Revisão de Cinética Química 7.51 setembro 2001

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1 Revisão de Cinética Química 7.51 setembro 2001 Experimentos Cinéticos estudam a velocidade na qual as reações ocorrem, quer dizer como a concentração de algumas espécies molecular muda em função do tempo. Numa plotagem de concentração versus tempo, a velocidade da reação é simplesmente a inclinação. No experimento cinético mostrado abaixo, a velocidade da reação decresce à medida que a reação ocorre. O caminho exato pelo qual a velocidade muda em função do tempo e como esta velocidade varia com a concentração dos reagentes, depende do mecanismo de ação. Estudos cinéticos podem ser usados, entretanto, para testar mecanismos propostos. Equações de velocidade ou leis de velocidade mostram a variação na concentração de uma espécie molecular em relação ao tempo (a velocidade) como uma função matemática da constante de velocidade ou da constante cinética, especificada por k, e a concentração de cada espécie molecular que participa da reação. Os exemplos mostrados abaixo são equações de velocidade para reações que ocorrem em uma única direção (isto é, a reação reversa não é considerada). Em alguma destas, a velocidade deve ser ajustada para ser consistente com a estequiometria da reação. Assim para 2 A! A 2, a concentração do monômero varia duas vezes tanto quanto a concentração do dímero. rxn (1) U! N veloc= -d[u]/dt = d[n]/dt = k[u] rxn (2) AB! A + B veloc= -d[ab]/dt = d[a]/dt = k[ab] rxn (3) A + B! AB veolc=-d[a]/dt = -d[b]/dt = k[a] [B] 1

2 rxn (4) 2 A! A 2 veloc.= -d[a]/dt = d[a 2 ]/dt = k[a] 2 rxn (5) 2 A + B! A 2 B veloc.= -d[a]/dt =-d[b]/dt = 2d[A 2 B]= k[a] 2 [B] Observe que em cada uma das reações mostradas acima, os reagentes e os produtos são diferentes espécies moleculares. Isto significa que todos os reagentes participam da reação. Isto não será válido entretanto, para a reação abaixo: rxn (6) A + B + C! AB + C veolc=-d[a]/dt = -d[b]/dt = k[a] [B] Aqui, a equação de velocidade é idêntica a reação (3) e a concentração de [C] não aparece na expressão da velocidade por que C não participa da reação. Velocidade é expressa em unidade de concentração/tempo (p. ex. M.seg 1, µ M.min 1, nm. seg 1, etc.). A unidade da constante de velocidade sempre contém o tempo recíproco (p.ex. seg 1, min 1, etc.) e dependendo da reação pode também conter uma ou mais concentrações recíprocas. Por exemplo, se o lado direito da equação é k[a] [B], então a constante de velocidade deve ter unidades de M 1. tempo 1 assim a expressão terá como unidade M.tempo -1. Ordem de reação. Toda a ordem cinética de uma reação é definida pelo número de moléculas que aparecem no lado direito da expressão da velocidade da reação. A ordem de reação com relação a espécies particulares é definida se estas espécies aparecem uma ou mais vezes. Por exemplo, se o lado direito de uma equação de velocidade é [A] m [B] n, então a ordem de reação será m + n e a ordem de reação será "m" com relação à [A] e "n" com relação à [B]. Ordem zero significa que a velocidade de reação não varia em função da concentração das espécies presentes. Não existem reações bioquímicas que sejam totalmente de ordem zero. Para as reações mostradas acima, rxn (1) e rxn (2) são de primeira ordem por que apenas uma concentração aparece no lado direito da expressão matemática da velocidade. Rxn (3) é uma reação de segunda ordem de uma forma geral e de primeira ordem em relação à [A], e primeira ordem em relação à [B]. Rxn (4) é de segunda ordem de forma geral e de segunda ordem em relação à [A]. Rxn (5) é de terceira ordem de forma geral de segunda ordem em relação à [A] e de primeira ordem em relação à [B]. Reação (6) é de segunda ordem de forma geral e de primeira ordem em relação à [A] e [B] e de ordem zero em relação à [C]. Unidades e magnitude das constantes de velocidade: Para processos de primeira ordem, incluindo mudanças conformacionais (rxn 1) e reações de dissociação (rxn 2), a constante de velocidade tem unidade de tempo -1. Para reações de segunda ordem ou processos de associação bi moleculares, como a reação rxn (3) e rxn (4), a constante de velocidade de segunda ordem tem unidade de M -1 tempo -1. Existem limites superiores de magnitude para constantes de velocidade de primeira e segunda ordem. Para processos de primeira ordem, reações mais rápidas não podem exceder a velocidade das vibrações moleculares ou as rotações de ligação e assim existe um limite de 2

