BIOCONVERSÃO DE BIOMASSA DE LEVEDURA DE CERVEJA A GOMA XANTANA UTILIZANDO DIFERENTES CEPAS DE Xanthomonas Campestris: RENDIMENTO E REOLOGIA

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1 BIOCONVERSÃO DE BIOMASSA DE LEVEDURA DE CERVEJA A GOMA XANTANA UTILIZANDO DIFERENTES CEPAS DE Xanthomonas Campestris: RENDIMENTO E REOLOGIA Gleice V. P. Gomes 1 *, Maria C. A. Esperidião 2, Janice I. Druzian 3 1* Universidade Federal da Bahia UFBA, Escola Politécnica, Pós-Graduação em Engenharia Química, Salvador-BA gleicevp@ufba.br 2 Universidade Federal da Bahia UFBA, Instituto de Química, Departamento de Química, Salvador-BA. 3 Universidade Federal da Bahia UFBA, Faculdade de Farmácia, Departamento de Análises Bromatológicas, Salvador-BA. A goma xantana (GX) é um biopolímero, produzido por fermentação, empregando a bactéria Xanthomonas campestris. O processamento de cerveja gera grande volume de levedura (biomassa residual) separada do processo fermentativo com Saccharomyces cerevisiae. Este resíduo é composto de carboidratos, proteínas, vitaminas e microelementos, podendo ser usados em meios fermentativos como nutrientes para microrganismos. O objetivo deste trabalho foi avaliar a bioconversão de biomassa de levedura de cerveja (BLC) em GX, avaliando o rendimento de produção e características reológicas da goma utilizando diferentes linhagens de X. campestris. Para produção da GX utilizou-se dois meios fermentativos, o meio padrão usando sacarose ou glicose como fonte de carbono e o alternativo utilizando BLC substrato fermentativo. A maior produção de GX foi de 15,06 g/l e viscosidade aparente de 20,05 mpa.s (0,5 % de GX, 25 s -1 à 25ºC). As GX obtidas apresentaram comportamento pseudoplástico característico do polímero com altos valores de produção quando comparados com o meio padrão. Palavras-chave: Goma Xatana, Bioconversão, Resíduo, Viscosidade BIOCONVERSION OF BIOMASS OF YEASTS FOR BEER IN XANTHAN GUM USING A DIFFERENT STRAINS OF XANTHOMONAS CAMPESTRIS: INCOME AND RHEOLOGY The xanthan gum (XG) is a biopolymer, produced by fermentation, using the bacterium Xanthomonas campestris. The process generates large volumes of beer yeast (residual biomass) separated from the fermentation process in Saccharomyces cerevisiae. This residue is composed of carbohydrates, proteins, vitamins and microelements, which can be used in fermentative media as nutrients for microorganisms. The objective of this study was to evaluate the bioconversion of biomass of yeast of beer (BLC) in XG, evaluating the efficiency of production and rheological characteristics of the gum using different strains of X. campestris. Used for production of the GX is two half fermentative, the standard way using sucrose or glucose as carbon source and the alternative substrate fermentation using BLC. The increased production of GX was g / L and apparent viscosity of mpa.s (0.5% GX, 25 s -1 at 25 C). The XG obtained showed pseudoplastic behavior characteristic of the polymer with high production values when compared with the standard medium. Keywords: Xanthan Gum, Bioconversion, Residue, Viscosity Introdução O Brasil produz atualmente uma grande quantidade de biomassa de levedura, como subproduto das indústrias de cerveja e das destilarias produtoras de etanol. O setor de álcool tem uma produção anual de aproximadamente 240 mil toneladas, enquanto que o setor cervejeiro contribui com cerca de toneladas/ano [5,6].

