ENGINEERING ARTICULAR CARTILAGE USING NEWLY DEVELOPED CARRAGEENAN BASED HYDROGELS ABSTRACT

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1 ENGINEERING ARTICULAR CARTILAGE USING NEWLY DEVELOPED CARRAGEENAN BASED HYDROGELS ABSTRACT Articular cartilage holds specific functionality in the human body creating smooth gliding areas and allowing the joints to move easily without pain. However, due to its avascular nature and to the low metabolic activity of the constituent cells-the chondrocytes, cartilage has a low regenerative potential. The current surgical options to treat damaged cartilage are not long lasting and involve frequent revisions. Tissue engineering may provide an alternative approach for cartilage repair, involving the use of hydrogels which can act as a temporary artificial matrix for encapsulated cells, supporting their growth and inducing the extracellular matrix (ECM) production. The use of hydrogels is regarded as advantageous for cartilage tissue engineering because they provide similar environment to the native ECM where cells reside. Up to date, many different hydrogel systems based on natural polymers have been developed for cartilage regeneration. Among these systems, marine polysaccharides origin hydrogels have received increasing attention since they are seen as an inexpensive potential source of material with owing to their specific characteristics and composition. In the present PhD thesis it was investigated the potential of carrageenan, a sulphated polysaccharide that can be extracted from red algae, as an alternative hydrogel for cartilage regeneration. Carrageenans offer appealing assets for cell encapsulation/delivery, derived from their chemical composition and gelation process. Therefore, the main aims of this thesis were: - develop and characterize different blends of carrageenan with alginate, processed into different formats; - study the chondrogenic differentiation of stem cells loaded in κ-carrageenan hydrogels; - asses the viability, proliferation and chondrogenic potential of different cell types, laden in κ- carrageenan hydrogels; - evaluate the effect of cryopreservation methods on the viability and chondrogenic differentiation of stem cells encapsulated in κ-carrageenan hydrogels; - study the in vitro and in vivo biocompatibility of κ-carrageenan hydrogels. In the first part of this thesis, different formulations of alginate and carrageenan hydrogels and different processing parameters were considered in order to determine the best conditions required to achieve the most adequate response in terms of the mechanical stability, cell viability and functionality of the vii

2 developed systems. The morphology, size and structure of the hydrogels and their degradation behavior and mechanical properties were evaluated as well as their cytotoxicity and ability to encapsulate chondrocytes. The results obtained indicated that the different formulations, both in the form of beads and fibers have considerable potential as cell-carrier materials for cell delivery in tissue engineering/regenerative medicine applications. The results obtained in this study also showed that κappa carrageenan is more suitable for the proposed application than ιota carrageenan. Subsequently, further studies were designed to assess the ability of κappa-carrageenan hydrogels to support the chondrogenic differentiation of human adipose derived stem cells (hascs). Moreover, the chondrogenic potential of hascs encapsulated in κ-carrageenan hydrogels was compared to hydrogels laden with other cell types, namely human primary (nasal) chondrocytes (hncs) and a chondrocytic cell line (ATDC5). The in vitro cellular behavior of the encapsulated cells within κ-carrageenan hydrogel was analyzed after different culturing periods by mechanical tests and using biochemical assays as well as cytohistological and real time RT-PCR analysis. The results from the analysis of the cells encapsulated in the developed systems indicated that κ- carrageenan hydrogels support the viability, proliferation and chondrogenic differentiation of hascs. Interestingly, the mechanical analysis demonstrated an increase in stiffness and in the viscoelastic properties of κ-carrageenan gels with encapsulated hascs along the time in culture with chondrogenic media, as compared to hydrogels without cells or cell laden hydrogels cultured in basal media. Furthermore, these studies have also demonstrated that the 3 types of cells encapsulated in κ- carrageenan hydrogels showed good cellular viability and proliferation up to 21 days of culture and the cell laden hydrogels showed to be positive for specific cartilage markers. Nevertheless, the results also showed that hascs embedded in κ-carrageenan hydrogels proliferate faster and exhibit higher expression levels of the typical cartilage markers analysed as compared to hncs or ATDC5 cells. Based on this data, it was possible to conclude that κ-carrageenan hydrogel provides a good support for culture and differentiation of encapsulated cells and that hascs may provide an advantageous alternative to primary chondrocytes, currently used in clinical treatments of cartilage defects/diseases. These bioengineered constructs are anticipated to participate in a cartilage regeneration strategy providing temporary habitation for cell survival, proliferation and production of extracellular matrix which is expected to replace the hydrogel, enhancing the regeneration of native tissues in clinical settings. Nevertheless, the time span needed for obtaining a functional cartilage substitute using tissue engineering strategies, together with the need for specific patient oriented constructs stimulated our interest for assessing the possibility of developing of off-the shelf products, based on cryopreservation, that would provide clinical substitute available as needed and could be adapted to an viii

