Bactérias de Gram negativo produtoras de β-lactamases e mecanismos moleculares implicados na expressão da resistência à tigeciclina

Transcrição

1 Universidade de Lisboa Faculdade de Ciências Departamento de Biologia Animal Bactérias de Gram negativo produtoras de β-lactamases e mecanismos moleculares implicados na expressão da resistência à tigeciclina Stephanie Vieira Barbosa Dissertação Mestrado em Biologia Humana e Ambiente 2013

2 Universidade de Lisboa Faculdade de Ciências Departamento de Biologia Animal 2013 Bactérias de Gram negativo produtoras de β-lactamases e mecanismos moleculares implicados na expressão da resistência à tigeciclina Stephanie Vieira Barbosa Dissertação Mestrado em Biologia Humana e Ambiente Orientadores Professora Doutora Manuela Caniça, Instituto Nacional de Saúde Dr. Ricardo Jorge Professora Doutora Maria Teresa Rebelo, Departamento de Biologia Animal, Faculdade de Ciências, Universidade de Lisboa 2013

3 Agradecimentos Agradecimentos À Doutora Manuela Caniça, por me receber no laboratório, proporcionando a realização desta tese de mestrado, assim como pela orientação, disponibilidade e conhecimentos partilhados, que tanto acrescentou na minha formação. À Doutora Eugénia Ferreira, pela orientação e contribuição no laboratório, bem como pela boa disposição que tornou a rotina mais agradável. À Doutora Teresa Rebelo, pelo acompanhamento e disponibilidade demonstrada. À Doutora Vera Manageiro pela paciência e pela enorme ajuda no desenvolvimento das práticas laboratoriais, que tanto contribuiu na conclusão deste trabalho. À Daniela Dias por toda a ajuda prestada no laboratório e partilha de conhecimentos, principalmente na parte final deste trabalho. À Constança Simões e Joana Almeida pela amizade, pelos bons momentos e por me ajudarem nos momentos que eu precisei. Aos meus pais, por todo amor e apoio constante, apesar das centenas de quilómetros que nos separam. À minha família por todo apoio, principalmente à minha irmã Cássia pelo momentos compartilhados e pela paciência ao longo deste ano. Aos meus amigos, que sabem quem são, pela amizade, incentivo e por terem acreditado sempre em mim. À Doutora Manuela Caniça e ao Instituto Nacional da Saúde Dr. Ricardo Jorge pelas condições de trabalho que me proporcionaram e colaboração prestada sem as quais não seria possível a realização deste trabalho. i

4 Resumo Resumo A emergência de bactérias de Gram negativo com resistência aos antibióticos, particularmente, as produtoras de β-lactamases, tem vindo a comprometer as opções de tratamento disponíveis. Este trabalho teve como objetivo avaliar a suscetibilidade e caracterizar os mecanismos de resistência à tigeciclina, pela ação de bombas de efluxo, em 211 isolados de Gram negativo, assim como esclarecer a atividade in vitro deste antibiótico em bactérias com suscetibilidade diminuída a outras classes de antibióticos, sobretudo β-lactâmicos, e com eventual produção de β-lactamases. Os testes de suscetibilidade permitiram identificar 73% de isolados suscetíveis à tigeciclina e 89% com multirresistência, dos quais 70% eram suscetíveis à tigeciclina. Verificou-se ainda uma percentagem elevada de suscetibilidade à colistina e amicacina, bem como de suscetibilidade diminuída aos antibióticos β-lactâmicos, com exceção dos carbapenemes. A caracterização molecular dos mecanismos de resistência aos antibióticos β- lactâmicos, permitiu identificar a produção de β-lactamases: penicilinases, ESBLs da família CTX-M [CTX-M-15-(tipo), CTX-M-1, CTX-M-32 e CTX-M-14], TEM (TEM- 4, TEM-10), SHV (SHV-2, SHV-12, SHV-55) e GES (GES-7), bem como carbapenemases (KPC-3) e AmpC (CMY-2, DHA-1, MIR-tipo); 65% destes isolados apresentaram suscetibilidade à tigeciclina. A caracterização molecular dos mecanismos implicados na resistência à tigeciclina, permitiu identificar no gene ramr de 9 dos 20 isolados de Klebsiella pneumoniae com suscetibilidade diminuída àquele antibiótico, uma deleção, uma inserção e de uma a quatro mutações pontuais num mesmo gene, contribuindo para a sobre-expressão da bomba de efluxo AcrAB. No gene marr de 12 isolados de Escherichia coli (5 com e 6 sem suscetibilidade diminuída à tigeciclina), foram detetadas duas mutações pontuais, que sugerem estar associadas à resistência a diversos antibióticos, podendo contribuir para fenótipos de multirresistência. Este estudo evidencia diversidade de β-lactamases, sobretudo ESBL, e emergência de carbapenemases em isolados de Gram negativo. No entanto, estes isolados mantêm uma importante suscetibilidade aos cabapenemes, colistina, amicacina e tigeciclina. Palavras-chave: tigeciclina, Gram negativo, β-lactamase, bomba de efluxo ii

5 Abstract Abstract The emergence of antibiotic resistant Gram negative bacteria, particularly β- lactamase-producing bacteria, seriously compromises the efficacy of the treatment options available. This study aimed to evaluate the antimicrobial susceptibility, and to characterize the tigecycline resistance due to efflux pump production, in a collection of 211 Gram negative clinical isolates. Moreover, it meant to clarify the in vitro activity of tigecycline against isolates resistant to other antibiotic classes, such as β-lactams, eventually related to β-lactamase production. Susceptibility testing evaluation identified 73% of tigecycline susceptible isolates, and 89% of multidrug resistance, among which 70% were susceptible to this antibiotic. Although there was a high prevalence of β-lactam resistance, carbapenems were still effective against the majority of the isolates studied, as well as colistin and amikacin. Globally, molecular characterization allowed the detection of penicillinases, ESBLs from families CTX-M [CTX-M-15-(type), CTX-M-1, CTX-M-32 and CTX-M- 14], TEM (TEM-4, TEM-10), SHV (SHV-2, SHV-12, SHV-55) and GES (GES-7), as well as carbapenemases (KPC-3) and AmpC β-lactamases ( CMY-2, DHA-1, MIRtipo); among those, 65% were susceptible to tigecycline. The molecular analyses of tigecycline resistance mechanisms revealed one deletion, one insertion and one to four point mutations in the ramr gene that might contribute to the overexpression of AcrAB efflux pump, in 9 out of 20 Klebsiella pneumoniae isolates showing reduced susceptibility. Considering the analyses of the marr gene from 12 Escherichia coli isolates (5 with and 6 without tigecycline resistance), two point mutations were detected, which might be accountable for the resistance to several antimicrobial classes, contributing to multidrug resistance scenarios. This study showed a great diversity of β-lactamases, such as ESBL, and the emergence of carbapenemases in Gram negative bacteria. Nevertheless, the studied isolates still showed decisive susceptibility patterns to carbapenems, colistin, amikacin and tigecycline. Key-words: tigecycline, Gram negative, β-lactamases, efflux pump iii

6 Índice Índice Agradecimentos... i Resumo... ii Abstract... iii Índice de Figuras... vi Índice de Tabelas... vii I. Introdução Antibióticos e Resistências Classes de Antibióticos Mecanismos de resistência aos antibióticos Resistência Intrínseca Resistência Adquirida Antibióticos β-lactâmicos Mecanismo de ação dos antibióticos β-lactâmicos Mecanismos de resistência aos antibióticos β-lactâmicos β-lactamases Classificação de β-lactamases Família TEM Família SHV Família CTX-M Família OXA β-lactamases AmpC Carbapenemases Tigeciclina Estrutura química e mecanismo de ação da tigeciclina Espetro de ação da tigeciclina Resistência à tigeciclina Bomba de efluxo AcrAB-TolC da família RND Objetivos II. Material e Métodos Isolados bacterianos Caracterização fenotípica: suscetibilidade aos antibióticos Método de microdiluição Preparação da solução-mãe dos antibióticos Preparação das concentrações dos antibióticos iv

7 Índice Preparação das diluições dos antibióticos na microplaca Preparação do inóculo bacteriano Método de difusão por disco Método de E-teste Teste de sinergia com meropeneme Caracterização genotípica: mecanismos de resistência aos antibióticos Extração de DNA Pesquisa de genes que codificam β-lactamases Pesquisa de genes implicados na resistência à tigeciclina Eletroforese em gel de agarose e visualização de DNA Purificação dos produtos de PCR Sequenciação nucleotídica Caracterização bioquímica: β-lactamases Extração de β-lactamases Teste do Nitrocefin Gel de focagem isoelétrica Preparação do gel de migração Migração Preparação do gel de revelação III. Resultados Avaliação da suscetibilidade de bactérias de Gram negativo aos antibióticos Suscetibilidade a 8 classes de antibióticos Suscetibilidade à tigeciclina Análise da multirresistência Caracterização genotípica dos isolados produtores de β-lactamases ESBLs, PMAβ e penicilinases Carbapenemases β-lactamases de diferentes famílias produzidas por bactérias de Gram negativo com ou sem suscetibilidade à tigeciclina Contribuição da bomba de efluxo AcrAB-TolC na atividade da tigeciclina Análise da sequência nucleotídica do gene marr em E. coli Análise da sequência nucleotídica do gene ramr em K. pneumoniae IV. Discussão V. Bibliografia v

8 Índice de Figuras Índice de Figuras Figura 1 - Estrutura química dos antibióticos β-lactâmicos (Adaptado de Martín et al., 2010; Nordmann et al., 2012) Figura 2 - Estrutura química dos inibidores de β-lactamases (Adaptado de Nordmann et al., 2012) Figura 3 - Classificação das ß-lactamases relacionando o perfil do substrato e dos inibidores de ß-lactamases com a sua estrutura molecular. Cb, carbapenemes; Cf, cefalosporinas de primeira geração; CA, ácido clavulânico; EDTA, ácido etilenodiaminotetracético; Esc, Cefalosporina de espectro alargado; M, monobactamos; Pn, penicilinas (Adaptado de Bush, 2013) Figura 4 - Estrutura química da tigeciclina (A) e da minociclina (B) (Dean et al. 2003) Figura 5 - Estrutura do sistema de efluxo AcrAB-TolC em E.coli (Adaptado de Alvarez-Ortega et al., 2013) Figura 6 - Organização genética do locus marab em E. coli ; PmarI e PmarII, promotores (Alekshun e Levy, 1999) Figura 7 - Via de regulação da bomba de efluxo AcrAB: a proteina RamR reprime a expressão do gene rama que codifica o activador trancripcional acrab. (Adaptado de Yamasaki et al., 2013) Figura 8 - Distribuição, pelos hospitais de origem, de 211 isolados que constituem a amostra do estudo Figura 9 - Representação da diluição seriada dos antibióticos na microplaca Figura 10 - Esquema utilizado para interpretação dos resultados obtidos no teste de sinergia com meropeneme para deteteção de metalo-β-lactamases, carbapenemases de classe A ou D e β- lactamases AmpC (cromossómicas ou plasmídicas). BOR, ácido borónico; CLOX, cloxacilina Figura 11 - Distribuição de 199 isolados suscetíveis e não suscetíveis à tigeciclina por grupo etário dos doentes. TG, tigeciclina; S, sucetíveis; I/R, suscetibilidade diminuída; (Não contempla 12 (6%) dos isolados do estudo, cuja idade dos doentes se desconhece) Figura 12 - Distribuição do (A) número de isolados e (B) percentagem, de acordo com a suscetibilidade à tigeciclina, multirresistência e produção de β-lactamases; OXA: OXA-1-tipo (n=9); ND, mecanismo de resistência não detetado ou sobrexpressão de β-lactamases (n=16). a Isolados cuja produção de ESBL CTX-M (isoladamente ou com coexpressão de KPC ou PMAβ) não implicou a eventual pesquisa da presença de outros genes blaesbl. TGC, tigeciclina; S, suscetível; I/R, suscetibilidade diminuída; MDR, multirresistente Figura 13 - Alinhamento das sequências do gene ramr com a sequência de referência (Klebsiella pneumoniae subsp. pneumoniae MGH (CP000647)) do nucleótido G 401 ao nucleótido G 480, representando a deleção nucleotídica do nucleótido G 411 ao nucleótido A 421 no isolado TG Figura 14 - Alinhamento das sequências do gene ramr com a sequência de referência (Klebsiella pneumoniae subsp. pneumoniae MGH (CP000647)) do nucleótido G 1 ao nucleótido G 80, representando a inserção de 2 nucleótidos entre o nucleótido 50 e 51 no isolado TG vi

9 Índice de Tabelas Índice de Tabelas Tabela 1 - Representação de antibióticos, mecanismos de ação e alvos moleculares (Chopra et al., 2002; Murray et al., 2007; Tenover, 2006)... 2 Tabela 2 - Classificação das cefalosporinas e exemplos de antibióticos (Murray et al., 2007) Tabela 3 - Origem de genes que codificam β-lactamases AmpC (Adaptado de Livermore e Woodford, 2006) Tabela 4 - Antibióticos, concentrações das soluções-mãe, solventes e potência dos antibióticos Tabela 5 - Antibióticos, concentração da solução CIM, diluentes e concentrações testadas na determinação da concentração inibitória mínima Tabela 6 - Sequência de primers para pesquisa de diferentes genes bla utilizados no PCR e na sequênciação a, tamanho dos respetivos fragmentos e temperatura de hibridação Tabela 7 - Sequência e tamanho dos primers ramr e marab e as condições utilizadas nas reações de amplificação Tabela 8 - Suscetibilidade de 211 isolados de Gram negativo a antibióticos de diferentes classes Tabela 9 - Intervalo de concentrações inibitórias mínimas (CIM) nas quais 50% (CIM 50 ) e 90% (CIM 90 ) dos isolados foram inibidos por 7 antibióticos de 4 classes diferentes, em relação ao total de isolados (n=211) e à suscetibilidade ou suscetibilidade diminuída à tigeciclina Tabela 10 - Distribuição de 187 isolados com multirresistência aos antibióticos, em 211 isolados de Gram negativo, realçando os perfis com e sem suscetibilidade diminuída à tigeciclina, por espécie bacteriana Tabela 11 - Genótipo de 177 isolados, de diferentes espécies, com suscetibilidade diminuída à cefotaxima, detetados como possíveis produtores de ESBL por métodos fenotípicos: β- lactamases expressas, perfil de resistência aos antibióticos β-lactâmicos e distribuição por hospital a b Tabela 12 - Genótipo de 2 isolados com suscetibilidade diminuída à cefotaxima, produtores de ESBL, mas sem evidência fenotípica de produção de ESBL: β-lactamases expressas, perfil de resistência aos antibióticos β-lactâmicos e distribuição por hospital Tabela 13 - Genótipo de 32 isolados com ou sem suscetibilidade diminuída à cefotaxima, sem evidência fenotípica e genotípica de produção de ESBL: β-lactamases expressas, perfil de resistência aos antibióticos β-lactâmicos e distribuição por hospital Tabela 14 - Isolados produtores de carbapenemase de classe A (KPC-3) Tabela 15.β-lactamases identifcadas nos 211 isolados estudados, com e sem bla CTX-M Tabela 16 - Mutações nucleotídicas no gene marr da estirpe de referência e de 12 isolados clínicos e respetivas substituições aminoacídicas Tabela 17 - Mutações nucleotídicas no gene ramr da estirpe de referência MGH (CP000647) e de 20 isolados clínicos e respetivas substituições aminoacídicas encontradas vii

10 Introdução I. Introdução 1. Antibióticos e Resistências A descoberta e o desenvolvimento dos antibióticos no início do século XX com a introdução das sulfonamidas nos anos 30 e da penicilina nos anos 40 foi um marco importante na história da medicina. Desde então foram descobertas várias classes de antibióticos, quer de origem natural, quer sintética: aminoglicosídeos, glicopeptídeos, macrólidos, fluoroquinolonas, entre outras (Van Hoek et al., 2011). Contudo, as bactérias desenvolveram mecanismos de resistência aos antibióticos, resultante, essencialmente, da utilização inapropriada e indiscriminada dos antibióticos. Isto devese à pressão seletiva, que resulta do uso, sem controlo, de antibióticos, tanto a nível clínico, como ao nível comercial, proporcionando a seleção e predominância de microrganismos resistentes (Rice, 2009). A emergência e a prevalência destes microrganismos constitui uma das mais importantes ameaças à saúde pública, a nível mundial, com extensivas implicações na morbilidade e mortalidade, assim como no aumento dos custos em saúde e cuidados médicos (Fraise, 2006) Classes de Antibióticos As classes de antibióticos utilizados no tratamento de infeções por bactérias são determinadas de acordo com os alvos em que atuam e com os mecanismos de ação que determinam (Tabela 1). Os antibióticos podem exercer uma atividade bactericida ou bacteriostática, podendo ser classificados da seguinte forma: anti-parietais, quando inibem a síntese de peptidoglicano da parede celular; anti-membranares, quando alteram a permeabilidade da membrana celular; inibidores da síntese proteica, associando-se a alvos ribossomais; inibidores da síntese dos ácidos nucleicos; e anti-metabólitos, quando alteram o metabolismo energético da célula bacteriana (Murray et al., 2007; Tenover, 2006). A classe dos β-lactâmicos e glicilciclinas, com maior relevância para o presente trabalho, encontram-se descritas com mais detalhe nos tópicos 2 e 3, respetivamente. 1