2 As células de levedura apresentam alto teor protéico, entre 45-65%, são ricas em vitaminas, particularmente do complexo B, carboidratos, lipídios, minerais essenciais, tais como: Ca, P, K, Mg, Cu, Fe, Zn, Mn e Cr, entre outros [2,3]. A levedura de cerveja comercial é um fermento nutricional inativo (células de fermento inativas), resultante do processo de fermentação. A levedura de cerveja é produzida por cultivo de S. cerevisiae em cevada maltada que é separado depois da fermentação e seca. Um expressivo número de processos fermentativos industriais aproveita o potencial de matériasprimas renováveis na obtenção de produtos químicos, combustíveis, alimentos e bebidas, bioinseticidas, fármacos e enzimas, entre outros. Entre as matérias-primas utilizadas, os resíduos agrícolas e agroindustriais desempenham um papel marcante, com uma gama de processos fermentativos sendo realizados com base em materiais como caldo e melaço de cana-de-açúcar, farelos de soja, trigo e arroz, resíduos celulósicos e da indústria de papel [9]. O objetivo deste trabalho foi avaliar a bioconversão de biomassa de levedura de cerveja a goma xantana por fermentação com diferentes cepas nativas de Xanthomonas campestris, com ênfase no rendimento da produção e características reológicas da goma, comparando os resultados com os obtidos pela fermentação de sacarose ou glicose. Experimental Material e métodos As linhagens nativas utilizadas foram Xanthomonas campestris manihotis 1182 e Xanthomonas campestris mangiferaindicae As cepas foram doadas da coleção de culturas de fitobactérias do Instituto Biológico - IBSBF, Campinas-SP. As culturas foram mantidas em YMagar inclinado, sob refrigeração e repicadas periodicamente. As etapas de obtenção de goma foram: inóculo; cultivo; e recuperação da goma. A biomassa de levedura de cerveja foi obtida em supermercados da cidade de Salvador - BA. Composição da levedura de cerveja utilizada na fermentação O teor de umidade, proteína bruta, lipídios totais, cinzas e carboidratos foram determinados segundo metolodogia da AOAC [1]. Repicagem e inoculação 2

3 Para o processo de repicagem utilizou-se o meio YM agar (sólido), acrescentando ágar puríssimo (2,0%) ao meio YM padrão. O volume de 10 ml do meio foi transferido para tubos de ensaio e autoclavados a 121 C por 15 minutos. A repicagem foi realizada com uma alçada das culturas mantidas em estoque e incubadas em estufa por 48 horas a 28 C. Para a preparação do inóculo, foi utilizado o meio YM padrão (Yeast-Malt) líquido, contendo 1,0% de glicose; 0,5% de peptona bacteriológica; 0,3% de extrato de levedura; 0,3% de extrato de malte em água destilada (p/v) [4]. O volume de 50 ml do meio YM foi autoclavado (121 C/15 minutos) em Erlemeyer de 250 ml, esfriado, inoculado com uma alçada da cultura de Xanthomonas e incubado a 28 C sob agitação de 180 rpm por 48 horas. Produção de goma xantana A produção de goma xantana foi realizada em meio fermentativo composto com um mínimo de nutrientes necessários de acordo com citações [8], buscando obter um meio alternativo de baixo custo. Portanto, utilizou-se uma fonte de Nitrogênio, uma de Fósforo e uma de Carbono, que são os requerimentos nutricionais mínimos para a Xanthomonas produzir goma xantana. O meio convencional foi composto de sacarose (2%) acrescido de 0,01% de Uréia e 0,1% de K 2 HPO 4. No meio alternativo, a sacarose (fonte de carbono) foi substituída por biomassa de levedura de cerveja (substrato alternativo), acrescido de 0,01% de Uréia e de 0,1% de K 2 HPO 4. Os meios foram ajustados para ph = 7,0 e autoclavados a 121 C por 15 minutos. Foram transferidos 16 ml do inóculo para Erlemeyer de 250 ml contendo 80 ml do meio padrão (sacarose) ou do meio alternativo (biomassa de levedura de cerveja). O cultivo em batelada foi realizado em incubadora rotatória Tecnal com agitação de 250 rpm a 28 C por 120 horas. Recuperação e purificação da goma Para a separação de goma xantana produzida, foi adicionado álcool etílico ao produto fermentado na proporção de 3 partes de álcool para 1 parte do meio fermentativo. A goma precipitada foi retirada com o auxílio de um bastão de vidro e transferida para placas de Petri, previamente taradas, secada em estufa (30± 2 C) por 72 horas, moída e armazenada. O rendimento de goma xantana por litro de meio fermentativo utilizado foi medido por gravimetria. O rendimento da produção obtida variando-se as cepas foi calculado e os valores expressos em g.l 1 (g de goma por litro de meio de cultivo). 3