3 autologous immediate solution for the patient. Therefore, the following experiments were planned to examine the effects of cryopreservation on the chondrogenic differentiation characteristics of hascs encapsulated in κ-carrageenan hydrogels. The results obtained show that the hydrogels withstand the cryopreservation with dimethyl sulfoxide, maintaining their structural integrity, while assisting cells proliferation and chondrogenic potential after cryopreservation. Thus, cell encapsulation systems of natural based hydrogels seem to be an interesting approach for the preservation of cartilage tissue engineered products. The final stage of the work developed involved studies on the in vitro and in vivo biocompatibility of κ- carrageenan hydrogels. The in vitro cytotoxicity of the hydrogels was evaluated under standard tests using the L929 cell line, and chemiluminescence assays were performed using human polymorphonuclear cells. The in vivo study was accomplished by the subcutaneously implantation of carrageenan hydrogels discs in Wistar rats for up to 15 days. The obtained findings indicated that κ- carrageenan hydrogels induced a reduced and insignificant signal concerning the detection of superoxide and hydroxyl anions and seems to induce a low inflammatory response and thus, can be further studied to be used in target biomedical applications. Moreover, a recent preliminary in vivo study showed that loading κ-carrageenan with cells previously exposed to chondrogenic medium led to higher stability of the construct in vivo (rat subcutaneous model) as compared to hydrogels cultured in basal media or hydrogels without cells. Such accomplishment is probably related to an increase in the extracellular matrix deposition which may result in progressive increase of the mechanical properties, in agreement with the results obtained in the in vitro studies performed with κ-carrageenan. Overall, the work developed under this thesis allowed to conclude that κ-carrageenan hydrogels laden with human adipose derived stem cells show a great potential to be tailored to specific applications in cartilage tissue regeneration approaches. ix

4 Desenvolvimento de novos hidrogéis baseados em carragenina para aplicação em engenharia de cartilagem articular RESUMO A cartilagem articular desempenha funções específicas no corpo humano criando áreas de deslizamento lisas e quase sem atrito que permitem a movimentação das articulações sem causar dor. No entanto, devido à sua natureza avascular e a reduzida atividade metabólica das células que a constituem condrócitos, possui um potencial de regeneração baixo. As atuais opções cirúrgicas para o tratamento da cartilagem danificada não são duradouras e geralmente obrigam a repetição de procedimentos e/ou recorrência dos sintomas. A engenharia de tecidos proporciona uma abordagem alternativa na regeneração da cartilagem, envolvendo o uso de hidrogéis que atuam como uma matriz artificial temporária para encapsular células, suportar a sua proliferação e produção de matriz extracelular. O uso de hidrogéis é considerado vantajoso na engenharia de tecido cartilagíneo, uma vez que estes proporcionam um ambiente similar ao da matriz extracelular onde as células nativas residem. Até à data, foram desenvolvidos vários hidrogéis com base em polímeros naturais para regenerar cartilagem. Entre estes, os polissacáridos de origem marinha têm recebido atenção crescente já que são considerados uma fonte barata e praticamente inesgotável de material, e também pelas suas características e composição. Nesta tese de doutoramento foi investigado o potencial da carragenina, um polissacárido sulfatado extraído das algas vermelhas, como hidrogel alternativo para regeneração de cartilagem. As carrageninas possuem aributos apelativos para o encapsulamento/libertação de células, dada a sua composição química e processo de gelificação. Assim, os principais objetivos desta tese foram: - desenvolver e caracterizar diferentes misturas de carragenina com alginato, processadas de diferentes formas; - estudar a diferenciação condrogénica de células estaminais encapsuladas/cultivadas em hidrogéis de κ-carragenina; - avaliar a viabilidade, proliferação e potencial condrogénico de diferentes tipos celulares encpasuladas em hidrogéis de κ-carragenina; - analisar o efeito de métodos de criopreservação na viabilidade e capacidade de diferenciação condrogénica de células estaminais encapsuladas em hidrogéis de κ-carragenina; - investigar a biocompatibilidade in vitro e in vivo de hidrogéis de κ-carragenina. xi