3 aproximadamente seg -1 para a constante de velocidade. A reação de dobramento protéico mais rápida conhecida ocorre com uma constante de velocidade de 10 6 seg -1. Mudanças conformacionais simples podem ocorrer com uma constante de velocidade de 10 9 seg -1. Para reações de segunda ordem, o limite superior da constante de velocidade é determinado pela velocidade de difusão, aproximadamente 10 9 M -1 seg -1, uma vez que duas moléculas não podem reagir se não colidirem. Não existe limite inferior para constante de velocidade. Em geral, para um determinado intervalo de concentração, alta constante de velocidade significa reação rápida e baixas ou pequenas constantes de velocidade significam reações lentas. Observe, entretanto, que uma alta constante de velocidade garante uma alta velocidade. A reação bi-molecular A + B! AB pode ter uma constante de velocidade de difusão limitada (10 9 M -1 seg -1 ) mas ela não vai ocorrer a nenhuma velocidade de a concentração de [A] ou [B] for zero. Diagramas de reação coordenada, como mostrado abaixo para uma reação de desnaturação de proteína, são geralmente usados para ilustrar a idéia de que existem barreiras energéticas para o processo cinético. O maior, menos estável ponto no perfil de energia livre é chamado de estado de transição. Mesmo se a reação á energeticamente favorável (ela ocorre à baixa energia livre), existe uma certa quantidade de energia livre de ativação é necessária para que a reação ocorra. Para a reação de desdobramento protéico, um alto G u * * é necessário para quebrar as ligações não covalentes que mantém a estrutura protéica unida. No diagrama da reação coordenada, grandes barreiras (valores altos para G * * ) representam reações lentas e vice-versa. Expressão da velocidade para sistemas dinâmicos. Relação entre cinética e constante de equilíbrio. Existem relativamente poucas reações na biologia que são verdadeiramente irreversíveis. Assim, quando escrevemos a reação do tipo: AB! A + B 3

4 pode não ser razoável ou possível ignorar a reação reversa. Se considerarmos ambas, reações de dissociação e associação unidas, AB < == > A + B então a equação de velocidade combinada é: d[ab]/dt = kon [A] [B] - koff [AB] onde k on e k off significam as constantes de velocidade de associação e dissociação, respectivamente. A porção k on [A] [B] é a velocidade na qual AB é formado a partir da associação de A + B. A porção k off [AB] é a velocidade na qual AB é perdido pela dissociação. Quando o sistema atinge o equilíbrio, não existira variação nas concentrações de [AB], [A], e [B]. assim, d[ab]/dt = kon [A] [B] - koff [AB] = 0 e [A] [B]/[AB] = koff /kon = Kd Isto mostra a relação entre a constante de velocidade e a constante de equilíbrio para uma reação de dissociação bi molecular. Para uma reação unimolecular como dobramento/desdobramento de uma proteína no equilíbrio, N < == > U d[n]/dt = kf [U] - ku [N] = 0 e [U]/[N] = ku /kf = Ku Medindo velocidades e determinando as constantes de velocidades: Existem algumas informações importantes para desenhar experimentos para medir as constantes de velocidades. Primeiro, deve haver um ensaio que possa distinguir reagentes de produtos. Isto poderia incluir ensaios espectroscópicos (UV, absorbância, fluorescência, dicroísmo circular, NMR, etc.) ou ensaios nos quais reagentes e produtos são separados e identificados através de suas mobilidades em gel filtração, HPLC, eletroforese etc... Segundo, o experimento deve focalizar predominantemente um simples processo (por exemplo, associação ou dissociação). Para um experimento de dissociação, deve-se começar com o complexo AB numa concentração X e fazer-se diluições de forma que a reação de re-associação seja insignificante. Para uma reação de associação, A e B seriam misturados no tempo zero se escolheria o intervalo de tempo no qual não se observa uma substancial dissociação de AB (antes da formação de AB), ou seja, onde a velocidade de dissociação de AB seja insignificante. Para medir a velocidade de um processo uni-molecular como de dobramento protéico, deve-se iniciar com a proteína desnaturada em ph baixo (ou um desnaturante como uréia) e então coloca-la em solução com ph 7 onde o dobramento é favorecido. Como qualquer reação que atinge o equilíbrio, as velocidades de avanço e de reversão são similares. Em geral, para estudar a cinética do avanço ou da reversão de reações isoladas, trabalha-se nas condições mais distantes do equilíbrio possível. A questão final é como analisar os dados cinéticos para determinar a constante de velocidade. Os exemplos abaixo mostram caminhos simples para analisar a cinética de reações uni ou bi moleculares. 4