11 Introdução Tabela 1 - Representação de antibióticos, mecanismos de ação e alvos moleculares (Chopra et al., 2002; Murray et al., 2007; Tenover, 2006) Antibióticos/Classe Mecanismo de ação Alvo molecular Exemplos de antibióticos β-lactâmicos Inibição da síntese de Transpeptidases, peptidoglicano carboxipeptidases Penicilinas Glicopeptídeos Inibição da síntese de Vancomicina, Peptidoglicano peptidoglicano teicoplanina Aminoglicosídeos Inibição da síntese proteica Gentamicina, Subunidade 30S do Amicacina, ribossoma Kanamicina Fluoroquinolonas Inibição da síntese de DNA DNA Girase e Ácido nalidíxico DNA topoisomerase IV Ciprofloxacina Macrólidos Inibição da síntese proteica Subunidade 50S do ribossoma Eritromicina Polimixinas Rompimento da estrutura Fosfolípidos da membrana fosfolipídica da membrana celular celular Colistina Fosfomicinas Inibição da síntese de UDP-N-acetilglucosamina peptidoglicano enolpiruvato transferase Fosfomicina Inibição da descarboxilação Nitrofuranos oxidativa do piruvato a Acetil-coenzima A Nitrofurantoína acetil-coenzima A Sulfonamidas Inibição da síntese do ácido fólico Dihidropteroato sintetase Sulfametoxazol Trimetoprim Inibição da síntese do ácido fólico Dihidrofolato redutase Trimetoprim Tetraciclinas Inibição da síntese proteica Subunidade 30S do Minociclina; ribossoma Doxiciclina Glicilciclinas Inibição da síntese proteica Subunidade 30S do ribossoma Tigeciclina 1.2. Mecanismos de resistência aos antibióticos Apesar da diversidade de classes e mecanismos de ação dos antibióticos, as bactérias desenvolveram estratégias de resistência a estes compostos (Barbosa e Levy, 2000a). Os mecanismos de resistência aos antibióticos incluem: alteração do local de 2

12 Introdução ação do antibiótico; alteração da permeabilidade da membrana celular, impedindo a entrada e ação do antibiótico nas células bacterianas; ativação de bombas de efluxo na célula bacteriana, conduzindo à expansão do antibiótico para o exterior antes de alcançar o local alvo; aumento da produção da enzima alvo e inativação do antibiótico por ação enzimática (Van Hoek et al., 2011; Tenover, 2006). De realçar que a resistência das bactérias pode ser intrínseca ou adquirida Resistência Intrínseca A resistência intrínseca, é transmitida apenas verticalmente, de geração em geração, fazendo parte das propriedades inatas, fenotípicas de microrganismos de uma mesma espécie (Alekshun e Levy, 2007). As bactérias de Gram negativo, por exemplo, são intrinsecamente resistentes aos glicopeptídeos. Isto resulta da incapacidade de difusão via canais de porina na membrana externa celular, uma vez que a molécula é muito grande (Woodford e Ellington, 2007) Resistência Adquirida Por outro lado, a resistência adquirida ocorre quando populações de bactérias inicialmente suscetíveis se tornam resistentes a um antibiótico. O aumento da prevalência da resistência aos antibióticos está, assim, principalmente associado à aquisição e disseminação de genes de resistência aos antibióticos pela ação seletiva e pela pressão do antibiótico utilizado (Tenover, 2006). As bactérias podem adquirir resistência aos antibióticos, quer modificando o seu genoma por mutação, quer por diferentes sistemas de transferência genética (Levy e Marshall, 2004; Tenover, 2006). A resistência adquirida por meio de mutação e seleção denomina-se evolução vertical, pois as bactérias com novas mutações, responsáveis pela resistência, são selecionadas pela utilização dos antibióticos e estes eliminam as bactérias suscetíveis, enquanto as resistentes sobrevivem e disseminam (Tenover, 2006). A resistência adquirida pode ainda resultar da aquisição de elementos genéticos, tais como os plasmídeos, transposões e integrões, que permitem a transferência de DNA no genoma ou ainda entre células bacterianas, facilitando a transmissão e disseminação de genes de resistência aos antibióticos através de mecanismos genéticos (Levy e 3

13 Introdução Marshall, 2004). A transferência genética denominada evolução horizontal constitui o principal meio de difusão de genes de resistência, que pode ocorrer entre isolados da mesma espécie ou entre isolados de diferentes espécies ou géneros (Woodford e Ellington, 2007). A transferência genética entre as bactérias pode ocorrer de diferentes formas: transformação, conjugação e transdução. A transformação é um mecanismo pelo qual o DNA libertado por uma bactéria (dadora) é captado e incorporado por outras bactérias (recetoras). Na conjugação há contacto físico bactéria-bactéria e o material genético é transferido através de pilis de uma célula (dadora) para a outra (recetora). A transdução é um processo que consiste na transferência de genes de resistência por intermédio de um bacteriófago (Alekshun e Levy, 2007; Barbosa e Levy, 2000a; Tenover, 2006). Através destes mecanismos de troca genética muitas bactérias podem tornar-se resistentes a várias classes de antibióticos; se a resistência ocorrer em 3 ou mais classes de antibióticos estruturalmente diferentes, trata-se de bactérias multirresistentes, as quais constituem a causa de maior preocupação, tanto a nível hospitalar como a nível da comunidade (Levy e Marshall, 2004). 2. Antibióticos β-lactâmicos Os antibióticos β-lactâmicos são a classe mais variada de antibióticos, sendo amplamente utilizada em todo o mundo devido à sua eficácia terapêutica, baixa toxicidade e propriedades farmacocinéticas (Livermore e Woodford, 2006; Suárez e Gudiol, 2009). É um grupo de antibióticos com a característica comum de exibir um anel ß-lactâmico na sua estrutura molecular (Fig.1). Esta classe divide-se em diferentes grupos: penicilinas, cefalosporinas, cefamicinas, inibidores de ß-lactamases (ácido clavulânico, sulbactam e tazobactam), carbapenemes e monobactamo (Drawz e Bonomo, 2010; Murray et al., 2007). As penicilinas têm como estrutura básica um núcleo pename bicíclico com um anel tiazolidina (com um átomo de enxofre), um anel β-lactâmico e uma cadeia lateral ligada ao grupo amina (Fig. 1). As penicilinas são frequentemente produzidas por espécies Penicillium e Aspergillus e são classificadas de acordo com o espetro de atividade (Liras e Martín, 2006; Martín et al., 2010). 4

14 Introdução Figura 1 - Estrutura química dos antibióticos β-lactâmicos (Adaptado de Martín et al., 2010; Nordmann et al., 2012). A penicilina G e a penicilina V pertencem ao grupo das penicilinas naturais, tendo sido a penicilina G (Benzilpenicilina) a primeira a ser desenvolvida. A partir desta produziram-se novas estruturas e, consequentemente, descobriram-se novos antibióticos β-lactâmicos, atualmente utilizados na clínica médica (Drawz e Bonomo 2010). As penicilinas dividem-se em diferentes subgrupos: as penicilinas resistentes às penicilinases (p.e. oxacilina e cloxacilina), aminopenicilinas (p.e. amoxicilina), carboxipenicilinas (p.e. ticarcilina) e ureidopenicilinas (p.e. piperacilina). Os inibidores de β-lactamases são compostos associados a alguns antibióticos β- lactâmicos de forma a inativar as β-lactamases e potenciar a ação do antibiótico. O ácido clavulânico, o sulbactam e o tazobactam (Fig. 2) são inibidores de β-lactamases irreversíveis, frequentemente utilizados na prática clínica (Murray et al., 2007). Figura 2 - Estrutura química dos inibidores de β-lactamases (Adaptado de Nordmann et al., 2012). As cefalosporinas constituem outro grupo de antibióticos β-lactâmicos, tendo, no entanto, maior atividade sobre as bactérias de Gram negativo em comparação com as penicilinas. O anel β-lactâmico encontra-se associado a um anel di-hidrotiazina (Fig.1). 5

15 Introdução São derivados do ácido 7-aminocefalosporânico, obtidos inicialmente do fungo Cephalosporium. Os antibióticos deste grupo encontram-se classificados em quatro gerações, de acordo com o espetro de atividade e período de introdução na prática clínica (Tabela 2) (Murray et al., 2007). As cefamicinas (cefoxitina, cefotetan) (Fig.1) são semelhantes às cefalosporinas, contudo, apresentam mais estabilidade à hidrólise mediada pelas β-lactamases, devido à substituição de um radical de oxigénio no local do enxofre no anel dihidrotiacina (Murray et al., 2007). Tabela 2 - Classificação das cefalosporinas e exemplos de antibióticos (Murray et al., 2007). Classificação de cefalosporinas Cefalosporinas de 1ª geração Cefalosporinas de 2ª geração Cefalosporinas de 3ª geração Cefalosporinas de 4ª geração Exemplos de antibióticos Cefazolina; Cefalotina; Cefapirina; Cefradina Cefaclor; Cefuroxima Cefixima; Cefotaxima; Cefriaxona; Ceftazidima; Cefoperazona; Cefpodoxima Cefepima; Cefpiroma Os carbapenemes (imipeneme, meropeneme, ertapeneme e doripenem) constituem um grupo de antibióticos β-lactâmicos com amplo espetro de ação, frequentemente utilizados para o tratamento de infeções graves e infeções causadas por isolados produtores de β-lactamases de espetro alargado (ESBL - Extended-Spectrum ß- Lactamase) (Patel e Bonomo, 2013). Como característica comum deste grupo de antibióticos, o anel tiazolidina contém um átomo de carbono no local do átomo de enxofre (Liras e Martin, 2006). Por fim, os monobactamos (aztreonam) (Fig.1) são compostos que apresentam uma estrutura monocíclica e possuem um espetro de ação reduzido, sendo ativos apenas em bactérias aeróbias de Gram negativo e inativos em bactérias de Gram positivo e anaeróbias (Liras e Martin 2006; Murray et al., 2007). Deste modo, as modificações nos radicais R e R' da cadeia lateral determinam o espetro de ação dos antibióticos β-lactâmicos, as propriedades farmacocinéticas e a resistência às β- lactamases. 6

16 Introdução 2.1. Mecanismo de ação dos antibióticos β-lactâmicos Os antibióticos ß-lactâmicos atuam na fase parietal da biossíntese do peptidoglicano. O peptidoglicano é o principal constituinte da parede celular, sendo constituído por cadeias de 10 a 65 resíduos de dissacarídeos formados por moléculas de N-acetilglucosamina (NAG) intercaladas com moléculas de ácido N-acetilmurâmico (NAM). As proteínas de ligação à penicilina (PBPs, Penicillin-binding proteins) são enzimas (p.ex., transpeptidases, transglucosidases, carboxipeptidases), da família das serina proteases, que catalisam a síntese dos polímeros de peptidoglicano na parede celular, conferindo rigidez às bactérias. Assim, os antibióticos β-lactâmicos atuam através da ligação às PBPs específicas da parede celular bacteriana, visto que possuem grande afinidade para estas proteínas. Este mecanismo resulta na acilação das PBPs, tornando-as incapazes de realizar a reação de transpeptidação, a principal etapa na síntese do peptidoglicano. Este mecanismo ativa as autolisinas que degradam a parede celular e causam a destruição das células (Murray et al., 2007). Como resultado, a parede celular das bactérias entra em citólise, ou morte celular, devido à pressão osmótica (Van Hoek et al., 2011) Mecanismos de resistência aos antibióticos β-lactâmicos Os mecanismos de resistência aos antibióticos ß-lactâmicos incluem (1) produção de ß-lactamases, que constitui o principal mecanismo de resistência em bactérias de Gram negativo, (2) a alteração no local alvo de ligação, (3) diminuição da permeabilidade da membrana celular, e ainda (4) sistemas de bombas de efluxo (Drawz e Bonomo, 2010). A resistência mediada pela alteração no local alvo de ligação resulta de alterações no sítio ativo das PBPs, o que pode determinar a diminuição da afinidade e aumento de resistência aos antibióticos β-lactâmicos. Este mecanismo é raro em bactérias de Gram negativo, sendo principalmente encontrado em bactérias de Gram positivo (Livermore e Woodford, 2006). As porinas, proteínas de membrana externa (OMP, Outer membrane protein), são canais membranares das bactérias de Gram negativo que atuam como canal de 7

17 Introdução entrada dos antibióticos β-lactâmicos. Assim, alterações na expressão ou perda de porinas podem diminuir a permeabilidade dos antibióticos β-lactâmicos na célula. No entanto, este mecanismo não é suficiente para conferir resistência, sendo geralmente encontrado em associação com a produção de β-lactamases (Drawz e Bonomo, 2010). A resistência mediada por bombas de efluxo é outro mecanismo, que consiste num sistema de transporte ativo intrínseco ou adquirido. Ao serem expressas, as bombas de efluxo são capazes de bombear diversos antibióticos do citoplasma para fora da célula. Desta forma, em muitos casos, estão associados a fenótipo de multirresistência em isolados de Gram negativo (Piddock, 2006). A resistência mediada pelas bombas de efluxo pode derivar de alterações nos genes repressores e/ou hiperexpressão dos seus reguladores transcricionais. Este mecanismo confere, geralmente, baixos níveis de resistência aos antibióticos, pois mesmo possuindo múltiplos antibióticos como substratos, podem não conferir elevado nível de resistência. Contudo, a diminuição da concentração intracelular do antibiótico permite à bactéria sobreviver até que sejam selecionadas bactérias com mutações que podem determinar níveis de resistência clinicamente importantes (Webber e Piddock, 2003) β-lactamases A hidrólise dos antibióticos ß-lactâmicos pelas ß-lactamases é o mecanismo de resistência mais comum a esta classe de antibióticos em bactérias de Gram negativo (Bush e Jacoby, 2010). Estas enzimas podem ser classificadas em penicilinases, específicas para as penicilinas, cefalosporinases, que hidrolisam preferencialmente as cefalosporinas, carbapenemases que inativam os carbapenemes, ou ainda ß-lactamases de espetro alargado (ESBLs) capazes de hidrolisar as penicilinas, as cefalosporinas de primeira, segunda e terceira geração e o aztreonam (Van Hoek et al., 2011; Nordmann et al., 2012). As ß-lactamases desempenham assim um papel crucial na seleção da terapia mais adequada, visto que as penicilinas, as cefalosporinas e os carbapenemes são frequentemente incluídos no tratamento de várias doenças infeciosas (Bush e Jacoby 2010). Estima-se que existem, pelo menos, ß-lactamases descritas em isolados clínicos (Bush, 2013). 8

18 Introdução As ESBLs são enzimas de grande relevância, uma vez que se tem verificado uma ampla disseminação a nível mundial nas últimas décadas. Atualmente, existe uma grande variedade de ESBLs, derivando, a maioria, das β-lactamases TEM-1, TEM-2 e SHV-1, após introdução de substituições aminoacídicas no sítio ativo. Os genes bla ESBL são geralmente adquiridos por mecanismos de transferência genética, associados a elementos genéticos móveis, como os plasmídeos (Paterson e Bonomo, 2005). Já se encontram descritas centenas de ESBLs diferentes, sendo a maioria das famílias CTX- M, TEM e SHV Classificação de β-lactamases As ß-lactamases são classificadas de acordo com a sua homologia na sequência de aminoácidos (classificação de Ambler) e de acordo com a preferência por um determinado substrato e perfil de inibição (classificação de Bush e Jacoby) (Bush e Jacoby, 2010). Segundo a classificação de Ambler as β-lactamases dividem-se em quatro classes: A, B, C e D (Figura 3). Aquelas que pertencem às classes A, C e D são denominadas β-lactamases-serina, pois possuem um resíduo de serina no centro ativo para facilitar a catálise e aquelas que pertencem à classe B contêm um ião de zinco, sendo designadas de metalo-β-lactamases (Jacoby e Munoz-Price, 2005). A classificação de Bush divide as ß-lactamases em três grupos (1-3). Os grupos 1 e 2 são β-lactamases-serina e o grupo 3 são metalo-β-lactamases. As β-lactamases do grupo 1, associadas à classe C, hidrolisam as cefalosporinas e são resistentes à ação dos inibidores de β-lactamases. O grupo 2, que inclui as classes A e D, representa o grupo com vários subgrupos e com uma ampla variedade de enzimas com diferentes perfis de substratos (Figura 3). O grupo 3 engloba as metalo β-lactamases da classe B de Ambler. Estas enzimas hidrolisam todos os antibióticos β-lactâmicos, à exceção dos monobactamos (Bush e Jacoby, 2010). 9

19 Introdução Figura 3 - Classificação das ß-lactamases relacionando o perfil do substrato e dos inibidores de ß- lactamases com a sua estrutura molecular. Cb, carbapenemes; Cf, cefalosporinas de primeira geração; CA, ácido clavulânico; EDTA, ácido etilenodiaminotetracético; Esc, Cefalosporina de espetro alargado; M, monobactamos; Pn, penicilinas (Adaptado de Bush, 2013). Atualmente, tem-se verificado uma emergência de ESBLs, sobretudo da família CTX-M (classe A de Ambler), de ß-lactamases AmpC (classe C de Ambler) mediada por plasmídeos e de carbapenemases (das classes A, B e D de Ambler), nomeadamente da família KPC, IMP e VIM, produzidas por Enterobacteriaceae e por outras bactérias de Gram negativo (Bush, 2013; Van Hoek et al., 2011; Jacoby, 2009) Família TEM As enzimas TEM pertencem à classe A de Ambler e aos grupos funcionais 2b, 2be e 2br segundo a classificação de Bush e Jacoby (Fig.3) (Bush e Jacoby, 2010). No início da década de 60 foi descrita na Grécia a primeira β-lactamase TEM-1 mediada por plasmídeos, num isolado de Escherichia coli. A sua designação advém de Temoniera, nome do paciente a quem foi detetada a enzima pela primeira vez. Esta enzima disseminou-se por todo o mundo, anos depois da sua descrição, sendo a mais encontrada em bactérias de Gram negativo. A enzima TEM-1 é uma penicilinase, que tem como substrato as penicilinas e cefalosporinas de primeira geração, como a cefalotina e cefaloridina (Bradford, 2001). 10

