APLICAÇÃO DA ENGENHARIA A PROCESSOS BIOTECNOLÓGICOS: O CASO DOS BIOPESTICIDAS

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1 APLICAÇÃO DA ENGENHARIA A PROCESSOS BIOTECNOLÓGICOS: O CASO DOS BIOPESTICIDAS Deise M. F. Capalbo 1, Iracema O. Moraes 2, Regina O. M. Arruda 3, Rodrigo O. Moraes 4 Embrapa Meio Ambiente 1, Laboratório de Fermentações, CP 69, CEP Jaguariúna - SP. deise@cnpma.embrapa.br l Universidade Guarulhos 2 Centro de Ciências Exatas e Tecnológicas, Guarulhos/SP. iomoraes@prof.ung.br Universidade Guarulhos 3 Centro de Ciências Exatas e Tecnológicas, Guarulhos/SP. reginaarruda@hotmail.com Bolsista FAPESP 4 romoraes@cnpma.embrapa. br Resumo. A biotecnologia é reconhecida como ferramenta imprescindível na obtenção de novos produtos de interesse industrial. Exemplos incontestáveis são os alimentos nutracêuticos, os novos medicamentos além dos biopesticidas. Na obtenção destes últimos, a engenharia das fermentações permitiu viabilizar sua produção de tal forma que o biopesticida mais conhecido e comercializado no mundo todo, o Bacillus thuringiensis, é produzido em reatores com cerca de L, sendo que seu volume comercializado corresponde aproximadamente a US$ 100 milhões anuais. Os biopesticidas são uma ferramenta indispensável para reduzir a contaminação alimentar e ambiental provocada pelos produtos químicos. Eles são originados de bactérias, fungos, vírus e protozoários. Com exceção dos vírus, os demais são produzidos em processos fermentativos. A escala de produção, piloto e industrial, só é atingida se houver conhecimento de processo de ampliação de escala, onde os fundamentos da engenharia são indispensáveis. No Brasil já existem vários estudos para produção de pesticidas microbianos para o controle de insetos, fitopatógenos e ervas daninhas. Para todos eles, entretanto, têm sido observados poucos estudos de engenharia para o desenvolvimento de processos fermentativos que permitam transformá-los em produtos tecnológicos. Entre as soluções para suprir esta deficiência, o ensino e pesquisa da engenharia precisam, rapidamente, ser reforçados para que seus profissionais atendam a esta demanda do mercado Palavras-chave: Biopesticida, Processo fermentativo, Bactéria entomopatogênica, Controle biológico. EMA - 34

2 1. INTRODUÇÃO A Biotecnologia passou por quatro patamares segundo Rehm & Reed [1]: no primeiro ocorreu a produção microbiana de alimentos, existente desde os primórdios, praticadas por milhares de anos. Alimentos fermentados como iogurte, queijo, molho de soja, chucrute, entre outros vem sendo produzidos há muitos séculos e, em alguns casos, milênios. A descoberta de cerveja nas antigas pirâmides do Egito revela que eles produziam um malte fermentado utilizando culturas puras de leveduras. O segundo patamar considera a produção biotecnológica de ácidos orgânicos, solventes e biomassa, sob condições não-estéreis. Ocorreu com as descobertas de Pasteur e outros cientistas, ao final do século XIX, sobre a obtenção de metabólitos primários. Ainda nestes casos, simples tecnologias estavam envolvidas: a conversão de açúcar em álcool (na produção de cerveja e vinho) e a conversão de açúcar a ácido lático (como ocorre na produção do queijo). Após Pasteur, a microbiologia e a tecnologia das fermentações se desenvolveram enormemente. Pesquisas realizadas até o início do século XX levaram ao isolamento de novos microrganismos de grande interesse e ao desenvolvimento de processos de crescimento de células e metodologia analítica para acompanhar estes processos. Alexander Fleming descobriu a penicilina o que levou ao grande desenvolvimento da indústria de antibióticos que por muitos anos foi a galinha dos ovos de ouro da indústria farmacêutica. O terceiro patamar envolve os processos desenvolvidos sob condições de esterilidade, e praticamente se iniciou em 1940, com a necessidade de produção de enormes quantidades de penicilina, em processo absolutamente estéril. Com estas novas técnicas tornou-se possível o crescimento unicamente do microrganismo desejado, em quantidades máximas, obtendo apenas o produto final visado. Não apenas a obtenção de produtos considerados metabólitos secundários, tornou-se possível, mas também a obtenção de produtos através da transformação microbiana de metabólitos. O quarto patamar refere-se aos avanços das novas tecnologias destacados a seguir. 