterais de dois resíduos de tirosina, presentes na estrutura de citocromo c. A reação de oxidação do DPAA pelo ferro hemínico é favorecida quando um resíduo de tirosina está ionizado e o outro não. A cadeia lateral do resíduo não ionizado faz stacking com os anéis

33 29 aromáticos do DPAA e a cadeia lateral de tirosina ionizada favorece a doação de elétrons do DPAA pois deve diminuir seu potencial de redução (RINALDI, 2004). H H H (a) H H H + cyt c Fe 3+ + cyt c Fe 2+ (b) H 2 meio aerado. H e- H H (c) H H 37ºC 3 * + HCH (d) Figura 9 Mecanismo proposto para a reação entre citocromo c e DPAA (NANTES,2001) Reação com t-buh Dados da literatura demonstram que o citocromo c reage com hidroperóxidos orgânicos formando radicais livres, fato importante no processo de peroxidação lipídica e danos a proteínas. A reação do citocromo c com t-butil hidroperóxido (t-buh) resulta em progressiva queda de absorção da banda Soret, em 409 nm, juntamente com a conversão do estado de spin do ferro hemínico, de baixo spin para alto spin com simetria rômbica. (NANTES, 2001).

34 Imidas Aromáticas Neste trabalho, fez-se a modificação do citocromo c com uma 4-amino-1,8-naftalimida principalmente por se tratar de uma substância que exibe fluorescência. Imidas aromáticas constituem uma classe de compostos de grande interesse em razão de suas diversas aplicações na área biológica e no campo de novos materiais (RDRIGUES, 1999). A importância biológica das 1,8-naftalimidas e das 1,4,5,8-naftalenodiimidas se referem principalmente a suas atividades anticarcinogênicas e antivirais que resultam das suas capacidades de intercalação no DNA. Além do mais, a ativação fotoquímica encontrada favorece a atividade biológica das imidas naftalênicas, resultando em clivagem específica na seqüência de DNA (SAIT, 1992). As 1,8- naftalimidas e seus derivados substituídos com grupos doadores de eletrons no carbono na posição 4 são coloridas, amarelo brilhantes, exibindo intensa fluorescência e ótima fotoestabilidade, sendo por esse fato importantes na modificação do citocromo c apresentada neste trabalho Estrutura das Imidas As imidas contêm o grupo -C-N(R)-C- em sua estrutura, sendo que R pode ser um átomo de hidrogênio, um grupo alquila ou um grupo arila. Elas podem ser classificadas como monoimidas e diimidas considerando o número de grupos imida, ou também como benzênicas, naftalênicas e perilênicas se considerarmos o número de anéis aromáticos. A Figura 10 mostra as estruturas de imidas aromáticas importantes em vários estudos envolvendo fluorescência (BRCHSZTAIN, 1999; CAMPS, 2004; BARRS, 1996; CSNARD, 1998; FURTAD, 2005; GRABCHEV, 2003; PTEAU, 2000; ). As imidas aromáticas têm sido recentemente muito estudadas no desenvolvimento de novos materiais. Isto se deve à versatilidade de sua síntese, permitindo variar amplamente a estrutura do grupo R. A modificação do grupo R permite a modelação de propriedades destas moléculas, tais como: solubilidade e capacidade de se incorporar em sistemas supramoleculares (SAHA, 2002; GUNNLAUGSSN, 2003).

35 N-R N-R ftalimidas R N 2,3-naftalimidas R N 1,8-naftalimidas NH 2 4-amino-1,8-naftalimidas R N CH 2 CH N N NH 2 R 1,4,5,8-naftalenodiimidas 4-amino-N-carboetoxi-1,8-naftalimida (4-ANI-GLI) Figura 10 Estruturas de imidas aromáticas relevantes. A numeração das imidas naftalênicas segue a ordem indicada na estrutura do naftaleno que consta no alto da página (BRCHSZTAIN, 1999).

36 Síntese de imidas aromáticas As imidas aromáticas podem ser facilmente sintetizadas, permitindo a incorporação de vários N-substituintes. Para este procedimento usa-se um anidrido aromático e uma amina primária. É uma reação muito versátil sendo que qualquer imida aromática pode ser sintetizada desde que exista uma amina primária (R-NH 2 ) com o substituinte R desejado (GRABCHEV,2003). A Figura 11 mostra a reação geral de obtenção de imidas aromáticas a partir de um anidrido 1,8-naftálico e uma amina primária. R 1 N + R 1 NH 2 R 2 R 2 Figura 11 Reação geral de obtenção de imidas aromáticas (BRCHSZTAIN, 1999). mecanismo proposto para explicar a formação das imidas, descrito na Figura 12, sugere a presença de um intermediário, neste caso o ácido âmico, que ao sofrer rearranjo intramolecular passa a exibir o anel imídico. A reação é uma abertura do anel seguida de fechamento com perda de uma molécula de água (CECHINEL, 2003).

37 33 + H 2 N - R H NH - R N - R Figura 12 Mecanismo geral de formação de imidas (CECHINEL, 2003) Espectroscopia das imidas Em geral, as transições eletrônicas de mais baixa energia (S 0 S 1 ) das naftalimidas apresentam um caráter π π*. Entretanto, a presença de um substituinte doador de elétrons na posição 4, como no caso das 4-amino-1,8-naftalimidas (4-ANI, Figura 10), altera totalmente as propriedades fotofísicas da molécula (Figura 13) (PESCE,1971). Neste caso, a transição S 0 S 1 possui um caráter de transferência de carga (CT) intramolecular, de acordo com a literatura (ALEXIU, 1990; SAHA, 2002). A influência do substituinte na posição 4 fica evidente ao compararmos os espectros característicos da 4-bromo-N-(2-fosfonoetil)-1,8-naftalimida (BNIP) com o da 4-amino-N-(2-fosfonoetil)-1,8-naftalimida (ANIP), mostrados na Figura 14. Nota-se que o espectro da BNIP apresenta resolução vibracional típica de transições π π*. A substituição de um átomo de bromo por um grupo amino, entretanto, leva a alterações dramáticas no espectro de absorção, resultando em um deslocamento para o vermelho do λ abs max de cerca de 100 nm e da perda da resolução vibracional, características típicas de uma transição do tipo CT. A natureza do substituinte na posição 4 também influi na fluorescência dos compostos (Figuras 13, 14 e Tabela 1). Alexiou (1990) e colaboradores prepararam uma série de 1,8- naftalimidas substituídas e determinaram suas propriedades fotofísicas. s resultados desses estudos (Tabela 1) mostraram que a presença do bromo como substituinte na posição 4 diminui significativamente o rendimento quântico de fluorescência da 1,8-naftalimida (Φ F = 0,003). Entretanto, se o substituinte for o grupo amino este valor aumenta para 0,64, confirmando a influência da natureza do substituinte na fluorescência do composto (ALEXIU, 1990;