20 Introdução A enzima TEM-2 foi a primeira enzima derivada de TEM-1 a ser descrita. Ambas apresentam o mesmo perfil hidrolítico, contudo TEM-2 tem um promotor mais ativo e um ponto isoelétrico (pi) de 5,6 diferente do TEM-1, com pi de 5,4. A enzima TEM-3, reportada em 1989, foi a primeira enzima derivada de TEM-1 a exibir o fenótipo de ESBL. Desde então, foram descritas outras enzimas derivadas de TEM, entre as quais β-lactamases resistentes aos inibidores (IRT, Inhibitor Resistant TEM) e ESBLs, representando estas últimas a maioria (Bradford, 2001; Paterson e Bonomo, 2005). Atualmente existem mais de 200 β-lactamases TEM, principalmente ESBLs (Jacoby, 2012) Família SHV As β-lactamases SHV estão incluídas na classe A de Ambler e nos subgrupos funcionais 2b, 2be e 2br de Bush e Jacoby (Bush e Jacoby, 2010). As enzimas desta família derivam da enzima SHV-1. Esta β-lactamase possui 68% de homologia com a sequência aminoacídica de TEM-1 e apresenta uma estrutura semelhante (Jacoby e Munoz-Price, 2005). A enzima SHV-1 é, frequentemente, codificada por genes cromossómicos em Klebsiella pneumoniae (Bradford, 2001). Ao contrário das β-lactamases TEM, as alterações no gene bla SHV, que dão origem às variantes de SHV ocorrem em menor número de posições aminoacídicas diferentes. A maioria das variantes de SHV, conferindo um fenótipo ESBL, são caracterizadas pela substituição de uma serina por uma glicina na posição 238. Outras variantes de SHV, relacionadas com SHV-5, possuem também a substituição de uma lisina por glutamato na posição 240. A maioria das enzimas derivadas de SHV-1 possui fenótipo de ESBLs, contudo sete variantes estão descritas como β-lactamases resistentes aos inibidores. Globalmente, foram já descritas 182 variantes de β-lactamases SHV (Jacoby, 2012) Família CTX-M As enzimas da família CTX-M têm origem em genes cromossómicos de espécies de Kluyvera spp. e têm como substratos as cefalosporinas de terceira geração, preferencialmente a cefotaxima. Ao contrário das enzimas da família TEM e SHV, 11

21 Introdução hidrolisam mais a cefotaxima do que a ceftazidima (Bradford, 2001; Paterson e Bonomo, 2005; Jacoby e Munoz-Price, 2005). As β-lactamases CTX-M pertencem à classe A de Ambler e subgrupo funcional 2be de Bush e Jacoby (Bush e Jacoby, 2010). A enzima CTX-M-1 foi inicialmente descrita na década de 80 na Alemanha, tendo sido identificada num isolado clínico de E. coli (Bauernfeind et al., 1990). Posteriormente, verificou-se uma expansão das enzimas desta família em várias partes do mundo e em vários isolados clínicos, sobretudo em membros da família das Enterobacteriaceae (Bonnet, 2004). Estas β-lactamases são classificadas em diferentes grupos, tendo em conta a homologia nas sequências de aminoácidos: grupo CTX-M-1, CTX-M-2, CTX-M-8, CTX-M-9, CTX-M-25 e o grupo KLUC (Bonnet, 2004; D'Andrea et al., 2013). As ESBLs da família CTX-M representam β-lactamases importantes, as quais têm sido encontradas em muitos isolados, quer em ambiente hospitalar, quer na comunidade, e, atualmente, têm sido fonte de preocupação dada a sua rápida expansão pelo mundo, inclusive em Portugal (Bush, 2013; Cantón e Coque, 2006; Manageiro et al., 2012a; Mendonça et al., 2007). Considera-se que a emergência destas enzimas em vários locais está associada à aquisição e disseminação de plasmídeos com genes bla CTX-M (Bonnet, 2004). Atualmente, tem-se verificado um predomínio de ESBLs CTX-M-14 e, sobretudo, CTX-M-15, a nível mundial (Bush e Fisher, 2011) Família OXA As β-lactamases OXA pertencem à classe D de Ambler e aos grupos funcionais 2de e 2df de Bush e Jacoby. Esta família consiste num grupo heterogéneo, de várias enzimas (Bush, 2013). No subgrupo 2de estão incluídas as oxacilinases, caracterizadas pela elevada atividade hidrolítica à oxacilina e cloxacilina, com exceção dos carbapenemes. Estão incluídas neste grupo enzimas derivadas de OXA-10 (com fenótipo ESBL), entre as quais OXA-10, -11, -14, -15, -16, e -17 (Bradford, 2001; Bush e Jacoby, 2010). A maioria das β-lactamases OXA, embora hidrolisando fracamente a cefotaxima, ceftriaxona e aztreonam, conferem suscetibilidade diminuída a esses antibióticos e fenótipo de ESBL (Paterson e Bonomo, 2005). As ESBL tipo OXA são encontradas, particularmente, em Pseudomonas aeruginosa e ainda em Enterobacteriaceae, embora em menor frequência (Bradford, 2001). 12

22 Introdução As oxacilinases com atividade hidrolítica aos carbapenemes estão incluídas no subgrupo funcional 2df, capazes de hidrolisar as amino- e as carboxipenicilinas. Estas têm sido, frequentemente, encontradas em Acinetobacter spp., com um aumento em isolados de Enterobacteriaceae, principalmente de OXA-48 (Patel e Bonomo, 2013; Bush e Jacoby, 2010). Inativam eficientemente as penicilinas, cefalosporinas de primeira geração, antibióticos β-lactâmicos combinados com inibidores de β- lactamases, com exceção das cefalosporinas de espetro alargado. Contudo, a variante OXA-163, que apresenta uma baixa atividade de carbapenemase, hidrolisa estas cefalosporinas. A maioria das enzimas desta família apresenta baixa suscetibilidade aos inibidores de β-lactamases (ácido clavulânico e EDTA), mas são inibidas in vitro pelo cloreto de sódio (NaCl) (Patel e Bonomo, 2013; Nordmann et al., 2012). Já se encontram descritas mais de 250 variantes de oxacilinases, com uma minoria exibindo baixo nível de hidrólise aos carbapenemes (Patel e Bonomo, 2013) β-lactamases AmpC As β-lactamases AmpC hidrolisam as penicilinas, as oximino-cefalosporinas, aztreonam (variável) e a cefoxitina e não são inibidas pelo ácido clavulânico (Jacoby e Munoz-Price, 2005; Jacoby, 2009). Estas enzimas pertencem à classe C de Ambler e aos subgrupos funcionais 1 e 1e de Bush e Jacoby. No entanto, as enzimas do subgrupo 1e, designadas por AmpC de espetro alargado (ESAC, Extended-spectrum AmpC), apresentam maior atividade hidrolítica às cefalosporinas de terceira geração do que as do subgrupo 1 (Bush, 2013). As β-lactamases AmpC são importantes cefalosporinases codificadas por genes cromossómicos em algumas espécies de Enterobacteriaceae (Enterobacter spp., Citrobacter freundii, M. morganii e E. coli) e P. aeruginosa. Têm sido também muito descritas β-lactamases AmpC mediadas por plasmídeos (PMAβ, Plasmid-Mediated AmpC β-lactamases) em Enterobacteriaceae (E. coli, Klebsiella spp., Salmonella spp. e Proteus mirabilis) (Livermore e Woodford, 2006; Jacoby, 2009). As PMAβ derivam de genes ampc cromossómicos de diferentes espécies (Tabela. 3) (Jacoby e Munoz-Price, 2005). 13

23 Introdução Tabela 3 - Origem de genes que codificam β-lactamases AmpC (Adaptado de Livermore e Woodford, 2006) Classe Origem Exemplos CIT Citrobacter freundii CMY-2 a CMY-7; LAT-1,-3,-4 ENT Enterobacter spp. ACT-1; MIR-1 FOX Aeromonas spp. FOX-1 a FOX-5 MOX Aeromonas spp. MOX-1, MOX-2; CMY-1 e CMY-8 DHA Morganella morgani DHA-1, DHA-2 ACC Hafnia alvei ACC-1 A expressão de AmpC pode ser constitutiva, como por exemplo, em E. coli, ou indutiva, como em E. cloacae, C. freundii, M. morganii e P. aeruginosa, sendo os níveis de produção da enzima dependentes do grau de expressão do gene ampc (Jacoby, 2009). A expressão de AmpC cromossómica pode estar desreprimida em isolados com gene ampc cromossómico indutível, devido a mutações nos genes reguladores (p.e. ampd e ampr), resultando na hiperprodução, estável, de AmpC (Jacoby, 2009; Jacoby e Munoz-Price, 2005). A expressão das PMAβ pode também ser indutiva, conferindo resistência semelhante à das AmpC cromossómicas, no entanto, o nível de resistência depende do nível de enzima expressa, bem como da presença de outros mecanismos de resistência (Jacoby, 2009) Carbapenemases As carbapenemases constituem um grupo diverso de enzimas que têm emergido e que se tem tornado num facto preocupante, uma vez que hidrolisam os carbapenemes, último recurso, em muitos casos, no tratamento de infeções. Além de hidrolisarem os carbapenemes, hidrolisam as cefamicinas e as oximino-cefalosporinas (Alekshun e Levy, 2007; Jacoby e Munoz-Price, 2005). As carbapenemases estão distribuídas em três classes de β-lactamases de Ambler: classe A, B e D (Patel e Bonomo, 2013). Atualmente, as β-lactamases KPC (classe A), as metalo-β-lactamases, como VIM, IMP, e NDM (classe B), e a carbapenemase OXA-48 (classe D), mediada por plasmídeos, representam as carbapenemases com maior importância clínica em Enterobacteriaceae (Tzouvelekis et al., 2012; Nordmann et al., 2012). As enzimas NmcA/IMI, SME, e KPC são as principais carbapenemases da classe A de Ambler. Hidrolisam as penicilinas, cefalosporinas, carbapenemes e o 14

24 Introdução aztreonam e são inibidas in vitro pelo ácido clavulânico e tazobactam. A enzima GES também pertence à classe A, contudo, foi inicialmente designada como uma β-lactamase ESBL clássica, uma vez que a enzima GES-1 não hidrolisa os carbapenemes. Posteriormente, foram identificadas outras variantes (p.e., GES-2, GES-4, GES-5, GES- 6, GES-11 e GES-14), com atividade hidrolítica fraca, mas significativa sobre os carbapenemes (Nordmann et al., 2012). Todas as carbapenemases apresentam capacidade de hidrolisar as cefalosporinas de terceira geração e os carbapenemes devido a uma substituição aminoacídica no sítio ativo (nas posições 104 e 170). Atualmente, as β-lactamases KPC representam as carbapenemases de classe A, com maior importância clínica. Em 1996, foi identificada a primeira KPC (KPC-2) num isolado de K. pneumoniae, na Carolina do Norte, nos Estados Unidos da América (Patel e Bonomo, 2013; Nordmann et al., 2012). Desde então, já foram identificadas doze variantes de KPC (KPC-2 a KPC-15), verificando-se uma maior predominância das variantes KPC-2 e KPC-3 (Patel e Bonomo, 2013). As enzimas do tipo IMP, VIM e NDM representam as principais carbapenemases do grupo das metalo-β-lactamases; em Enterobacteriaceae, são as que possuem maior distribuição geográfica. As metalo-β-lactamases conferem resistência a todas as penicilinas, cefalosporinas e carbapenemes, à exceção do aztreonam, não sendo hidrolisadas pelos inibidores de β-lactamases (Patel e Bonomo, 2013; Nordmann et al., 2012). Como referido anteriormente (capítulo ), a enzima OXA-48, pertence à classe D de Ambler e tem atividade hidrolítica sobre os carbapenemes. Desde a sua primeira descrição na Turquia, a enzima OXA-48, tem sido identificada em países Africanos e do sul da Europa, o que se torna preocupante devido à sua rápida disseminação (Nordmann et al., 2012). 3. Tigeciclina A tigeciclina é um antibiótico recente e o primeiro composto sintético da nova classe de antibióticos glicilciclinas disponibilizado para uso clínico (Stein e Craig, 2006). Foi desenvolvida através da pesquisa de compostos mais ativos, a partir da 15

25 Introdução estrutura química das tetraciclinas, de forma a contornar os principais mecanismos de resistência a esta classe de antibióticos (Doan et al., 2006; Seputiene et al., 2010). Em 2005, a tigeciclina (Tygacil ) foi aprovada, pela FDA (Food and Drug Administration), para utilização no tratamento de infeções complicadas da pele, tecidos moles e intra-abdominais. Em 2009, foi também aprovada pela FDA para o tratamento de pneumonia bacteriana adquirida na comunidade (Stein e Babinchak, 2013; Sun et al., 2012; Sader et al., 2013). A utilização de tigeciclina é aconselhada apenas em adultos, estando a duração do tratamento dependente da gravidade e local da infeção, bem como da forma como o doente reage ao antibiótico, podendo variar entre 5 a 14 dias. O tratamento consiste na administração da tigecilina por via intravenosa, devendo inicialmente ser administrada uma dose de 100 mg e, nos dias seguintes, doses de 50 mg de 12 em 12 horas (Babinchak et al., 2005) Estrutura química e mecanismo de ação da tigeciclina A tigeciclina (Fig.4A) deriva estruturalmente da minociclina (Fig.4B), antibiótico pertencente à classe das tetraciclinas, por uma substituição na posição D-9, conferindo-lhe um amplo espetro de atividade (Peterson, 2008).A cadeia lateral N- alquilo glicilamido, na posição 9 do átomo de carbono da tigeciclina confere-lhe propriedades ao nível da atividade biológica, tal como o aumento da solubilidade lipídica, o bloqueio do efluxo da tigeciclina para o exterior da célula e ainda o aumento da afinidade ao local de ligação no ribossoma (Seputiene et al 2010). A tigeciclina é um antibiótico bacteriostático, pois inibe a síntese de proteínas bacterianas através da sua união à subunidade 30S do ribossoma bacteriano. Este mecanismo impede a entrada da RNA aminoacil-transferase no local de ligação A do ribossoma (Petersen et al., 1999). Apesar da tigeciclina apresentar um mecanismo de ação semelhante às tetraciclinas, possui uma afinidade cinco vezes superior para o ribossoma (Bauer et al., 2004). 16

26 Introdução Figura 4 - Estrutura química da tigeciclina (A) e da minociclina (B) (Dean et al. 2003) 3.2. Espetro de ação da tigeciclina A tigeciclina exibe um mecanismo de ação semelhante às tetraciclinas, apresentando, no entanto, atividade em isolados que possuem genes responsáveis por mecanismos de resistência mediados por bombas de efluxo e proteção do ribossoma, que os tornam resistentes às tetraciclinas. A título de exemplo, um estudo de Petersen et al. (1999) demonstrou que a tigeciclina tem a capacidade de contornar a resistência mediada pelos determinantes tet(m) e tet(o), que promovem proteção ribossomal, e pelos determinantes tet(a-e) e tet(k), que promovem a ação de bombas de efluxo sobre as tetraciclinas. A tigeciclina apresenta um amplo espetro de ação in vitro, sendo ativa sobre uma grande variedade de microrganismos de Gram positivo e de Gram negativo, quer aeróbios, quer anaeróbios, quer da comunidade quer de origem nosocomial (Betriu et al., 2006; Bouchillon et al., 2005; Castanheira et al., 2008; Goldstein et al., 2006). Assim, a tigeciclina tem ação sobre isolados de Gram positivo, como Staphylococcus aureus, nomeadamente S. aureus resistente à meticilina (MRSA, Methicillin-resistant Staphylococcus aureus), Streptococcus pneumoniae (incluindo resistentes à penicilina), Streptococcus agalactiae, Enterococcus faecium e Enterococcus faecalis, nomeadamente resistentes à vancomicina (Betriu et al., 2006; Cercenado et al., 2003; Dowzicky e Chmelarová, 2011; Norskov-Lauritsen et al., 2009). Isolados de Gram negativo, tais como E. coli, K. pneumoniae, Enterobacter spp. Citrobacter spp. e Serratia marcescens têm apresentado suscetibilidade à tigeciclina (Betriu et al., 2006; Bouchillon et al., 2005; Castanheira et al., 2008; Roy et al., 2013; Souli et al., 2006). 17

27 Introdução Adicionalmente, este antibiótico possui ação antimicrobiana em bactérias com resistência a outros antibióticos, sobretudo aos β-lactâmicos, nomeadamente em Enterobacteriaceae produtoras de ESBL (Bouchillon et al., 2005; Roy et al., 2013), bem como de β-lactamases AmpC (Bouchillon et al., 2005), carbapenemases e metaloβ-lactamases (Castanheira et al., 2008; Souli et al., 2006), ou multirresistentes aos antibióticos (Gupta et al., 2012) Resistência à tigeciclina Apesar do espetro de ação da tigeciclina e da sua capacidade de contornar os mecanismos de resistência a outras classes de antibióticos, já foram descritos casos de microrganismos com suscetibilidade diminuída a este antibiótico. As P. aeruginosa são intrinsecamente resistentes à tigeciclina (Dean et al., 2003; Sun et al., 2012). De igual modo, isolados de Burkholderia cepacia e isolados da família Proteeae, tais como, Proteus spp., Providencia spp. e Morganella morganii apresentam geralmente suscetibilidade diminuída a este antibiótico (Ruzin et al., 2005; Sun et al., 2012). Além disso, tem-se verificado a aquisição de resistência à tigeciclina em Acinetobacter baumannii (Peleg et al., 2007 Ruzin et al., 2007) e em outros isolados da família das Enterobacteriaceae, como E. coli, K. pneumoniae e Enterobacter spp. (Keeney et al., 2008; Ruzin et al. 2005; Veleba et al., 2013). Os mecanismos de resistência à tigeciclina não estão bem esclarecidos, mas, de forma geral, a resistência tem sido atribuída à ação de bombas de efluxo da família RND (Resistance-Nodulation-Division), regulada por genes localizados ao nível do cromossoma; estas bombas são, frequentemente, associadas à multirresistência aos antibióticos (Pérez et al., 2012; Sun et al., 2012). O sistema de efluxo mais descrito em P. aeruginosa é o MexXY-OprM (Dean et al., 2003). Em A. baumannii foi reportado uma diminuição da suscetibilidade à tigeciclina associada ao sistema de efluxo AdeABC (Peleg et al., 2007). O sistema de efluxo AcrAB está associado à suscetibilidade diminuída à tigeciclina em P. mirabilis, E. coli, K. pneumoniae, M. morganii e Enterobacter spp. (Keeney et al., 2007; Keeney et al., 2008; Ruzin et al. 2005; Veleba et al., 2013; Visalli et al., 2003). A hiperprodução da bomba de efluxo SdeXY, da família RND, está associada à suscetibilidade diminuída à tigeciclina em S. marcescens (Hornsey et al., 2010). 18