2. AVANÇOS BIOTECNOLÓGICOS, PESTICIDAS E BIOPESTICIDAS As dificuldades de comércio e abastecimento de diversos materiais forçaram os países a procurarem fontes biológicas como matéria prima. Cientistas encontraram formas de obter e incrementar a produção de etanol e solventes como acetona e butanol por fermentação. A produção de antibióticos teve sua escala de produção ampliada para atender as necessidades crescentes devido às doenças provocadas pelas guerras. Encontra-se aí o quarto patamar com o uso de enzimas e de células imobilizadas, mutantes e novas técnicas avançadas. No campo da biologia molecular e tecnologia genética, desenvolveram-se microrganismos cuja estrutura genética foi modificada, expressando genes de interesse, plantas com inserção de genes para o controle de pragas, por exemplo, plantas modificadas contendo genes de Bacillus thuringiensis. Desenvolveram-se novos reatores biotecnológicos, estudou-se a otimização dos processos e o emprego de melhores técnicas de medidas e controle de processo, controle total, via computador. Para estas atividades biotecnológicas contribuíram, e continuam a contribuir, conhecimentos das ciências biológicas e de várias áreas da engenharia, abrindo assim um novo espaço de aplicação tecnológica importante nos dias de hoje a chamada nova biotecnologia. 2.1 Biotecnologia e engenharia Muitos são os produtos biotecnológicos produzidos a partir de células microbianas. Podem ser citados: antibióticos (penicilina, cefalosporina, tetraciclina); enzimas industriais (amilases, proteases, lipases); enzimas especiais (endonucleases de restrição, estreptoquinases); biomassa (fermentos, culturas para queijo, inóculos para bioremediação, algas); biopolímeros, goma xantana (dextranas); biopesticidas (Bacillus thuringiensis); alimentos (molho de soja, iogurte, vinagre, queijo); pigmentos (ß-caroteno, astaxantina); produtos terapêuticos (interleuquina, fatores contra tumores necróticos, interferons, vacinas, hormônios de crescimento, anticorpos). As células que produzem estes compostos crescem e se reproduzem em reatores conhecidos como bioreatores ou fermentadores. Muitas empresas de biotecnologia - desde pequenos departamentos em Universidades até empresas multinacionais - usam bioreatores como componente chave de suas operações de produção. Bioreatores disponíveis no mercado variam de a de litros, dependendo da aplicação. Uma das áreas envolvidas na muitidisciplinaridade da biotecnologia é a Engenharia, ou melhor, as engenharias bioquímica, química, de alimentos, elétrica, mecânica, entre outras. É o caso, por exemplo, da engenharia bioquímica que fornece conhecimentos amplos do desenvolvimento de células e seus metabólitos, bem como a sua aplicação potencial. Ela analisa o processo bioquímico quantitativamente e enfoca de maneira sistêmica o desenvolvimento do produto. Já a Engenharia química e a de alimentos contribuem com toda sua carga de conhecimentos técnicos, cálculos e definições de fluxos e fenômenos de transporte que caracterizam os processos químicos e biológicos envolvidos numa fermentação. Outras engenharias contribuem na concepção e construção dos bioreatores, de seus controles de temperatura, esterilização, assepsia, agitação, aeração, medidas analíticas do processo biológico que tem lugar no interior destes reatores, ou ainda na finalização do processo quando o produto é separado do restante do material. O caso dos biopesticidas é um exemplo da aplicação do conhecimento de múltiplas áreas para se chegar a um produto biotecnológico. EMA - 35

