AVALIAÇÃO DO NÍVEL DE CONTAMINAÇÃO MICROBIANA DURANTE A PRODUÇÃO ARTESANAL DE CACHAÇA. FERNANDA DE SOUSA FERNANDES

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1 AVALIAÇÃO DO NÍVEL DE CONTAMINAÇÃO MICROBIANA DURANTE A PRODUÇÃO ARTESANAL DE CACHAÇA. FERNANDA DE SOUSA FERNANDES TRABALHO DE CONCLUSÃO DE CURSO SUBMETIDO À COORDENAÇÃO DO CURSO DE QUÍMICA INDUSTRIAL DA UNIVERSIDADE ESTADUAL DE GOIÁS COMO PARTE DOS REQUISITOS PARA A OBTENÇÃO DO TÍTULO DE BACHAREL EM QUÍMICA INDUSTRIAL. ANÁPOLIS, GO BRASIL JUNHO 2011

2 AVALIAÇÃO DO NÍVEL DE CONTAMINAÇÃO MICROBIANA DURANTE A PRODUÇÃO ARTESANAL DE CACHAÇA. FERNANDA DE SOUSA FERNANDES TRABALHO DE CONCLUSÃO DE CURSO SUBMETIDO À COORDENAÇÃO DO CURSO DE QUÍMICA INDUSTRIAL DA UNIVERSIDADE ESTADUAL DE GOIÁS COMO PARTE DOS REQUISITOS PARA A OBTENÇÃO DO TÍTULO DE BACHAREL EM QUÍMICA INDUSTRIAL. Aprovada por: Prof. Dr. Plínio Lázaro Faleiro Naves (ORIENTADOR) Prof. MS. Lauro Bernardino Coelho Junior (MEMBRO I) Prof. Dr. Tácito Dantas Frota Leite (MEMBRO II) ANÁPOLIS, GO BRASIL JUNHO 2011 ii

3 FERNANDES, FERNANDA DE SOUSA. Avaliação do nível de contaminação microbiana nas etapas do processamento e sua influência no rendimento de uma usina alcooleira. [ANÁPOLIS] xii, 41 p. 29,7 cm (UnUCET/UEG, Bacharel, Química Industrial, 2011) Trabalho de Conclusão de Curso Universidade Estadual de Goiás, UnUCET 1. Cachaça artesanal 2. Cachaça 3. Contaminação microbiana 4. Rendimento fermentativo I. UnUCET/UEG II. Título (série) iii

4 DEDICATÓRIA Dedico este trabalho aos meus pais, Jeremias e Regina, pelo exemplo de vida, carinho e confiança. Andrey e Lúcia pela amizade e incentivo nos momentos mais difíceis. iv

5 AGRADECIMENTOS Agradeço a Deus, pela vida, por estar sempre no meu caminho, iluminando e guiando às escolhas certas. Aos meus pais, Jeremias e Regina, pelo exemplo de vida, e por tantas vezes que abdicaram de seus sonhos para realizar os meus. Além da paciência e apoio, por todas as vezes que liguei desesperada em prantos. Ao meu noivo Andrey, pelo amor e paciência nos meus maus momentos. Graças a sua presença foi mais fácil transpor os dias de desânimo e cansaço. A Lúcia serei grata eternamente pela ajuda de todas as formas possíveis sempre que precisei OBRIGADA. Ao meu irmão Marcelo, por me mostrar que tudo é possível, dividindo alegrias, tristezas e muitas brigas, além da companhia ao longo de dois anos! Aos meus familiares, Tia Zarita e Tio Ângelo, que apoiaram de várias maneiras durante esses anos de curso. Agradeço aos amigos que conquistei durante a faculdade, dentre eles, Laís, Raquel e Camila. A faculdade não seria a mesma sem a presença de todos vocês. E um agradecimento especial, a Raquel, que me deu apoio tanto na parte experimental deste trabalho, quanto na parte teórica OBRIGADA. Ao professor Plínio, agradeço por toda a paciência e compreensão ao me orientar neste trabalho! Osvaldo e Alex por me ceder o laboratório de Microbiologia. As técnicas do laboratório de Química, que cederam os reagentes sempre que necessário. Obrigada pela ajuda! E agradeço a todas as outras pessoas que não foram citadas neste agradecimento, mas que contribuíram para a concretização do trabalho. v

6 Resumo do Trabalho de Conclusão de Curso apresentado a UNUCET/UEG como parte dos requisitos necessários para a obtenção do título de Bacharel em Química Industrial AVALIAÇÃO DO NÍVEL DE CONTAMINAÇÃO MICROBIANA DURANTE A PRODUÇÃO ARTESANAL DE CACHAÇA. Fernanda de Sousa Fernandes Junho 2011 Orientador: Prof. Dr. Plínio Lázaro Faleiro Naves Curso: Química Industrial A levedura Saccharomyces cerevisiae é o principal micro-organismo utilizado na produção de bebidas fermentadas como a cachaça, principalmente devido ao fato desta levedura ser uma eficiente fermentadora de açúcares. Geralmente a fermentação do caldo de cana-deaçúcar ocorre em condições favoráveis ao desenvolvimento de outros micro-organismos, tais como temperatura, ph, concentração de açúcar e normas de higiene não devidamente controladas. Bactérias e leveduras contaminantes, quando encontradas em altas concentrações, podem prejudicar significativamente a produtividade da cachaçaria, por competir pelos nutrientes e ocasionar a formação de compostos secundários indesejáveis, condição que leva a redução da viabilidade de Saccharomyces cerevisiae afetando a eficiência fermentativa, o que justificaria a adoção de boas práticas industriais, mesmo em escala artesanal. Com o objetivo de avaliar o nível de contaminação microbiana foram obtidas por métodos microbiológicos 19 amostras do mosto, na moenda e nas seis dornas de fermentação, onde foram encaminhadas ao Laboratório de Microbiologia da Universidade Estadual de Goiás para determinação das UFC/mL dos micro-organismos contaminantes assim como para o estudo da morfologia colonial e de seus aspectos microscópicos, por meio da coloração de Gram. Os resultados foram correlacionados e observou-se que as amostras de caldo de cana processado em três diferentes ciclos fermentativos em uma cachaçaria artesanal expressaram níveis significativos de contaminação bacteriana acima de 5,0x10 6 UFC/mL, fato que poderia ser prejudicial ao processo fermentativo em todos os dias coletados. PALAVRAS-CHAVE: cachaça artesanal, eficiência fermentativa, contaminação microbiana, leveduras, fermentação. vi

7 SUMÁRIO LISTA DE FIGURAS... ix LISTA DE QUADROS... x LISTA DE TABELAS... xi 1. INTRODUÇÃO REVISÃO BIBLIOGRÁFICA Histórico da cachaça no país e mercado atual Aguardente e cachaça segundo a Legislação Brasileira Cachaça artesanal Cadeia produtiva da cachaça Qualidade da matéria prima Extração do caldo Preparo do pé-de-cuba Fermento caipira ou selvagem Fermento prensado Fermento selecionado Fermento misto Fermentação Fases da fermentação alcoólica utilizadas na produção da cachaça Micro-organismos contaminantes da fermentação alcoólica Contaminação por leveduras Contaminação por bactérias Métodos de controle de micro-organismos contaminantes MATERIAIS E MÉTODOS Caracterização e amostragem do alambique estudado Processamento microbiológico das amostras Preparação do meio de cultura ágar WLN (Wallerstein Laboratory Nutrient) Diluição seriada Caracterização dos micro-organismos isolados RESULTADOS E DISCUSSÃO Caracterização do alambique amostrado... Erro! Indicador não definido. 4.2 Determinação das UFC/mL Caracterização das cepas isoladas CONCLUSÃO vii

8 6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS APÊNDICE...42 viii

9 LISTA DE FIGURAS FIGURA 1 Esquema simplificado da coleta das amostras FIGURA 2 Aspecto microscópico da amostra T4D3-a (bactérias Gram-negativas) FIGURA 3 Aspecto microscópico da amostra T5D1-a (bactérias Gram-positivas) ix

10 LISTA DE QUADROS QUADRO 1 Caracterização das cepas isoladas das amostras de caldo bruto obtidas no dia 13/08/ QUADRO 2 Caracterização das cepas isoladas das amostras de mosto obtidas no dia 13/08/ QUADRO 3 Caracterização das cepas isoladas das amostras de mosto obtidas no dia 20/08/ QUADRO 4 Caracterização das cepas isoladas das amostras de mosto obtidas no dia 27/08/ x