5 Reação de primeira ordem (uni molecular) exemplo: mudança conformacional ou reações de dissociação Reação: Equação de velocidade : Solução integrada: A! B -d[a]/dt = k[a] ƒd[a]/[a] = -k.dt ln [A] = -kt + ln [Ao ] [A] = [Ao ] e -kt Para qualquer reação de primeira ordem (como A! B), existirá um decaimento exponencial na concentração do reagente, como mostrado a esquerda do diagrama abaixo, para uma reação com [A 0 ] = 10-3 M e k= 0,1 seg -1. Uma vez que o produto é formado com a perda do reagente, também existirá um aumento exponencial da concentração do produto. Para qualquer reação de primeira ordem, também existe uma relação linear entre o ln [reagente] e o tempo, conforme mostrado no lado direito do diagrama abaixo. A inclinação desta reta corresponde k. Observe, entretanto, que plotando ln [produto] versus tempo, não se obtém uma reta. 5

6 Uma boa relação linear para dados de experimentos cinéticos plotados com ln [reagentes] versus tempo fornece uma evidência que a reação é de primeira ordem ou de pseudoprimeira ordem (veja abaixo) A meia vida (t 1/2 ) para a reação é o tempo requerido para que a metade dos reagentes seja convertida em produtos. Para uma reação de primeira ordem, t 1/2 é uma constante e pode ser calculado a partir da constante de velocidade como: t 1/2 = -ln(0.5)/k = 0.693/k No experimento mostrado acima, a meia vida é 6,9 segundos. A relação recíproca entre meia vida e a constante de velocidade é uma forma para se ter uma idéia do tempo em que a reação ocorre. Assim, para k= 0,01 seg 1, a meia vida é aproximadamente 70 segundos. para k= 10 seg -1, a meia vida seria cerca de 0,07 segundos ou 70 mili-segundos. A meiavida para reações de primeira ordem, também é independente do ponto de partida. Se ela demora 20 seg. para que a primeira metade das moléculas reaja, ela também vai levar 20 segundos para que a outra metade das moléculas reajam, e assim sucessivamente. O fato de que a meia vida é constante durante uma reação de primeira ordem, significa que, a qualquer tempo uma fração constante de moléculas reagentes tem energia suficiente para atravessar a barreira cinética e assim se torne produto. Isto faz sentido por que a energia de uma população de moléculas é distribuída randomicamente de acordo com a distribuição de Boltzmann. 6

7 Reação de segunda ordem (dimerização) Reação: Equação de velocidade: Solução integrada: 2A! A2 - d[a]/dt = k[a]2 ƒd[a]/[a]2 = -k.dt 1/[A] = k (t) + 1/[A0 ] [A] = A0 /(A0 kt + 1) A última equação é uma equação hiperbólica e a reação de segunda ordem, e a cinética de dimerização também é chamada de cinética hiperbólica. Os gráficos mostrados abaixo são para a reação de dimerização com [A 0 ] = 10-6 M e k = 2x10 5 M -1 seg -1. O decaimento de [A] com o tempo (gráfico da esquerda) nesta reação de segunda ordem parece superficialmente similar à reação de primeira ordem descrita acima mas na verdade é diferente como pode ser visto na equação que descreve a variação de [A] com o tempo. 7