3 2.2 O caso do Bacillus thuringiensis No final do século XX, desastres ambientais, menor disponibilidade de suprimentos alimentícios, aumento de pragas e doenças de plantas cultivadas, demanda crescente por alimentos e produtos de primeira necessidade em razão do crescimento populacional, além de expansão de mercado consumidor nos países mais desenvolvidos criaram novas oportunidades para os especialistas em biotecnologia. Para reduzir a contaminação por pesticidas químicos, foi proposto o combate aos insetos utilizando entomopatógenos que incluem especialmente vírus, bactérias e fungos que desencadeiam doenças nas pragas, eliminando-as. Os inseticidas baseados em entomopatógenos são quase sempre específicos e apresentam baixa ou nenhuma toxidez aos vertebrados e insetos benéficos, ocorrendo naturalmente nos campos cultivados. Apesar do seu uso representar atualmente apenas 1% do mercado total de produtos para proteção de plantas, um número significativo de estudos promoveu o aumento da quantidade de produtos disponíveis e ampliou as perspectivas para o mercado, como é o caso de Bacillus thuringiensis, o ingrediente ativo mais utilizado comercialmente como biopesticida, que cresceu pela aplicação de métodos biotecnológicos. A aplicação de B. thuringiensis e outros entomopatógenos como inseticidas requer grandes quantidades do agente ativo. Conseqüentemente, sua produção deve ser relativamente fácil e boas as características de estocagem. A produção depende do microrganismo entomopatogênico se desenvolver em meio artificial (in vitro) o que lhe garantirá ser produzido em larga escala, utilizando-se as modernas técnicas de fermentação. Etapas do processo fermentativo. Para a produção comercial de B. thuringiensis há necessidade de seleção de uma linhagem bem adaptada ao processo fermentativo e variações são necessárias a fim de maximizar a produção e realizar o crescimento sob condições de fermentação econômicas. Independente da fonte de obtenção da linhagem seja ela isolada de fontes naturais como solo ou insetos, seja ela obtida por manipulação genética, todos os novos materiais deverão seguir etapas de otimização antes de poderem ser utilizados em fermentações de escala comercial, segundo Bryant [2]. Estas etapas envolvem a estabilidade da linhagem e as condições ótimas de produção. As etapas preliminares de otimização das condições de produção são normalmente realizadas em pequenos reatores (entre 1 e 5 litros), seguidas de etapas intermediárias (reatores entre 10 e 20 litros). Esses reatores são construídos de forma a permitir o controle, o monitoramento e o registro das condições de trabalho (temperatura, aeração, agitação, entre outras) bem como a retirada de amostras assepticamente. Desses testes obtém-se dados sobre condições ideais de suprimento de nutrientes (carboidratos, minerais, proteínas), temperatura, ph, oxigênio dissolvido, que embasarão o escalonamento do processo. Considerações do aspecto custo de produção e recuperação do produto final devem ser conjugadas com os dados de produtividade obtidos nas etapas de otimização do processo fermentativo de forma a gerar produtos competitivos (Moraes et al. 1998, Bryant 1994). No caso do B. thuringiensis a aplicação de bioensaios com o produto obtido determina a melhor linhagem. Os processos fermentativos de B. thuringiensis envolvem várias etapas na obtenção de grandes quantidades de células e seus esporos segundo Moraes et al [3]. Cada linhagem é mantida como uma cultura-estoque na forma liofilizada. Uma pequena quantidade deste material é então transferida para um meio de propagação e após um período de fermentação sob condições controladas, este volume inicial (1-2 litros) será o inóculo de um reator ainda maior (50 litros), e assim sucessivamente até se atingir o volume final desejado. Condições de assepsia durante todo o procedimento devem ser observadas para evitar contaminações por outros microrganismos; todo o equipamento e meios de cultivo devem ser esterilizados em autoclave ou por vapor, de forma a manter as condições de assepsia necessárias. As condições de produção devem ser cuidadosamente monitoradas para segurança quanto ao andamento e manutenção da produtividade. Após o período de crescimento analisa-se o caldo quanto às propriedades físicas e microbiológicas, para assegurar qualidade e integridade antes de passar a etapas posteriores de produção que atingirão até litros ou mais por reator, conforme Moraes & Capalbo [4]. EMA - 36