11 LISTA DE TABELAS TABELA 1 - Principais Países Importadores da Cachaça Brasileira... 4 TABELA 2 - Limites máximo dos componentes secundários... 6 TABELA 3 - Limite máximo de contaminantes orgânicos e inorgânicos... 6 TABELA 4 - Formulação do meio WLN TABELA 5 Quantificação de micro-organismos totais isolados das amostras xi

12 1. INTRODUÇÃO No Brasil, o caldo de cana é utilizado para produzir uma bebida muito popular, a cachaça. Essa bebida, obtida pela destilação de mosto fermentado de cana-de-açúcar, é a segunda bebida mais consumida no Brasil, perdendo somente para a cerveja (GOMES, 2004). A produção de cachaça no país destina-se quase totalmente ao mercado interno, dos 1,5 bilhões de litros produzidos por ano apenas 1% é exportado. Contudo, a bebida vem conquistando novos mercados. A Europa compra cerca de 57% do total exportado, sendo a Alemanha a maior importadora com cerca de 30% do total (VENTURINI FILHO, 2010). Deste volume de cachaça que é produzido por ano, aproximadamente 10% têm origem artesanal, com 25 mil produtores. São Paulo é o setor com maior produção de cachaça e Minas Gerais o quarto maior. Em Goiás a produção de cachaça está distribuída em diversas regiões, entre pequenos e médios produtores. Ainda que a produção seja em pequena escala, as condições de clima se revelam propícias para um bom desenvolvimento (CALIARI et al., 2009). A cachaça é uma bebida com graduação alcoólica de 38 a 48% em volume, obtida da destilação do mosto fermentado de cana-de-açúcar. O passo inicial e de grande importância na produção dessa bebida consiste na qualidade da matéria-prima. Na seleção da matéria-prima deve-se levar em conta a as condições locais de clima e solo, a época de maturação da cana-de-açúcar pois a safra ocorre de maio a dezembro e cada variedade tem seu ponto de maturação em determinada época. (GABRIEL, 2010). Escolhido o tipo de cana, procede-se a extração do caldo nas moendas, que deve possibilitar o máximo de extração. Na cana madura, o caldo possui de 75% a 82% de água e de 18 a 25% de açúcares, sendo que de 16 a 23% são constituídos de sacarose e aproximadamente 2% de glicose e frutose (SEBRAE, 2001). O caldo de cana obtido das moendas e coado é denominado mosto, que será fermentado pela ação das leveduras (AQUARONE, 1983). A levedura é o micro-organismo responsável pela fermentação dos açúcares do mosto e a levedura Saccharomyces cerevisiae é atualmente o principal micro-organismo utilizado na produção de bebidas alcoólicas como a cachaça. Alguns alambiques iniciam o 1

13 processo fermentativo com leveduras prensadas, enquanto outros desenvolvem o fermento na própria cachaçaria fermento caipira que são fermentos preparados a partir de leveduras que naturalmente acompanham o mosto, oriundos da lavoura de cana, do ar e equipamentos do processo, geralmente com pequena tolerância ao álcool (NOGUEIRA et al., 2005). Durante o processo de fermentação, o caldo-de-cana é frequentemente adicionado a dorna, dessa forma, os micro-organismos presentes estarão em constante sucessão. Saccharomyces cerevisiae é a espécie de levedura predominante, no entanto, bactérias podem estar presentes, principalmente em meios ácidos ou em altas temperaturas (BADOTTI, 2005). A presença de micro-organismos no processamento de cana-de-açúcar ocorre desde a lavoura até o setor de fermentação, sendo que a contaminação bacteriana presente no caldo e no mosto pode refletir na qualidade da matéria-prima utilizada, pois, tanto o caldo de cana quanto o mosto são ótimos substratos para o crescimento de micro-organismos (CHERUBIN, 2003). Os maiores prejuízos causados pela contaminação bacteriana são a degradação da sacarose e a formação dos ácidos lático e acético que ocasionam perda de açúcar e intoxicação das leveduras. (CHERUBIN, 2003). De acordo com vários autores, os produtores de cachaça artesanal, de uma maneira geral, não se preocupam em controlar as variáveis do processo de produção, como qualidade da matéria-prima, temperatura das dornas de fermentação, higiene dos maquinários, ph do mosto, contaminação antes e durante a etapa fermentativa, dentre outros (BADOTTI, 2005). Diante do exposto, este trabalho tem por objetivo avaliar a presença de contaminações antes e durante a fermentação por meio de análises microbiológicas para caracterização dos micro-organismos isolados de amostras do caldo bruto e do mosto. 2

14 2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA 2.1 Histórico da cachaça no país e mercado atual A história da cachaça está vinculada à própria história do Brasil. Esta bebida feita da fermentação e destilação do melaço proveniente da cana-de-açúcar foi descoberta acidentalmente no período colonial entre 1538 e 1545 na Capitania de São Vicente pelos negros escravos durante a fermentação da cana-de-açúcar (GABRIEL, 2010). Os escravos observaram que a borra separada do processo de concentração da garapa para a cristalização do açúcar, fermentava espontaneamente quando deixada de um dia para o outro, produzindo um líquido de sabor e odor diferentes. E quando submetida à destilação, em pequenos alambiques de barro, resultava em um líquido transparente, brilhante e ardente quando ingerido (VENTURINI FILHO, 2010). Como se parecia com água, deu-lhe o nome de água ardente, originando a palavra aguardente. Outro nome que lhe foi atribuído foi cachaça por ser originada da borra ou cachaza por que servia de alimento para os porcos (cachaços). Considerando-se que durante a destilação o líquido pingava, surgiu o nome pinga (VENTURINI FILHO, 2010). Inicialmente a produção de cachaça era rural, de pequeno volume de produção, obtida de fábricas rudimentares e muito atrasada tecnicamente, onde o proprietário e sua família plantavam a cana-de-açúcar, produziam a cachaça e a comercializavam. O produto apresentava características de paladar e aroma dos mais variados, não havendo padrões de qualidade definidos (AQUARONE, 1983). Considerando que a quantidade consumida era menor que a produzida, estoques de safras remanescentes resultavam em um envelhecimento do produto melhorando suas características sensoriais (VENTURINI FILHO, 2010). Marginalizada pela sua associação às classes mais pobres da população, a cachaça acabou ganhando uma notoriedade (DUARTE, 2009) somente após o fim da 2 a Guerra Mundial quando o consumo da aguardente cresceu exigindo melhores técnicas de produção, comercialização, qualidade e consequentemente maior valor agregado (GABRIEL, 2010). 3

15 Fatores como os aumentos da população, do consumo e da produção doméstica, estimularam a procura de melhores técnicas de produção, renovação e modernização da indústria aguardenteira (GABRIEL, 2010). A necessidade de incrementar a produção requereu o domínio de conhecimentos técnicos e científicos, da cultura da cana ao engarrafamento da aguardente tanto quanto à extração do caldo, purificação, fermentação, desinfecção, técnicas de destilação, busca de leveduras apropriadas e selecionadas foram fundamentais para essa modernização (AQUARONE, 1983). Atualmente, a cachaça é a segunda bebida alcoólica mais consumida no Brasil, perdendo somente para a cerveja. No que se refere ao mercado dos destilados, detém a preferência absoluta dos brasileiros. Seu consumo é quase 5 vezes maior do que o do whisky (348 milhões de litros) e da vodca (270 milhões de litros) (GOMES, 2004). No Brasil é consumida quase toda a produção de cachaça, dos 1,5 bilhão de litros produzidos por ano apenas 1% é exportado (BRAGA, 2006). Os destinos das exportações brasileiras se concentram principalmente na União Européia com 57,1% do volume total exportado, destacando-se principalmente a Alemanha detentora de 30,8% do total (VENTURINI FILHO, 2010). Os principais países importadores da cachaça brasileira são mostrados na Tabela 1. TABELA 1 - Principais Países Importadores da Cachaça Brasileira Brasil País Quantidade (mil litros) Valor (mil dólares) Alemanha Paraguai Uruguai Portugal Estados Unidos Argentina Itália Fonte: VERDI, 2006 Deste volume de cachaça que é produzido por ano, aproximadamente 10% têm origem artesanal, com 25 mil produtores. São Paulo é o setor com maior produção de 4