38 34 WDS,2003; YIN,1998). No caso da BNIP a presença de um átomo de bromo suprime totalmente a fluorescência. utras características das ANI típicas de transições por transferência de carga (CT) são o acentuado deslocamento de Stokes, da ordem de 100 nm (Figura 14) e a elevada sensibilidade dos λ max de absorção e emissão à polaridade do meio (vide seção 4.1.1). R 1 N R 1 = praticamente não influi nas propriedades fotofísicas. R 2 = aceptor de elétrons (compostos incolores, não fluorescentes). -N 2 ; -Cl; -Br. R 2 R 2 = doador de elétrons (compostos amarelos altamente fluorescentes). -NH 2 ; -NHR; -NR 2 ; -CH 3 Figura 13 Estrutura das 1,8 naftalimidas (BRCHSZTAIN, 1999). 1,0 P 3 H 2 P 3 H 2 0,6 0,8 Absorbância 0,4 0,2 ABS BNIP ABS ANIP EM ANIP 0,6 0,4 Intensidade u.a. N N 0,2 Br NH 2 0, Comprimento de onda nm 0,0 BNIP ANIP Figura 14 Espectros de absorção (ABS) e de emissão (EM) de 4-bromo-N-(2-fosfonoetil)-1,8-naftalimida (BNIP) e da 4-amino-N-(2-fosfonoetil)-1,8-naftalimida (ANIP) em acetonitrila e suas respectivas estruturas (BRCHSZTAIN, 1999).

39 35 Tabela 1 Rendimento quântico de fluorescência de 1,8-naftalimidas com diferentes substituintes (ALEXIU, 1990). R 1 R 2 Φ F Propil - Br 0,003 Butil - H 0,040 Butil - NH 2 0,640 A transição do tipo CT intramolecular nas 4-ANI pode ser melhor visualizada através das estruturas de ressonância mostradas na Figura 15. R R 1 1 N N hν : + NH 2 NH 2 Figura 15 Transição do tipo CT intramolecular nas 4-ANI.

40 Modificadores fluorescentes de proteínas Uma vez que o objetivo é sintetizar um citocromo c fluorescente procurou-se na literatura trabalhos referentes a modificadores fluorescentes de proteína. As modificações químicas de proteínas têm sido amplamente utilizadas para obter informações sobre o papel de diferentes grupos funcionais em seu mecanismo de ação. Além disso, quando ambas, a seqüência de aminoácidos e a estrutura tridimensional da proteína são conhecidas, como no caso do citocromo c, os resultados das modificações de resíduos funcionais importantes podem ser interpretados. s modificadores mais utilizados encontrados na literatura são: complexos de rutênio, fluoresceína e os corantes Lúcifer (CATÁLG SIGMA, 2006) Complexos de rutênio s ésteres ativados de complexo de rutênio são modificadores fluorescentes por acilação de aminas em aminoácidos de cadeias laterais de proteínas (Figura 16). Comercialmente, estão disponíveis em uma série de corantes baseados em complexos de rutênio com diversas aplicações. Estes corantes podem ser usados para marcar biomoléculas sob condições brandas. Proteína - N C N--C H Proteína -N N H N Ru(bpy) Proteína - NH 2 C N N C C C C N N Ru(bpy) 2 +2 Figura 16 Preparação do derivado Ru(bpy)2(dcbpy)-citocromo c

41 37 As vantagens destes corantes como marcadores de proteínas incluem: alta fotoestabilidade, boa solubilidade em água, ausência de interações corante corante e amplos deslocamentos Stokes, ou seja, com significativo efeito batocrômico (para o vermelho) ou hipsocrômico (para o azul ). Além disso, os sinais de fluoróforos de longa vida podem ser utilizados para eliminar a emissão dos de vida curta e a autofluorescência de células e biomoléculas para melhorar ainda mais a sua sensibilidade (SCTT, 1996) Fluoresceína John A. Thomas e colaboradores relataram um método adequado para monitorar o transporte de cátions hidrogênio em partículas mitocondriais, evento importante no processo de fosforilação oxidativa. s pesquisadores prepararam citocromo c modificado por isotiocianato de fluoresceína (Figura 17) na proporção 1:5, reagindo por 4 horas em ph 7,8 (THMAS, 1975). H CH Figura 17 Estrutura da fluoresceína Sabe-se que o citocromo c de coração de cavalo apresenta 19 resíduos de lisina com amino grupos primários e que estes reagiram com isotiocianato fluoresceína, fato esse que possibilitou a preparação de 19 derivados modificados. Entretanto, duas lisinas se mostraram muito mais reativas do que outras.

42 Corantes Lúcifer A estrutura dos corantes Lúcifer (Figura 18) se assemelha ao modificador do citocromo c utilizado neste trabalho por se tratar de um derivado de 4-ANI. Desde sua apresentação, em 1978, amarelo Lúcifer CH e amarelo Lúcifer VS têm sido usados com sucesso como marcadores intracelulares em uma ampla variedade de sistemas biológicos. Ambos contêm o mesmo grupo 4- amino-1,8-naftalimida, mas eles diferem no substituinte do nitrogênio da imida. As suas sínteses estão baseadas no pigmento comercial sulfoflavina. s pigmentos têm propriedades espectrais semelhantes: absorção máxima entre 280 nm e 430 nm com emissão máxima perto de 540 nm. R N Li+- 3 S S 3 -Li+ NH 2 Figura 18 Estrutura do corante Lúcifer. Stewart (1980) e colaboradores relatam ter desenvolvido um método de obtenção do conjugado covalente a proteína, em filamentos de actina, de cultura de fibroblastos, sinalizados por conjugados desse gênero, e que o mesmo seria publicado posteriormente, porém, após extensa pesquisa, buscando a possível publicação dos referidos autores não a encontramos. Lúcifer amarelo VS é similar ao isotiocianato de fluoresceína em sua facilidade de uso e intensidade de fluorescência e tem a vantagem de que seu pico de emissão de 540 nm é consideravelmente para o vermelho da fluoresceína em 515nm, e aí que seu contraste fluorescente mais fortemente com tecido autofluorescente. Mas desde que o Lúcifer não tem outra vantagem clara e já que é menos conhecido a cerca de sua química e estabilidade de ligação que é formada, é provável que isotiocianato de fluoresceína permanecerá o pigmento escolhido para mais aplicações imunofluorescentes. Quando a fluorescência é necessária em phs abaixo de 6, Lúcifer amarelo VS é mais útil. A intensidade fluorescente do Lúcifer VS continua sendo a mesma de ph 2 a ph 10, assim como a atípica propriedade de solubilidade em água do pigmento.

43 39 Esta independência do ph faz com que o pigmento seja apropriado para monitoramento de mudanças conformacionais induzidas por alterações de ph em macromoléculas (STEWART,1981).

44 40 3 BJETIVS s principais objetivos deste trabalho são: Modificar o citocromo c, uma importante proteína, com um cromóforo pertencente a um grupo de substâncias bastante explorado pelos pesquisadores nos últimos anos, uma 4-amino-1,8-naftalimida, a fim de obter uma biomolécula fluorescente que possa ser utilizada para seguir o curso da apoptose. Desenvolver diferentes métodos de inserção da imida no citocromo c: (i) através de síntese por acoplamento com EDAC; (ii) síntese com imidazol fundido; (iii) síntese utilizando tratamento por microondas e ultra-som. Purificar e caracterizar o citocromo c modificado de acordo com os métodos citados no item anterior.