4 Pode-se esquematizar a produção comercial de B. thuringiensis conforme Ref. [4]: meio de cultura pré-fermentação do inóculo inoculação e incubação (fermentador) recuperação dos esporos e toxinas padronização e bioensaio formulação comercialização 2.3 Outros biopesticidas Os biopesticidas hoje disponíveis para comercialização no mercado nacional são originados de bactérias (B. thuringiensis, Bacillus sphaericus), fungos (Beauveria bassiana, Metharizium anisopliae) e vírus (Baculovirus anticarsia). Com exceção dos vírus, que são produzidos em células animais viáveis, os demais são produzidos em processos fermentativos em meio líquido ou sólido. Na obtenção dos fungos e bactérias biopesticidas, a engenharia das fermentações permitiu viabilizar sua produção em escala comercial de tal forma que o biopesticida mais conhecido e comercializado, o Bacillus thuringiensis é produzido em reatores com cerca de L, representando 90% do total de biopesticidas comercializados no mundo, o que representa algo ao redor de US$100 milhões anuais. Ressalte-se que as escalas piloto e industrial só foram atingidas pelo conhecimento de processo de ampliação de escala, baseado em fundamentos da engenharia. 3. CONSIDERAÇÕES FINAIS Nos últimos anos a biotecnologia é reconhecida como ferramenta imprescindível na obtenção de novos produtos de interesse industrial, a maioria deles tendo aplicações na: Indústria, Agricultura, Saúde, Energia e Meio Ambiente. Exemplos incontestáveis são os alimentos nutracêuticos, os novos medicamentos além dos biopesticidas. Muitos outros microrganismos podem ser utilizados na obtenção de outros produtos, em todas as áreas de influência da biotecnologia, sejam elas do setor primário, secundário ou terciário. A Biotecnologia evolui a passos largos, mas há muitos obstáculos a serem ultrapassados para sua máxima utilização. O Brasil é conhecido por suas pesquisas em controle microbiano de pragas. Embora a maioria dessas pesquisas esteja direcionada ao controle de insetos, como os exemplos indicados anteriormente, já existem várias para o controle de fitopatógenos e ervas daninhas. Para todas elas, entretanto, têm sido observados poucos estudos de engenharia para o desenvolvimento de processos fermentativos que permitam transformá-las em produtos tecnológicos. Os resultados atingidos pelo grupo de pesquisa composto pelos autores serão apresentados. Há carência de biopesticidas no mercado nacional, que precisa ser suprida rapidamente para que produtos agrícolas saudáveis cheguem ao consumidor. Entre as soluções para suprir esta deficiência, o ensino e pesquisa da engenharia precisam, rapidamente, ser reforçados para que seus profissionais atendam a esta demanda do mercado. 4. REFERÊNCIAS [1] H.J.Rehm and G. Reed (editors), Biotechnology - a Comprehensive Treatise. Vol 1. Microbial Fundamentals. Verlag Chemie, GmbH, 1981, 520 pp. EMA - 37

5 [2] J.E.Bryant, Commercial production and formulation of Bacillus thuringiensis, Agric. Ecosyst. and Environm., vol.49, 1994, pp [3] I.O.Moraes, D.M.F.Capalbo and R.O.M. Arruda, Produção de bactérias entomopatogênicas, in S.B. Alves (Ed.) Controle microbiano de insetos, Piracicaba, FEALQ/USP, 1998, pp [4] I.O. Moraes and D.M.F. Capalbo. Produção de bactérias entomopatogênicas, in: S.B. Alves (coord.), Controle Microbiano de Insetos, São Paulo, Manole, pp EMA - 38