16 cachaça e Minas Gerais o quarto maior, sendo Minas Gerais o Estado mais especializado na produção de cachaça artesanal com cerca de alambiques (CALIARI et al., 2009). Em Goiás a produção de cachaça está distribuída em diversas regiões, entre pequenos e médios produtores. Ainda que a produção seja em pequena escala, as condições de clima se revelam propícias para um bom desenvolvimento (CALIARI et al., 2009). Algumas marcas de cachaças em Goiás merecem destaque devido a sua qualidade, e um dos principais pólos do Estado é Orizona (CALIARI et al., 2009). A cachaça de Orizona tem fama e tradição, pois vem sendo produzida e apreciada pelos consumidores do Estado de Goiás há mais de um século. O número de indústrias artesanais é superior a 50, neste que pode ser considerado o maior pólo estadual da bebida (PAIVA, 2008). 2.2 Aguardente e cachaça segundo a Legislação Brasileira Os padrões de Identidade e Qualidade da aguardente de cana e cachaça deverão atender às disposições legais contidas na Instrução Normativa n. 13 de 29/06/2005, alterada pela Instrução Normativa n. 27 de 15/05/2008 e Instrução Normativa n. 58 de 19/12/2007, do Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento (MAPA), conforme as seguintes definições (VENTURINI FILHO, 2010). Aguardente de cana é a bebida com graduação alcoólica de 38 a 54% (V/V) a 20 C, obtida do destilado alcoólico simples de cana-de-açúcar ou pela destilação do mosto fermentado do caldo de cana-de-açúcar, podendo ser adicionada de açúcares até 6 g/l expressos em sacarose (BRASIL, 2005). Cachaça é a denominação típica e exclusiva da aguardente de cana produzida no Brasil, com graduação alcoólica de 38 a 48% (V/V) a 20 C, obtida pela destilação do mosto fermentado do caldo de cana-de-açúcar com características sensoriais peculiares, podendo ser adicionada de açúcares até 6 g/l, expressos em sacarose (BRASIL, 2005). A fermentação do caldo de cana não é exclusivamente alcoólica, ocorrendo normalmente outras fermentações que geram produtos chamados secundários e que são constituídos principalmente de ácidos, aldeídos, ésteres e alcoóis superiores. São estes produtos que tornam a aguardente de cana diferente de uma simples solução alcoólica, sendo responsável pelo seu odor e sabor típicos (FARIA et al,. 1989) 5

17 Atualmente a cachaça e a aguardente devem seguir os padrões de identidade e qualidade segundo características físicas e químicas estabelecidas pela legislação brasileira, descritos na Tabela 2. A soma dos componentes secundários (componentes voláteis não álcool ) não poderá ser inferior a 200 mg e nem superior a 650 mg por 100 ml de álcool anidro (VENTURINI FILHO, 2010). TABELA 2 - Limites máximo dos componentes secundários COMPONENTES SECUNDÁRIOS UNIDADE LIMITE MÁXIMO Acidez volátil mg/100ml álcool anidro 150 Aldeídos totais mg/100ml álcool anidro 30 Ésteres totais mg/100ml álcool anidro 200 Soma de Alcoóis superiores: álcool isobutílico, isoamílico, butanol e 1-propanol mg/100ml álcool anidro 200 Soma de Furfural e Hidroximetilfurfural mg/100ml álcool anidro 360 Fonte: VENTURINI FILHO, 2010 Além do etanol, água e componentes secundários, a aguardente de cana contém pequenas quantidades de contaminantes orgânicos, como o metanol, carbamato de etila, acroelina, álcool séc-butílico, álcool n-butílico e contaminantes inorgânicos como o cobre, chumbo e arsênio, cujas quantidades estão descritas na Tabela 3. (VENTURINI FILHO, 2010). TABELA 3 - Limite máximo de contaminantes orgânicos e inorgânicos CONTAMINANTES UNIDADE LIMITE MÁXIMO Alcóol metílico mg/100ml álcool anidro 20 Carbamato de etila mg/100ml álcool anidro 150 Acroelina (2-propenal) mg/100ml álcool anidro 5 Álcool sec-butílico (2-butanol) mg/100ml álcool anidro 10 Álcool n-butílico (1-butanol) mg/100ml álcool anidro 3 Fonte: VENTURINI FILHO, 2010 Cobre mg/l 5 Chumbo µ/l 200 Arsênio µ/l 100 6

18 2.3 Cachaça artesanal A cachaça artesanal é fabricada em uma pequena indústria familiar, denominada engenho, normalmente produzida com matéria prima oriunda de plantações próprias, onde normalmente não se utilizam agrotóxicos, a colheita é manual e sem queima da cana (GABRIEL, 2010). Geralmente esses produtores são representados por empresas familiares que muitas vezes tem na produção da cachaça uma complementação de renda, onde se associa com outras atividades agrícolas, como milho, feijão, café, leite (SEBRAE, 2008). Do ponto de vista biológico, o processo para fabricação de cachaça artesanal constitui-se de duas etapas principais: na primeira é preparado o inóculo, chamado também de pé-de-cuba onde micro-organismos são multiplicados em condições apropriadas, para garantir o desenvolvimento adequado da segunda etapa, que corresponde à conversão de açúcares em álcool e gás carbônico, fase que é chamada de fermentação (MALTA, 2006). A fermentação é natural ou espontânea, sem adição de aditivos químicos com o uso do chamado fermento caipira que é responsável por um produto com qualidade sensorial própria, fator este que requer técnicas adequadas e assepsia por parte do produtor (GABRIEL, 2010). O fermento selecionado que é constituído de leveduras isoladas das dornas de fermentação promove resultados melhores, mas exige técnicas apropriadas para sua multiplicação, instalação adequada e assepsia, o que requer maior investimento e técnica do produtor (GABRIEL, 2010). 2.4 Cadeia produtiva da cachaça Qualidade da matéria prima A cana-de-açúcar é considerada uma espécie alógama, da família Poaceae (Gramíneae), do gênero Saccharum, com seis espécies das quais a espécies do gênero S. officinarum L. destaca-se das demais devido as suas boas propriedades e altos teores de sacarose, por isso é chamada de cana nobre (CORTEZ, 2010). A cana-de-açúcar é constituída por uma parte subterrânea, formada pelos rizomas e raízes e a outra aérea que são os colmos, folhas e flores. O colmo é a parte da planta que 7

19 apresenta maior valor econômico. Suas funções estão em dar suporte às folhas e partes aéreas da planta, conduzir água e nutrientes do solo para as folhas onde os açúcares da planta estão sintetizados, transportar esses carboidratos para outras partes da planta e armazenar sacarose e outras substâncias (NOGUEIRA et al., 2005). Para a produção de cachaça os componentes mais importantes da cana são os açúcares, que são os dissacarídeos - sacarose (comumente designada por açúcar) e os monossacarídeos - glicose (ou dextrose) e frutose (ou levulose). Durante a maturação da cana a sacarose aumenta até atingir os limites extremos de 12 a 18%, ao passo que os outros açúcares, glicose e frutose, diminuem até limites de 0,2%. A frutose diminui mais depressa e chega a desaparecer, em certos casos (NOBREGA et al., 2009). Dentre os requisitos exigidos pela indústria aguardenteira, a qualidade da matéria prima é dos mais importantes por influenciar diretamente no processo de fermentação, especialmente considerando a natureza do carboidrato fermentescível e dos microorganismos contaminantes (MUTTON et al., 2002). Este critério deve ser compatibilizado entre o produtor de cana que deve fornecer uma matéria prima de qualidade e o industrial que visa um bom rendimento e produto de qualidade. No entanto, em relação à produção da cachaça quase sempre o fornecimento da cana é realizado pelo próprio fabricante (NOGUEIRA et al., 2005). A cana-de-açúcar que apresenta o caldo muito rico em açúcares prejudica o rendimento das fermentações. Quanto mais açúcar, mais álcool deve ser formado, porém, uma alta riqueza em açúcar pode levar a uma quantidade de álcool suficientemente elevada prejudicando a ação fermentativa das leveduras, causando fermentações incompletas (AQUARONE, 1983). Recomenda-se que a escolha da variedade de cana a ser utilizada seja aquela adaptada às condições locais de clima e solo para que garanta a produtividade no canavial de modo que as necessidades do alambique sejam atendidas (GABRIEL, 2010). Um fator determinante é a época de maturação da cana-de-açúcar, pois esta influencia as características físico-químicas e microbiológicas que mais tarde acarretarão em alterações tanto na fase de fermentação quanto na destilação da cachaça (GABRIEL, 2010). O produtor deve calcular a quantidade de cana a ser cortada em função da cana que será processada a fim de evitar perda em rendimentos e contaminações micro-biológicas, 8