45 41 4 MÉTD 4.1 Materiais - Citocromo c de coração de cavalo (Cytochrome c horse heart) (cit c)12384 g/mol (Sigma). - Anidrido 4-amino-1,8-naftálico MM 213 g/mol (AAN) (Aldrich). - Imidazol, MM 68,08 g/mol,(merck). - Dimetilformamida (DMF) (J.T. Baker). - EDAC (N-(3-dimetilaminopropil)-N-etilcarbodiimida)-MM 191,7 g/mol - - Fosfato de sódio mono e dibásico (Sigma). - Fosfato de potássio (Sigma) - Glicina MM 75 g/mol (Carlo Erba). - Cromatofolhas de plástico Silicagel 60 F 254 marcador (Merck) - Membrana de nitrocelulose 6,000-8, mm de largura (Spectrum Laboratório Inc.). - Carboximetil-celulose 32 (Whatman). - (4-ANI-GLI) - (4-amino-N-carboetoxi-1,8-naftalimida), preparada no Centro Interdisciplinar de Investigação Bioquímica da Universidade de Mogi das Cruzes, UMC. - Dimetilsulfóxido (DMS) (Sigma). Todos os demais reagentes utilizados são de grau analítico e as soluções foram preparadas com água deionizada em sistema Mili-Q TM Water System da Millipore Corp. (Bedford, MA,USA). 4.2 Equipamentos - Agitadores: Vortex Genie 2, modelo G250, Scientific Industries (Boemia, NY,EUA). - Banhos de temperatura constante PRECISIN. - Centrifuga refrigerada, Hitachi modelo CF 15R (Tóquio, Japão). - Espectrofotômetro Shimadzu Modelo 1501 MultiSpec (Tóquio, Japão). - Espectrofluorímetro Hitachi F2500 (Tóquio, Japão). - Espectropolarímetro JASC J-810 (CD).

46 42 - Infravermelho FTIR/ATR Perkin Elmer modelo Spectrum ne. - phmetro modelo rion A. - Purificador de água Mili-Q TM Water System da Millipore Corp. (Bedford, MA,USA). - Shaker Tecnal TE Espectrômetro de massas MALDI-TFF. - Liofilizador STS Systems modelo EZ550R. - Lâmpada compacta 4W modelo UVGL-25 (UVP). - Forno microondas - Sonicador - Ressonância Magnética Nuclear RMN Equipamento Bruker AC 200 (200 MHz) - Central Analítica do Instituto de Química da USP. 4.3 Preparação do citocromo c modificado com imida aromática (CIT-ANI) Síntese de 4-amino-N-carboetoxi-1,8-naftalimida (4-ANI-GLI) por acoplamento com citocromo c A preparação de 4-ANI-GLI foi realizada em presença de imidazol fundido. Misturouse 100 mg (470 µmoles) de anidrido 4-amino-1,8-naftálico e 40 mg (533 µmoles) de glicina com 0,5 g de imidazol fundido. A mistura permaneceu sob agitação e aquecimento (120ºC) por 30 minutos. Após esfriar, adicionou-se cerca de 10 ml de clorofórmio à mistura reacional para dissolver o excesso de glicina e imidazol. sólido resultante foi recolhido por filtração em funil de Büchner e lavado com um pouco de clorofórmio e finalmente seco a vácuo. bteve-se 150 mg do produto (117,62 % de rendimento), fato este que pode ser explicado pela formação do produto na forma do sal de imidazol. A reação foi monitorada por cromatografia de camada delgada (TLC) utilizando etanol para eluição. espectro RMN da 4-ANI-GLI em DMS-d 6 apresenta δ (ppm): 4,67(s), H a, 2H; 6,87(d), H c, 1H; 7,04(s), H b, 2H; 7,55(s), H g (NH 2 ), 2H; 7,68(t), H e, 1H; 7,72(d), H a, 1H; 8,20(d), H b, 1H; 8,44(d), H d, 1H; 8,65(d), H f, 1H.

47 Acoplamento entre citocromo c e 4-ANI-GLI com EDAC - Método A Misturou-se em um béquer: 1mL de ácido clorídrico 10-5 M, 3 µl de EDAC 50 mm (0,14 µmol) e 10,5 µl de uma solução aquosa de 4-ANI-GLI 13,8 mm (0,14 µmol). Em seguida adicionou-se 50 µl de uma solução aquosa de citocromo c 2,9 mm (0,14 µmol). A mistura permaneceu por 30 minutos sob agitação e a reação foi interrompida com a adição de 100µL de tampão acetato de sódio 0,2 M ph 5,0. produto obtido foi dialisado em água por quatro horas, duas vezes. - Método B Em um balão misturou-se 5 mg (0,4 µmol) de citocromo c nativo, 22 mg (80 µmoles) de 4-ANI-GLI e 12,5 mg (65 µmoles) de EDAC em 1,25 ml de tampão fosfato de potássio 50 mm ph 6,0. tampão fosfato foi previamente deaerado em argônio, por 30 minutos. A mistura permaneceu sob agitação em sistema fechado e em banho de gelo (~ 4ºC) por 12 horas. A mistura reacional foi dialisada em 2 L de tampão fosfato de potássio 50 mm ph 6,0 até que a solução externa não apresentasse mais imida (seis vezes). - Método C 5 mg (0,4 µmol) de citocromo c nativo, 22 mg (80 µmoles) de 4-ANI-GLI e 12,5 mg (65 µmoles) de EDAC foram misturados em 1,25 ml de tampão fosfato de potássio 50 mm ph 6,0. tampão fosfato foi previamente deaerado em argônio, por 30 minutos. A mistura permaneceu sob agitação em sistema fechado e em banho de gelo (~ 4ºC) por 24 horas. Adicionou-se 14 ml de tampão fosfato de potássio 50 mm ph 6,0 ao produto obtido que foi centrifugado por 30 minutos, rpm à temperatura de 20ºC. líquido sobrenadante foi dialisado com membrana de nitrocelulose, 6,000 8,000, em 2 L de tampão fosfato de potássio 50 mm ph 6,0 com troca do tampão a cada duas horas, por seis vezes.