28 Introdução Além do mecanismo de resistência à tigeciclina associado às bombas de efluxo, foi, recentemente, identificada uma proteína Tet(X) monoxigenase, dependente da flavina, que confere resistência às tetraciclinas e à tigeciclina em bactérias anaeróbias, como Bacteroides, através da hidroxilação da região-seletiva de tetraciclinas para 11ahidroxi-tetraciclinas, reduzindo a atividade antimicrobiana. Adicionalmente, a tigeciclina representa um substrato da hidroxilação dependente, quer de NADPH (nicotinamida adenina difosfato), quer de oxigénio por parte da proetína Tet(X) (Volkers et al., 2011). É de realçar que, até a atualidade, esta proteína não foi observada noutras bactérias aeróbias e/ou anaeróbias isoladas em meio clínico; no entanto, se os genes que a codificam forem integrados em elementos genéticos móveis, pode disseminar-se para outras bactérias (Linkevicius et al., 2013) Bomba de efluxo AcrAB-TolC da família RND A bomba de efluxo AcrAB-TolC da família RND constitui um mecanismo de resistência com relevância clínica, uma vez que confere resistência a múltiplos antibióticos utilizados no tratamento de infeções humanas, incluindo os β-lactâmicos, fluoroquinolonas, macrólidos, tetraciclinas, clorafenicol e trimetoprim, encontrando-se bastante distribuída em bactérias de Gram negativo (Alekshun e Levy, 1999; Piddock, 2006). Em Enterobacteriaceae, conferem ainda resistência a uma variedade de compostos tóxicos, como detergentes, corantes e desinfetantes (Pérez et al., 2012). A bomba de efluxo AcrAB é formada por três subunidades: AcrB, uma proteína na membrana interna, que atua expelindo substâncias para o exterior; TolC, uma porina da membrana externa, e AcrA, uma proteína que liga a bomba à porina (Fig.5). As três subunidades da bomba de efluxo permitem a expulsão de compostos diretamente a partir do citoplasma para o ambiente externo, contribuindo para o aumento da resistência aos antibióticos. Este sistema de efluxo utiliza um gradiente de protões na membrana como fonte de energia (Pérez et al., 2012). 19

29 Introdução Figura 5 - Estrutura do sistema de efluxo AcrAB-TolC em E.coli (Adaptado de Alvarez-Ortega et al., 2013). A expressão da bomba de efluxo AcrAB é regulada por proteínas da família AraC, os quais conferem resistência aos antibióticos e desinfetantes, aumentado a expressão daquela bomba. Os reguladores transcricionais da família AraC são: MarA, SoxS, RamA e Rob (Alekshun e Levy, 1999; Rosenblum et al., 2011). Atualmente, tem sido descrito que este sistema AcrAB-TolC está envolvido na suscetibilidade diminuída à tigeciclina, nalgumas espécies de Gram negativo. A expressão da bomba de efluxo pode ser desreprimida pela sobre-expressão dos reguladores transcricionais, como MarA em E. coli e RamA em K. pneumoniae. Mutações no gene acrr, repressor da bomba de efluxo AcrAB, ou ainda mutações no genes marr e ramr (repressores de mara e rama, repetivamente) podem também desencadear um aumento da expressão da bomba de efluxo. Por sua vez, o aumento da atividade da bomba de efluxo AcrAB, pode conferir um fenótipo de multirresistência (Keeney et al., 2008; Ruzin et al., 2005; Hentschke et al., 2010). A suscetibilidade diminuída à tigeciclina, mediada pela bomba de efluxo AcrAB, em E. coli, está associada a mutações no repressor marr, desencadeando a sobre-expressão da proteína MarA e da bomba de efluxo (Keeney et al., 2008). O operão marab em isolados de E. coli é constituído pelos genes mara, marb e o gene marr, repressor de MarA, que regulam a expressão da bomba de efluxo AcrAB (Alekshun e Levy, 1999). A expressão do operão marab e marc é controlada por promotores independentes, Pmar II e Pmar I, respetivamente (Fig.6). Os genes marr e 20

30 Introdução mara codificam o repressor e o regulador transcricional MarR (144 resíduos de aminoácidos) e MarA (127 resíduos de aminoácidos), respetivamente. O gene marb (codifica 72 resíduos de aminoácidos) tem uma função desconhecida, bem como o marc (codifica 201 resíduos de aminoácidos). Assim, MarR reprime a expressão de MarAB através da ligação em dois sítios no operador MarO, podendo a sua inativação resultar na expressão constitutiva de MarAB, dependendo dos níveis de expressão dos reguladores transcricionais, como MarA (Alekshun e Levy, 1999). Figura 6 - Organização genética do locus marab em E. coli ; PmarI e PmarII, promotores (Alekshun e Levy, 1999). Em K. pneumoniae, Enterobacter cloacae e Enterobacter aerogenes a diminuição da suscetibilidade à tigeciclina tem sido associada à sobre-expressão da proteína RamA, homóloga da proteína MarA (Hentschke et al., 2010; Keeney et al., 2007; Ruzin et al., 2005; Veleba et al., 2013). A sobre-expressão de MarA e RamA, designadas de reguladores positivos, desencadeiam o aumento da atividade da bomba de efluxo AcrAB, conferindo um fenótipo de multirresitência à outras classes de antibióticos (Keeney et al., 2008 Ruzin et al., 2005; Rosenblum et al., 2011; Hentschke et al., 2010). Para além disso, mutações no gene ramr (repressor de rama) têm sido descritas como uma via de aquisição de resistência à tigeciclina em K. pneumoniae, E. cloacae e E. aerogenes, que leva a sobre-expressão de RamA e da bomba de efluxo AcrAB (Hentschke et al., 2010; Veleba et al., 2013). O gene ramr está localizado a montante do gene rama e codifica a proteína da família de repressores transcricionais TetR (Fig.7). O local de ligação do RamR localiza-se a montante do gene rama e esta região abrange uma parte do promotor de rama. A proteína RamR liga-se então à região intergénica, entre o ramr e o rama, e RamA liga-se na região a montante do acrab. 21

31 Introdução Deste modo RamR reprime o gene rama, o qual codifica a proteína RamA que ativa os genes da bomba de efluxo AcrAB (Yamasaki et al., 2013). Figura 7 - Via de regulação da bomba de efluxo AcrAB: a proteina RamR reprime a expressão do gene rama que codifica o activador trancripcional, RamA, do acrab. (Adaptado de Yamasaki et al., 2013). 22

32 Objetivos 4. Objetivos Tendo em conta que a tigeciclina é um antibiótico, recentemente, desenvolvido com o intuito de tentar ultrapassar o problema da resistência aos antibióticos, este trabalho teve como objetivo avaliar a suscetibilidade e caracterizar os mecanismos de resistência à tigeciclina em 211 isolados de Gram negativo provenientes de doentes, em Portugal. Pretendeu-se igualmente esclarecer a ação da tigeciclina em bactérias com resistência, sobretudo aos antibióticos β-lactâmicos, ou multirresistentes de forma a compreender a possibilidade da tigeciclina constituir uma alternativa nestes casos. Assim, o presente trabalho teve como objetivos específicos: i. Avaliar a suscetibilidade da tigeciclina em isolados de Gram negativo ii. Determinar a suscetibilidade de isolados de Gram negativo a outras classes de antibióticos, nomeadamente β-lactâmicos (aminopenicilinas, carboxipenicilinas, ureidopenicilinas, cefalosporinas da 1ª, 2ª, 3ª e 4ª geração, monobactâmicos, carbapenemes), fluoroquinolonas, aminoglicosídeos, trimetoprim-sulfametoxazol, colistina, fosfomicina e nitrofuranos. iii. Pesquisar e identificar os genes bla associados à resistência aos antibióticos β-lactâmicos, orientada pela leitura interpretativa dos testes de suscetibilidade. iv. Caracterizar molecularmente a resistência à tigeciclina, através da pesquisa e identificação de mutações nos genes ramr e marr em isolados estudados de E. coli e K. pneumoniae, predominantemente, com suscetibilidade diminuída à tigeciclina. 23

33 Número de isolados Material e Métodos II. Material e Métodos 1. Isolados bacterianos Para a realização do presente trabalho foram estudados 211 isolados de Gram negativo, reunidos em 2011 e 2013 no Laboratório Nacional de Referência da Resistência aos Antimicrobianos (LNR-RA) do Instituto Nacional de Saúde Dr. Ricardo Jorge, tendo como proveniência diversos hospitais nacionais (Fig. 8). Os isolados estudados foram os seguintes: Escherichia coli (n=101), Klebsiella pneumoniae (n=70), Citrobacter freundii (n=4), Enterobacter cloacae (n=12), Enterobacter aerogenes (n=4), Morganella morganii (n=10), Proteus mirabilis (n=7) e Serratia marcescens (n=3). A identificação preliminar dos isolados foi realizada nas instituições hospitalares de proveniência. Sempre que necessário, foi utilizado o método API20E, com leitura em 24 horas, no LNR-RA para confirmar a identificação dos isolados estudados A B C D E F G H I J L M N Hospitais Figura 8 - Distribuição, pelos hospitais de origem, de 211 isolados que constituem a amostra do estudo. 24

34 Material e Métodos 2. Caracterização fenotípica: suscetibilidade aos antibióticos 2.1. Método de microdiluição O método de microdiluição em caldo foi realizado para determinar a suscetibilidade de 211 isolados em estudo aos seguintes antibióticos: tigeciclina (Pfizer), colistina (Sigma), ciprofloxacina (Bayer), imipinem (Merck), cefoxitina (Fluka), ceftazidima (GSK), cefotaxima (Sanofi) e cefotaxima (Sanofi) em combinação com ácido clavulânico (Cipan). Assim, a determinação da concentração inibitória mínima (CIM) foi realizada através dos passos descritos a seguir Preparação da solução-mãe dos antibióticos A solução-mãe de cada um dos antibióticos, para a determinação da CIM, foi preparada de acordo com a concentração final descrita na Tabela 4. Para cada antibiótico, a quantidade necessária para a solução-mãe foi calculada de acordo com a potência e pureza do mesmo e dissolvidos em solventes adequados (Tabela 4), utilizando a fórmula descrita a seguir: Peso (mg) = Volume (ml) x Concentração (μg/ml) Potência (μg/mg) Os antibióticos em pó foram pesados numa balança analítica (AE200, Mettler). Após a preparação da solução-mãe na concentração estabelecida (Tabela 4), esta foi esterilizada por filtração (Acrodisc syringe filters, Pall corporation) e acondicionada em eppendorf a -80ºC até o uso. Tabela 4 - Antibióticos, concentrações das soluções-mãe, solventes e potência dos antibióticos. Antibiótico Solução-mãe (mg/l) Solvente Potência (%) Cefotaxima 2048 Água 90,1 Ceftazidima 2048 Carbonato de Sódio 84,6 Cefoxitina 2048 Água 99,4 Imipeneme 2048 Tampão Fosfato [0,01M] ph 7,2 50,0 Ciprofloxacina 1024 Água + hidróxido de sódio [0,1M] 93,6 Tigeciclina 1024 Água 99,7 Colistina 2048 Água 78,6 Ácido Clavulânico 4mg/ml Tampão Fosfato [0,1M] ph 6 95,5 25

35 Material e Métodos Preparação das concentrações dos antibióticos Após a obtenção da solução-mãe foi preparada a solução CIM (utilizadas diretamente no teste), que corresponde a uma concentração acima da maior concentração a ser testada. Assim, esta solução CIM (Tabela 5) foi preparada a partir da solução-mãe com um diluente específico para cada antibiótico. Tabela 5 - Antibióticos, concentração da solução CIM, diluentes e concentrações testadas na determinação da concentração inibitória mínima. Antibiótico Solução CIM (mg/l) Diluente Concentrações testadas (μg/ml) Cefotaxima 128 Água 1 64 Ceftazidima 128 Água 1 64 Cefoxitina 256 Água Imipeneme 1024 Tampão Fosfato [0,01M] ph 7,2 0, Ciprofloxacina 16 Água Tigeciclina 32 Água 0,25 16 Colistina 64 Água 0,5 32 Ácido Clavulânico 40 mg/ml Tampão Fosfato [0,1M] ph Preparação das diluições dos antibióticos na microplaca O meio de Mueller-Hinton (INSA) foi distribuído (100 µl) em cada um dos 96 poços da microplaca com o auxílio de um aparelho de microdiluição (Precision TM BioTek, Winooski, USA). Para a tigeciclina utilizou-se meio de Mueller-Hinton fresco (<12 h) (Bradford et al. 2005). De seguida, com aquele aparelho de microdiluição foi realizada a diluição seriada dos antibióticos nas microplacas, que já possuiam meio de Mueller-Hinton (Fig. 9). Assim, foram adicionados 100 µl da solução CIM, do antibiótico a testar, nos poços da primeira fila e diluído de forma seriada, pipetando 100 µl da primeira fila para a segunda e, assim sucessivamente, até à penúltima fila, rejeitando, por fim, os 100 µl. A última fila foi utilizada como controlo negativo. 26

36 Material e Métodos Figura 9 - Representação da diluição seriada dos antibióticos na microplaca Preparação do inóculo bacteriano A partir de uma cultura bacteriana pura, em gelose simples (INSA), fez-se uma suspensão em meio de Mueller-Hinton (10 8 UFC/mL) com uma turvação de 0,5 na escala de McFarland (Dade Behring, MicroScan Turbidity Meter). Para a determinação da CIM, a suspensão de 0,5 McFarland foi diluída na proporção de 1:20 (5x10 6 UFC/mL), à exceção da suspensão a ser testada pela combinação cefotaxima/ácido clavulânico, a qual foi diluída a 1:10 (1x10 7 UFC/mL) e adicionada, numa microplaca, com a solução de ácido clavulânico (40µg/mL) preparada a partir da solução-mãe do ácido clavulânico (Tabela 4), ficando assim uma concentração final de 5x10 6 UFC/mL. Após o preparo das suspensões bacterianas, cada poço, de uma microplaca, já contendo as diluições de antibiótico (referido em 2.1.3), foi inoculado com 10 µl da cultura diluída (5x10 4 UFC/mL) com o aparelho de microdiluição, com exceção dos poços da última fila (controlo negativo). O controlo de qualidade foi realizado com Escherichia coli ATCC Após incubação a 37ºC, durante 18 horas, as placas foram lidas num local iluminado e a CIM foi determinada de acordo com a observação de crescimento bacteriano nos poços da microplaca. A interpretação dos resultados foi efetuada utilizando as normas do Comité de l Antibiogramme de la Société Française de 27

37 Material e Métodos Microbiologie (2013) (CASFM 2013), pela análise comparativa das concentrações críticas (mg/l) obtidas e as aí referidas Método de difusão por disco O método de difusão por disco foi realizado para complementar a avaliação da suscetibilidade aos antibióticos efetuados por CIM, para os mesmos 211 isolados. Foram ensaiados 23 antibióticos (carga do disco): amoxicilina (25µg), amoxicilina/ácido clavulânico (20+10µg), ticarcilina (25µg), piperacilina (25µg), piperacilina/tazobactam (25µg), cefalotina (25µg), cefuroxima (30µg), ceftriaxona (30µg), cefpodoxima (10µg), cefixima (10µg), cefepima (30µg), aztreonam (30µg), ertapeneme (10µg), meropeneme (10µg), ácido nalidíxico (30µg), norfloxacina (5µg), pefloxacina (5µg), kanamicina (30µg), gentamicina (15µg), amicacina (30µg), fosfomicina (50µg), nitrofuranos (300µg) e trimetoprim/sulfametoxazol (1,25+23,75µg). Para realização deste método o inóculo foi preparado a partir de duas a cinco colónias isoladas após cultura em meio de gelose simples (INSA), ressuspendidas em 2,5 ml de soro fisiológico, de modo a obter uma turvação de 0,5 na escala de McFarland (Dade Behring, MicroScan Turbidity Meter), e diluídas a 1:100 em soro fisiológico, num volume total de 10mL. O inóculo foi espalhado uniformemente, por inundação, em duas placas quadradas (120 x 120 mm) com meio de Muller-Hinton agar (INSA), para cada estirpe. Os discos de antibióticos escolhidos foram aplicados no meio inoculado, com um dispensador automático. De forma a identificar mecanismos específicos de resistência utilizaram-se discos impregnados com inibidores de β-lactamases: ácido clavulânico, cloxacilina, ácido borónico e EDTA. Para tal, adicionou-se um disco de imipeneme com 5μL de uma solução de EDTA 0,5M (750 μg) e um disco branco com 3,5μL de ácido borónico (300 μg) para pesquisa de metalo-β-lactamases e carbapenemases do grupo A, respetivamente. A pesquisa de cefalosporinases AmpC foi realizada com a utilização de um disco branco impregnado com 4,2μL de cloxacilina (750 μg) e a produção de β- lactamases de espetro alargado através da combinação amoxicilina/ácido clavulânico ( μg). Os discos foram aplicados nas placas com o auxílio de uma pinça estéril. Em seguida as placas foram invertidas e incubadas em estufa a 37ºC, por um período de 18 horas. Após incubação, os halos de inibição dos antibióticos ensaiados 28