8 O caminho mais simples para determinar a constante de velocidade neste caso, é plotar 1/[A] versus tempo e determinar a inclinação a qual será igual a k. Observe, entretanto, que plotando 1/ [A 2 ] versus tempo não obtemos uma linha reta. A expressão para a meia-vida desta reação de segunda ordem é: t 1/2 = 1/(k[A 0 ]) Para os dados mostrados, a meia vida é 5 segundos. É importante notar, entretanto, que as meias-vidas para reações de segunda ordem, são fundamentalmente diferentes para as de primeira ordem. No caso de primeira ordem, t 1/2 é independente da concentração inicial da reação. Aqui, a mesma reação realizada com diferentes concentrações iniciais terão diferentes meias-vidas. Além disso, se demora 5 segundos para que metade das moléculas reaja com uma dada concentração de A, então levará 10 segundos para que a outra metade das moléculas reajam. Isto num sentido intuitivo, por que a colisão entre duas moléculas de A torna-se mais difícil à medida que a concentração de A diminui. Reações bi-moleculares com reagentes diferentes: Reação: A + B! AB Equação de velocidade : -d[a]/dt = -d[b]/dt = k[a][b] Solução integrada: COMPLICADA EXCETO SOB CONDIÇÕES ESPECIAIS Devido ao fato de que uma solução geral para esta classe de reações bi-moleculares é complicada, três caminhos são geralmente utilizados para determinar a constante de velocidade de segunda ordem. (1) Misturar A e B no tempo zero e estimar a velocidade inicial da reação com diferentes concentrações dos reagentes. No t=0, [A]=[A 0 ] e [B]=[B 0 ], e a constante de velocidade é calculada como: k = (velocidade inicial)/([a 0 ][B 0 ]) (2) Fazer o experimento com [A 0 ] = [B 0 ]. Agora a solução integrada é idêntica à reação de dimerização mostrada acima e a constante de velocidade pode ser obtida pelo gráfico de 1/[A] ou 1/[B] versus tempo. (3) Fazer o experimento onde [A 0 ] >> [B 0 ] ou vice-versa. Se A está em grande excesso em relação a B, então a concentração de [A] não irá variar significativamente durante a reação e a equação de velocidade pode ser escrita como: -d[b]/dt = k[a 0 ][B] = k aparente [B] onde k aparente = k[a 0 ] 8

9 Observe que esta expressão de velocidade agora tem a mesma forma e a mesma solução integrada do que uma reação de primeira ordem. Poderíamos agora plotar ln [B] vs. tempo e obter uma linha reta com uma inclinação igual a k [A 0 ]. Pela manipulação das concentrações iniciais, nós transformamos uma reação bi-molecular em uma reação de pseudoprimeira-ordem. Ao contrario de uma reação de primeira ordem real, entretanto, não obtemos o mesmo valor de k aparente nos experimentos realizados com diferentes concentrações iniciais de [A 0 ]. Testando Mecanismos de reação: Um dos usos da cinética em bioquímica é estabelecer qual o modelo que melhor representa a reação de interesse. Por exemplo, temos uma interação monomérica de uma proteína ligadora de DNA (R) que liga a um fragmento de 20 pares de bases (D) mas não sabemos se a proteína liga como um monômero ou um dímero. Se medirmos a velocidade inicial da reação de associação e encontrarmos que varia linearmente com [R], então o modelo preferencial seria: R + D! RD desde que d[r]/dt = -k[r][d] Inversamente, se nós medirmos a velocidade inicial da reação e associação e encontrarmos que ela varia na proporção de [R] 2 então isto suporta o modelo: 2R + D! R 2 D desde que d[r]/dt = -k[r] 2 [D] Experimentos cinéticos, por si só, também podem ser usados para excluir certos modelos, mas não podem ser usados para distinguir modelos que tenham a mesma dependência de concentração para velocidade. No exemplo acima, especificamos que a proteína ligante de DNA livre era monomérica, e se não conhecêssemos a forma oligomérica para a proteína livre? Então, a variação linear da velocidade inicial de associação aumentando com o aumento da concentração inicial da proteína seria consistente com o modelo de reação expresso abaixo: R + D! RD; ou R2 + D! R2 D; ou R4 + D! R4 D; etc. Neste caso, uma informação estrutural adicional sobre a forma oligomérica da proteína livre e/ou ligada seria necessária para distinguir entre os diferentes modelos de reação. 9