4 Viscosidade aparente A viscosidade aparente em função da taxa de cisalhamento foi calculada a partir da tensão de cisalhamento medida em taxas de cisalhamento pré-fixadas. A tensão e a taxa de cisalhamento foram medidas em um reômetro rotacional da Haake modelo Rheotest 2.1, com sistema de medida constituído de uma mola helicoidal cilíndrica e dispositivo de cilindros concêntricos tipo S1 (relação entre os raios dos cilindros interno, r, e externo, R, r/r = 0,98), acoplado a um banho termostático da marca Lauda com precisão de medida de temperatura de ± 0,01 C. Foram requeridos, para esse modelo de reômetro, 25 ml das soluções de goma xantana. As viscosidades aparentes de soluções aquosas da goma foram determinadas na concentração 0,5%, nas temperaturas de 25, 45, 65 e 85 C e taxas de cisalhamento entre 25 e 1000 s 1. As soluções aquosas foram preparadas e permaneceram em repouso por 12 horas à temperatura ambiente antes de se realizarem as medidas. A amostra foi transferida para o cilindro externo e a velocidade de rotação do cilindro interno, imerso na solução, foi mantida constante em cada medida, e posteriormente, variada de quantidades pré-estabelecidas no aparelho, resultando nas diferentes taxas de cisalhamento. As correspondentes tensões de cisalhamento foram determinadas convertendo-se as leituras feitas, usando-se um amperímetro, em valores em Pascal [12]. Resultados e Discussão O resíduo resultante do processamento da cerveja que foi utilizado na etapa de fermentação para ser bioconvertido em goma xantana apresentou 9,43% de umidade, sendo a composição dos 90,57% de matéria seca: 42,5% proteína, 41,5% de carboidratos, 0,30% gordura e 6,27% cinza, (Tabela 1). Tabela 1 - Valor médio da composição centesimal da levedura de cerveja utilizada na fermentação para obtenção de goma xantana. Parâmetros Levedura de Cerveja (%) Matéria-seca 90,57±0,01 Cinzas 6,27 ± 0,01 Lipídeos 0,30 ± 0,02 Proteína Bruta 42,5 ± 0,01 Carboidratos 41,5 ± 0,02 4

5 Estes compostos têm grande importância considerando a utilização dos mesmos como substratos na fermentação pelas bactérias Xanthomonas campestris, uma vez que irão fazer parte dos nutrientes tanto para o crescimento celular como para a biossíntese de goma xantana. De acordo com Sutherland [7], uma elevada concentração de nitrogênio é necessária para um rápido crescimento celular, entretanto, quando a concentração de nitrogênio no meio de cultura é muito elevada, a goma xantana produzida possui propriedades reológicas inadequadas. Meios contendo elevado teor de carbono e baixo teor de nitrogênio favorece o acúmulo de polímero. A relação carbono:nitrogênio (C:N) para a biomassa de levedura de cerveja foi de aproximadamente 1:1, (Tabela 1). Analisando os resultados obtidos na Tabela 2, verificou-se que o melhor valor obtido na produção de goma xantana utilizando biomassa de levedura de cerveja foi com a cepa Xanthomonas campestris manihotis 1182 apresentando um valor de 15,06 g/l, sendo considerado cinco vezes maior do que o valor obtido com a fonte de carbono convencional (sacarose). Tabela 2 - Goma xantana obtida por fermentação com diferentes cepas de X. campestris em meio alternativo e convencional. Substrato * Goma Xantana g.l -1 Cepa 1182 Cepa 2103 Levedura de cerveja 15,09 ± 1,07 9,37 ± 0,05 Glicose 9,38 ±0,03 2,74 ± 0,03 Sacarose 2,76 ±0,07 4,21 ± 0,07 *Composição do meio fermentativo (2% de substrato, 0,01% uréia e 0,1% K 2HPO 4 ). Condições de produção: 28 C, 250 rpm, 120 horas. As maiores produções de gomas obtidas a partir do substrato alternativo apresentaram valores superiores, quando comparados aos meios fermentativos controles (sacarose e glicose). Diante dos resultados obtidos foram selecionadas as gomas para a análise de viscosidade. As propriedades reológicas foram avaliadas por medida da viscosidade aparente, para verificar a qualidade das gomas produzidas. A viscosidade, em diferentes temperaturas e taxas de cisalhamento fixas, as gomas produzidas com sacarose têm um comportamento reológico de um fluido pseudoplástico típico de goma xantana e similares entre si. A Figura 1 mostra o efeito da variação da temperatura na viscosidade das soluções de goma xantana que tiveram maior produção obtidas a partir da sacarose, com a cepa 2103 (ηmax=50mpa.s) e com cepa 1182 (ηmax=70mpa.s) comparada com as viscosidade das gomas obtidas a partir da biomassa de levedura de cerveja com a cepa 2103 (ηmax=20mpa.s) e com a cepa 1182 (ηmax=9mpa.s) nas mesmas condições. 5