48 44 - Método D Em um frasco foram colocados 0,8 mg (4 µmoles) de EDAC, 2,2 mg (8 µmoles) de 4- ANI-GLI e 1 ml de tampão fosfato de potássio 50 mm ph 6,0 que foram misturados vigorosamente por 15 minutos, à temperatura ambiente. Uma solução de citocromo c nativo: 0,4 µmol em 500 µl tampão fosfato de potássio 50 mm ph 6,0 foi preparada e posteriormente adicionada lentamente (~20minutos) à mistura imida + EDAC. sistema reacional permaneceu sob agitação por mais dez minutos. A mistura reacional foi dialisada em 2 L de tampão fosfato de potássio 50 mm ph 6,0, com troca a cada 2 horas por seis vezes Acoplamento de citocromo c com anidrido 4-amino-1,8-naftálico (AAN) usando imidazol fundido - Método A Em um balão misturou-se 3 mg (2,34 µmoles) de citocromo c, 7,4 mg (34,7 µmoles) de anidrido 4-amino-1,8-naftálico e 750 mg de imidazol. A mistura foi mantida a 90ºC por 10 minutos sob agitação. A dissolução da mistura reacional foi feita com adição de 25 ml de água deionizada. A seguir a mistura foi centrifugada a 20ºC por 5 minutos e 1000 rpm. líquido sobrenadante foi retirado e dialisado em água deionizada por 12 horas. - Método B Em um balão misturou-se 517 mg de imidazol e 161,5 µl de solução 0,01M (1,6 µmoles) de anidrido 4-amino-naftálico em DMF (dimetilformamida) a 90ºC. A seguir adicionou-se 1,6 µmoles de citocromo c deixando-se a mistura sob agitação por 2 minutos. Após o resfriamento da mistura foram adicionados 20 ml de água deionizada e procurou-se dissolver a mistura que na seqüência foi centrifugada a 20ºC, 5 minutos e 1000 rpm. líquido sobrenadante foi retirado e dialisado em membrana de nitrocelulose (6,000-8,000) e água deionizada por duas horas.

49 Síntese por ultra-som e microondas Em um tubo de ensaio misturou-se 2 µmoles de citocromo c nativo, 81µL de solução de anidrido 4-amino-1,8-naftálico 0,01M (0,8 µmol) em DMF (dimetilformamida) e 500µL de água deionizada. tubo foi coberto com parafilme e sonicado por 10 minutos e em seguida registrou-se seu espectro UV/vis. Repetiu-se essa operação em intervalos de 10 minutos por mais duas vezes. Em seguida sonicou-se por mais 24 horas e um novo espectro UV/vis foi registrado. Utilizou-se uma solução controle como referência para avaliação do processo. Essa solução continha: 0,4 µmol de citocromo c nativo, 40,5 µl de DMF e 250 µl de água deionizada. Após o tratamento por sonicação submeteu-se essas mesmas amostras à microondas por 20 segundos monitoradas. Repetiu-se o procedimento por mais três vezes Monitoração das preparações Teste de estabilidade térmica do citocromo c Testamos a estabilidade térmica do citocromo c dissolvido em água, submetido a 90ºC durante 1min, 2 min e 15 min e avaliamos através de espectroscopia UV-VIS Cromatografia por camada delgada (TLC) Após a diálise do liquido sobrenadante do CIT-ANI aplicamos em cromatofolhas e eluimos com etanol junto a citocromo c nativo e o anidrido 4-amino-1,8-naftálico (AAN) conforme figura 16 mostrada em resultados Espectroscopia Ultra-Violeta/Vísivel Em um espectrofotômetro de rede de fotodiodo Multispec 1501 da Shimadzu Corporation realizou-se medidas em cubetas de quartzo de caminho ótico de 10 mm para soluções de menor concentração e de 1mm para soluções de maior concentração. software Shimadzu Hyper-UV foi utilizado para obtenção do espectros, cujas medidas foram feitas a temperatura ambiente. equipamento contém uma lâmpada de halogênio para medidas na faixa de luz visível e uma lâmpada de deutério para medidas na faixa de luz ultra-violeta.

50 Dicroísmo Circular As medidas de CD, na região de ultravioleta distante ( nm), foram realizadas em um espectropolarímetro Power Suply JASC, à 25ºC, em uma velocidade de varredura de 50 nm/min. Foram utilizadas cubetas de 0,5mm de caminho óptico. s experimentos foram realizados com 20µM do citocromo c modificado em água à 25ºC. s espectros por dicroísmo circular foram registrados em colaboração com a Profª Adelaide Faljoni Alário, do Instituto de Bioquímica da USP Espectroscopia por Infravermelho (IR) Dispersou-se 100 µl da solução aquosa do CIT-ANI em uma placa de Zn/Se e secouse com ar quente, por 15 minutos, a fim de eliminar a interferência provocada pela presença de água e registrou-se os espectros por infravermelho a partir da média de 32 leituras. s espectros foram corrigidos com acerto de linha base e retirada de ruídos.

51 47 5 RESULTADS E DISCUSSÃ Geralmente, o método mais utilizado para acoplar biomoléculas com modificadores orgânicos emprega carbodiimidas como agentes acoplantes (FRAGS, 2002), uma vez que a reação é feita em meio aquoso e à temperatura ambiente, ao contrário dos métodos de síntese convencional, os quais empregam condições drásticas, como solventes orgânicos e altas temperaturas que sabidamente causam danos às biomoléculas. Assim sendo, procurou-se primeiramente fazer a modificação do citocromo c por acoplamento com EDAC (FRAGS, 2002), porém os resultados iniciais dos experimentos por TLC e espectroscopia UV/vis indicam não ter ocorrido a reação. Decidiu-se, portanto, tentar um método alternativo que consiste em utilizar imidazol fundido como solvente para a reação de acoplamento. Apesar do método empregar condições drásticas julgou-se ser viável testá-lo devido a grande estabilidade do citocromo c e ao sucesso de nosso grupo na síntese de imidas com o mesmo método. Além desses métodos, procuramos também sintetizar o CIT-ANI por ultra-som e microondas. 5.1 Síntese da 4-ANI-GLI acoplamento de uma proteína com EDAC acontece a partir da reação entre um grupo carboxila e um grupo amino formando uma amida. Portanto, existem duas possibilidades de acoplamento: (a) uma 4-ANI carboxilada (4-ANI-CH) reagindo com um grupo amino da proteína (proteína-nh 2 ) ou (b) uma 4-ANI substituída com grupo amino (4-ANI-NH 2 ) reagindo com um grupo carboxila da proteína (proteína-ch). Uma vez que o citocromo c é uma proteína que apresenta considerável quantidade de resíduos do aminoácido lisina (18% dos resíduos), parece mais lógico utilizar a opção (a). Portanto, decidiu-se sintetizar o composto 4- ANI-GLI por condensação do AAN com o aminoácido glicina (Figura 19). Preparou-se a 4-ANI-GLI utilizando-se imidazol fundido como solvente. Após a reação, foram feitos testes de solubilidade com a mistura obtida (4-ANI-GLI + imidazol + glicina) nos solventes etanol, água e clorofórmio com o objetivo de purificar a imida. Descobriu-se que o clorofórmio dissolve apenas o imidazol e a glicina e por isso foi escolhido para a purificação da 4-ANI-GLI. bteve-se para a reação um rendimento superior a 100% (vide seção 3.3.1), sugerindo que o produto foi obtido na forma do sal imidazólico (Figura 19). Ao refazer os

52 48 cálculos para a fórmula molecular 4-ANI-GLI. imidazol, obteve-se um rendimento de 94 %, o que é coerente com a formação do sal. espectro de 1H-RMN do produto (Figuras 20A e B) confirmou este resultado uma vez que os picos atribuíveis ao imidazol (Figura 20C) estavam presentes em proporções estequiométricas. NH 2 NH 2 imidazol + NH 2 -CH 2 -CH + 90ºC H 2 N CH 2 CH Figura 19 Preparação da 4-amino-N-carboetoxi-1,8-naftalimida (4-ANI-GLI) SERGI-UMC LUCI01 DMS-d Integral C CH 2 N Hf He Hb Hc Hd NH 2 } Hg } Ha. Ha' N NH 2 + Hb' Hb' X H 2 H b H a H e + H a H b H d H f H g H c DMS X (ppm) Figura 20A Espectro de 1H-RMN da 4-ANI-GLI em DMS-d 6 : 4,67(s), H a, 2H; 6,87(d), H c, 1H; 7,04(s), H b, 2H; 7,55(s), H g (NH 2 ), 2H; 7,68(t), H e, 1H; 7,72(d), H a, 1H; 8,20(d), H b, 1H; 8,44(d), H d, 1H; 8,65(d), H f, 1H.