20 sendo aconselhável que ela seja transportada e moída dentro de no máximo horas após o corte (NOGUEIRA et al., 2005). A queima da cana foi, por muitas décadas, prática corrente na agroindústria canavieira, especialmente pelas indústrias de açúcar e álcool. Este uso difundiu-se porque facilita o corte, aumenta o rendimento dos cortadores, reduz a mão-de-obra, praticamente elimina a operação de despalha, barateia o corte, facilita a brotação e os tratos culturais imediatos (NOBREGA et al., 2009). Essas vantagens não compensam as desvantagens de ressecar o solo pela maior evaporação da água, destruir grande quantidade de matéria orgânica de que nossos solos são pobres, facilitar o desenvolvimento de plantas daninhas. A queima também altera a composição do caldo, mais ou menos intensamente, de acordo com a variedade, tempo de espera entre a queima e a moagem, temperatura ambiental e umidade, alem de causar sérios prejuízos com relação a poluição atmosférica (NOBREGA et al., 2009) Extração do caldo Extração quer dizer a quantidade de caldo extraído por tonelada de cana. Moagem é o ato de se extrair o caldo existente nos colmos da cana-de-açúcar que, em geral, apresenta de 85 a 92% de caldo e de 8 a 15% de fibras. Na cana madura, o caldo possui de 75% a 82% de água e de 18 a 25% de açúcares, sendo que de 16 a 23% constituídos de sacarose e aproximadamente 2% de glicose e frutose (SEBRAE, 2001). O processo de extração do caldo é realizado por moendas com o objetivo de separar a fração líquida (caldo rico em açúcares) do resíduo fibroso (bagaço). É talvez um dos fatores mais importantes que governam o rendimento de aguardente por tonelada de cana processada (VENTURINI FILHO, 2010), estando este diretamente relacionado com o número e tipo de unidades esmagadoras, como também o perfeito desempenho das moendas (NOBREGA et al., 2009). As moendas são compostas por cilindros ou rolos que variam de 1 a 5 ternos de moagem dependendo das condições de cada alambique. Os pequenos produtores trabalham normalmente com moendas de um terno de moagem, acionadas por motores elétricos, diesel ou vapor (GABRIEL, 2010). As moendas, caixas de recepção de caldo e decantadores são os pontos de partida do processo de elaboração da cachaça. Além de serem bem escolhidos, devem ser objeto 9

21 de cuidados especiais tais como limpeza rigorosa dos rolos, condutores de caldo e bombas ao final das operações do dia e, pelo menos, desinfecção semanal (NOBREGA et al., 2009). A separação das impurezas grosseiras extraídos do caldo pela moenda deve ser realizada por peneiras fixas, rotativas ou vibratórias, no entanto nas cachaçarias artesanais é comum o emprego de coadores fixos, normalmente de náilon (SEBRAE, 2008). Denomina-se mosto, todo líquido suscetível a fermentação. O caldo de cana obtido das moendas e coado é um mosto natural (AQUARONE et al., 1983). O seu preparo tem por objetivo garantir uma quantidade ideal de açúcares fermentescíveis, menor contaminação inicial possível, ph ideal, nutrientes e boas condições para o metabolismo da levedura, garantindo uma fermentação pura, regular e com rendimentos satisfatórios (GABRIEL, 2010). O Brix do mosto para fabricação de aguardente deve estar em torno de 14 a 16º Brix, valores acima dificultam o processo fermentativo deixando parte do açúcar presente sem fermentar (NOGUEIRA et al., 2005). Nesses casos, recomenda-se diluir o mosto até quantidades adequadas de açúcares visando retardar a produção de álcool que em grandes concentrações inibe o desenvolvimento do levedo, gerando fermentações incompletas (GABRIEL, 2010). As condições das diferentes etapas do processo produtivo podem selecionar o desenvolvimento de micro-organismos, assim o ph baixo do caldo extraído pela moenda pode favorecer o crescimento de micro-organismos acidófilos, que associados à alta temperatura, favorece os termófilos esporulados, que podem degradar a sacarose, formando ácido lático e acético. Portanto, mostos contaminados poderão produzir bebidas com excesso de acidez e gosto desagradável (GALLO, 1990). Quanto à higienização, a limpeza dos equipamentos utilizados deve ser regular e bastante rigorosa, empregando-se água de boa qualidade, escovas e vapor, se possível. Sem o manejo adequado dos equipamentos, observam-se a formação de focos de contaminação, indesejáveis à fermentação, que se desenvolvem por falta de assepsia, resultando em perda de açúcar e de rendimento do processo (VENTURINI FILHO, 2010). O produtor deve estar consciente de que um canavial altamente infestado por pragas e doenças, além de resultar em menor produtividade, também pode afetar a fermentação, inibindo a ação do fermento. Assim, um bom estado fitossanitário da cultura contribuirá para 10

22 se ter menores interferências nos resultados finais do empreendimento agroindustrial (VENTURINI FILHO, 2010) Preparo do pé-de-cuba Os mostos preparados pela agroindústria de cana-de-açúcar prepara não sofrem espontaneamente fermentações alcoólicas vigorosas, que só ocorrem depois que os mostos forem inoculados pelos levedos alcoólicos, também conhecidos como pé-de-cuba, pé de fermentação, pé ou simplesmente fermento (NOBREGA et al., 2009). As leveduras são fungos de interesse industrial pertencentes à classe dos Ascomicetos, sendo a espécie mais importante a Saccharomyces cerevisiae por ser uma eficiente fermentadora de açúcares, mesmo na presença de oxigênio (VENTURINI FILHO, 2010), são responsáveis pela fermentação dos açúcares do mosto, bem como pela produção de diversos outros compostos que contribuem para as qualidades organolépticas da cachaça (BADOTTI, 2005). O fermento ou pé-de-cuba é uma suspensão de células de leveduras em concentração suficiente para garantir a fermentação dos açúcares de um determinado volume de mosto em condições econômicas (NOGUEIRA et al,. 2005). Seu número pode variar de 2 a 5 x 10 6 cel/ml, sendo que, durante o preparo do pé-de-cuba, objetiva-se otimizar essa concentração (VENTURINI FILHO). Nos pequenos engenhos de cachaça é comum preparar, sempre no início da safra apenas um pé-de-cuba e depois seguir o trabalho normal cortando, ou seja, dividindo o mosto em fermentação para as demais dornas. O melhor seria preparar um pé-de-cuba para cada dorna, sendo aconselhável ter novos pés-de-cuba para, periodicamente, substituir ou reforçar os fermentos das dornas que não estiverem trabalhando eficientemente (NOBREGA et al., 2009). Alguns alambiques iniciam o processo fermentativo com leveduras prensadas de panificação, enquanto outros desenvolvem o fermento na própria cachaçaria (fermento caipira), de acordo com técnicas regionais (BADOTTI, 2005) Os tipos de fermentos mais empregados nas indústrias de cachaça são: fermento caipira ou selvagem, fermento prensado, fermento misto e fermento selecionado. 11

23 Fermento caipira ou selvagem O fermento caipira nada mais é que o resultado do aproveitamento das leveduras naturais do mosto, mediante certos tratamentos cuja finalidade é ativar a sua multiplicação (NOBREGA et al., 2009). Comum nas pequenas destilarias de cachaça, sem nenhuma evolução técnica e de instalações modestas, são fermentos preparados a partir de leveduras que naturalmente acompanham o mosto, oriundos da lavoura de cana, do ar e equipamentos do processo, geralmente com pequena tolerância ao álcool (NOGUEIRA et al., 2005). Este tipo de fermento é obtido por meio da fermentação natural de uma mistura com receita variável (pode ser feita com farelo de arroz, fubá de milho e suco de laranja ou limão), em quantidade suficiente para formar uma pasta ao ser misturado com os demais ingredientes. (ROSA et al., 2007). Esta mistura deve ficar em repouso durante 12 a 24 horas, até que comece a formar trincas na superfície do preparo, a qual é adicionado caldo de cana diluído com água até que fique completamente submerso (NOGUEIRA et al., 2005). Após o crescimento da população de fungos na mistura mais caldo de cana é colocado em quantidades crescentes para fornecer o açúcar necessário a rápida proliferação do micro-organismo. Durante essa preparação, que demora entre 5 e 10 dias, surgem diferentes espécies de leveduras, mas nas etapas finais de proliferação predomina a Sacharomyces cerevisiae (ROSA et al., 2007). O fermento caipira se apresenta com cor amarelada característica e cheiro agradável. Quando se consegue, de início, um pé-de-cuba vigoroso, os seus resultados na fermentação dos mostos são bastante compensadores. O pior defeito do fermento caipira é a incerteza se haverá ou não fermentação (NOBREGA et al., 2009) Fermento prensado O fermento prensado é constituído por uma massa sólida, contendo um aglomerado de células no estado sólido da espécie Saccharomyces cerevisiae (VENTURINI FILHO, 2010). 12

