ISSN Volume 09 Número Uniterms: hybrid , micropropagation, rooting, growth regulators

Transcrição

1 PROPAGAÇÃO DE REBENTOS IN VITRO DE SISAL Silva, C. V.¹, Silva, H.², Carvalho, J. M. F. C.³ RESUMO: A propagação convencional do sisal é muito lenta ocorrendo principalmente por bulbilhos produzidos na inflorescência, depois de 8 a 9 anos de cultivo e raramente produzindo sementes férteis. Nesse contexto, objetivou-se com esse trabalho regenerar plantas do agave Híbrido cultivado nos campos experimentais da Embrapa Algodão utilizando-se combinações dos reguladores de crescimento BAP (6-benzilaminopurine) e 2,4D (ácido 2,4-diclorofenoxiacético) na micropropagação de rebentos e a auxina AIB (ácido indolil-3-butírico) para indução a rizogênese. A pesquisa foi desenvolvida no Laboratório de Cultivo de Tecidos, da Embrapa Algodão no período de fevereiro a dezembro de De acordo com as análises estatísticas dos dados obtidos verificou-se que não foram registradas diferença significativas entre as concentrações estudadas, porém houve significância no fator tipo de explante para todas as variáveis. Observou-se que a combinação dos fitorreguladores BAP e 2,4D, mesmo em menores taxas induzem a multiplicação de gemas de sisal. Foi visto ainda que na rizogênese apenas ocorreu variação significativa quanto ao fator concentração para a variável número de raízes, enquanto que no fator período esta só foi detectada na variável tamanho de broto. Contudo,todas as concentrações da auxina utilizada responderam a contento no desenvolvimento do sistema radicular.conclui-se, ainda, que a aclimatação ex vitro foi bem sucedida Unitermos: Híbrido 11648, micropropagação, rizogênese, fitorreguladores PROPAGATION OF SHOOTS OF SISAL IN VITRO Abstract: The conventional propagation of sisal is very slow occurring mainly by bulbils produced in the inflorescence, after 8-9 years of cultivation and rarely producing fertile seeds. In this context, the aim of this work is to regenerate the Hybrid 11,648 agave plants grown at Embrapa Cotton trial fields using combinations of growth regulators BAP (6-benzilaminopurine) and 2,4-D (2,4- dichlorophenoxyacetic acid) in micropropagation shoots and auxin IBA (indole-3-butyric acid) to induce the rooting. The research was conducted in the Laboratory of Tissue Culture, at Embrapa Cotton from February to December According to the statistical analysis of the data obtained it was found that no significant differences were recorded between the concentrations studied, but there was a significant factor in explant type for all variables. It was observed that the combination of plant hormones BAP and 2,4-D, even at lower rates induce the multiplication of sisal shoots. It was also seen that the rhizogenesis significant change occurred only on the concentration factor for the variable number of roots, while in the period this factor was detected only in variable sized bud. However, all concentrations of the usead auxin answered satisfactorily in developing the root system. It also concludes that the acclimatization ex vitro was successful. Uniterms: hybrid , micropropagation, rooting, growth regulators 1.INTRODUÇÃO 1. Rua Maria dos Ramos Carvalho, Praia do Poço, 55, Cabedelo, PB, CEP: claudiane_vs@hotmail.com. 2. CCBS/UEPB, Bodocongó, Campina Grande, PB. humbertoecologia@bol.com.br 3. Embrapa Algodão, Rua Osvaldo Cruz 1143 Centenário Caixa Postal 174, Campina Grande, PB, CEP , julita@cnpa.embrapa.br