10 POSSÍVEIS PONTOS DE CONFUSÃO: Reações do tipo 2R + D! R 2 D; 2R 2 + D! R 4 D e 2R 4 + D! R 8 D todas predizem uma dependência quadrada da velocidade de associação sobre a concentração protéica por que, em cada caso duas moléculas livres da proteína se combina no complexo. De forma similar, R + D! RD; R 2 + D! R 2 D; e R 4 + D! todas predizem a mesma dependência linear da velocidade de associação sobre a concentração protéica por que não existe variação na forma oligomérica da proteína quando passa da forma livre para forma ligada. Assim a informação chave para a cinética não é se um oligômero está ligado mas se existe variação na forma oligomérica durante a reação de ligação. Reações de passos múltiplos: Reações freqüentemente não ocorrem num passo simples mas envolve a formação de um ou mais intermediários. Considerando a reação 2R + D! R 2 D discutida acima. É improvável que três moléculas (2 de proteína e um sítio do DNA) irão colidir no mesmo instante na solução para formar um complexo tri-molecular. Existem dois caminhos distintos nos quais a associação do complexo R 2 D deve ocorrer através de sucessivas reações bi-moleculares: 2R + D! R 2 + D! R 2 D e/ou 2R + D! RD + R! R 2 D os quais são mostrados no diagrama abaixo: Estes mecanismos não precisam ser mutuamente exclusivos, mas se apenas um ou outro representa o caminho da associação, que tipo de experimento poderia ajudar a decidir entre um modelo ou outro? Um deles seria a identificação de possíveis intermediários. Será que a proteína forma um dímero na ausência de DNA em concentrações suficientemente altas? Seria a espécie intermediária, com comportamento eletroforético esperado para RD, vista 10

11 em um experimento de separação em gel? A detecção das espécies R 2 ou RD, por si mesma, não comprovaria que estas espécies participam como intermediários iniciais de uma determinada via de reação. Por exemplo, desenhando a ligação de DNA-dímero como: mas talvez as espécies intermediárias R 2 e RD tenham estruturas do tipo Tais espécies poderiam ser formadas mas não ter relevância no caminho de associação. Se as espécies R 2 e RD apresentarem estruturas mais razoáveis como então isto indicaria a possibilidade de que elas foram associadas como intermediários, porém não necessariamente seja uma garantia disso. A regra da significância cinética afirma que para uma espécie ser um autêntico intermediário numa reação, ela deve se formar e desaparecer numa velocidade maior do que a do produto final. Assim, se as espécies R 2 ou RD forem detectadas na reação mas aparecem numa velocidade menor do que a formação de R 2 D, então isto as excluiria como intermediários significantes no caminho da associação. De forma semelhante, se R 2 for um autentico intermediário, então a adição de D a R 2 purificado resultará na formação de R 2 D a uma velocidade muito mais rápida do que seria com 2R e D. Passo velocidade determinante: Em reações de múltiplos passos, um passo elementar é muito mais lento do que outros passos e se torna o determinante da velocidade. Isto quer dizer, a velocidade de toda a reação é determinada pela velocidade deste passo ou desta etapa lenta. Em alguns casos, aumentando a velocidade de alguns passos elementares observa-se um efeito insignificante na velocidade total da reação. Em sistemas biológicos, 11

12 os passos velocidade determinante ou velocidade limitante, são os passos susceptíveis a regulação. No exemplo unimolecular mostrado abaixo, a constante de velocidade para o passo B! C é muito menor do que a constante de velocidade do passo A! B. Assim, B! C é o passo lento e fundamental e determinante da velocidade (velocidade limitante). Quando escrevemos reações como acima, sem reações reversas, estamos assumindo que a constante de velocidade para estas reações reversas é muito pequena em relação a constante de velocidade para as reações de avanço. Se, neste modelo, iniciarmos a reação com A puro, o que acontecerá? A rapidamente será convertido em B, mas como B é convertido em C mais lentamente, a concentração de B irá aumentar, como mostrado abaixo, e C aparecerá com uma cinética muito menor. Aqui, B está de acordo com a lei de significação cinética, uma vez que se forma e desaparece mais rapidamente que C aparece. Observe também que a formação de C ocorre com uma meia vida de 0,7 segundos e a velocidade de 1 seg 1, a magnitude da constante de velocidade para o passo elementar e mais lento. 12

13 Agora considere a mesma reação porém com as constantes de velocidade invertidas: Agora A!B é o passo velocidade limitante. A medida que B é formado, ele é rapidamente convertido em C e, como mostrado abaixo, relativamente pouco B se acumula. Em geral, os intermediários só se acumulam em quantidades significantes quando eles precedem um passo lento ou velocidade limitante de todo o processo. 13