24 É o processo mais simples e rápido na obtenção do pé-de-cuba, uma vez que é um produto pré-industrializado, facilitando sua multiplicação em qualquer tipo de destilaria (NOGUEIRA et al., 2005). Em contraposição às vantagens de simplicidade e rapidez no preparo, o fermento prensado apresenta como inconveniente quando comparado com o selecionado pouca tolerância a altos teores alcoólicos e altas temperaturas (NOGUEIRA et al., 2005) Fermento selecionado Este tipo de fermento necessita de condições técnicas desenvolvidas na própria destilaria, recomendado tanto para pequena como para as de grande capacidade (NOGUEIRA et al., 2005). Ele é obtido a partir de leveduras selvagens que foram isoladas por apresentar maior tolerância ao etanol e a elevada produtividade e eficiência fermentativa, além de conduzirem a fermentações sem contaminações, com tempos de duração similares, elevada produtividade e de alta conversão de açúcar para álcool (NOGUEIRA et al., 2005) Fermento misto O preparo e a utilização do fermento misto são realizados também por pequenos produtores de cachaça. Tal preparo assemelha-se ao preparo do fermento caipira, com diferença de que o caldo diluído, inicialmente acrescentado à pasta de farelo e fubá, é completado com uma dose de fermento prensado de panificação. Assim será favorecida a predominância daquele micro-organismo que melhor se adaptou às condições do meio de fermentação (NOGUEIRA et al., 2005) Fermentação Fermentação é todo fenômeno causado por micro-organismos vivos, sejam bactérias, fungos ou leveduras, que decompõe e transformam o substrato resultando em produtos variados, dependendo da composição do substrato e dos micro-organismos presentes (VENTURINI FILHO, 2010). No caso específico da fermentação alcoólica, o processo é realizado em substrato açucarado, onde ocorre o desdobramento dos açúcares do caldo de cana com formação de 13

25 pequenas quantidades de outros compostos, os quais recebem a denominação de produtos secundários da fermentação alcoólica contribuintes para as qualidades organolépticas da cachaça (BORGUSZ JUNIOR et al., 2006). A levedura é o micro-organismo responsável pela fermentação dos açúcares do mosto. É um micro-organismo facultativo, podendo realizar respiração ou fermentação. Quando respira (metabolismo aeróbico), transforma o açúcar em H 2 O e CO 2. Nesse caso, promove-se a multiplicação das células. Quando fermenta (metabolismo anaeróbico), produz etanol e CO 2, além de outros subprodutos, como ácidos orgânicos e glicerol (VENTURINI FILHO, 2010). A reação de fermentação é demonstrada abaixo (DUARTE, 2009): C 6 H 12 O 6 2 CH 3 CH 2 OH + 2CO 2 + calorias Nessa reação, uma molécula de glicose passa pelo processo anaeróbico mediante doze etapas intermediárias antes de ser transformada em etanol e gás carbônico. Ao lado do etanol e do gás carbônico, formam o acetaldeído glicerol, 2,3 butilenoglicol, ácido succínico e ácido cítrico como produtos constantes da fermentação alcoólica, o que contribui fundamentalmente para o sabor e para o aroma da cachaça. O álcool etílico e o dióxido de carbono são produtos de excreção da célula e não são utilizados pela levedura em condições anaeróbicas (DUARTE, 2009). De acordo com as etapas fermentativas de uma cachaçaria artesanal, primeiramente o pé-de-cuba é levado às dornas de fermentação, em quantidades equivalentes a 20% do volume dessas dornas, onde já está o caldo de cana vindo da moenda e diluído em água. A partir dessa etapa, 80% do caldo fermentado (o vinho de cana) são retirados das dornas e seguem para o alambique, e o volume das dornas é completado com caldo diluído. Os 20% que ficam na dorna atuam como fermento iniciador. A concentração inicial de açúcares no caldo é medida pela porcentagem de sólidos em solução onde a concentração média do caldo de cana diluído deve ser em média, para obter melhor rendimento, de 16º Brix, que correspondem a 16% de açúcar. A fermentação é concluída quando todo o açúcar é consumido pelas leveduras (ROSA et al., 2007). O mosto fermentado passa a se chamar vinho, que deve acusar 0º Brix se o processo tiver sido conduzido de forma correta. O vinho é composto principalmente de água (80-90%), álcool etílico (6-10%) e produtos secundários de fermentação alcoólica (1-3%) (AQUARONE, 1986). 14

26 Finalmente, o vinho é destilado em alambique, feito em geral de cobre no caso dos pequenos produtores originando-se a cachaça. Esse processo é fundamental na obtenção de bebida de boa qualidade, pois, além de separar, selecionar e concentrar os componentes pelo uso do calor, ainda são promovidas algumas reações químicas. Desta forma, os componentes do vinho podem aumentar, diminuir ou ainda originar novos compostos durante a destilação (BADOTTI, 2005). Além dos compostos principais produzidos pela levedura, outros podem ser incorporados durante o armazenamento ou o envelhecimento da bebida em tonéis de madeira, outra etapa determinante para a qualidade final da bebida (ROSA et al., 2007) Fases da fermentação alcoólica A fermentação alcoólica é um processo constituído basicamente por três fases distintas: pré-fermentação, fermentação principal e pós-fermentação (ANTONINI, 2004). Na pré-fermentação, observa-se o consumo de açúcares que resultam na predominante multiplicação de leveduras. Não há produção de álcool, nem liberação de CO 2, sendo a elevação da temperatura muito pequena. A etapa deve ser curta para adaptação das leveduras ao meio (VENTURINI, 2010). Após 5 a 6 horas, com pouca espuma, inicia-se a fermentação principal, que é reconhecida pela elevação rápida da temperatura, desprendimento de CO 2, formação de espumas, queda da densidade do mosto por causa do desaparecimento dos açúcares e da formação equivalente do álcool. A acidez eleva-se abaixando o ph. Essa fase termina quando as espumas desaparecem, durando de 9 a 10 horas (ANTONINI, 2004). Na pós-fermentação há o consumo dos açúcares que ainda estão disponíveis no meio. Verifica-se diminuição lenta e gradual da temperatura do mosto, diminuição do desprendimento do gás carbônico e não se formam mais espumas. Completa-se a fermentação alcoólica, a superfície do vinho fica tranqüila e limpa de espumas, sendo então considerada concluída (VENTURINI, 2010). Essa fase dura de 6 a 8 horas e deve durar o mínimo possível para evitar a infecção do vinho e do pé-de-cuba, que será utilizado em nova fermentação (ANTONINI, 2004). 15

27 utilizadas na produção da cachaça O caldo de cana é um excelente meio para o desenvolvimento do micro-organismos, como a levedura da fermentação alcoólica. De um modo geral ela possui acidez e teor de nutrientes suficientes para que ocorra a fermentação (VENTURINI FILHO, 2010). A escolha da levedura adequada ao processo requer conhecimento, instalações próprias, técnica e bom senso, dependendo ainda das finalidades para as quais se destina a cachaça elaborada. Talvez por falta de conhecimento, este assunto não é devidamente considerado pelos fabricantes e contribui, com outros fatores, para a heterogeneidade dos produtos encontrados no comércio do Brasil (NOBREGA et al., 2009). Na escolha da levedura devem ser levadas em consideração, no mínimo, as seguintes condições básicas: natureza do mosto, condições locais da fábrica e o fim a que se destina o produto fabricado. Entre as principais leveduras existem espécies de diversas estirpes, das quais, as mais importantes sob o ponto de vista da agroindústria da cachaça, encontram-se entre os Saccharomyces e Schizossachaomyces diferindo entre si pela forma e pelas propriedades biológicas e fisiológicas (NOBREGA et al., 2009). A levedura empregada nas destilarias de cachaça trabalha entre 20 e 35 C, sendo temperatura ótima entre 26 e 32 ºC (VENTURINI FILHO, 2010). 2.5 Micro-organismos contaminantes da fermentação alcoólica A presença de micro-organismos no processamento de cana-de-açúcar ocorre desde a lavoura até o setor de fermentação, sendo que a contaminação bacteriana presente no caldo e no mosto pode refletir na qualidade da matéria-prima utilizada, pois, tanto o caldo de cana quanto o mosto são ótimos substratos para o crescimento de micro-organismos devido a alta atividade de água, aos teores de nutrientes orgânicos, ph, além da temperatura que ocorrem nos processos industriais de fermentação (CHERUBIN, 2003). Com baixos valores de acidez, não há condições favoráveis ao desenvolvimento da levedura, facilitando a ocorrência das infecções bacterianas. Entretanto, teores excessivos de ácidos podem destruir as células de leveduras. Em meio com ph neutro, poderá haver o desenvolvimento da bactérias contaminantes, resultando em aumento significativo nos teores da acidez volátil (VENTURINI FILHO, 2010). Quando os níveis de contaminação são muito elevados e as técnicas de manejo e condução da fermentação não são suficientes para reduzir a população de micro- 16