53 SERGI-UMC LUCI01 DMS-d 6 Integral H b H a H g (NH 2 ) H b H c H d H e H f (ppm) Figura 20B Ampliação da região dos prótons aromáticos do espectro da Figura 20A.

54 50 CDCl 3 H b (7,13 ppm) Ha' N NH 2 + Hb' Hb' H a (7,73 ppm) X H 2 Figura 20C Espectro de 1H-RMN do imidazol (SBDS AIST, 2007).

55 Caracterização fotofísica da 4-ANI-GLI Caracterização por UV/vis As 4-ANI apresentam propriedades fotofísicas interessantes, como emissão de fluorescência, exibindo comportamento diferente em diversos solventes. Como é típico em transições de transferência de carga (CT), um aumento na polaridade do meio provoca deslocamento batocrômico (SAHA,2002). A Figura 21 mostra os espectros de absorção UV/vis da 4-ANI-GLI em diferentes solventes. Pode-se observar uma banda de absorção (ε máx = 9544 a M -1 cm -1 ) que não apresenta estrutura vibracional, com comprimento de onda de máxima absorção (λ abs max ) variando de 408 nm a 430 nm e deslocamento batocrômico conforme a polaridade do meio aumenta, indicando transição eletrônica do tipo CT. s dados espectrais estão resumidos na Tabela Absortividade Molar M -1. cm ( )clorofórmio ( )acetonitrila ( )água ( )etanol Comprimento de onda nm Figura 21 - Espectros de absorção UV/vis da 4-ANI-GLI 4x10-5 M em solventes de diferentes polaridades.

56 52 Tabela 2. Dados espectrais para a 4-ANI-GLI em solventes de diferentes polaridades. s respectivos parâmetros empíricos de polaridade de solvente E T (30) (REICHARDT,1994) são também apresentados. (a) solvente aprótico; (b) solvente prótico. Solvente Et(30) λ max abs nm ε M -1 cm -1 λ max em nm Φ F Clorofórmio (a) 39, ,40 Acetonitrila (a) 45, ,25 Etanol (b) 51, ,24 Água (b) 63, ,06 A Figura 22 mostra o efeito de ph sobre os espectros de absorção da 4-ANI-GLI em água. Em ph 6,0 obtivemos o maior valor de ε, fato este que corresponde também ao melhor rendimento quântico de fluorescência (vide seção ). s dados estão resumidos na Tabela Absortividade Molar M -1.cm Comprimento de onda nm Figura 22 - Espectros de absorção da 4-ANI-GLI em água em diferentes ph, em tampão triplo (5mM de acetato de sódio + 5mM tris(hidroxi-metil-aminometano) + 5mM de hidróxido de amônio) na concentração de 4 x 10-5 M;(...) ph 4,5; ( ) ph 8,5; (----) ph 6,0.

57 53 Tabela 3 Rendimento quântico de fluorescência, λ max abs, λmax em e absortividade molar da 4-ANI-GLI em diferentes phs. ph abs λ max ε M -1 cm -1 em λ max Φ F nm nm 4, ,0625 6, ,0778 8, , Caracterização por espectroscopia de emissão A Figura 23 mostra os espectros de fluorescência da 4-ANI-GLI que foram obtidos em em solventes de diferentes polaridades. s λ max aumentam (deslocamento batocrômico) a medida que a polaridade do solvente aumenta, variando de 500 a 538 nm. s dados espectrais estão resumidos na Tabela 2. 1,0 0,8 Clorofórmio Acetonitrila Etanol Água Intensidade a.u. 0,6 0,4 0,2 0, Comprimento de onda nm Figura 23- Espectros de emissão da 4-ANI-GLI 4x10-5 M em solventes de diferentes polaridades. normalizados de emissão, registrados após excitação de solução em 375 nm. Espectros

58 54 Pode-se observar que o efeito de solvente sobre os espectros de emissão é muito mais pronunciado do que o observado com os espectros de absorção seguindo a ordem de polaridade de acordo com o parâmetro empírico Et(30) (Tabela 2) introduzido por Reichardt (1994). A Figura 24 mostra o efeito de ph sobre os espectros de emissão da 4-ANI-GLI. bservase que mudanças de ph não alteram significativamente o comprimento de onda máximo de emissão da 4-ANI-GLI. A intensidade de emissão, por outro lado, é sensível ao ph do meio, aumentando de ph 4,5 para 6,0 e diminuindo novamente ao aumentar-se o ph para 8,5. Este fenômeno pode ser explicado através dos estados de protonação da 4-ANI-GLI, de acordo com o Figura 25. s resultados obtidos sugerem que a forma zwitteriônica é mais emissiva que as outras possivelmente devido à supressão pelo contra-íon nas formas aniônica e catiônica. utros autores observaram efeitos semelhantes com naftalimidas utilizadas como quimiosensores (GUNNLAUGSSN,2003) ph 4,5 ph 6,0 ph 8,5 Intensidade Comprimento de onda nm Figura 24 - Espectros de emissão da 4-ANI-GLI em água em diferentes ph, em tampão triplo (5mM de acetato de sódio + 5mM tris(hidroxi-metil-aminometano) + 5mM de hidróxido de amônio).

59 55 CH 2 CH CH 2 C - CH 2 C - + Na N - + H N - + H N + H+ + + H + NH 3 - Cl + NH 3 NH 2 Figura 25 Estados de protonação da 4-ANI-GLI em água.

60 Acoplamento do citocromo c com a 4-ANI-GLI utilizando-se EDAC Procurou-se fazer o acoplamento em duas etapas, como mostrado na Figura 26. Na primeira etapa, reagiu-se a 4-ANI-GLI com EDAC, gerando um éster de isoaciluréia. Na segunda etapa, adicionou-se a solução de citocromo c à mistura do éster de isoaciluréia. Tentou-se fazer o acoplamento utilizando-se diferentes condições como resumido na Tabela 4 (vide seção para maiores detalhes). Deve-se considerar que no método A os três reagentes foram adicionados juntos, já em B variou-se apenas o tampão. Todas as condições de B foram repetidas em C e apenas o tempo de reação foi o dobro. No método D colocou-se EDAC e a 4-ANI-GLI para reagir e após quinze minutos adicionou-se o citocromo c. N CH 2 CH N N H N NH 2 N H + CH 2 C C cyt c NH 2 NH N 2 N H + cyt c NH C CH N C N NH 2 N N H C N H Figura 26 Mecanismo de reação entre o citocromo c e a 4-ANI-GLI por acoplamento com EDAC. Tabela 4 - Descrição sumarizada das condições empregadas na síntese pelo método por acoplamento com EDAC (MARGALIT,1973 a b ) Método Cit c : 4-ANI-GLI: EDAC ph Tampão A 1:1:1 5 Ácido clorídrico B 1:200:165 (12 horas) 6 Fosfato de potássio 50 mm C 1:200:165 (24 horas) 6 Fosfato de potássio 50 mm D 1:20:10 6 Fosfato de potássio 50 mm