14 Nesta reação, B forma-se mais rápido do que C no início da reação (satisfazendo a regra da significância cinética) mas pode ser difícil de mostrar experimentalmente a menos que se utilize um método extremamente sensível para medir pequenas quantidades de B e C. Novamente, observe que a formação de C ocorre com uma meia vida de 0,7 segundos e a velocidade é aproximadamente de 1 seg 1, o qual é a constante de velocidade para o passo elementar e mais lento. Velocidade Limitante pré-equílibrio: Até aqui, temos enfocado reações que ocorrem numa simples direção. Uma classe comum de reações cinéticas envolve situações como: Neste caso, uma vez que uma molécula de B é formada ela pode formar C ou se converter novamente em A. Com as constantes de velocidades mostradas, deveria estar claro que a maioria de B seria revertido em A por que a constante de velocidade para este passo é 10 vezes maior do que a constante de velocidade para a conversão de B! C. Assim, deveria demorar 10 vezes mais, para formar tanta quantidade de C neste modelo, do que no modelo onde não temos a conversão de B! A. Nestes sistemas, A e B efetivamente se equilibram. K ab = [A]/[B] = (200 s -1 )/(1 s -1 ) = 200. assim B nunca será maior do que A. A velocidade de formação de C é apenas 20 s -1 [B]. Substituindo [B] temos d[c]/dt = (20 s -1 )/(200) [A] = 0.1 s- 1 [A] Assim a meia vida de formação de C é aproximadamente de 7 segundos, considerando que era de 0,7 segundos quando a conversão de B! A não ocorria. Este é o mesmo resultado que chegamos acima apenas considerando a velocidade em que B se forma como intermediário entre A e C. Observe que neste caso, a reação global é mais lenta do que qualquer outro passo. 14

15 O caso discutido acima é um exemplo específico para a reação geral: Neste tipo de reação, se k -1 >> k 2 (B forma A muito mais rapidamente do que forma C), então existirá um pré-equilibrio velocidade limitante e a velocidade de formação de C será dependente das três constantes de velocidade. d[c]/dt = (k 1 k 2 )/(k -1 ) [A] equação 3.1 Se, entretanto, assumirmos que k 2 >> k -1 (B forma C muito mais rapidamente do que forma A), então podemos efetivamente ignorar a reação reversa de B! A e a única questão será se k 1 ou k 2 é o passo velocidade limitante. 15

16 Aproximação do equilíbrio estacionário: A cinética de reação deste tipo também pode ser analisada escrevendo a expressão global para a variação de B e ajustando esta como sendo zero. Fazendo isto, estamos assumindo que a concentração de B rapidamente atinge uma constante, um equilíbrio estacionário cujo valor não muda apreciavelmente durante a reação. d[b]/dt = k1[a] - k -1 [B] - k 2 [B] = k 1 [A] - (k -1 +k 2 )[B] = 0 substituindo d[c]/dt = k 2 [B] temos: (k -1 +k 2 )[B] = k1[a] [B] = (k1)/(k -1 + k 2 ) [A] agora se, k -1 >> k 2 d[c]/dt = (k 1 k 2 )/(k -1 + k 2 ) [A] d[c]/dt (k 1 k 2 )/(k -1 ) [A] esta é a mesma equação: 3.1 em contraste, se k 2 >> k -1 d[c]/dt (k 1 k 2 )/(k 2 ) [A] = k 1 [A] equação: 3.2 A equação 3.2 é equivalente a se dizer que o passo k -1 é o passo velocidade limitante de todo o processo. A aproximação do estado de equilíbrio estacionário para um intermediário não se aplica se o intermediário é formado a uma velocidade muito maior do que sua quebra. Por exemplo, com as constantes de velocidade mostradas abaixo: B é formado muito mais rapidamente do que desaparece e a concentração de B irá aumentar mais do que atingir o equilíbrio estacionário. (Observe que a cinética aqui deveria ser muito similar àquelas mostradas na página 12) A maior parte de B irá formar C ao invés de voltar a A e assim a reação global deve ocorrer a uma constante de velocidade de aproximadamente 1 seg Embora k 2 >> k -1 usando a equação 3.2 (a qual só é valida se d[b]/dt 0) neste exemplo poderia nos levar a uma resposta errada uma vez que não é válido assumir o equilíbrio estacionário. 16