28 organismos estranhos ao processo, pode ser recomendado o uso de desinfetantes. Não obstante, deve-se realizar uma adaptação prévia das leveduras (VENTURINI FILHO, 2010). Os maiores prejuízos causados pela contaminação bacteriana são a degradação da sacarose e a formação dos ácidos lático e acético que ocasionam perda de açúcar e intoxicação das leveduras. (CHERUBIN, 2003). É conveniente conhecer quais micro-organismos se encontram presentes na canade-açúcar, tanto pela suas conseqüências na fermentação do caldo quanto sobre a qualidade da cachaça (NOBREGA et al., 2009) Contaminação por leveduras A cachaça é composta principalmente por água, álcool, aldeídos, ésteres e ácidos, e a fermentação é uma das etapas críticas da sua fabricação. O surgimento ao longo da safra de linhagens diferentes de Saccharomyces cerevisiae, com características de atuação variadas, pode alterar o sabor e o aroma da bebida, dando origem a cachaças diferentes (ROSA et al., 2007). A correta identificação e caracterização das linhagens de S. cerevisiae no processo de fermentação para produção da cachaça é de grande importância do ponto de vista industrial. Dependendo da linhagem do fungo que predomina nas dornas, em cada momento da safra, e das taxas de crescimento da população do micro-organismo, a qualidade da bebida varia muito. A alta diversidade de S. cerevisiae deve-se a ciclos de fermentação curtos (duração de 20 a 24 horas, em média), às altas temperaturas ambientais nos meses mais quentes da safra e a concentração elevada de etanol no final do ciclo (ROSA et al., 2007) Contaminação por bactérias Quando as condições do processamento da cachaça são impróprias há o desenvolvimento de outros micro-organismos, que atuando sobre os açúcares, ou mesmo sobre os produtos originados da fermentação alcoólica, formam outros compostos orgânicos (NOBREGA et al., 2009). Desde a cana-de-açúcar no campo até a etapa de fermentação alcoólica nas dornas de fermentação, ocorre um seletiva mudança da microflora contaminante onde efeitos como ph, temperatura, condições atmosféricas e produtos inibidores presentes no substrato, 17

29 influenciam diretamente na seleção dos micro-organismos que melhor se adaptarão (OLIVA NETO, 1995). Entre os principais micro-organismos contaminantes estão as bactérias que causam problemas como: consumo de açúcar, queda de viabilidade de células de levedura, floculação do fermento e queda no rendimento industrial, e ainda bebidas de baixa qualidade e valor comercial (BREGAGNOLI, 2006). Os produtos de metabolismo destes micro-organismos são incorporados ao caldo, encontrando-se substâncias como alcoóis, ácidos orgânicos e polissacarídeos que alteram a sua composição química, podendo causar sérios transtornos nos processos de fabricação (ANTONINI, 2004). Tanto a reprodução dos micro-organismos como a formação dos metabólitos se fazem à custa do açúcar inicialmente presente na cana. Uma alta contaminação bacteriana inicial aumenta o risco de inibição da levedura, gerando perdas não desprezíveis, na forma de degradação de açúcar e de álcool não produzido, provocando perdas na eficiência da destilaria (CARDOSO et al., 2008). Com relação aos contaminantes da linha de caldo, sabe-se que há uma perda de sacarose, que varia de 1,0 kg de sacarose/tonelada de cana quando as condições higiênicas e operacionais são satisfatórias a 2,5 kg de sacarose/tonelada de cana, quando nem as condições higiênicas e nem a eficiência nas operações são boas (GALLO, 1989). Durante a fermentação alcoólica ocorrem várias interações entre leveduras e bactérias. Muitas pesquisas são realizadas para esclarecer melhor essas interações, principalmente a inibição exercida pelas bactérias sobre o desenvolvimento das leveduras (CHERUBIN, 2003). Os contaminantes da fermentação alcoólica com capacidade infectante são restritos a poucos gêneros devido ao fato de o ambiente ser altamente seletivo permitindo o desenvolvimento apenas dos micro-organismos resistentes ao etanol e a ph baixo (OLIVA NETO, 1995). Entre os contaminantes que mais aparecem nos processos fermentativos, ocorrendo inclusive na etapa da fermentação alcoólica, predominam as bactérias Gram-positivas em formas de bastonetes dos gêneros Lactobacillus, Bacillus e Leuconostoc, sendo o último menos comum devido a sua baixa resistência ao etanol (ANTONINI, 2004). 18

30 Estudos já realizados revelaram que uma concentração bacteriana da ordem de 10 9 UFC/mL leva a uma queda no rendimento alcoólico, chegando a atingir 100% com Lactobacillus e 60% com Leuconostoc, e redução na viabilidade das células de leveduras a cerca de 10% (ANTONINI, 2004). A redução no rendimento fermentativo devido a presença de bactérias láticas é obvia, pois, quando uma molécula de glicose é convertida em duas de ácido láticos resulta em duas moléculas de etanol que deixaram de ser produzidas pela levedura. Muitos nutrientes são desviados para a multiplicação bacteriana e deixam de ser aproveitados pela levedura (CHERUBIN, 2003). São bactérias Gram-positivas, anaeróbias e apresentam-se como bastonetes ou coccus isolados (NOGUEIRA et al., 2005). As bactérias láticas são acidófilas, limitando-se a ambientes de ph relativamente baixos, crescendo em uma faixa ótima de ph 5,5 a 6,2 mas também a valores menores que 5,0 (OLIVA NETO, 1995). Além da elevação da acidez, a presença de bactérias láticas pode ser diagnosticada pela diminuição da espuma e pelo odor característico de ácido lático. O acúmulo deste metabólito torna o meio desfavorável às leveduras alcoólicas (NOGUEIRA et al., 2005). As bactérias acéticas mais freqüentes pertencem ao gênero Acetobacter, são aeróbias, Gram-negativas e apresentam-se como bastonetes alongados, móveis ou não. Elas podem oxidar açúcares do mosto, o etanol do vinho e ainda o acetaldeído (metabólito intermediário da fermentação alcoólica) para produzir ácido acético na presença de oxigênio. Cheiro forte característico de vinagre e presença da mosca do vinagre (drosófila) são características de sua presença (NOGUEIRA et al., 2005). Outro problema causado pela presença de bactérias contaminantes em processos de fermentação alcoólica é a floculação do fermento, que ocasiona redução na velocidade de fermentação e aumento de aproximadamente 15% no rendimento fermentativo, além de inconvenientes como entupimento de tubulações, aumento de fundo de dorna entre outros (CHERUBIN, 2003). Essas bactérias indutoras de floculação do fermento estão restritas a linhagens de Lactobacillus, mais particularmente L. fermentum (ANTONINI, 2004). As canas que sofrem corte na colheita ou são danificadas durante a queimada, são particularmente mais susceptíveis ao crescimento de bactérias e leveduras. Além disso, focos de contaminação nas moendas, esteiras e outros equipamentos contribuem no aumento da microbiota bacteriana presente (VENTURINI FILHO, 2010). 19