2 Entre os produtos de grande importância para a humanidade, as fibras naturais vêm assumindo destaque como matéria prima para novos empregos da mesma e aproveitamento de subprodutos (Gondim; Souza, 2009). O sisal, ou agave, se destaca como uma das fibras duras de maior importância no país tendo em vista, ser o Brasil o maior exportador mundial do produto, porém apesar de ser considerado um vegetal polivalente, até pouco tempo atrás, só era aproveitado no território apenas como fibra (Moreira et al., 1996). A cultura de sisal, nos últimos anos, teve um acentuado declínio, tanto na área planta da como na produção. Carvalho et al. (2008) afirmam como causas de tal declínio: o mau aproveitamento da planta de sisal; a concorrência com fibras sintéticas; o elevado custo inicial para a produção da monocultura sisaleira; a falta de variedades adaptadas às regiões produtoras; o não aproveitamento dos resíduos do desfibramento; a ocorrência de doenças e o manejo deficitário da fertilidade dos solos. Em decorrência destes fatos, existe um interesse no desenvolvimento de cultivares para a criação de um banco de germoplasma. A propagação convencional desta planta ocorre principalmente por bulbilhos produzidos na inflorescência, o que se converte em um problema devido a lentidão do processo de floração que ocorre depois de 8 a 9 anos de cultivo em solo e raramente produz sementes férteis. Em vista da importância econômica desta planta e da lenta propagação convencional da mesma, torna-se necessário o desenvolvimento de pesquisas que estabeleçam protocolos para realizar propagação rápida e maciça, ampliando a técnica de cultivo de tecidos in vitro (Carvalho et al., 2006). As técnicas de engenharia genética, amplamente baseadas no cultivo de tecidos, possibilitam a superação dos limites ambientais e de tempo, no cultivo de espécies de ampla difusão, contribuindo para a solução de numerosos impasses relacionados aos países subdesenvolvidos e aos industriais ameaçados do perigo de contaminação ambiental. Grattapaglia e Machado (1998), assim como Gonzáles et al., (2002) destacam a importância do tipo de explante, bem como a espécie utilizada e sua subsequente manipulação nos resultados obtidos, desta forma, a micropropagação pode ser conduzida por: multiplicação por meio de proliferação de gemas axilares; multiplicação mediante indução de gemas adventícias por organogênese direta e indireta e multiplicação via embriogênese somática. A organogênese constitui um importante método de propagação in vitro de plantas em que a multiplicação mediante indução de gemas adventícias se dá de forma indireta ou direta, nesta, ocorre o surgimento direto de gemas a partir de tecidos que apresentam potencial morfogenético na planta in vivo, mas que em geral não se expressam. Já a fase de organogênese indireta ocorre quando o processo de regeneração de gemas é precedido pela formação de calo (Grattapaglia; Machado, 1998). Através desta prática vários milhares de plantas clonadas podem ser propagadas em poucos meses, a partir de uma única planta mãe. Um método eficiente permite a seleção de materiais de alto rendimento, de alta qualidade, seleção dos clones indesejados (com mínima variabilidade genética) e produção das unidades saudáveis para o plantio (Robert et al., 2008). Ferreira et al. (1998) destaca que a cultura in vitro permite que o material genético possa ser enviado a diferentes regiões do território nacional ou utilizado em intercâmbio internacional. Por fim vale reiterar que a propagação in vitro, apesar de requerer um grande custo benefício, tendo em vista os gastos com a montagem de um laboratório apropriado com mão-deobra qualificada e com os equipamentos e produtos necessários, é uma técnica que possibilita uma ampla produção em escala comercial de plantas de qualidade, selecionadas e livres de patógenos, além do elevado número de plantas obtidas em um curto período de tempo, o que torna esse dispendioso valor justificável. Neste contexto objetivou-se com este trabalho regenerar rebentos do agave Híbrido utilizando-se combinações dos reguladores de crescimento BAP (6- benzilaminopurine) e 2,4D (ácido 2,4-diclorofenoxiacético) na micropropagação de rebentos e a auxina AIB (ácido indolil-3-butírico) para indução da rizogênese.