38 Material e Métodos foram lidos com auxílio de uma régua e os valores obtidos (em milímetros) foram, igualmente, interpretados de acordo com as normas do Comité de l Antibiogramme de la Société Française de Microbiologie (CASFM, 2013) Método de E-teste O método de E-teste (BioMérieux) PM-PML (cefepima/ combinação de cefepima com ácido clavulânico) foi utilizado para confirmar a produção de ESBL por alguns isolados em estudo. Para tal, o inóculo foi preparado a partir de colónias isoladas em gelose simples (INSA) e ressupendidas em 2,5 ml de soro fisiológico estéril, de modo a obter um padrão de 0,5 McFarland (Dade Behring, MicroScan Turbidity Meter). A suspensão foi inoculada por espalhamento à superfície da placa de Muller- Hinton (INSA), com uma zaragatoa esterilizada. De seguida, adicionou-se uma tira de E-teste (BioMérieux) com um gradiente de concentração de cefepima (0,25-16 µg/ml) (PM) numa extremidade e no outro lado com um gradiente de cefepima (0,064-4 µg/ml) em combinação com ácido clavulânico com uma concentração de 4µg/ml. Após um período de incubação de 18 horas, a interpretação foi feita com base na observação da elipse de inibição de crescimento produzida e a determinação do valor da CIM que correspondeu à concentração de antibiótico presente no local onde a elipse interceptou a tira. Um resultado positivo para produção de ESBL consiste na deformação da elipse no PM, ou uma CIM PM 0,25 com o valor da razão da CIM da PM e da CIM de PML Teste de sinergia com meropeneme Foi realizado o teste de sinergia com meropeneme para os isolados (das espécies K. pneumoniae, E. coli e E. aerogenes) com suscetibilidade diminuída aos carbapenemes, sugerindo a possibilidade de produção de carbapenemases das classes A, B e/ou D e/ou produção de cefalosporinases (classe C) associadas a impermeabilidade. A suspensão bacteriana foi preparada utilizando colónias isoladas em gelose simples (INSA) dos isolados clínicos selecionados, e diluídas em soro fisiológico estéril, de modo a obter uma turvação de 0,5 na escala de McFarland (Dade Behring, MicroScan Turbidity Meter). A solução obtida foi diluída a 1:10 e inoculada, por espalhamento à superfície de uma placa de Muller-Hinton (INSA), com uma zaragatoa 29

39 Material e Métodos esterilizada. De seguida, foram aplicados quatro discos de meropeneme (10µg, Biorad) a uma distância de 30mm entre si, tendo sido adicionadas as seguintes soluções (a três dos discos): 750µg de EDTA (5µl de uma solução 0,5M), 600µg de ácido borónico (7µl de uma solução 0,5M) e 750µg de cloxacilina (6µl de uma solução 0,25M). Adicionouse ainda um disco branco com EDTA (5µl de uma solução 0,5M) no centro da placa (Fig. 9), a fim de averiguar o efeito do inibidor sozinho na espécie bacteriana. As placas foram incubadas a 37ºC, durante 18h. Posteriormente, foram medidos e registados os diâmetros dos halos de inibição para cada um dos discos e para cada uma das estirpes analisadas e os resultados foram interpretados de acordo com o esquema apresentado na Figura 10. Figura 10 - Esquema utilizado para interpretação dos resultados obtidos no teste de sinergia com meropeneme para deteteção de metalo-β-lactamases, carbapenemases de classe A ou D e β-lactamases AmpC (cromossómicas ou plasmídicas). BOR, ácido borónico; CLOX, cloxacilina. 3. Caracterização genotípica: mecanismos de resistência aos antibióticos 3.1. Extração de DNA A extração de DNA de 211 isolados em estudo foi efetuada pelo método de fervura. Para tal, uma porção de cultura pura de 18 horas em gelose simples (INSA) foi inoculada em 750µl de água bidestilada estéril e centrifugada durante 5 minutos, a rpm (2K15, Sigma). Após centrifugação, o sobrenadante foi desprezado e o pellet 30

40 Material e Métodos ressuspendido em 500 µl de água bidestilada estéril, e seguido de nova centrifugação nas mesmas condições. Após desprezar-se o sobrenadante, o pellet foi ressuspendido em 100µl de água bidestilada estéril e fervido ( 100ºC) em banho-maria, durante 15min. Por fim, a amostra foi centrifugada (10000rpm/5min) e o sobrenadante (extrato de DNA) recolhido para um eppendorf Pesquisa de genes que codificam β-lactamases Os resultados dos testes de suscetibilidade aos antibióticos orientaram a pesquisa e identificação molecular dos genes associados ao fenótipo obtido. Assim, utilizando a técnica de reação da polimerase em cadeia (PCR, Polymerase Chain Reaction), foram detetados os genes de interesse, que codificam para a resistência aos β-lactâmicos. Nos isolados com fenótipo de ESBL, sugerida pela suscetibilidade diminuída ou resistência à cefotaxima e com sinergia com o ácido clavulânico foi pesquisada a presença do gene blactx-m por PCR simples. Em 15 isolados em que não se detetou o gene bla CTX-M foi pesquisada a presença dos genes de resistência bla TEM, bla SHV, bla OXA e ampc (este último detetado apenas por constituir um controlo interno da espécie E. coli) por PCR multiplex. Em 34 isolados suscetíveis ou resistentes à cefotaxima e sem sinergia com o ácido clavulânico foi igualmente pesquisada a presença dos genes bla TEM, bla SHV, bla OXA e ampc por PCR multiplex e ainda o gene bla GES por PCR simples. Em 30 isolados, selecionados aleatoriamente na amostra, das espécies K. pneumoniae, E. coli e Enterobacter spp., com suscetibilidade diminuída à cefoxitina, foram ainda pesquisados sete outros genes, que codificam β-lactamases plasmídicas da família AmpC (PMAβ): bla MOX, bla CIT, bla DHA, bla ACC, bla MIR, bla FOX e bla ACT. O gene blaact foi detetado por PCR simples e os restantes genes por PCR multiplex. Nos isolados que apresentaram suscetibilidade diminuída aos carbapenemes e resultado positivo para carbapenemase de classe A e D no teste de sinergia com meropeneme, pesquisou-se a presença dos genes bla KPC, bla SME, bla OXA-48, bla GES e bla NMC, por PCR multiplex. Os primers, o tamanho dos fragmentos de amplificação e a temperatura de hibridação de todos os genes bla pesquisados estão descritos na Tabela 6, tendo os mesmos sido desenhados no LNR-RA, a apartir de sequências publicadas no EMBL ou a partir de primers previamente publicados por outros autores. 31

41 Material e Métodos Tabela 6 - Sequência de primers para pesquisa de diferentes genes bla utilizados no PCR e na sequênciação a, tamanho dos respetivos fragmentos e temperatura de hibridação. Gene Primer Sequência (5 3 ) Tamanho do fragmento (pb) Temperatura de hibridação bla CTX-M CTXiF TTTGCGATGTGCAGTACCAGTAA 543 CTXiR CGATATCGTTGGTGGTGCCATA 55 C bla CTX-M-15 CTX-M-1F a ATGGTTAAAAAATCACTGCG 869 CTX-M-15R a ACCGTCGGTGACGATTTTAG CTX-M-15F a AGAATAAGGAATCCCATGGTT 903 CTX-M-1R a CCGTTTCCGCTATTACAA bla CTX-M-14 CTXG3F a CTGATGTAACACGGATTGACC 871 CTX14R a CGATTTATTCAACAAAACCAG bla TEM P1 b TACGATACGGGAGGGCTTAC 716 P2 a b TTCCTGTTTTTGCTCACCCA FIN a ATTCTTGAAGACGAAAGGGC 1091 DEB a ATGAGTAAACTTGGTCTGAC bla SHV SHVF b TCAGCGAAAAACACCTTG 471 SHVR b TCCCGCAGATAAATCACCA SHV1059 a TTAGCGTTGCCAGTGCTC 911 SHV149P a CGCTTCTTTACTCGCCTTTA ampc AmpCF b CCCCGCTTATAGAGCAACAA 634 AmpCR b TCAATGGTCGACTTCACACC bla OXA OXAF b TATCTACAGCAGCGCCAGTG 199 OXA R b CGCATCAAATGCCATAAGTG bla GES GES -F a AAAGCAGCTCAGATCGGTGT 891 GES - R a AATTCGTCACGTTCTACGGC GES-Fi c AAAGCAGCTCAGATCGGTGT C GES-Ri c AACCAATCAGCAGGAACAC bla KPC KPC F a c ATGTCACTGTATCGCCGTCTAG 888 KPC -R a c AGAGCCTTACTGCCCGTTG KPC_istB_fw a GCTACCGCTTGAAGGACAAG Variável ( 1800) KPC_tnpA_rev a GTCAATGCCAAGACCCATCC bla NMC/IMI NMC/IMI F c TTACAATATAGCGACAATGG C NMC/IMI R c TTACTTTATCCTCATGCTTG bla SME SME F c CAGATGAGCGGTTCCCTTTA C SME R c AACCCAATCAGCAGGAACAC a primers utilizados em sequenciação; b primers utilizados em PCR multiplex para pesquisa de genes bla ESBL ; c primers utilizados em PCR multiplex para pesquisa de genes que codificam carbapenemases de classe A e D; d primers utilizados em PCR multiplex para pesquisa de genes que codificam PMAβ. 55 C 55 C 55 C 56 C 56 C 56 C 56 C 56 C 56 C 61 C 56 C 60 C 32

42 Material e Métodos Tabela 6 - (Continuação) Gene Primer Sequência (5 3 ) Tamanho do fragmento (pb) Temperatura de hibridação bla OXA-48 OXA-48 -F c ATGCGTGTATTAGCCTTATC 140 OXA-48 -R c CCTAAACCATCCGATGTG 56 C bla MOX MOXM F d GCTGCTCAAGGAGCACAGGAT 520 MOXM - R d CACATTGACATAGGTGTGGTGC bla CIT CITM - F d TGGCCAGAACTGACAGGCAAA 462 CITM- R d TTTCTCCTGAACGTGGCTGGC CMYG2F a TTACGGAACTGATTTCATG C CMYG2R a TCGTCAGTTATTGCAGC bla DHA DHAM-F d AACTTTTCACAGGTGTGCTGGGT 405 DHAM-R d CCGTACGCATACTGGCTTTGC DHA1A a CTGATGAAAAAATCGTTATC 1141 DHA1B a ATTCCAGTGCACTCAAAATA bla ACC ACCM-F d ACCAGCCTCAGCAGCCGGTTA 346 ACCM-R d TTCGCCGCAATCATCCCTAGC bla MIR EBCM-F d CAGTTCTGCATTCGCCGCAC 802 EBCM-R d CACCTTGTTATCACTGCCTCCGAC EBCF a AAATCCCTAAGCTGTGCCCTGCTG 1137 EBCR a TTACTGCAGCGCGTCGAGGAT bla FOX FOXM-F d GGACTCATCGCCAGTATTCCAACC 286 FOXM-R d AACTTCAGCAGATCCGCCGAAC bla ACT ACT-F a GATGATGACTAAATCCCTTTGCTG C ACT-R a AAATACGGTATGCCGCCTC a primers utilizados em sequenciação; b primers utilizados em PCR multiplex para pesquisa de genes bla ESBL ; c primers utilizados em PCR multiplex para pesquisa de genes que codificam carbapenemases de classe A e D; d primers utilizados em PCR multiplex para pesquisa de genes que codificam PMAβ. Para as reações de PCR simples foi preparada uma mistura de reação na câmara de fluxo laminar (Holton) com os seguintes reagentes: tampão (1x, Quiagen), dntps (0,2 mm de datp, dctp, dgtp e dttp, Roche Diagnostics), cloreto de magnésio (3 mm, Quiagen), Q solution (1x, Quiagen), primers específicos (Tabelas 6), Taq polimerase (0,6 unidades, Bioline) e água bidestilada, estéril e apirogénica (Labesfal) de forma a perfazer um total de 24 μl. Para os PCR multiplex foi utilizado um protocolo semelhante, mas com alteração na concentração de cada dntp: 0,5mM. De seguida, adicionou-se 1 μl de DNA (numa concentração final de 4 ng/μl) à mistura de reação. As amplificações foram realizadas num termociclador (C1000 Thermocycler, Bio-Rad). De acordo com as temperaturas de hibridação de cada primer e com o tamanho do fragmento amplificado, os programas das reações diferiram entre si. 64 C 64 C 64 C 56 C 64 C 64 C 64 C 33

43 Material e Métodos 3.3. Pesquisa de genes implicados na resistência à tigeciclina Nos isolados das espécies K. pneumoniae e E. coli, com suscetibilidade diminuída à tigeciclina, amplificaram-se os genes ramr e marr, respetivamente. Os primers para os genes ramr e marr foram desenhados, para este estudo, no LNR-RA a partir de sequências publicadas (Hentschke et al., 2010; Keeney et al., 2008). As condições de amplificação dos genes ramr e marr foram otimizados pela primeira vez, no presente estudo. Assim, inicialmente foram testados intervalos de temperatura para realizar o PCR (gradiente de temperatura), utilizando um termociclador (C1000 Thermocycler, Bio-Rad), com a possibilidade de efetuar esse gradiente, de forma a determinar a temperatura ótima de hibridação para cada um dos genes. Além disso, foi realizado um PCR com um gradiente de cloreto de magnésio (MgCl 2 ) (1,5-5mM) de forma a detetar a concentração ótima de MgCl 2 que corresponderia à melhor amplificação, com a temperatura de hibridação previamente escolhida no PCR com gradiente de temperatura, para cada um dos genes. Para o gene ramr utilizou-se a temperatura de hibridização de 48 ºC e para o gene marr 54 ºC. Foi escolhida a concentração de 3mM e 2,5mM de MgCl 2 para amplificação dos genes marr e ramr, respetivamente. Para as reações de amplificação, por PCR simples, do gene marr foram padronizadas para 25μL de volume total com os seguintes reagentes: 13,7 μl de água bidestilada, estéril e apirogénica (Labesfal), 0,2 μl de dntps (0,2 mm de datp, dctp, dgtp e dttp, Roche Diagnostics) 2,5μL de tampão (1x, Quiagen), 1,5μL de MgCl 2 (3 mm, Quiagen), 0,5 μl de cada primer (20 μm) (Tabela 7), 5 μl de Q solution (1x, Quiagen), 0,1μL de Taq polimerase (0,6 unidades, Bioline) e, por fim, 1μL de DNA. Para as reações de amplificação por PCR simples do gene ramr, foram utilizadas as mesmas condições usadas para o gene marr, com uma diferença no volume de água bidestilada (14,2 μl) e MgCl 2 (1 μl; 2,5 mm, Quiagen). Com a padronização dos parâmetros da reação de amplificação do gene marr e ramr, foram efetuadas as reações de PCR com as condições descritas na Tabela 7, para posterior análise da sequência nucleotídica. As amplificações e sequenciação foram realizadas num termociclador (C1000 Thermocycler). 34

44 Material e Métodos Tabela 7 - Sequência e tamanho dos primers ramr e marab e as condições utilizadas nas reações de amplificação. Gene Primers 5' - 3' Desnaturação Nº de Extensão Tamanho do Ciclos inicial ciclos final fragmento marab marr-f GCAACTAATTACTTGCCAGG 94º C 5min 30 94º C 30s 72º C 10min 1162bp marb-r AAGGTGGGAAGTTAATAAGC 54º C 30s 72º C 1min15s ramr RamR-F ACTCATTATTAGGAAAGCGATG 94º C 5min 30 94º C 30s 48º C 45s RamR-R AGTGTTTCCGGCGTCATTAG 72º 1min 72º C 10min 725bp 3.4. Eletroforese em gel de agarose e visualização de DNA Os produtos amplificados de cada reação foram submetidos à eletroforese em gel de agarose a 1% (Agarose Multi-Purpose, BIOLINE) em TAE 1x (0,04M tris-acetato, 0,001M EDTA), ao qual se adicionou SYBR Safe (Invitrogen life Science Technologies). O volume de amostra aplicado no gel foi de 7 μl, adicionados de 2 μl de tampão (0,25% de azul de bromofenol, 0,25% xileno-cianol e 30% glicerol). A eletroforese decorreu durante 35min, a 120V para os produtos de PCR simples e durante 45min a 120V para os produtos dos PCRs multiplex. Após migração dos produtos de PCR, o gel foi visualizado sob luz ultravioleta num transiluminador (Bio-Rad Gel Doc 2000). Os isolados com genes de resistência evidenciaram um fragmento de DNA com o tamanho (pb) previsto (ao serem desenhados os primers), tendo sido confirmado pelos controlos positivos Purificação dos produtos de PCR De forma a eliminar o excesso de reagentes (primers, dntps, Taq polimerase) não utilizados na reação de amplificação, foi efetuada a purificação dos produtos de PCR antes da realização da reação de sequenciação. Para tal, foi utilizado o método ExoSAP-IT (Usb ), que tem a atividade enzimática, inicialmente, de uma exonuclease e, posteriormente, de uma fosfatase alcalina. Assim, a reação de purificação foi realizada com 2 l do reagente ExoSAP-IT adicionados a 5 l de produto de PCR. A reação decorreu num termociclador (C1000 Thermocycler, Bio-Rad) com a ação das 35

45 Material e Métodos enzimas a 37ºC, durante 15 minutos, numa fase inicial, seguida da sua inativação, a 80ºC, durante 15 minutos, numa fase final Sequenciação nucleotídica Os produtos de PCR purificados foram sequenciados, de modo a determinar a composição da sequência nucleotídica e identificar os genes detetados por PCR. Para cada produto de PCR fez-se uma mistura de sequenciação com 1 l de BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing (Applied Biosystem), 0,4 μl do primer específico para o gene em estudo (Tabelas 6 e 7), 1 μl de DNA purificado e 7,6 μl de água bidestilada, estéril e apirogénica (Labesfal), de modo a perfazer um volume final de 10 l. A reação de sequenciação decorreu num termociclador (Mastercycler Pro, Eppendorf) durante 23 ciclos, com as seguintes condições: desnaturação das cadeias de DNA a 96ºC, durante 10 s, hibridação dos primers a 56ºC, durante 5 s, e extensão a 60ºC, durante 5 min. De seguida, os produtos sequenciados foram enviados à Unidade de Tecnologia e Inovação do INSA, para remoção dos terminadores por precipitação alcoólica, migração no sequenciador automático (ABI PRISM 3100, Applied Biosystem) e registo das sequências (eletroferogramas). A análise e interpretação das sequências nucleotídicas dos genes bla e dos genes ramr e marr obtidas foram, posteriormente, realizadas no LNR-RA, recorrendo ao software Bionumerics Applied Maths versão 3.5. O alinhamento das sequências nucleotídicas obtidas para o gene marr, foi realizada, incluindo a sequência de referência de E. coli K-12 MG1655 wild-type, recorrendo ao programa bioinformático CLC DNA Workbench 5.6. As sequências nucleotídicas do gene ramr foram também alinhadas com a sequência de referência de Klebsiella pneumoniae subsp. pneumoniae MGH (CP000647), recorrendo ao mesmo programa bioinformático. 4. Caracterização bioquímica: β-lactamases Realizou-se a focagem isoelétrica para confirmar a expressão de β-lactamases codificadas pelos genes amplificados, em isolados selecionados aleatoriamente na amostra em estudo. 36