31 Teoricamente, é possível diminuir até 62% de perda em sacarose apenas adotando medidas higiênicas e sanitárias adequadas. Entretanto, na prática, esse limite é pouco provável de ser atingido. Através do uso de práticas adequadas de limpeza e aplicação correta de agentes antimicrobianos, tem-se conseguido reduzir 17-35% das perdas de sacarose por causas microbianas (GALLO, 1989). 2.6 Métodos de controle de micro-organismos contaminantes Atualmente são encontrados diversos sanitizantes, próprios para a indústria de bebidas, que podem ser usados nos engenhos de cachaça. Devidos cuidados são essenciais para não deixar resíduos de desinfetantes, já que poderiam prejudicar a fermentação, além de contaminar os vinhos ou serem arrastados com o destilado. Na falta de sanitizantes específicos, soluções de hipoclorito de cálcio a 5% e de formol a 2% são adequados. Após sua utilização deve ser feito enxágue com água em abundância (NOBREGA et al,. 2009). O avanço tecnológico das destilarias colaborou com a diminuição da frequência de contaminação, no entanto o mesmo ainda não é observado para cachaçarias de produção artesanal. Por isso é necessária uma supervisão constante por parte do produtor para evitar ou suprimir este tipo de problema (NOGUEIRA et al., 2005). Dentre as medidas que podem ser tomadas estão: Empregar matéria-prima bem conservada e não queimada; Tomar um mínimo espaço de tempo entre o corte e a moagem; Coar o caldo após a moagem; Efetuar as devidas correções do mosto com emprego de água de boa qualidade; Utilizar sanitizantes dentro das especificações técnicas; Empregar um fermento sadio, em quantidade suficiente e adequada para o bom andamento da fermentação; Controlar a temperatura em torno de 30 C durante a fermentação; 20

32 Realizar exames microscópicos para aferir o impacto da contaminação na viabilidade do fermento; Limpar as instalações da destilaria com freqüência, que é sem dúvida, o fator mais importante no controle da contaminação; 21

33 3. MATERIAIS E MÉTODOS Este estudo foi realizado no Laboratório de Microbiologia da Unidade de Ciências Exatas e Tecnológicas da Universidade Estadual de Goiás UEG/UnUCET. As amostras utilizadas para a execução das análises microbiológicas foram coletadas em uma cachaçaria artesanal localizada na região Sudeste do Estado de Goiás, na cidade de Orizona, durante o mês de agosto de Caracterização e amostragem do alambique estudado O alambique amostrado foi caracterizado por meio da aplicação de questionário em entrevista exploratória, segundo critérios propostos por CALIARI et al., O alambique utiliza somente caldo de cana como substrato para a produção da cachaça, sendo a fermentação descontínua, composta por duas moendas que realizam o preenchimento das seis dornas de fermentação independentes. O processo de fermentação compreende as seguintes etapas: Extração do caldo de cana por moagem: Passa-se a cana por três cilindros ranhurados que compõem a moenda, onde se faz a extração do caldo de cana. O alambique possui duas moendas que trabalham simultaneamente. Coamento: O caldo após a moagem passa por peneiras de aço inox que retiram impurezas grosseiras. O caldo é transportado para um decantador para purificação da cachaça onde permanece por aproximadamente trinta minutos. Em seguida o caldo é encaminhado para as dornas através de tubulações. Preparo do pé-de-cuba : Antes de iniciada a fermentação, o produtor prepara o fermento (fermento caipira) na própria dorna de fermentação. Para seu preparo utiliza-se uma mistura de milho e caldo de cana como substrato, que permanece em repouso por vinte dias. Fermentação: Após o preparo da mistura, a alimentação do fermento é realizada somente com garapa. A fermentação completa ocorre em torno de 24 horas. 22

34 Isca: A quantidade de isca deixada nas dornas é de aproximadamente trinta por cento, entre as fermentações. Tanque de vinho: O vinho é separado da dorna de fermentação por um tanque de vinho a fim de diminuir o tempo de contato entre o vinho e o fermento decantado. Destilação: A destilação é feita em alambiques de cobre. Com o objetivo de avaliar a presença e a quantidade de micro-organismos contaminantes, foram obtidas assepticamente um total de 19 amostras, nos dias 13/08 (44º dia de safra), 20/08 (51º dia de safra) e 27/08 (58º dia de safra), nos mesmos horários e em pontos específicos da linha de produção representados na FIGURA 1. Segundo metodologia de GALLO (1989), o mosto foi coletado na moenda e nas seis dornas de fermentação, sendo as amostras obtidas na primeira dorna após 10 horas do início de seu preenchimento. As amostras obtidas nas dornas dois, três e quatro com intervalos de aproximadamente uma hora. E finalmente, as amostras coletadas nas dornas cinco e seis, as últimas a serem preenchidas no ciclo, após 5 e 3 horas, respectivamente. D1 CB Moenda Moenda Dornas de Fermentação D1 D2 D3 Dorna 1 Dorna 2 Dorna 3 Dorna 4 Dorna 5 Dorna 6 T1 T2 T3 T4 T5 T6 Legenda: CB caldo bruto; T1-6 dornas coletadas; D1 data da primeira coleta (13/08/2010); 23

35 D2 data da segunda coleta (20/08/2010); D3 data da terceira coleta (27/08/2010); FIGURA 1 Esquema simplificado da coleta das amostras. As amostras foram coletadas em frascos esterilizados e transportadas em caixa térmica com gelo picado para o Laboratório de Microbiologia da UnUCET, aonde foram imediatamente processadas com a diluição e semeadura como especificado a seguir. 3.2 Processamento microbiológico das amostras Preparação do meio de cultura ágar WLN (Wallerstein Laboratory Nutrient) Meios seletivos foram desenvolvidos com o objetivo de selecionar e diferenciar micro-organismos. Ágar WLN é um meio seletivo recomendado para o isolamento e enumeração de bactérias, leveduras e fungos encontrados nas fermentações industriais. Este meio tem um ph de 5,5±0,2 que permite o crescimento e desenvolvimento de uma gama de micro-organismos, que serão diferenciados pela fermentação e viragem do indicador de ph, verde de bromocresol (HIMEDIA LABORATORIES). TABELA 4 - Formulação do meio WLN. COMPONENTES QUANTIDADE Caseína enzimática hidrolisada 5,00g Extrato de levedura 4,00g Dextrose 50,00g Fosfato monopotássico (KH 2 PO 4 ) 0,55g Cloreto de potássio (KCl) 0,425g Cloreto de cálcio (CaCl 2.2H 2 O) 0,125g Sulfato de magnésio (MgSO 4.7 H 2 O) 0,125g Cloreto férrico (FeCl 3.6H 2 O) 0,0025g Sulfato de manganês (MnSO 4.4H 2 O) 0,0025g Verde bromocresol 0,022g 24

36 Fonte: ANTONINI, 2004 Ágar bacteriológico 20,00g A caseína enzimática hidrolisada fornece nitrogênio, aminoácidos e carbono. O extrato de levedura é fonte de oligoelementos, vitaminas e aminoácidos, estimulando o crescimento das bactérias láticas. A dextrose, escolhida como fonte de carbono por ser assimilada por todas as bactérias, ao ser utilizada em alta quantidade junto com os sais minerais com ph ácido favorece a fermentação de açúcar. Fosfato monopotássico é o tampão do meio. Cloreto de potássio, cloreto de cálcio, cloreto férrico são os íons essenciais que ajudam a manter o equilíbrio osmótico. Sulfato de manganês e sulfato de magnésio são fontes de cátions divalentes. O verde de bromocresol é um indicador de ph e o ágar um agente solidificante (HIMEDIA LABORATORIES). Na preparação do meio WLN foram pesadas 80,25 gramas para a dissolução em 1000 ml de água destilada. Para uma homogenização completa aqueceu-se o meio em banho maria. Em seguida, tampou-se com rolha de algodão e colocou na autoclave a uma temperatura de 121ºC por 15 minutos. Apos o resfriamento até uma temperatura de aproximadamente 45ºC mediu-se o ph próximo de 6,0. Em seguida homogeneizou-se a solução e rapidamente distribuiu-se cerca de 20 ml em placas de petri esterilizadas. Depois de resfriadas, as placas foram incubadas a 35ºC para validar a esterilidade (ANTONINI, 2004) Diluição seriada Na diluição seriada, o inóculo é diluído em uma série de tubos de diluição onde cada tubo de diluição subsequente conterá um décimo do número de micro-organismos presentes no anterior (TORTORA, 2003). Nesta etapa foram utilizados sete tubos com solução salina a 0,9 % e pipetas graduadas previamente esterilizadas. Após a homogeneização da amostra, pipetou-se 1 ml desta para um tubo contendo 9 ml de solução salina (diluição 10-1 ). Após homogeneizar o tubo com a solução diluída pipetou-se novamente 1 ml dessa diluição para outro tubo com 9 ml de solução salina (diluição 10-2 ). Diluições subseqüentes são feitas sempre homogeneizando bem a diluição, tomando-se 1mL de cada e adicionando-se aos tubos com 9 ml de solução salina até o último tubo que apresentará diluição A semeadura em placas ou plaqueamento revela o número de células de microorganismos capazes de se multiplicarem e formarem colônias em meios de cultivo 25