6 22 Viscosidade (mpa.s) A 25ºC 45ºC 65ºC 85ºC Viscosidade (mpa.s) B 25 C 45 C 65 C 85 C Dr (1/s) Taxa de Cisalhamento (1/s) Viscosidade (mpa.s) C 25ºC 45ºC 65ºC 85ºC Viscosidade (mpa.s) D 25ºC 45ºC 65ºC 85ºC Dr (1/s) Taxa de Cisalhamento (1/s) Figura 1: (A) Viscosidade da goma obtida a partir de sacarose com a bactéria X (B) Viscosidade da goma obtida a partir da biomassa de levedura de cerveja com a bactéria X (C) Viscosidade da goma obtida a partir de sacarose com a bactéria X (D) Viscosidade da goma obtida a partir de levedura de cerveja com a bactéria X todas nas seguintes condições (25-85ºC, 25s s -1 e 0,5% de xantana). Vale ressaltar que a produção máxima de xantana com sacarose e cepa 1182 foi de 2,76 g/l, e com a 2103 foi 4,21g/L, enquanto a produção da cepa 2103 com biomassa de levedura de cerveja foi de 9,37 g/l, e da cepa 1182 foi de 15,06 g/l. As maiores produções com o substrato alternativo pode ser justificado pelo fato do resíduo apresentar maior quantidade de alguns dos nutrientes e principalmente de micronutrientes necessários a reprodução celular da bactérias, resultando em uma maior bioconversão de goma xantana, ao contrário dos meios fermentativos composto com sacarose ou glicose. Comparando os resultados de produção de goma xantana e de viscosidade aparente pode-se perceber que a bioconversão da levedura de cerveja com a cepa 1182 apesar de ter bioconverdido um volume maior de goma xantana, apresentou uma menor viscosidade quando comparado a 6

7 produção com a cepa 2103 que apresentou um valor inferior no rendimento de goma e, no entanto se destacou com uma maior viscosidade, ambas utilizando o mesmo resíduo (Figura 2). Os maiores rendimentos de goma xantana obtidos com o substrato alternativo (biomassa de levedura de cerveja) podem ser justificados pelo fato de que a bactéria utiliza tanto as fontes de carbono e de nitrogênio, quanto os micronutrientes presentes no resíduo para o crescimento celular, aumentando conseqüentemente a produção de goma xantana. O contrário acontece nos meios com as fontes de carbono convencionais (glicose e sacarose) que foram formulados apenas com os requerimentos nutricionais mínimos para o crescimento celular. Entretanto, apesar do rendimento de goma obtida a partir da levedura de cerveja ter sido maior do que os obtidos com sacarose e glicose, a viscosidade aparente da goma foi muito inferior à goma obtida com o meio contendo a fonte de carbono convencional (Figura 1). Uma vez que a viscosidade depende da massa molecular e dos grupos de substituintes do polímero [4, 8, 10, 13, 14], supõe-se que as gomas obtidas pela bioconversão de levedura de cerveja apresentem menor tamanho e/ou acetato e piruvato quando comparadas às obtidas pela bionversão da sacarose. A goma xantana com alto grau de acetilação e especialmente baixo grau de piruvatação, aumenta a viscosidade de suas soluções porque associações intermoleculares são favorecidas. Um problema importante relacionado com a produção de goma xantana deve-se à instabilidade das linhagens de Xanthomonas campestris, resultando em uma variação de massa molecular do polissacarídeo, e do grau de piruvatação e em 45% e aumentar o rendimento da goma em 20% [7]. A estrutura básica do carboidrato da maioria dos exopolissacarídeos não muda com as condições do crescimento, mas o índice dos grupos unidos à estrutura básica do hidrato de carbono, tal como os grupos acetil e piruvato, podem variar extensamente. As variações desses grupos podem ter um efeito dramático nas propriedades do polímero alterando a eficácia de suas aplicações. Por exemplo, o índice de piruvato presente na goma xantana pode variar entre 0-8% (teoricamente a concentração máxima) com a alteração dos meios de crescimento. Um outro fator muito importante para determinar o desempenho do polímero é a massa molecular; as variáveis que controlam a massa molecular ainda não estão estabelecidas, mas a massa molecular pode variar principalmente com as condições de crescimento. A escala típica da massa molecular para a goma xantana é a Daltons [6,7]. A viscosidade da solução de goma xantana depende da temperatura em que a viscosidade é medida (temperatura da medida, TM) e da temperatura em que a goma xantana foi dissolvida (temperatura da dissolução, TD). A viscosidade das gomas xantana obtidas tanto com fonte alternativa quanto com sacarose ou glicose, diminuiu com o aumento da temperatura (Figura 1), 7