46 Material e Métodos 4.1. Extração de β-lactamases A extração de β-lactamases, para posterior realização da focagem isoelétrica, foi realizada pela inoculação, em 15mL de Brain Heart Infusion (BHI) (INSA), de uma colónia isolada em meio de gelose simples (INSA). A suspensão bacteriana obtida, foi incubada a 37ºC, com agitação, durante 18h e, de seguida, centrifugada a 10000rpm, a 4ºC, durante 15min (2K15 Sigma). Após centrifugação, o sobrenadante foi rejeitado e o pellet foi ressuspendido em 1mL de água destilada estéril e agitado num vortex. De seguida, a suspensão foi sonicada (num tubo envolto em gelo), durante 1min30seg com um sonicador (UP 200S, Dr. Hielscher, GmbH). A suspensão obtida foi, então, centrifugada a 16000rpm, a 4ºC, durante 30min. Por fim, o sobrenadante (β-lactamase) foi transferido para um eppendorf, e conservado a -20ºC, para posterior aplicação e migração no gel de focagem Teste do Nitrocefin Para analisar a atividade enzimática da β-lactamase, adicionou-se 5µL de cada amostra a 5µL de Nitrocefin (Oxoid). O resultado positivo resulta da degradação do Nitrocefin pela enzima, com alteração da cor inicial (amarelo) para vermelho Gel de focagem isoelétrica Preparação do gel de migração Inicialmente, duas placas de vidro (para realização do gel de migração) foram tratadas com Repel-Silane (Pharmacia). Adicionou-se, numa das placas, o GelBond PAG Film (Amersham Pharmacia Biotech AB), com a parte hidrófila para cima. De seguida, a outra placa foi assente por cima daquele filme (segura à primeira placa, por meio de molas). O gel de migração foi preparado num volume de 31,1mL com os seguintes reagentes: 3,75mL ReadySol IEF 40% (Pharmacia Biotech), 2mL Ampholine (ph 7,0-9,0) (Amersham Pharmacia Biotech AB), 24 ml água destilada, 85µL persulfato de amónia 10% (Merck) e 50 µl de TEMED (N,N,N,N - 37

47 Material e Métodos tetrametiletilenodiamina) (Merck). Após preparação da solução, esta foi injetada entre duas placas vidros. A polimerização foi efectuada por exposição à luz, durante 25min Migração Após o período de polimerização, o gel foi colocado numa plataforma de migração (Multiphor II, Amersham Pharmacia Biotech), e refrigerado por um banho à temperatura de 12ºC (Multitemp III, Amersham Pharmacia Biotech). Posteriormente, os pedaços de papel de filtro (Amersham Biosciences AB), que exerceram a função de suporte para a aplicação de 5 l de extratos enzimáticos, foram colocados no gel (ânodo). Finalmente, aplicaram-se duas tiras de papel de filtro (Amersham Pharmacia Biotech AB) no gel: uma embebida em H 3 PO 4 1M (ânodo) e outra embebida em NaOH 1M (cátodo). Estas tiras permitiram o contato entre o gel e os eléctrodos. A duração da migração foi de 1 hora, com uma voltagem de 1500V, intensidade de 30mA e potência de 30W. Em paralelo com as amostras em estudo, foram aplicados no gel os seguintes extratos de β-lactamases de referência, isto é, controlos de migração, com pis conhecidos: E. coli R111 (TEM-1, pi 5,4), E. coli 5753 (CTX-M-15, pi 8,9), E. coli Guer (IRT-2, pi 5,2), E. coli Soler (AmpC, pi 9,2) e K. pneumoniae 6884 (SHV-1, pi 7,6) Preparação do gel de revelação A preparação do gel de revelação foi efetuada da seguinte forma: aquecimento de 14,7mg/mL de agar (Difco) e 4,9mg/mL de amido (Difco) dissolvidos em 70mL de tampão fosfato 0,1M, ph 6. Após arrefecimento da solução, adicionou-se 0,13mg/mL de penicilina G (Wyeth) e 3mL de uma solução de iodo composta por 20mg/mL de iodo (Sigma) e por 530mg/mL de iodeto de potássio (Merck). Seguidamente, injetou-se o gel entre duas placas de vidro, previamente aquecidas para evitar a polimerização do gel e colocou-se no frio para solidificar. Após migração das amostras no gel de migração, colocou-se o gel de revelação sobre o primeiro. A revelação da presença do extrato enzimático no gel de migração foi possível devido à hidrólise enzimática da penicilina G pela -lactamase, a qual origina ácido penicilinóico; este promove a redução do iodo na presença do amido, descorando o gel de revelação. Através da comparação com as enzimas de referência determinou-se o(s) pi(s) em cada amostra. 38

48 Resultados III. Resultados 1. Avaliação da suscetibilidade de bactérias de Gram negativo aos antibióticos 1.1. Suscetibilidade a 8 classes de antibióticos O teste de suscetibilidade foi efetuado em 211 isolados de Gram negativo. Os resultados da suscetibilidade de todos os antibóticos ensaiados estão descritos na Tabela 8. Dentro do grupo dos antibióticos β-lactâmicos verificou-se uma elevada percentagem de suscetibilidade diminuída a vários antibióticos ensaiados. Assim, todos os isolados em estudo apresentaram suscetibilidade diminuída à amoxicilina; 95 e 97% apresentaram suscetibilidade diminuída a outras penicilinas: ticarcilina e piperacilina, respetivamente. Verificou-se que 91% e 53% dos 211 isolados eram ser não suscetíveis às combinações amoxicilina/ácido clavulânico e piperacilina/tazobactam, respetivamente. De forma geral, os isolados apresentaram suscetibilidade diminuída às cefalosporinas de primeira (98%), segunda (98%) e terceira geração (90-95%). Os isolados apresentaram menor percentagem de suscetibilidade diminuída (69%) à cefalosporina de quarta geração, em relação às outras cefalosporinas. Verificou-se ainda menor atividade antimicrobiana da cefoxitina (71%) e do aztreonam (85%) para os isolados estudados. Os carbapenemes foram os antibióticos que apresentaram maior atividade in vitro na classe dos β-lactâmicos ensaiados, tendo, portanto, os isolados evidenciado uma maior suscetibilidade a estes antibióticos; no entanto de entre todos os carbapenemes ensaiados, os isolados apresentaram uma maior percentagem de suscetibilidade diminuída (13%) ao ertapeneme. Nas espécies bacterianas estudadas, a suscetibilidade diminuída ao imipeneme encontra-se distribuída da seguinte forma: 6% das K. pneumoniae (4/70), 50% das M. morganii (5/10), 5% Enterobacter spp./c. freundii (1/20), e 29% dos P. mirabilis (2/7). Em relação às fluoroquinolonas, os isolados apresentaram baixa percentagem de suscetibilidade (78-88% de suscetibilidade diminuída). Na classe dos aminoglicosídeos, os antibióticos menos eficazes in vitro foram a kanamicina (73%) seguida da gentamicina (57%). Os isolados apresentaram maior percentagem de suscetibilidade à amicacina (91%), neste grupo. Os nitrofuranos e a fosfomicina apresentaram boa atividade in vitro. Já em relação à combinação trimetoprim/sulfamidas verificou-se que 39

49 Resultados 69% dos isolados apresentavam suscetibilidade diminuída. A colistina foi um dos antibióticos para os quias os 211 isolados apresentaram menor percentagem de suscetibilidade diminuída (14%), bem como a tigeciclina (27%). A análise das CIM 50 e CIM 90 de, pelo menos, um antibiótico de cada classe ensaiada para as várias espécies bacterianas estudadas, encontra-se na Tabela 9. Como se pode verificar a menor CIM 90 da tigeciclina é de 1mg/L para E. coli, Enterobacter spp./c. freundii, sendo superior em K. pneumoniae (4mg/L). Em relação à ciprofloxacina, a CIM 90 foi >8mg/L para todas as espécies e CIM 50 e CIM 90 de 32 a >64mg/L nas cefalosporinas de terceira geração, com exceção da CIM 50 da ceftazidima para P. mirabilis e M. morganii (CIM 50 4mg/L e CIM 50 8mg/L, respetivamente). Já a CIM 50 e CIM 90 do imipeneme foi igual para E. coli e K. pneumoniae ( 0,25mg/L e 0,5mg/L, respetivamente), tendo aquele antibiótico menor atividade in vitro nos isolados de M. morganii (CIM 50 2 mg/l e CIM 90 4mg/L) e P. mirabilis (CIM 50 2 mg/l e CIM 90 16mg/L), mas atividade superior in vitro em S. marcescens (CIM 50 0,25mg/L e CIM 90 0,25mg/L). 40

50 Resultados Tabela 8 - Suscetibilidade de 211 isolados de Gram negativo a antibióticos de diferentes classes. Antibióticos Suscetibilidade diminuída Suscetibilidade Nº % Nº % β-lactâmicos Amoxicilina Ticarcilina Piperacilina Amoxicilina + CLAV Piperacilina + TAZ Cefalotina Cefuroxima Cefotaxima a Ceftazidima a Cefpodoxima Ceftriaxona Cefixima Cefepima Cefoxitina a Aztreonam Imipeneme a Ertapeneme Meropeneme Fluroquinolonas Ácido nalidíxico Norfloxacina Pefloxacina Ciprofloxacina a Aminoglicosídeos Kanamicina Gentamicina Amicacina Polimixinas Colistina a Glicilciclinas Tigeciclina a Outras classes Nitrofuranos Fosfomicina Trimetoprim/Sulfamidas a Suscetibilidade determinada pelo método de microdiluição (a suscetibilidade aos restantes antibióticos foi determinada pelo método de difusão por disco); CLAV, Ácido clavulânico; TAZ, tazobactam. 41

51 Resultados 1.2. Suscetibilidade à tigeciclina A atividade in vitro da tigeciclina (expressa em CIM 50 e CIM 90 ) para as diferentes espécies obtida pelo método de microdiluição, está igualmente analisada na Tabela 9. Aí comparou-se a suscetibilidade do total dos isolados em relação aos isolados suscetíveis à tigeciclina e com suscetiblidade diminuída a este antibiótico. Assim, no total de isolados, 73% eram suscetíveis à tigeciclina (Tabela 8), representado por 93% dos isolados de E. coli, 90% de Enterobacter spp./c. freundii, 57% de K. pneumoniae, 33% de S. marcescens e, por fim, 20% de M. morganii (Tabela 9). Nos isolados suscetíveis à tigeciclina verificou-se que a CIM 50 para este antibiótico variou de 0,5 a 1mg/L e a CIM 90 foi de 1mg/L nos isolados de E. coli, K. pneumoniae, Enterobacter spp./c. freundii, M. morganii e S. marcescens. Entre os antibióticos β-lactâmicos testados nesses isolados suscetíveis à tigeciclina, o imipeneme foi o antibiótico que apresentou melhor atividade in vitro com CIM 50 e CIM 90 baixas (CIM 50 0,25 e CIM 90 0,25 a 1mg/L), à exceção da espécie M. morganii (CIM 50 0,5 mg/l e CIM 90 4mg/L). No que diz respeito às cefalosporinas de terceira geração, verificaram-se valores de CIM 90 entre 32 mg/l e >64mg/L, relativamente próximos dos valores de CIM 50 entre 32 mg/l e 64mg/L, excetuando-se um valor de CIM 50 8 mg/l para P. mirabilis. A cefoxitina apresentou também baixa atividade in vitro nesses isolados, com CIM mg/l - >128mg/L, assim como a ciprofloxacina com valores de CIM 90 de 4 mg/l a >8mg/L. Relativamente à colistina, foi observada uma atividade in vitro superior a outros antibióticos testados nos isolados de E. coli e K. pneumoniae com CIM 90 0,25 mg/l e 1mg/L, respetivamente. A suscetibilidade diminuída à tigeciclina foi observada em 27% dos 211 isolados em estudo (Tabela 8). De entre estes, 100% dos P. mirabilis apresentaram CIM 50 e CIM 90 de 8mg/L. Para as outras espécies com suscetibilidade diminuída à tigeciclina este antibiótico apresentou CIM 50 de 2 mg/l, exceto M. morganii com 4mg/L, e evidenciou uma CIM 90 de 2mg/L para isolados de E. coli e S. marcescens, 8mg/L para K. pneumoniae e Enterobacter spp./c. freundii e 16mg/L para M. morganii. Ainda nos isolados com suscetibilidade diminuída à tigeciclina, a atividade in vitro das cefalosporinas de terceira geração (CIM >64mg/L) e da cefoxitina (CIM >128mg/L) foi menor do que para os restantes antibióticos, sendo, no entanto, semelhantes as CIM 90 dos isolados suscetíveis à tigeciclina. O imipeneme apresentou, 42

52 Percentagem Resultados geralmente, uma maior atividade in vitro do que os restantes antibióticos, nomeadamente para isolados de E. coli, K. pneumoniae e S. marcescens com CIM 90 0,25 mg/l e em Enterobacter spp./c. freundii com CIM 90 0,5mg/L, valores, qualquer deles, de suscetibilidade. Em isolados de M. morganii e P. mirabilis observaram-se valores mais elevados de CIM 90 4 e 16mg/L, respetivamente. A ciprofloxacina apresentou CIM 90 >8mg/L, para todas as espécies, com exceção de Enterobacter spp./ C. freundii (CIM 90 0,25mg/L). Relativamente à colistina, foi observada uma elevada atividade in vitro apenas nos isolados de K. pneumoniae e Enterobacter spp./c. freundii com CIM 90 de 1mg/L, correspondendo a valores de suscetibilidade. Ainda em relação aos isolados suscetíveis e não suscetíveis à tigeciclina, analisou-se a sua distribuição de acordo com a idade do doente em que foram obtidos (Fig. 11), tendo-se verificado que os isolados não suscetíveis foram, sobretudo, provenientes de doentes com idade 65 anos (22%). Foram ainda isolados de doentes do grupo etário15-64 anos (3 %), do grupo etário 1-9 anos (1 %) e 0% em indivíduos com idade < 1 ano e no grupo etário anos. Desconhece-se a idade dos doentes de 6% dos isolados estudados <1 ano (n=5) 1-9 anos (n=8) anos (n=2) anos (n=37) 65 anos (n=147) 0 TGC S (n=149) TGC I/R (n=50) Figura 11 - Distribuição de 199 isolados suscetíveis e não suscetíveis à tigeciclina por grupo etário dos doentes. TG, tigeciclina; S, sucetíveis; I/R, suscetibilidade diminuída; (Não contempla 12 (6%) dos isolados do estudo, cuja idade dos doentes se desconhece). Os isolados suscetíveis à tigeciclina estavam distribuídos em todas as faixas etárias, com uma maior frequência também em doentes com idade 65 anos (52%) (Fig. 11). 43

53 Resultados Tabela 9 - Intervalo de concentrações inibitórias mínimas (CIM) nas quais 50% (CIM 50 ) e 90% (CIM 90 ) dos isolados foram inibidos por 7 antibióticos de 4 classes diferentes, em relação ao total de isolados (n=211) e à suscetibilidade ou suscetibilidade diminuída à tigeciclina. E. coli CIM (mg/l) Total de isolados (n=101) Tigeciclina Suscetível (n=94) Tigeciclina I/R (n=7) Breakpoints Interpretação Interpretação Interpretação SFM Antibióticos CIM 50 CIM 90 Range %S %IR CIM 50 CIM 90 Range %S %IR CIM 50 CIM 90 Range %S %IR S R CAZ >64 6% 94% >64 6% 94% % 100% 1 >4 CTX >64 > >64 5% 95% >64 > >64 5% 95% % 100% 1 >2 FOX >128 23% 77% >128 24% 76% % 100% 8 >32 IMP 0,25 0,5 0, % 0% 0,25 0,5 0, % 0% 0,25 0,25 0,25-0,25 100% 0% 2 >8 CIP >8 >8 0,125- >8 10% 90% >8 >8 0,125- >8 11% 89% >8 >8 >8 - >8 0% 100% 0,5 >1 TGC 0,5 1 0, % 7% 0,5 1 0, % 0% % 100% 1 >2 COL 0,5 0,5 0,5- >32 97% 3% 0,5 0,5 0, % 2% 0,5 8 0,5-8 86% 14% 2 >2 K. pneumoniae CIM (mg/l) Total de isolados (n=70) Tigeciclina Suscetível (n=40) Tigeciclina I/R (n=30) Breakpoints Interpretação Interpretação Interpretação SFM Antibióticos CIM 50 CIM 90 Range %S %IR CIM 50 CIM 90 Range %S %IR CIM 50 CIM 90 Range %S %IR S R CAZ >64 0% 100% >64 0% 100% % 100% 1 >4 CTX >64 > >64 3% 97% >64 > >64 3% 98% >64 > >64 3% 97% 1 >2 FOX >128 51% 49% >128 58% 43% % 57% 8 >32 IMP 0,25 0,5 0, % 6% 0,25 0,5 0, % 10% 0,25 0,25 0, % 0% 2 >8 CIP >8 >8 0,125- >8 14% 86% >8 >8 0,125- >8 23% 78% >8 >8 0,5 - >8 3% 97% 0,5 >1 TGC 1 4 0, % 43% 1 1 0, % 0% % 100% 1 >2 COL 0,5 1 0,5-8 96% 4% 0,5 1 0,5-4 95% 5% 0,5 1 0,5-8 97% 3% 2 >2 44