61 57 s resultados por TLC (não mostrados) indicam que a imida não se ligou ao citocromo c nativo. A Figura 27 mostra o espectro de absorção UV/vis com a banda Soret inalterada, diferente dos espectros do citocromo c modificado preparado pelo método com imidazol (vide seção 4.3.3) que apresenta um ombro característico da imida na região da banda Soret. Se houvesse ocorrido o acoplamento seria esperado um espectro semelhante ao da solução contendo uma mistura do citocromo c com a 4-ANI-GLI (linha verde na Figura 27) 0,6 0,5 0,4 Absorbância 0,3 0,2 0,1 0, Comprimento de onda nm Figura 27 Espectro de absorção UV/vis do cit c nativo (linha preta), 4-ANI-GLI (linha vermelha), solução contendo cit c + 4-ANI-GLI (linha verde) e do produto isolado da reação de acoplamento de acordo com o método D (linha azul). Alguns fatores devem ser considerados com relação ao insucesso da reação de acoplamento com EDAC: a) o fato de a imida 4-ANI-GLI estar na forma de sal imidazólico pode ter dificultado a reação uma vez que a EDAC reage com nucleófilos diversos; b) fosfatos reagem também com EDAC, por isso o uso do referido tampão descrito na Tabela 4 implica em consumo da carbodiimida. Diante do exposto verifica-se a possibilidade de sucesso a partir da eliminação de tais problemas no desenvolvimento de trabalhos futuros.

62 Síntese do CIT-ANI pelo método de imidazol fundido Devido a todas as tentativas de acoplar a imida ao citocromo c pelo método da carbodiimida não apresentarem resultados satisfatórios decidiu-se pelo método com imidazol. As reações de acoplamento em imidazol fundido foram realizadas utilizando duas condições diferentes (Figura 28): excesso de anidrido 4-amino-1,8-naftálico (Método A) e na proporção equimolar citocromo c : anidrido (Método B). s produtos isolados nestas reações foram designados como CIT-ANI-7 e CIT-ANI, respectivamente. Como controle aqueceu-se o citocromo c em imidazol fundido nas mesmas condições utilizadas nas reações de acoplamento com o objetivo de avaliar as alterações provocadas pelo tratamento. Para evitar a degradação da proteína misturou-se primeiro o anidrido com o imidazol sólido, aqueceu-se a mistura até a fusão do imidazol (PF = 90ºC) e só então adicionou-se o citocromo c e o tempo de tratamento foi minimizado (no máximo 10 minutos). Após a reação deixou-se esfriar a mistura e adicionou-se água para dissolver o produto, uma vez que esperavase que este fosse hidrossolúvel, já que tanto o citocromo c quanto as ANI são bastante solúveis em água. Entretanto, observou-se que parte do sólido residual não se dissolveu, por isso centrifugou-se a mistura e retirou-se o liquido sobrenadante para dar prosseguimento à caracterização. liquido sobrenadante foi então dialisado para remover o excesso de anidrido e o imidazol. A diálise foi conduzida até que na solução externa não houvesse mais anidrido e imidazol, monitorada por UV-VIS. dialisado apresentou uma coloração vermelho-alaranjada diferente das soluções originais de citocromo c e do anidrido e mostrou uma fluorescência alaranjada quando examinada com uma lâmpada de UV (λ = 365 nm) em uma placa de TLC (vide infra) sugerindo que a modificação deva ter ocorrido. conteúdo do tubo de diálise foi armazenado sem nenhum outro processamento e utilizado desta forma para a caracterização. A presença de precipitado após a adição de água nos produtos da reação, tanto na presença quanto na ausência do anidrido (controle), sugere a formação de oligômeros de citocromo c induzida pelo imidazol fundido. Tentou-se dissolver este precipitado em vários solventes (água em ph ácido e alcalino, DMF a quente, DMS, SDS, etanol) sem sucesso. Diante deste resultado decidiu-se desprezar o precipitado, seguindo a caracterização apenas com o produto dialisado.

63 59 NH 2 N N NH 2 Cit c : anidrido (excesso) 1:14 N NH 2 HN 2 (g) NH 2 (f) (a) 2 HN (b) NH 2 (c) NH 2 + NH 2 imidazol 90ºC Método A NH 2 N NH 2 N N NH 2 N NH 2 CIT-ANI-7 HN 2 (e) NH 2 (d) Cit c : anidrido 1:1 2 HN NH 2 NH 2 Método B 2 HN NH 2 2 HN N CIT-ANI NH 2 Figura 28 Reação entre citocromo c nativo e anidrido 4-amino-1,8-naftálico em presença de imidazol fundido. Método A: cit c: anidrido (1:14). Método B: cit c : anidrido (1:1). (a)lys 22; (b)lys 25; (c)lys 27; (d)lys 73; (e) Lys 72; (f) Lys 87; (g) Lys 88. As estruturas apresentadas para os produtos são apenas uma sugestão uma vez que não é possível determinar a estrutura exata com a nossa metodologia.

64 Caracterização do CIT-ANI pelo método do imidazol fundido CIT-ANI-7 (Figura 28), ou seja, o produto obtido a partir da reação de citocromo c com excesso de anidrido 4-amino-1,8-naftálico (AAN), apresentou alterações que permitiram a sua caracterização por diversas técnicas, exceto por espectrometria de massa (MALDI-Toff), já que não foi possível a ionização do mesmo após inúmeras tentativas. Por outro lado, o produto obtido em proporções equimolares (CIT-ANI) (Figura 28), foi detectado por espectrometria de massa, mas não pôde ser caracterizado pela maioria das outras técnicas. Por isso a maior parte dos resultados apresentados a seguir referem-se ao CIT-ANI Caracterização por TLC As reações foram monitoradas inicialmente por TLC (Figura 29) comparando-se o comportamento do CIT-ANI-7 com o dos reagentes puros, utilizando etanol como eluente. Nessas condições o citocromo c não sai da origem (R f = 0), enquanto que o AAN se desloca com R f = 0,9, portanto há uma diferença significativa entre ambos, o que pode ser confirmado quando se aplica os dois reagentes no mesmo ponto. A mancha do CIT-ANI-7 permaneceu na origem (R f =0) de forma semelhante ao observado com o cit c nativo, sugerindo se tratar de uma macromolécula, mas diferentemente do citocromo c apresentou fluorescência sob irradiação UV e uma coloração alaranjada (a cor da mancha do citocromo c é avermelhada). Nota-se a total ausência do AAN na análise do dialisado. Todas essas observações constituem forte evidência do sucesso da modificação.