17 Estas idéias gerais sobre um rápido pré-equilíbrio e a aproximação do estado de equilíbrio estacionário para intermediários, são igualmente aplicáveis a reações nas quais o primeiro passo é bi-molecular. Por exemplo, Com as constantes de velocidades mostradas, AB irá dissociar a A + B numa velocidade 10 vezes mais rápido que se isomeriza em AC. Comparado à reação na qual a velocidade de dissociação de AB foi insignificante, isto irá demorar a formação de AC num fator de aproximadamente 10. Nós podemos novamente fazer uma aproximação de estado de equilíbrio estacionário para [AB] e deduzir a seguinte expressão: d[ac]/dt = (k 1 k 2 )/(k -1 + k 2 ) [A][B] (k 1 k 2 )/(k -1 ) [A][B] desde que k 2 >> k -1 Veremos expressões como esta última em alguns tipos de reações catalisadas por enzimas. Novamente, supomos o estado de equilíbrio estacionário para analisar o processo global, onde a velocidade de formação de AB é muito mais rápida do que sua quebra. Quando os intermediários não podem ser determinados diretamente: Algumas vezes os intermediários numa determinada reação não podem ser isolados como espécies moleculares distintas ou caracterizadas diretamente. Nestes casos, a existência de intermediários, é muitas vezes derivada da passagem da fase de cinética lenta para a de grande aceleração, ou de outros comportamentos multifásicos (p.ex. quando se observa o aparecimento de duas fases exponenciais para uma reação unimolecular) Entretanto, mesmo quando a cinética de uma reação unimolecular mostra uma única fase exponencial, a ausência de intermediários detectáveis não pode ser usada como prova de estes não existam. Isso quer dizer que, se os intermediários existem, eles devem desaparecer a velocidade significantemente mais rápida do que eles são formados. Isto, por sua vez, geralmente significa são relativamente mais instáveis do que os reagentes e/ou os produtos. Por exemplo, durante o processo de dobramento protéico só são detectadas espécies moleculares que estão totalmente desnaturadas ou totalmente na forma nativa. Neste caso, parece improvável que uma cadeia polipeptídica desordenada possa adquirir a conformação nativa através de um simples passo, uma vez que isto implicaria no ajuste simultâneo de centenas de ângulos de ligação simultaneamente. Este é provavelmente um caso no qual quaisquer que sejam os intermediários eles são instáveis e não se acumulam durante o curso da reação. Diagramas das reações coordenadas para reações com intermediários: Conforme observado acima, quando se escreve uma reação com múltiplos passos que ocorre em uma única direção, simplesmente ignoramos as reações reversas o que é justificado se estas 17

18 reações ocorrem a uma constante de velocidade muito menor do que as que ocorrem no sentido do avanço da reação. O diagrama da reação coordenada para este tipo de situação tem uma representação conforme mostrado abaixo: Observe que a energia livre de A é maior do que a de B a qual é maior do que para C. A reação ocorre no sentido decrescente. Também, a barreira energética a ser vencida entre B e C é maior indicando que este é o passo mais lento. Finalmente, B está localizado no fundo de um "vale" profundo de baixa energia indicando que ele deve se acumular. No próximo diagrama de reação coordenada, a primeira barreira a ser ultrapassada é a maior, e assim correspondendo ao passo mais lento na reação. B agora está num "vale" muito mais raso do que no exemplo anterior e dessa forma vai se acumular menos. 18

19 Se agora nós considerarmos uma rápida reversão de B! A, nós teremos um diagrama de reações coordenadas como o mostrado abaixo: A primeira barreira ainda corresponde ao passo mais lento por que, à distância de A para ultrapassar a primeira barreira, representa a maior variação de energia livre. B, entretanto, agora é menos estável (tem maior energia livre) do que A. Uma vez que B é produzido, a reação reversa para A é cinéticamente mais favorável do que a reação de avanço até C uma vez que a barreira energética no sentido reverso é menor do que no sentido do avanço. Em casos como este, onde existe um passo velocidade limitante préequilíbrio, o ponto de maior diferença de energia livre (agora o pico entre B e C) não representa o passo mais lento, mas representa o passo velocidade limitante ou velocidade determinante da reação global. Considere, por exemplo, o que aconteceria se a constante de velocidade para a conversão de B! C fosse 100 vezes maior: 19

20 Agora, uma vez que as moléculas A sejam transformadas em B, elas vão imediatamente se transformar em C. A barreira entre A e B novamente se tornou o passo velocidade limitante. Acelerando a reação B! C, a reação global agora ocorre mais rápido já que não há um passo velocidade limitante pré-equilíbrio. Este é um caso onde a regulação de um passo que não seja o passo mais lento, pode ter conseqüências cinéticas na reação global de A! C. 20