54 Resultados Tabela 9 - (Continuação) Enterobacter spp./c. freundii CIM (mg/l) Total de isolados (n= 20) Tigeciclina Suscetível (n=18) Tigeciclina I/R (n=2) Breakpoints Interpretação Interpretação Interpretação SFM Antibióticos CIM 50 CIM 90 Range %S %IR CIM 50 CIM 90 Range %S %IR CIM 50 CIM 90 Range %S %IR S R CAZ 64 > >64 0% 100% 64 > >64 0% 100% >64 >64 >64 - >64 0% 100% 1 >4 CTX >64 > >64 0% 100% >64 > >64 0% 100% >64 >64 >64 - >64 0% 100% 1 >2 FOX b 128 > >128 0% 100% 128 > >128 0% 100% 128 > >128 0% 100% 8 >32 IMP 0,25 0,5 0, % 5% 0,25 1 0, % 6% 0,25 0,5 0,25-0,5 100% 0% 2 >8 CIP 0,25 >8 0,125- >8 60% 40% 0, 25 >8 0,125- >8 56% 44% 0,125 0,25 0,125-0,25 100% 0% 0,5 >1 TGC 0,5 1 0, % 10% 0,5 1 0, % 0% % 100% 1 >2 COL 0,5 4 0, % 15% 0,5 32 0, % 17% 0,5 1 0, % 0% 2 >2 M.morganii CIM (mg/l) Total de isolados( n=10) Tigeciclina Suscetível (n=2) Tigeciclina I/R (n=8) Breakpoints Interpretação Interpretação Interpretação SFM Antibióticos CIM 50 CIM 90 Range %S %IR CIM 50 CIM 90 Range %S %IR CIM 50 CIM 90 Range %S %IR S R CAZ >64 20% 80% 8 > >64 0% 100% % 75% 1 >4 CTX 32 > >64 20% 80% 4 > >64 0% 100% 32 > >64 25% 75% 1 >2 FOX 32 > >128 0% 100% 32 > >128 0% 100% 32 > >128 0% 100% 8 >32 IMP 2 4 0,5-4 50% 50% 0,5 4 0,5-4 50% 50% % 50% 2 >8 CIP 8 >8 0,125- >8 30% 70% % 100% 8 >8 0,125- >8 38% 63% 0,5 >1 TGC % 80% % 0% % 100% 1 >2 COL b >32 > >32 0% 100% 32 > >32 0% 100% >32 >32 >32 - >32 0% 100% 2 >2 45

55 Resultados Tabela 9 - (Continuação) P. mirabilis CIM (mg/l) Total de isolados (n=7) a Interpretação Breakpoints SFM Antibióticos CIM 50 CIM 90 Range %S %IR S R CAZ >32 29% 71% 1 >4 CTX 64 > >64 14% 86% 1 >2 FOX % 57% 8 >32 IMP % 29% 2 >8 CIP >8 >8 2 - >8 0% 100% 0,5 >1 TGC % 100% 1 >2 COL b >32 > >32 0% 100% 2 >2 S. marcescens CIM (mg/l) Total de isolados (n= 3) Tigeciclina Suscetível (n=1) Tigeciclina I/R (n=1) Breakpoints Interpretação Interpretação Interpretação SFM Antibióticos CIM 50 CIM 90 Range %S %IR CIM 50 CIM 90 Range %S %IR CIM 50 CIM 90 Range %S %IR S R CAZ % 100% % 100% % 100% 1 >4 CTX 64 > >64 0% 100% % 100% 64 > >64 0% 100% 1 >2 FOX % 100% % 100% % 100% 8 >32 IMP 0,25 0,25 0,25-0,25 100% 0% 0,25 0,25 100% 0% 0,25 0,25 0,25-0,25 100% 0% 2 >8 CIP 4 >8 1 - >8 0% 100% 4 4 0% 100% 1 >8 1 - >8 0% 100% 0,5 >1 TGC % 67% % 0% % 100% 1 >2 COL b >32 >32 >32 - >32 0% 100% >32 >32 0% 100% >32 >32 >32 - >32 0% 100% 2 >2 a Coincide com o número de isolados com suscetibilidade diminuída à tigeciclina (n=7); b Resistência natural; CAZ, ceftazidima; CTX, cefotaxima; FOX, cefoxitina; IMP, imipeneme; CIP, ciprofloxacina; TGC, tigeciclina; COL, colistina; S, suscetível, I, intermédio; R, resistente; SFM, Sociedade Francesa de Microbiologia. 46

56 Resultados 1.3. Análise da multirresistência Do total de 211 isolados, 89% eram multirresistentes. Foi observado que em todas as espécies existiam isolados multirresistentes: 88% de E. coli, 97% de K. pneumoniae, 50% de Enterobacter spp./c. freundii e 100% de M. morganii, P. mirabilis, e S. marcescens. Na Tabela 10 estão representados os diferentes perfis de multirresistência detetados nas várias espécies bacterianas estudadas, realçando os que apresentavam ou não suscetibilidade à tigeciclina. Aí se verifica que todos os perfis de multirresistência apresentavam suscetibilidade diminuída aos antibióticos β-lactâmicos e à maioria às fluoroquinolonas, seguida dos aminoglicosídeos. Embora tenham sido observados mais perfis de multirresistência com suscetibilidade diminuída à tigeciclina (n=20) do que perfis de multirresistência de isolados suscetíveis à tigeciclina (n=17), há uma maior percentagem (70%) de isolados multirresistentes com suscetibilidade à tigeciclina. Nos isolados suscetíveis à tigeciclina, o perfil de multirresistência predominante incluiu suscetibilidade diminuída aos β-lactâmicos, às fluoroquinolonas, aminoglicosídeos e à associação trimetoprim/sulfamidas, encontrado em E. coli (37%; 33/89 isolados), K. pneumoniae (19%; 13/68 isolados) e Enterobacter spp./c. freundii (50%; 5/10 isolados). Este perfil foi também observado em conjunto com a suscetibilidade diminuída à tigeciclina em E. coli (4%; 4/89 isolados) e K. pneumoniae (19%; 13/68 isolados). A multirresistência aos β-lactâmicos, fluoroquinolonas, aminoglicosídeos foi encontrada apenas em E. coli (34%, 30/89 isolados) e foi também observada em conjunto com suscetibilidade diminuída à tigeciclina apenas num isolado de E. coli. Foi ainda detetado outro perfil de multirresistência que incluiu suscetibilidade diminuída aos β-lactâmicos, às fluoroquinolonas, aos aminoglicosídeos, à associação trimetoprim/sulfamidas e nitrofuranos, predominante em K. pneumoniae (28%; 19/68 isolados) e encontrada num isolado de E. coli (1%; 1/89 isolados), tendo sido também observado em associação com suscetibilidade diminuída à tigeciclina apenas em K. pneumoniae (15%; 10/68 isolados). Em P. mirabilis, M. morganii e S. marcescens a multirresistência estava, sobretudo, associada à suscetibilidade diminuída à tigeciclina. 47

57 Resultados Tabela 10 - Distribuição de 187 isolados com multirresistência aos antibióticos, em 211 isolados de Gram negativo, realçando os perfis com e sem suscetibilidade diminuída à tigeciclina, por espécie bacteriana. Enterobacter Fenótipo de E.coli K. pneumoniae M. morganii P. mirabilis S. marcescens multirresistência (187/211) a (89/101) a (68/70) a spp./c. freundii (10/20) a b (10/10) a (7/7) a (3/3) a Suscetibilidade à tigeciclina (131/187) L A N 1 L A S 3 2 L Q A 30 L Q A C FS 1 L Q A FS 1 L Q A S L Q A S C 2 1 L Q A S C FS 1 L Q A S C N 1 1 L Q A S FS 2 L Q A S FS N 2 L Q A S N L Q FS 1 L Q N 1 L Q S 6 L Q S C 1 L Q S N 2 Suscetibilidade diminuída à tigeciclina (56/187) L C FS N T 1 L C N T 1 L N T 1 L Q A C FS N T 1 1 L Q A S C FS N T 2 2 L Q A S C FS T 1 L Q A S C N T 2 2 L Q A S C T 1 L Q A S FS N T 2 L Q A S FS T 1 L Q A S N T 10 L Q A S T 4 13 L Q A T 1 L Q C FS N T 1 L Q C N T 1 L Q N T 1 1 L Q S C FS N T 1 L Q S C N T 1 1 L Q S N T 2 L Q S T 1 a Isolados multirresistentes/ total de isolados em estudo. b Integra 8/16 isolados de Enterobacter spp. e 2/4 isolados de C. freundii Os perfis em negrito representam os perfis de multirresistência que são comuns em isolados com e sem suscetibilidade diminuída à tigeciclina; A, aminoglicosídeos (kanamicina, gentamicina, amicacina); C, colistina; FS, 48

58 Resultados fosfomicina; N, nitrofuranos; L, β-lactâmicos; Q, fluoroquinolonas (Ácido nalidíxico, norfloxacina, pefloxacina, ciprofloxacina); S, trimetoprim/sulfamidas; T, tigeciclina. Para além destes perfis em comum, com e sem suscetibilidade à tigeciclina, foram ainda observados outros perfis de multirresistência, em isolados das diferentes espécies, embora em menor frequência, sendo os perfis representados maioritariamente pela suscetibilidade diminuída aos aminoglicosídeos e às fluoroquinolonas. 2. Caracterização genotípica dos isolados produtores de β-lactamases Os resultados dos testes fenotípicos orientaram a pesquisa de genes bla implicados na suscetibilidade diminuída aos antibióticos β-lactâmicos. Os perfis de suscetibilidade aos antibióticos β-lactâmicos ensaiados foram relacionadas com os genótipos obtidos e respetivas β-lactamases identificadas, assim como a distribuição pelos hospitais de proveniência (Tabelas 11, 12 e 13) ESBLs, PMAβ e penicilinases Foram identificados 84% de isolados com suscetibilidade diminuída à cefotaxima e sinergia com ácido clavulânico e/ou resultado positivo no E-teste PM/PML, indicativo da produção de ESBL (Tabela 11). Assim, a presença deste fenótipo conduziu, principalmente, à pesquisa de genes bla CTX-M, tendo sido detetados 161 genes bla CTX-M (Tabela 11) que codificavam a β-lactamase CTX-M. Globalmente, foram identificadas 137 enzimas CTX-M-15 e CTX-M-15-tipo, distribuídas em todas as espécies estudadas, com predominância em E. coli (55%) e em K. pneumoniae (38%). Foram ainda identificadas outras β-lactamases CTX-M do grupo 1: CTX-M-1 (2%) em E. coli e CTX-M-32 (2%) em E. coli e P. mirabilis. Do grupo 9 foi identificada a ESBL CTX-M-14 (5%) apenas em E. coli. As enzimas AmpC plamídicas identificadas, DHA- 1 e CMY-2, foram detetadas em isolados de K. pneumoniae e E. coli, respetivamente. Em ambas verificou-se ainda a produção de CTX-M e fenótipo de suscetibilidade diminuída às penicilinas, cefalosporinas de primeira, segunda, terceira e quarta geração, ao aztreonam, cefoxitina e inibidores de β-lactamases. Foi efetuada a pesquisa de genes que codificam enzimas PMAβ em 26 dos 28 isolados de E. coli e K. pneumoniae com suscetibilidade diminuída à cefoxitina, no entanto, não foram obtidos resultados positivos. Na ausência de genes bla CTX-M foram, então, pesquisadas outras famílias de genes bla, nomeadamente, da família TEM e SHV. Assim, foram detetados genes 49

59 Resultados bla TEM, entre os quais a maioria codificavam penicilinases TEM-1, TEM-1-tipo e num isolado, TEM-2. De facto, num isolado de P. mirabilis, com fenótipo ESBL foram apenas identificadas as penicilinases TEM-1 e TEM-2. Foi também identificada a produção de duas ESBLs da família TEM, TEM-10 em P. mirabilis e TEM-4 em E. coli. A ESBL TEM-4 era co-produzida com a penicilinase TEM-1, o que foi confirmado pela identificação de duas enzimas, uma com pi 5,9 e outra com pi 5,4 (respetivamente), por focagem isoelétrica. Da família SHV, foram identificadas penicilinases parentais, entre as quais SHV-1, SHV-1-tipo e SHV-11. A presença de algumas destas β-lactamases foi demonstrada na focagem isoelétrica com pi de 7,6. Foram também identificados genes bla SHV que codificavam ESBL, nomeadamente SHV-2, SHV-12 e SHV-55. Em alguns casos, a expressão das enzimas SHV-12 e SHV-55 foi observada pela focagem isoelétrica dos extratos dos isolados respetivos, tendo-se identificado um pi de 8,2. As enzimas ESBL da família SHV foram encontradas em K. pneumoniae, E. coli, E. cloacae, C. freundii e S. marcescens. 50

60 Resultados Tabela 11 - Genótipo de 177 isolados, de diferentes espécies, com suscetibilidade diminuída à cefotaxima, detetados como possíveis produtores de ESBL por métodos fenotípicos: β-lactamases expressas, perfil de resistência aos antibióticos β-lactâmicos e distribuição por hospital a b. E. coli Genótipo c (Nº de isolados) β-lactamases d e Perfil de resistência aos (Nº isolados) β- lactâmicos bla CTX-M (10) CTX-M-1 (3)/ CTX-M-14 (1)/ CTX-M-15-tipo (3)/ CTX-M-15 (3) P C1 C2 C3 C4 M (I) bla CTX-M (62)/ bla CTX-M +bla CMY (1) CTX-M-1 (1)/ CTX-M-14 (5)/ CTX-M-15-tipo (36)/ CTX-M-15 (18) CTX-M-32 (1)/ CTX-M-15+ CMY-2 (1) P C1 C2 C3 C4 M F (I) Código de Hospitais B, D, E, G, H, N A, B, C, D, E, F, G, H, L, M, N Número de isolados bla CTX-M (1) CTX-M-15 (1) f P C1 C2 C3 C4 M F I C G 1 bla CTX-M (8) CTX-M-14 (1)/ CTX-M-15 (1)/ CTX-M-15-tipo (5) bla CTX-M (7)/ bla SHV + ampc (1)/ CTX-M-15 (1)/ CTX-M-15-tipo (6)/ SHV-12 (1)/ bla TEM + bla SHV + ampc (2) SHV-12 + TEM-1-tipo (2) P C1 C2 C3 (F) (I) B, F, L 8 P C1 C2 C3 M (F) I B, G, H 10 bla SHV + ampc (3) SHV-12 (3) g P C1 C2 C3 M F, L 3 bla TEM + ampc (1) TEM-1 + TEM-4 h P C1 C2 C3 M F L 1 K. pneumoniae bla TEM +bla SHV (1) TEM-1-tipo + SHV-2 (1) P C1 C2 C3 H 1 bla CTX-M (9) CTX-M-15 (2) f / CTX-M-15-tipo (7) f P C1 C2 C3 C4 M F (I) C B, G, L 9 bla CTX-M (47)/ bla CTX-M+ bla DHA (1) bla SHV (1) CTX-M-15 (13)/ CTX-M-15-tipo (27)/ CTX-M-15-tipo + DHA-1 (1)/SHV-1 + SHV-12 (1) i P C1 C2 C3 C4 M (F) I B, D, F, G, H, J, L bla CTX-M (2) CTX-M-15 (1) P C1 C2 C3 (F) I F 2 bla CTX-M (1)/ bla TEM +bla SHV (2) CTX-M-15 (1)/ TEM-1-tipo+SHV-11+SHV-12 (1) j / TEM-1-tipo + SHV-1+ SHV-55 (1) l P C1 C2 C3 M (F) I B, G, N

61 Resultados Tabela 11 - (Continuação) Genótipo c (Nº de isolados) β-lactamases d (Nº isolados) Perfil de resistência aos β-lactâmicos Código de Hospitais Número de isolados Enterobacter spp. /C. freundii bla CTX-M +bla TEM +bla KPC+ bla OXA (1 E. aerogenes) CTX-M-15-tipo+KPC-3-tipo m +TEM-1-tipo+OXA-1-tipo n (1) P C1 C2 C3 C4 M F I C B, H 1 bla CTX-M (1 E. aerogenes/ 1 C. freundii ) CTX-M-15-tipo (2) P C1 C2 C3 C4 M F I H 2 bla SHV +bla OXA (1 E. cloacae)/ bla TEM +bla SHV +bla OXA + bla MIR (1 E. cloacae) P. mirabilis SHV-12+ OXA-1-tipo (1) / TEM-1-tipo+OXA-1-tipo+SHV-12 + MIR-tipo o (1) P C1 C2 C3 M F I C H 2 bla CTX-M (2) CTX-M-32 (2) P C1 C2 C3 H 2 bla TEM (1) TEM-1 + TEM-2 P C1 C2 C3 F D 1 bla TEM (1) TEM-10 P C1 C2 C3 C4 M B 1 bla CTX-M (2) CTX-M-15-tipo (1)/ CTX-M-15 (1) P C1 C2 C3 C4 M F I (C) B, M 2 M. morganii bla CTX-M (1) CTX-M-15-tipo (1) P C1 C2 C3 F I H 1 bla CTX-M (1) CTX-M-15-tipo (1) P C1 C2 C3 F I C F 1 bla CTX-M (2) CTX-M-15 (1)/ CTX-M-15-tipo (1) P C1 C2 C3 M F I C H, M 2 S. marcescens bla CTX-M (1)/ bla TEM + bla SHV (1) CTX-M-15-tipo (1)/ TEM-1 + SHV-12 (1) P C1 C2 C3 C4 M F I B, H 2 a Isolados com sinergia entre cefotaxima e cefotaxima em combinação com ácido clavulânico ou b Isolados apenas com sinergia entre cefepima e cefepima em associação com ácido clavulânico. c Pesquisa efetuada por PCR; d Identificação obtida após sequenciação nucleotídica; e Isolados com sinergia entre cefotaxima e cefotaxima em combinação com ácido clavulânico, cujo fenótipo ESBL, uma vez justificado pela produção de CTX-M, não implicou a eventual pesquisa de outros genes bla ESBL. f Isolados com suscetibilidade diminuída aos carbapenemes, mas sem produção de carbapenemase, justificada pelo teste de sinergia negativo entre meropeneme e ácido borónico, cloxacilina e EDTA e pela ausência de β-lactamase por focagem isoelétrica; g pi 8,2 (expressão de SHV-12) determinado em um isolado; h pi 5,4 + 5,9 (expressão de TEM-1 e TEM-4, respetivamente); i pi 7,6 e 8,2 (expressão de SHV-1 e SHV-12, respetivamente); j pi 5,4 + 7,6 + 8,2 (expressão de TEM-1, SHV-11 e SHV-12, respetivamente); l pi 5,4 + 7,6 + 8,2 (expressão de TEM-1, SHV-1 e SHV-55); 52