65 Figura 29 - Resultados de cromatografia em camada delgada em sílica gel de citocromo c modificado pelo método de imidazol: (1) citocromo c nativo; (2) AAN; (3) AAN + citocromo c nativo; (4) CIT-ANI-7. Eluente: etanol. 61

66 Caracterização por UV/vis sucesso da modificação foi confirmado por espectroscopia de UV/vis no caso do CIT- ANI-7 (Figura 30). espectro UV/vis do citocromo c nativo é dominado pela banda Soret com máxima intensidade em 409 nm. Já as 4-ANI apresentam uma banda larga centrada em cerca de 430 nm. espectro do CIT-ANI-7 mostra claramente a presença da banda Soret e de um ombro na região onde a imida absorve sugerindo que a imida ligou-se à proteína. Absorbância 0,6 0,4 0,2 0,012 0,010 0,008 0,006 0,004 0,002 0, ,10 0,08 0,06 0,04 0,02 0, ,00 Comprimento de onda (nm) Figura 30 Espectros UV/vis registrados para determinação da concentração do CIT-ANI em solução aquosa, após diálise, por comparação com mistura física. Imida-4-amino-1,8-naftálica [ANIP] - 4,2 x 10-5 M (linha cheia); citocromo c nativo 3,8 x 10-6 M (linha tracejada); mistura física [cit c nativo 3,8x10-6 M + ANIP 3,8 x 10-5 M] (linha pontilhada) e CIT-ANI-7 3,8 x 10-6 M (linha traço-ponto); inserto destacando a banda de transferência de carga em 695 nm. espectro do CIT-ANI-7 é bastante semelhante ao espectro de uma solução contendo o cit c nativo e uma 4-ANI pura na proporção molar 1:7 (cit c : 4-ANI) sugerindo que o citocromo foi modificado com cerca de 7 moléculas de imida, daí a denominação CIT-ANI-7. Em geral, reações que envolvem modificações de proteínas resultam em uma distribuição de produtos com populações de números diferentes de modificador (THEDRAKIS, 1995; THMAS, 1975).

67 63 Presume-se a partir do exposto na Figura 30 que o produto com sete modificações seja o mais populoso. Como foi visto na introdução, o cit c nativo apresenta 19 resíduos de lisina, com sete deles mais expostos, sendo possível modifica-los por acetilação, o que esta de acordo com a sugestão da estrutura mostrada na Figura 28 (SCTT, 1996). espectro do CIT-ANI, por outro lado, não mostrou diferença significativa em relação ao espectro do cit c nativo devido ao baixo grau de modificação. A Figura 31 mostra as alterações do citocromo c nativo fundido em imidazol (controle negativo). Estas diferenças são: desvio de 2 nm para o azul do pico da banda Soret (Figura 31 A) e o desaparecimento da banda de transferência de carga (CT) em 695 nm (Figura 31 C), o que indica a perda de coordenação da metionina-80 na sexta posição. 1,0 0,8 A 0,08 0,06 C B 0,4 0,3 Absorbância u.a 0,6 0,4 0, ,2 0,2 0,1 0, , Comprimento de onda nm Figura 31 Espectros UV/vis, normalizados, do citocromo c nativo (linha tracejada) e do citocromo c tratado com imidazol fundido (linha cheia). Figura 31 A: banda Soret; Figura 31 B: banda β e Figura 31 C: inserto destacando a banda de transferência de carga (695 nm).

68 Caracterização por fluorescência A Figura 32 mostra o espectro de emissão do CIT-ANI-7 em comparação com o da imida 4-ANI-GLI, utilizada como referência. Em ambos os espectros a concentração da imida foi ajustada para 1 µm. Como o citocromo c nativo não apresenta fluorescência, o simples fato de o CIT-ANI-7 apresentar um espectro de emissão semelhante ao da 4-ANI-GLI é mais uma prova do sucesso da modificação. Nota-se um deslocamento para o vermelho do λ em max no caso do CIT- ANI-7, o que sugere que as moléculas de imida em média estão em um ambiente mais polar do que a água quando incorporadas à proteína. CIT-ANI, por outro lado, não apresentou fluorescência detectável, devido ao baixo grau de modificação. Pode-se observar na Figura 32 que a intensidade de fluorescência da imida é reduzida no CIT-ANI-7 em comparação com a imida livre (os espectros foram registrados nas mesmas condições), o que pode ser explicado pelo efeito supressor do ferro hemínico da proteína ligada covalentemente à imida. Para avaliar o efeito supressor do grupo heme, realizaram-se experimentos de supressão de fluorescência adicionando-se citocromo c nativo como supressor externo à uma solução aquosa contendo 1 µm de 4-ANI-GLI (Figura 33A). Como visto na Figura 32, é necessário adicionar 12 µm de citocromo c nativo para que a solução 1 µm de 4-ANI-GLI tenha a mesma fluorescência do que a solução de CIT-ANI-7 0,14 µm (contendo, portanto, 1 µm de imida). Pode-se concluir que o citocromo c, quando ligado covalentemente à imida, agindo como um supressor interno, apresenta uma eficiência de supressão cerca de duas ordens de grandeza maior do que quando adicionado externamente à uma solução da imida livre. A supressão neste caso é provavelmente devida à quenching estático. A Figura 33A mostra o efeito da adição de alíquotas sucessivas de citocromo c nativo á solução 1 µm de 4-ANI-GLI. Pode-se observar que a fluorescência da imida é totalmente suprimida quando a [cit c] é cerca de 1 x 10-4 M. gráfico de Stern-Volmer correspondente é mostrado na Figura 33B. Uma alta constante de supressão (K sv 1 x 10 6 M -1 ) pode ser observada.

69 CIT-ANI-7 [cit c 12 x 10-6 M +ANI1x10-6 M] 4-ANI-GLI 1 x 10-6 M 500 Intensidade comprimento de onda (nm) Figura 32 - Espectros de emissão do CIT-ANI-7 e da 4-ANI-GLI 1x 10-6 M em tampão fosfato de potássio 50 mm ph 6,0. comprimento de onda de excitação foi 430 nm para os três espectros: ( )[CIT-ANI-7] = 0,14 micromolar; (----) citocromo c nativo 12 x 10-6 M + 4-ANI-GLI 1 x 10-6 M ; ( _. _ ) 4-ANI-GLI 1 x 10-6 M , A 1 x ,4 B 500 1,3 Intensidade I 0 /I 1, comprimento de onda (nm) 100 x ,1 1, [cit c] 10-6 M Figura 33 - A - Efeito do citocromo c no espectro de emissão da 4-ANI-GLI: citocromo c nativo em adições sucessivas e a imida controle (4-ANI-GLI) 1µM em tampão fosfato de potássio 50 mm ph 6,0. B Gráfico de Stern- Volmer para a supressão de emissão de fluorescência da 4-ANI-GLI pelo citocromo c em tampão fosfato de potássio ph 6,0. [4-ANI-GLI] = 10-6 M; excitação = 430 nm; emissão = 435 nm. Regressão linear: y = 1,02 x + 0,065; coeficiente de correlação (r) = 0,999.