37 apropriados e sob condições de incubação adequadas. Cada colônia desenvolvida é supostamente originada a partir de uma unidade viável, a qual pode ser um único microorganismo ou um grupo. Como para uma maior precisão da análise somente deverão ser contadas as placas com número de colônias entre 30 e 300, uma diluição da amostra deverá ser feita antes de se proceder a sua mistura com o meio de cultura (ANTONINI, 2004). Com as diluições seriadas 10-3, 10-4, 10-5 e 10-6, e com o auxílio de uma pipeta automática (100 µl) e ponteiras estéreis, transferiu-se 0,1 ml das diluições para as placas já identificadas e utilizando a alça de Drigalsky (alça feita de vidro na forma de rodo) previamente esterilizada (mergulhando a alça em álcool e levando ao fogo logo em seguida) esparramou-se o inóculo no meio WLN de maneira que ficasse bem distribuído nas placas. Em seguida, as placas foram invertidas e incubadas a 28ºC e procedeu-se à contagem das colônias após 48 horas. Após horas de incubação, selecionou-se as placas que apresentavam de 30 a 300 colônias e em seguida fez-se a contagem das colônias (ANTONINI, 2004) Caracterização dos micro-organismos isolados Em paralelo a determinação das UFC/mL foi realizada a caracterização morfológica com a visualização das colônias em ágar WLN. Aspectos como a cor, tamanho e aspecto foram estudados. Após a etapa anterior, procedeu-se as análises microscópicas das amostras com a coloração de Gram, um método de coloração diferencial que utiliza um corante primário (cristal violeta) e um contracorante (safranina). Nas bactérias Gram-positivas a camada de peptideoglicano é mais espessa permitindo a retenção do corante cristal-violeta, após a descoloração com álcool-cetona, mantendo-se assim a coloração roxa. As bactérias Gramnegativas não retêm corante e assim exibem a coloração rosa do contracorante safranina (ANTONINI, 2004). Nesta técnica, as lâminas são preparadas com uma gota de solução salina sobre uma lâmina de vidro e com o auxilio de uma alça de platina, retirou-se assepticamente uma pequena porção da colônia de interesse. Em seguida, emulsionou-se na gota a fim de obter uma suspensão uniforme e um esfregaço fino. Anotou-se na lâmina a procedência do esfregaço. Após secar ao ar livre fixou-se o esfregaço, passando a lâmina três vezes sobre a chama. Esperou-se o resfriamento da lâmina. Colocou-se a lâmina sobre uma cuba de coloração e corou-se a mesma com uma solução de cristal violeta durante 1 minuto. Lavou- 26

38 se suavemente com água para eliminar o excesso de corante. Adicionou-se lugol por 1 minuto. Este atua como mordente ou fixador, onde ambas as bactérias gram-positivas e gram-negativas adquirem cor púrpura. Lavou-se novamente o excesso com água. Gotejouse a solução de álcool-cetona (um descorante) e lavou-se imediatamente com água. Neste momento, as células gram-positivas estão púrpuras e as gram-negativas incolores. Cobriuse com o contracorante safranina durante 1 minuto, onde as bactérias adquirem a cor rosa. Lavou-se com água e deixou-se secar em temperatura ambiente antes da microscopia. Examinou-se ao microscópio com objetiva 100X de imersão e determinou-se se as culturas são Gram-positivas (células coradas de roxo) ou Gram-negativas (células coradas de rosa) (ANTONINI, 2004). 27

39 4. RESULTADOS E DISCUSSÃO 4.1 Métodos de controle microbiológico Segundo CALIARI et al., 2009, e de acordo com entrevista exploratória do alambique amostrado, alguns métodos podem melhorar o processo produtivo reduzindo os microorganismos contaminantes que interferem no rendimento fermentativo como: Utilização de melhores conhecimentos sobre a maturação da cana-de-açúcar utilizando refratômetro para determinação do ponto de colheita, assim como utilizar variedades de cana-de-açúcar mais aptas para a produção de cachaça. Processar a cana-de-açúcar imediatamente após o corte sem armazená-la para dias posteriores. Fazer a limpeza das moendas antes e após a sua utilização assim como das peneiras. Fazer a limpeza do decantador antes e após a sua utilização com água quente ou à temperatura ambiente, com sanitizante apropriado. Realizar o controle da temperatura das dornas de fermentação. Realizar o controle da temperatura, formação de espumas e do teor de sólidos solúveis na fermentação. Limpar as instalações da cachaçaria com freqüência. 28

40 4.2 Determinação das UFC/mL A quantificação dos micro-organismos totais isolados das amostras está representada na TABELA 1. TABELA 5 Quantificação de micro-organismos totais isolados das amostras. UFC/mL Bactérias UFC/mL Total UFC/mL 1º dia coleta 8,5x º dia coleta 1,4x10 8 1,0x10 8 2,4x10 8 3º dia coleta 3,0x10 6 4,9x10 6 7,9x10 6 Nas contagens totais obtidas o índice de contaminação bacteriana foi significativo em todos os dias coletados. Segundo CHERUBIN (2003), contaminações bacterianas acima de 5,0x10 6 UFC/mL são consideradas prejudiciais a fermentação, acima de 1,0x10 7 UFC/mL os prejuízos econômicos são significativos e acima de 1,0x10 8 UFC/mL ocorrem quedas no rendimento fermentativo e industrial. 4.3 Caracterização das cepas isoladas Os resultados detalhados das análises microbiológicas encontram-se descritos nos Quadros 1, 2, 3 e 4. Nestes, estão representados o número total de colônias, características morfológicas das colônias, aspecto microscópico por meio da coloração de Gram o que permitiu a caracterização dos micro-organismos em leveduras, bactérias Gram-negativas e bactérias Gram-positivas. As cepas foram identificadas por meio de códigos, nos quais o primeiro caractere representa a dorna na qual foi coletada a amostra, identificadas como T1, T2, T3, T4, T5 e T6. O segundo caractere refere-se ao dia da coleta, sendo a primeira coleta (13/08/2010), identificada como D1, a segunda (20/08/2010), como D2 e a terceira (27/08/2010), como D3. 29

41 E por último, a morfologia das diferentes colônias isoladas em uma mesma amostra, foram identificadas como a, b, c, d, e, e f. Os resultados da determinação das UFC/mL no caldo de cana bruto (CB) foram representados no Quadro 1 e não estiveram dentro dos limites considerados como prejudiciais a fermentação (CHERUBIN, 2003). QUADRO 1 Caracterização das cepas isoladas das amostras de caldo bruto obtidas no dia 13/08/2010. Cepas Morfologia das Colônias em meio WLN N colônias Cor Tamanho Aspecto CB-a 1 Creme, opaca Grande CB-b 1 Verde claro brilhante Média Forma e borda irregulares, pastosa Lisa,borda regular, uniforme, redonda UFC/mL 1x10 5 1x10 5 Microscopia Bactérias Gramnegativas Bactérias Gramnegativas CB-c 1 Verde escuro Pequena Lisa, borda regular, uniforme 1x10 5 Bactérias Grampositivas A contaminação bacteriana ocorre, pois o caldo de cana, principalmente na fase de extração, permite o desenvolvimento de uma série de micro-organismos, por apresentar concentração de açúcares, ph e temperatura favoráveis (ANTONINI,2004). O resultado obtido esteve abaixo do esperado, pois de acordo com entrevista realizada com o produtor, após a colheita da cana-de-açúcar não há nenhum tipo de higienização da matéria-prima na cachaçaria sendo higienizada somente no canavial. A cana-de-açúcar passa pela etapa de extração na moenda que também não era higienizada. De um modo geral, as análise microbiológicas das amostras coletadas na dorna de fermentação no dia 13/08/2010, representadas no Quadro 2 apresentaram uma variação muito grande de morfotipos tanto de bactérias quanto de leveduras. No plaqueamento das amostras, as placas que permitiram a contagem apresentando de 30 a 300 colônias, apresentaram fator de diluição entre 10 4 a 10 7 UFC/mL. Dentre essas diluições priorizaramse as placas que proporcionaram os melhores resultados. QUADRO 2 Caracterização das cepas isoladas das amostras de mosto obtidas no dia 13/08/2010. Morfologia das Colônias em meio WLN Cepas N colônias Cor Tamanho Aspecto UFC/mL Microscopia 30