8 característica das soluções aquosas deste biopolimero [4, 8, 10, 14]. Este comportamento reversível entre 10 e 80 C está associado às mudanças da conformação das moléculas de xantana [13, 4]. Produção (g.l -1 ) e Viscosidade aparente(mpa.s) Produção GX de Levedura Viscosidade Cepas de Xanthomas campestris Figura 2: Comparativo de viscosidade (25ºC, 25 s -1 e 0,5% GX) e produção de goma xantana com as cepas 1182 e 2103 de X. campestris utilizando o meio alternativo de biomassa de levedura de cerveja a 2%. Os rendimentos de produção do biopolímero obtidos com as cepas 1182 e 2103 e suas viscosidades foram inversamente proporcionais (Figura 2). Este comportamento é característico na maioria dos estudos de produção e caracterização reológica de xantana [2, 4, 7, 8, 10, 14], pois à medida que a viscosidade do meio durante o processo fermentativo aumenta devido à massa molecular do polímero ser alta, a oxigenação do meio se torna menor e, conseqüentemente o crescimento celular e ação das polimerases diminui, resultando uma menor produção. As propriedades reológicas das soluções mudam com a natureza do polímero, dependendo principalmente da massa molecular média, da estrutura molecular e dos grupos acetil e piruvato [13]. Segundo Sutherland [7], as gomas com alto grau de acetilação e especialmente baixo grau de piruvatação, aumentam a viscosidade de suas soluções, porque associações intermoleculares são favorecidas. Conclusões É possível produzir gomas a partir de cepas nativas Xanthomonas campestris manihotis 1182 e Xanthomonas campestris mangiferaeindicae 2103 utilizando-se o meio fermentativo 8

9 alternativo compostos de biomassa de levedura de cerveja como matéria-prima para produção de goma xantana com altos rendimentos. As maiores produções de goma xantana foram obtidas a partir da fermentação da levedura de cerveja quando comparados com os meios contendo as fontes de carbono convencionais. Os maiores rendimentos de goma xantana foram obtidos pela bioconversão de levedura de cerveja com as cepas 1182 e 2103 quando comparados com as fontes de carbono convencionais (glicose e sacarose). As maiores produções de goma foram obtidas pela fermentação de levedura de cerveja com a cepa 1182 com rendimento de 15,06 g/l e viscosidade aparente de 9 mpa.s, e pela 2103 com 9,37 g/l e 20 mpa.s. Todas as gomas xantana obtidas apresentaram um comportamento pseudoplástico característico do biopolímero. Agradecimentos Ao CNPQ pelo apoio financeiro para realização dessa pesquisa. Referências Bibliográficas 1. Association of Official Analytical Chemists, AOAC. 1995, 32, A. Bekatorou; C. Psarianos; A. A. Koutinas. Food Technol. Biotechnol, 2006, 44, A. Halász; R. Lásztity. Boca Raton: CRC Press, 1991, F. Garcia-Ochoa; V. E. Santos; J. A. Casas; E. Gomez. Biothecnology Advances, 2000, 18, G. V. P. Gomes; L. V. Brandão; J. I. Druzian, Patente , Revista da Propriedade Intelectual, 2008, 1983, G. V. P. Gomes, Dissertação de Mestrado, Universidade Federal da Bahia, I. W. Sutherland. Advances in Microbial Physiology, 1982, 23, J. I. Druzian; A. P. Pagliarini. Ciência e Tecnologia de Alimentos, 2007, 27, L. A. Serafini; N. M. Barros; J. L. Azevedo, Biotecnologia: avanços na agricultura e na agroindústria. Ed.; Caxias do Sul: EDUCS, 2002, 1, L. V. Brandao; T. B. Rocha; B. Machado; M. C. A. Esperidião; J. I. Druzian, Ciência e Tecnologia de Alimentos, 2008, 28, L. V. Brandao; T. B. Nery; J. I. Druzian, Patente , R. P. Chhabra; J. F. Richardson. Butterworth Heinemann, 1999, T. B. R. Nery, Dissertação de Mestrado, Universidade Federal da Bahia, T. B. Nery; L. V. Brandao; M. C. A. Esperidião; J. I. Druzian. Química Nova (Online), 2008, 31, T. B. Nery; L. V. Brandao; J. I. Druzian, Patente ,