70 Caracterização por Infravermelho (IR) A Figura 34 mostra espectros de IR do citocromo c nativo, da ANIP, uma 4-ANI utilizada como referência (vide estrutura na Figura 6), e dos citocromos modificados CIT-ANI e CIT-ANI- 7. espectro do citocromo c nativo é dominado por duas bandas intensas em 1542 e 1653 cm -1. Estas bandas, que são características de proteínas, são denominadas amida II e amida I, respectivamente. Já o espectro da ANIP apresenta três bandas proeminentes em 1583, 1644 e 1687 cm -1, que podem ser atribuídas ao estiramento dos grupos carbonila (-C=) da imida aromática. s espectros dos citocromos modificados CIT-ANI e CIT-ANI-7, por outro lado, mostram bandas provenientes tanto da proteína como da imida, o que constitui mais uma evidência de que as modificações ocorreram. Apesar de os espectros de CIT-ANI e CIT-ANI-7 serem dominados pelas bandas amida II e amida I da proteína (linhas pontilhadas em vermelho), pode-se observar também as bandas de 4-ANI sobrepostas a estas (linhas pontilhadas em azul), em especial a banda em 1583 cm -1, a qual é mais visível por estar situada entre as bandas da proteína. Além disso, a intensidade relativa das bandas de absorção de 4-ANI em CIT-ANI e CIT-ANI-7 correspondem ao esperado conforme o grau de modificação dos mesmos, sendo mais intensas em CIT-ANI-7 do que em CIT-ANI a % Transmitância A Transmitância b c d B cm Número de onda (cm -1 ) Figura 34- Espectros de IR (infravermelho) em ATR A: (azul) citocromo c nativo; (verde) ANIP (ester dietílico); (vermelho) CIT-ANI; (preto) CIT-ANI-7. Espectros em escala original. B: (a) citocromo c nativo; (b) ANIP (ester dietílico); (c)cit-ani; (d) CIT-ANI-7. s espectros foram redimensionados para melhor visualização.

71 Caracterização por Dicroísmo Circular A Figura 35 mostra significativas mudanças espectrais entre o citocromo c nativo, o citocromo c modificado por imida (CIT-ANI-7 e CIT-ANI) e o citocromo c tratado em imidazol fundido (controle negativo). A diminuição da banda negativa no CIT-ANI e o desaparecimento dessa mesma banda no CIT-ANI-7 e no citocromo c em imidazol fundido sugere afastamento do sexto ligante do ferro hemínico, ou seja, existe a possibilidade do imidazol ter alterado a coordenação da metionina 80, tornando o citocromo c mais simétrico devido a presença do grupo imidazol da histidina próxima à cavidade heme (LIU,1997). 4 3 θ Molar (grau.dmol -1.cm 2 ) Comprimento de onda (nm) Figura 35 - Espectros no visível por CD de citocromo c tratado com imidazol fundido 20 µm (...), CIT-ANI-7 20 µm ( ), CIT-ANI 20 µm (----), citocromo c nativo 20mM (-.-.-.). citocromo c nativo apresenta em sua estrutura 40% de α-hélice e 9% de folhas-β indicadas no espectro mostrado na Figura 36 pela banda positiva em 190 nm e a banda negativa em 222 nm. A diminuição destas bandas mostra perda da estrutura em α-hélice.

72 [θ] (grau.dmol -1.cm 2 ) Comprimento de onda (nm) Figura 36 - Espectros por CD em alfa-hélice de citocromo c nativo 20 µm ( ), citocromo c nativo em imidazol fundido 20 µm (-----) e CIT-ANI-7 20 µm ( ).

73 Caracterização por espectrometria de massas espectro de massa do citocromo c nativo (MALDI-ToF) apresenta basicamente um pico referente ao íon molecular com massa de Da (Figura 37A). A escolha dessa técnica para caracterização do CIT-ANI-7 e do CIT-ANI deve-se ao fato de ser possível identificar alterações de massa a partir da formação dos fragmentos ionizados. Trata-se de uma técnica qualitativa, onde a amostra pode ou não ser ionizada em decorrência de mudanças em sua estrutura (ALTERMAN, 2004). As amostras (CIT-ANI-7 e CIT-ANI) foram diluídas, em uma faixa de concentração de 10 a 20 µm, na matriz de ácido 3,5-dimetoxi-4-hidroxicinâmico em solução saturada de acetonitrila e ácido trifluoroacético e submetidas a uma voltagem de 20 kv. A amostra de CIT-ANI-7 não ionizou, fato este que impossibilitou uma análise mais detalhada de suas modificações. Entretanto, esse fato está de acordo com os resultados encontrados, inicialmente, com a formação de partículas insolúveis, logo após o tratamento e com o perfil eletroforético (Figura 38). Figura 37 A: Espectro de Massa MALDI ToFF MS do citocromo c nativo; B: Espectro de massa CIT-ANI =195 Da (b) (c) intensidade citocromo c nativo Intensidade (a) (d) (e) (f) (g) (h) (i) (j) 500 A B m/z massa/carga espectro de massa do CIT-ANI (Figura 37B) mostra três séries de picos com massa maior do que o cit c nativo. A diferença de massa entre as séries é de exatamente 195 Da, que é a massa esperada do modificador, o qual é uma molécula de AAN (PM = 213) que perdeu uma molécula de água ao se condensar com o grupo NH 2 de uma lisina para formar a imida. Presume-se, portanto, que as séries correspondem ao citocromo c modificado com uma (picos a-

74 70 e), duas (picos f-j) e três moléculas de 4-ANI, sendo a população com uma única modificação a mais importante. Além do espaçamento de 195 Da entre as séries, observa-se dentro de cada série um espaçamento de 28 Da, o que pode indicar a incorporação de número variável de um segundo fragmento à proteína (a massa deste fragmento é compatível com um grupo etila). Até o presente momento não foi possível estabelecer a origem deste segundo fragmento Caracterização por eletroforese perfil eletroforético do CIT-ANI-7 foi comparado: a) com o padrão (1) na faixa de Da a Da de massa e b) com o citocromo c nativo em duas concentrações (2) 5µM e (3) 10 µm. Nota-se a presença de uma banda intensa no CIT-ANI-7 (4, 5, 6 e 7) coincidindo com a banda do citocromo c nativo que está abaixo da banda de Da do padrão. Este fato sugere a presença de moléculas de CIT-ANI-7 com variadas modificações ou até mesmo de moléculas de citocromo c em sua forma nativa. Entretanto, outras bandas situadas logo acima da banda Da indica um acréscimo de massa da ordem de 2016 Da (padrão citocromo c nativo) que corresponderiam a 10 ou 11 modificações (massa do modificador = 195 Da). utra banda de menor intensidade pode ser vista na Figura 25 indicando haver a possibilidade de ter um outro grupo de moléculas de CIT-ANI com um número ainda maior de modificações, ou formação de oligômeros. Padrão Cit c nativo 10 µm 5 µm 10 µm 5 µm 10 µm 5 µm Figura 38 Perfil eletroforético do citocromo c modificado (CIT-ANI): 1 Padrão Low Range Da; 2 cit c nativo 10 µm; 3- cit c nativo 5 µm; 4 e 6 CIT-ANI-7 10 µm; 5 e 7 - CIT-ANI-7 5 µm.

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