62 Resultados m Testes fenotípicos positivos que justifiquem produção de KPC: teste de sinergia positiva entre meropeneme e ácido borónico; caracterização bioquímica por focagem isoelétrica: pi 6,7. n pi 5,4+6,7+7,4+8,9 (co-expressão de β-lactamases TEM-1, KPC-3, OXA-1-tipo e CTX-M-15, respetivamente); o pi 8,2 (Co-expressão de SHV-12 e MIR-tipo); P, penicilinas (amoxicilina, ticarcilina e piperacilina); C1, cefalosporina de primeira geração (cefalotina); C2, cefalosporina de segunda geração (cefuroxima); C3, cefalosporinas de terceira geração (cefotaxima, ceftazidima, cefpodoxima, ceftriaxona, cefixima); C4, cefalosporina de quarta geração (cefepima); M, monobactamo (aztreonam); F, cefoxitina; I, inibidores de β- lactamases (amoxicilina com ácido clavulânico e piperacilina com tazobactam); Presença variável de fenótipo não suscetível está indicado entre parênteses. Tabela 12 - Genótipo de 2 isolados com suscetibilidade diminuída à cefotaxima, produtores de ESBL, mas sem evidência fenotípica de produção de ESBL: β-lactamases expressas, perfil de resistência aos antibióticos β-lactâmicos e distribuição por hospital. Genótipo a (Nº de isolados) β-lactamases b Perfil de resistência aos β-lactâmicos Código de Hospitais Número de isolados E. cloacae bla SHV +bla GES +bla OXA SHV-12 + GES-7 + OXA-1-tipo (1) P C1 C2 C3 C4 M F I C H 1 C. freundii bla TEM +bla SHV +bla OXA SHV-12 + TEM-1-tipo + OXA-1-tipo (1) P C1 C2 C3 M F I H 1 a Pesquisa efetuada por PCR; b Identificação obtida após sequenciação nucleotídica. P, penicilinas (amoxicilina, ticarcilina e piperacilina); C1, cefalosporina de primeira geração (Cefalotina); C2, cefalosporina de segunda geração (cefuroxima); C3, cefalosporinas de terceira geração (cefotaxima, ceftazidima, cefpodoxima, ceftriaxona, cefixima); C4, cefalosporina de quarta geração (cefepima); M, monobactamo (aztreonam); F, cefoxitina; I, inibidores de β- lactamases (amoxicilina com ácido clavulânico e piperacilina com tazobactam); 53

63 Resultados O fenótipo predominante nestes isolados, sobretudo produtores de β-lactamases CTX-M ou co-expressando predominantemente β-lactamases TEM e SHV (Tabela 11) mostrou suscetibilidade diminuída as penicilinas, cefalosporinas de primeira, segunda, terceira e quarta geração, aztreonam, cefoxitina (variável) e combinação amoxicilina/ácido clavulânico e combinação piperacilina/tazobactam (variável), tendo sido detetado, principalmente, em isolados de E. coli e K. pneumoniae. Estes isolados tiveram como proveniência diversos hospitais em Portugal. Foram ainda identificados dois isolados (E. cloacae e C. freundii) expressando a ESBL da família SHV: a β-lactamase SHV-12. No entanto, E.cloacae co-expressava a β-lactamase GES-7 (Tabela 12). Estes isolados não apresentaram fenótipo de ESBL, nem no método de microdiluição (sinergia entre cefotaxima e ácido clavulânico), nem no E-teste (BioMérieux) PM/PML, mas apresentaram suscetibilidade diminuída à maioria dos β-lactâmicos e foram isoladas no mesmo hospital (H). Foram também identificados isolados (n=32) para os quais não se observou qualquer evidência fenotípica ou genotípica de produção de ESBL (Tabela 13): 16 expressavam as enzimas TEM-1-tipo, SHV-36, SHV-1-tipo e/ou OXA-1-tipo, tendo revelado resistência ao grupo das penicilinas. Nos restantes dezasseis isolados não foi detectado nenhum gene bla pesquisado. Estes isolados (E. aerogenes, C. freundii, M. morganii e S. marcescens) estão, essencialmente, distribuídos no hospital H. Com exceção de cinco, a suscetibilidade diminuída às cefalosporinas de primeira e segunda geração foi verificada em todos os isolados deste grupo, também representado na tabela 13. A determinação do pi nos isolados anteriormente referidos, permitiu identificar a produção de MIR-tipo em dois isolados de E. cloacae, o que corresponde a uma β- lactamase cromossómica desta espécie. 54

64 Resultados Tabela 13 - Genótipo de 32 isolados com ou sem suscetibilidade diminuída à cefotaxima, sem evidência fenotípica e genotípica de produção de ESBL: β-lactamases expressas, perfil de resistência aos antibióticos β-lactâmicos e distribuição por hospital. Genótipo a (Nº de isolados) β-lactamases b Perfil de resistência aos Código de Número de β-lactâmicos Hospitais isolados E. coli bla TEM + bla ampc (4) TEM-1-tipo (4) P B, D, E 4 bla TEM +bla ampc +bla OXA (1) TEM-1-tipo + OXA-1-tipo (1) P C1 C2 C3 F I E 1 K. pneumoniae bla TEM+ bla SHV+ bla KPC (4) TEM-1+ SHV-36 + KPC-3 -tipo c d (4) P C1 C2 C3 C4 M F I C B, D 4 bla SHV (2) SHV-1-tipo (2) P C1 C2 C3 F I H 2 Enterobacter spp. C. freundii ND (1 E. cloacae/ 2 C. freundii) P C1 C2 C3 (M) F I H 3 ND (2 E. aerogenes + 7 E. cloacae)/ bla MIR (1 E. cloacae) MIR-tipo (1) e P C1 C2 C3 M F I C B, H 10 M. morganii bla OXA (1)/ ND (2) OXA-1-tipo (1) P C1 C2 C3 F I D, I, M 3 ND (1) P C1 C2 C3 F I C H 1 bla OXA (1) OXA-1-tipo (1) P C1 C2 C3 M F I C B 1 bla OXA (1) OXA-1-tipo (1) P C1 F I D 1 P. mirabilis bla TEM TEM-1-tipo P C1 C2 F I C M 1 S. marcescens ND P C1 C2 C3 M F I H 1 a Pesquisa efetuada por PCR; b Identificação obtida após sequenciação nucleotídica; c Testes fenotípicos que justifiquem produção de KPC: teste de sinergia positiva entre meropeneme e ácido borónico; pi 6,7. d pi 5,4+6,7+7,6 (co-expressão de β-lactamases TEM-1, KPC-3 e SHV-36, respetivamente); e pi 8,0 (expressão de MIR-tipo); ND, mecanismo de resistência não detetado ou sobrexpressão de β-lactamases; 55

65 Resultados P, penicilinas (amoxicilina, ticarcilina e piperacilina); C1, cefalosporina de primeira geração (Cefalotina); C2, cefalosporina de segunda geração (cefuroxima); C3, cefalosporinas de terceira geração (cefotaxima, ceftazidima, cefpodoxima, ceftriaxona, cefixima); C4, cefalosporina de quarta geração (cefepima); M, monobactamo (aztreonam); F, cefoxitina; I, inibidores de β-lactamases (amoxicilina com ácido clavulânico e piperacilina com tazobactam); Presença variável de fenótipo não suscetível está indicado entre parênteses Carbapenemases Do grupo de isolados selecionados (n=15) com suscetibilidade diminuída aos carbapenemes (ertapeneme), uma vez realizado o teste de sinergia com meropeneme, apenas cinco (4 K. pneumoniae e 1 E. aerogenes) revelaram sinergia com um dos inibidores, nomeadamente entre o meropeneme e o ácido borónico. Estes isolados apresentaram suscetibilidade diminuída aos carbapenemes e aos restantes antibióticos β- lactâmicos testados e eram provenientes dos hospitais B e D. Foi identificado o gene bla KPC, em todos os isolados, e detetado um pi de 6,7, o qual corresponde à carbapenemase KPC-3. A identificação específica por sequênciação permitiu confirmar a presença de bla KPC-3 e, portanto, a produção de KPC-3; a sequênciação nucleotídica permitiu ainda estudar o ambiente genético do gene bla KPC-3 e identificar o gene istb a montante e o tnpa a jusante. Foram ainda identificadas outros genes bla que codificavam as β-lactamases TEM-1 e SHV-36 em K. pneumoniae e CTX-M-15, TEM- 1 e OXA-1-tipo em E. aerogenes (Tabela 14). Tabela 14 - Isolados produtores de carbapenemase de classe A (KPC-3) Isolados CTX CAZ FOX IMP CIP COL TGC Outras β-lactamases TG139 K. pneumoniae >64 > ,125 0,5 1 TEM-1; SHV-36 TG142 E. aerogenes >64 64 > ,5 1 TEM-1; CTX-M-15; OXA-1-tipo TG144 K. pneumoniae >64 > ,125 0,5 1 TEM-1; SHV-36 TG146 K. pneumoniae >64 >64 > , ,5 TEM-1; SHV-36 TG148 K. pneumoniae >64 > ,125 0,5 1 TEM-1; SHV-36 CTX, cefotaxima; CAZ, ceftazidima; FOX, cefoxitina; IMP, imipeneme; CIP, ciprofloxacina; TGC, tigeciclina. Globalmente, nos 211 isolados estudados, possuindo ou não genes bla CTX-M, foram identificadas 151 β-lactamases CTX-M, entre as quais CTX-M-15(-tipo), CTX- M-1 e CTX-M-32 do grupo 1 e ainda CTX-M-14 do grupo 9 (Tabela 15). 56

66 Resultados Adicionalmente, foram identificadas, nestes isolados, outras β-lactamases, nomeadamente, KPC-3, CMY-2, DHA-1, TEM-1 e uma OXA-1-tipo. Nos isolados bla CTX-M negativos foram identificados outros genes bla, codificando 23 β-lactamases da família TEM, sendo duas ESBL (TEM-4 e TEM-10) e 24 β-lactamases da família SHV, em que 9 eram penicilinases e 15 ESBL (SHV-2, SHV-12 e SHV-55). Ainda nestes isolados foram identificados genes que codificavam as β-lactamases KPC-3, MIR-tipo e OXA-1-tipo (Tabela 15). Tabela 15.β-lactamases identificadas nos 211 isolados estudados, com e sem bla CTX-M. β-lactamases em: Genótipo: bla a Nº Nº CTX positivo (n=156) Genótipo: bla CTX negativo (n=61) CTX-M-15 (-tipo) 137 TEM-1 (-tipo) 20 CTX-M-1 4 TEM-2 1 CTX-M-32 3 TEM-4 1 CTX-M-14 7 TEM-10 1 KPC-3 1 SHV-1 (-tipo) 4 TEM-1 1 SHV-11 1 CMY-2 1 SHV-36 4 DHA-1 1 SHV-2 1 OXA-1-tipo 1 SHV SHV-55 1 KPC-3 4 MIR-tipo 2 OXA-1-tipo 8 a Isolados em que o fenótipo foi justificado pela presença de bla CTX-M, não tendo sido pesquisados mais genes bla ESBL. 3. β-lactamases de diferentes famílias produzidas por bactérias de Gram negativo com ou sem suscetibilidade à tigeciclina Ao relacionar os mecanismos de resistência aos antibióticos β-lactâmicos por produção de β-lactamases constatou-se que, de forma geral, os isolados produtores daquelas enzimas, principalmente ESBL, têm multirresistência aos antibióticos, quer nos isolados com suscetibilidade diminuída à tigeciclina, quer nos suscetíveis à tigeciclina (Fig. 12 A e B). Os isolados produtores de CTX-M apresentavam, na grande maioria, suscetibilidade à tigeciclina e multirresistência. Cerca de 25% dos isolados produtores de CTX-M-15(-tipo) e CTX-M-14, apresentaram suscetibilidade diminuída a tigeciclina e fenótipo de multirresistência. Os isolados produtores de CTX-M-32 eram maioritariamente (65%) não suscetíveis à tigeciclina. A tigeciclina apresentou atividade in vitro importante na maioria dos isolados com SHV, quer nos produtores de penicilinases (SHV-1-tipo, SHV-11 e SHV-36) quer nos produtores de ESBL (SHV-2, SHV-12 e SHV-55). Relativamente aos isolados produtores de TEM, verificou-se que, na sua maioria, eram suscetíveis à tigeciclina, 57

67 % de isolados Resultados contudo o isolado produtor de ESBL TEM-10 apresentou suscetibilidade diminuída a este antibiótico. De realçar ainda que a tigeciclina apresentou atividade in vitro elevada nos isolados produtores de KPC-3, GES-7 e de OXA. Em relação aos isolados em que se detetou MIR-tipo, um era suscetível e outro não suscetível à tigeciclina, sendo ambos multirresistentes. A B 100% 90% 80% 70% 60% 50% 40% 30% 20% 10% 0% TGC I/R MDR TGC S MDR Figura 12 - Distribuição do (A) número de isolados e (B) percentagem, de acordo com a suscetibilidade à tigeciclina, multirresistência e produção de β-lactamases; OXA: OXA-1-tipo (n=9); ND, mecanismo de resistência não detetado ou sobrexpressão de β-lactamases (n=16). a Isolados cuja produção de ESBL CTX-M (isoladamente ou com coexpressão de KPC ou PMAβ) não implicou a eventual pesquisa da presença de outros genes blaesbl. TGC, tigeciclina; S, suscetível; I/R, suscetibilidade diminuída; MDR, multirresistente. 58

68 Resultados 4. Contribuição da bomba de efluxo AcrAB-TolC na atividade da tigeciclina A suscetibilidade diminuída à tigeciclina está associada às mutações nos genes repressores ramr e marr em K. penumoniae e E. coli, respetivamente. Neste sentido, amplificaram-se estes genes e procedeu-se à análise da sequência nucleotídica Análise da sequência nucleotídica do gene marr em E. coli De forma a elucidar o mecanismo associado à suscetibilidade diminuída à tigeciclina em E. coli, selecionaram-se os sete isolados com suscetibilidade diminuída para amplificação do gene marr. Foi possível obter a amplificação do gene em cinco isolados. Adicionalmente, amplificou-se o gene marr em sete isolados de E. coli suscetíveis à tigeciclina. Todos os isolados selecionados apresentaram suscetibilidade diminuída à ciprofloxacina (CIM >8mg/L), com exceção dos isolados TG60 e TG177. Todas as sequências nucleotídicas do gene marr obtidas foram alinhadas e comparadas com a sequência de referência E.coli K-12 MG1655. Das 8 mutações nucleotídicas encontradas no gene marr dos isolados estudados, apenas 2 resultaram em substituições aminoacídicas (Tabela 16): Gly103Ser e Tyr137His. Com exceção do isolado 60, foram detetadas as mesmas 6 mutações silenciosas e as mesmas 2 mutações pontuais no gene marr de todos os isolados, em comparação com a sequência de referência. Tabela 16 - Mutações nucleotídicas no gene marr da estirpe de referência e de 12 isolados clínicos e respetivas substituições aminoacídicas. Enzima Nucleótido (aminoácido) Nº (103) (137) marr(u00096) C G A A C G(Glu) C T(Tyr) 1 TG60 a C G A A C G C T 1 marr b T A G G T A(Ser) T C(His) 11 a Isolado suscetível à tigeciclina e à ciprofloxacina. b Sequência do gene marr de onze idolados, incluindo cinco isolados com suscetibilidade diminuída à tigeciclina (TG48, TG81, TG127, TG164, TG172) e seis suscetíveis à tigeciclina (TG2, TG5, TG9, TG31, TG56, TG60, TG177), todas resistentes à ciprofloxacina, com exceção de uma (TG177) Análise da sequência nucleotídica do gene ramr em K. pneumoniae Dos 30 isolados de K. pneumoniae com suscetibilidade diminuída à tigeciclina obteve-se amplificação do gene ramr em 20. Foi realizado o alinhamento de todas as sequências nucleotídicas do gene ramr em comparação com a sequência de referência Klebsiella pneumoniae subsp. pneumoniae MGH (CP000647). Não foi detetada 59

69 Resultados nunhuma mutação nucleotídica no gene ramr de 11 isolados (TG68, TG76, TG82, TG149, TG169, TG193, TG194, TG201, TG202, TG205, TG208), em comparação com a sequência de referência (Tabela 17). No gene ramr do isolado TG3 foram detetadas duas mutações pontuais que resultaram em duas substituições aminoacídicas Ala20Thr e Arg148His. Foram também encontradas duas mutações pontuais no gene de dois isolados, TG42 (Lys63Thr) e TG136 (Glu78Thr) que resultaram num codão STOP prematuro. No gene do isolado TG136, foi detetada outra substituição aminoacídica, Ala19Val, a qual foi identificada também nos isolados TG166 e TG93. Neste último isolado, foi ainda identificada a deleção (Fig. 13) do nucleótido G 411 ao nucleótido A 421, o que alterou o quadro de leitura a partir do aminoácido Val 138 (sendo este a substituição aminoacídica Val138Ile) até ao codão STOP. No gene ramr do isolado TG70 foi identificada a inserção entre o nucleótido 50 e 51, o que causou alteração no quadro de leitura da proteína (Fig. 14); este gene apresentou ainda, uma substituição aminoacídica, Ile141Thr, também encontrada nos genes ramr dos isolados TG112 e TG155. No gene ramr do isolado TG209 foram identificadas várias mutações silenciosas (n=18), assim como quatro substituições aminoacídicas Thr18Ala, Glu53Lys, Thr69Met e His186Asn, em comparação com a sequência de referência. Figura 13 - Alinhamento das sequências do gene ramr com a sequência de referência (Klebsiella pneumoniae subsp. pneumoniae MGH (CP000647)) do nucleótido G 401 ao nucleótido G 480, representando a deleção nucleotídica do nucleótido G 411 ao nucleótido A 421 no isolado TG93. Figura 14 - Alinhamento das sequências do gene ramr com a sequência de referência (Klebsiella pneumoniae subsp. pneumoniae MGH (CP000647)) do nucleótido G 1 ao nucleótido G 80, representando a inserção de 2 nucleótidos entre o nucleótido 50 e 51 no isolado TG70. 60