5 Na primeira parte desta tese, foram consideradas diferentes formulações de hidrogéis de alginato e carragenina, bem como diferentes parâmetros de processamento de forma a determinar as condições ótimas para obter a resposta mais adequada em termos de estabilidade mecânica, viabilidade celular e funcionalidade dos sistemas desenvolvidos. A morfologia, tamanho e estrutura dos hidrogéis, a sua degradação e propriedades mecânicas foram avaliadas, bem como a sua citotoxicidade e capacidade de mantera viabilidade de durante o encapsulamento de condrócitos. Os resultados obtidos indicaram que diferentes formulações, quer sob a forma de esferas quer sob a forma de fibras, possuem um potencial considerável como sistemas de encapsulamento/libertação de células em aplicações de engenharia de tecidos/medicina regenerativa. Os resultados obtidos revelaram que a κapa-carragenina é mais adequada para a aplicação proposta do que a ιota-carragenina. Consequentemente, os estudos posteriores foram planeados para avaliar a capacidade dos hidrogéis de κ-carragenina de suportar a diferenciação condrogénica de células estaminais humanas derivadas de tecido adiposo (hascs). Para além disso, o potencial condrogénico de hascs encapsuladas em κ- carragenina foi comparado com o de hidrogéis semeados com outros tipos celulares, nomeadamente condrócitos (nasais) primários humanos (hncs) e uma linha celular condrocítica (ATDC5). O comportamento celular in vitro das células encapsuladas foi investigado após diferentes períodos de cultura, através de testes mecânicos, ensaios bioquímicos, citohistologia e RT-PCR. Os resultados destes ensaios indicaram que os hidrogéis de κ-carragenina mantêm a viabilidade, proliferação e diferenciação condrogénica das hascs. Interessantemente, a análise mecânica mostrou um aumento das propriedades mecânicas dos géis de κ-carragenina contendo hascs encapsuladas, ao longo do tempo de cultura com meio condrogénico, quando comparados com os géis sem células ou géis com células mas em meio basal. Os resultados demonstraram igualmente que os três tipos celulares encapsulados em hidrogéis de κ- carragenina mantiveram boa viabilidade celular e proliferação até aos 21 dias de cultura, e os géis semeados com as células expressaram positivamente marcadores específicos de cartilagem. No entanto, os resultados mostraram que as hascs encapsuladas na κ-carragenina proliferaram mais rapidamente e exibiram níveis de expressão de marcadores típicos de cartilagem mais elevadoss do que os observados em hncs e ATDC5. Com base nestes dados foi possível concluir que o hidrogel de κ-carragenina providencia um bom suporte para a cultura e diferenciação de células nele encapsuladas, e que as hascs podem ser uma alternativa vantajosa aos condrócitos primários usados atualmente em tratamentos clínicos de defeitos/patologias da cartilagem. xii

6 Antecipa-se que estes hidrogéis possam ser utilizados em estratégias de regeneração de cartilagem, providenciando habitat temporário para as células encapsuladas, aseegurando a sua viabilidade, proliferação e produção de matriz extracelular, que deverá substituir o hidrogel, intensificando a regeneração do tecido nativo em situações clínicas. Apesar das vantagens, é necessario um certo tempo para obter um substituto funcional da cartilagem com este tipo de abordagens de engenharia de tecidos, há uma clara necessidadede produtos "off-the-shelf", que possam ser imediatamente disponibilizados e adaptados a uma solução autóloga para o paciente. Isto pode ser evantualmente conseguido recorrendo a métodos baseados na criopreservação. Por este motivo, as experiências seguintes foram planeadas para examinar os efeitos da criopreservação na diferenciação condrogénica característica das hascs encapsuladas em κ-carragenina. Os resultados obtidos mostraram que o hidrogel suporta a criopreservação com dimetilsulfóxido (DMSO) mantendo a sua integridade estrutural e a capacidade de manter a proliferação e diferenciações celulares. O último estádio do trabalho desenvolvido envolveu estudos in vitro e in vivo de biocompatibilidade dos hidrogéis de κ-carragenina. A citotoxicidade dos hidrogéis foi avaliada por ensaios standards utilizando uma linha celular (L929) e por ensaios de quimoluminescência com células polimorfonucleadas humanas. O estudo in vivo envolveu a implantação subcutânea de discos de κ-carragenina em ratos Wistar durante 15 dias. Os resultados obtidos demosntraram que os hidrogéis de κ-carragenina induziram uma resposta insignificante na detecção de aniões superóxido e hidroxil, bem como resposta inflamatória mínima podendo ser estudados para aplicações biomédicas. Um estudo preliminar recente, in vivo revelou que a κ-carragenina semeada com células prédiferenciadas em meio condrogénico apresenta maior estabilidade in vivo (modelo de implante subcutâneo em rato), comparando com géis previamente cultivados com meio basal ou géis sem células. Este facto deve-se muito provavelmente ao aumento de deposição de matriz extracelular que pode resultar no aumento das propriedades mecânicas, em concordância com os resultados obtidos in vitro. Resumindo, o trabalho desenvolvido e apresentado nesta tese, permitiu concluir que os hidrogéis de κ- carragenina encapsulados com células humanas derivadas do tecido adiposo, revelam grande potencial para serem adaptados a aplicações específicas de terapias de regeneração de cartilagem. xiii