3 2. MATERIAL E MÉTODOS Indução de superbrotamento Foram utilizadas como plantas-mãe rebentos de sisal do gênero Agave, o Híbrido 11648, cultivado na Embrapa Algodão. Plantas de 25 a 40 cm de altura, saudáveis foram selecionadas no campo e levadas para casa de vegetação para um pré-condicionamento. Após este período os bulbos foram levados para o Laboratório de Cultivo de tecidos da Embrapa Algodão, onde foram desinfestados em solução de formaldeído a 1%; em solução de NaOCl a 2%; em solução de fungicida a 0,3% contendo Euparen e Monceren; em álcool a 70% e em solução de 100 mg/l do antibiótico Rifampicina. Após os procedimentos de desinfestação os explantes foram separados: em gemas apicais (tipo 1) e gemas laterais (tipo 2), e em seguida inoculados em meio básico MS suplementados com as combinações dos reguladores de crescimento: TS1: 2,00 mg/l BAP + 0,02 mg/l 2,4D; TS2: 3,00 mg/l BAP + 0,02 mg/l 2,4D; TS3: 5,00 mg/l BAP + 0,02 mg/l 2,4D; TS4: 10,00 mg/l BAP+ 0,02 mg/l 2,4D; TS5: 12,00 mg/l BAP + 0,02 mg/l 2,4D. Todos os meios utilizados foram adicionados 0,3% de Glicose e 0,62% de Gelrite e ph ajustado para 5,7. Utilizou-se o delineamento inteiramente casualizado, em arranjo fatorial de 5x2 (cinco meios de cultivo e dois tipos de explantes), totalizando 10 tratamentos. Com 5 repetições por tratamento para os explantes tipo 1, e 10 repetições para os de tipo 2, onde cada repetição foi constituída por um frasco de cultivo, com um explante por frasco. A avaliação dos explantes foi realizada, aos 45 dias de cultivo, quanto a presença de broto, número de brotos, e tamanho de brotos. Em seguida foram subcultivados para o meio MS sem regulador de crescimento, para o alongamento dos brotos. Indução de das gemas Aproximadamente após 100 dias em meio de alongamento, na câmara de fluxo laminar, as gemas foram separadas e, em seguida inoculadas em MS suplementados com três concentrações de ácido indolil-3-butírico (AIB): 0,0 mg/l, 0,5 mg/l e 1,0 mg/l. O delineamento utilizado foi inteiramente casualizado em arranjo fatorial de 3x2 (três concentrações de auxina e dois período de avaliação), totalizando 6 tratamentos. Com 10 repetições por tratamento, onde cada repetição era constituído por um tubo de ensaio com um broto por tubo. As avaliações foram realizadas em dois períodos: 15 e 30 dias de cultivo, (observando-se duas variáveis: número de raízes e tamanho dos brotos). Em todos os casos a incubação foi mantida a 25±2ºC sob o fotoperíodo de 16 h de luz e intensidade luminosa de 30 µmol m -2 s -1. Tanto na indução de superbrotamento como no das gemas, os dados originais foram transformados em x+1 e analisados estatisticamente, pelo software Statistical Analysis System (SAS), versão (SAS\STAT, 2000), enquanto as médias comparadas pelo teste de Tukey, a 5% de probabilidade. Aclimatização As plântulas que apresentaram o sistema radicular desenvolvido foram aclimatizadas em copos de propileno contento substrato de turfa e vermiculita estéril. Feito este processo, as plântulas foram devidamente incubadas em BOD (Biochemical oxygen demand) onde permaneceram por 20 dias, sendo após este período levadas para casa de vegetação. Resultados e Discussão

4 Na tabela 1, encontram-se os resultados obtidos com as concentrações MS + BAP + 2,4D. Verifica-se que com essas concentrações obtiveram-se: presença, número e tamanhos de brotos, bem como, superbrotamento. Entretanto, não houve efeito siginificativo dessas concentrações em relação as variáveis estudadas, comprovando-se que mesmo em pequenas concetrações dos fitohormonios pode-se auferir resultados positivos. Deste modo, constata-se nesta pesquisa um valor econômico favorável quando se utilizam reduzidos teores de fitohormonios, pois esta simularidade de resultados entre maiores e menores concentrações, permite um maior custo benefício, quando ponderado os valores no mercado dos fitohomônios utilizados e dissolvidos os custos com a quantidade de plantas de qualidade, produzida em um curto período de tempo. Observa-se ainda na Tabela 1, que o explante 1 (gema apical) foi superior ao explante 2 (gema lateral). Provavelmente, essa diferença deve-se ao fato das gemas apicais em desenvolvimento inibirem o crescimento das gemas laterais ou axilares. Tabela 1. Valores médios dos fatores concentração e explante. Campina Grande-PB, Fatores Variáveis Presença de brotos (1) Número de brotos (1) Tamanho de broto Superbrotamento (1) Concentração (mg/l) MS+2,0 BAP + 0,02 2,4D 1,121±0,05a 1,279±0,09a 1,740±0,50ª 0,879±0,06a MS+3,0 BAP + 0,02 2,4D 1,017±0,07a 1,149±0,11a 2,153±0,63ª 0,845±0,06a MS+5,0 BAP + 0,02 2,4D 1,086±0,06a 1,345±0,15a 2,766±0,95ª 0,845±0,06a MS+10,0 BAP + 0,02 2,4D 1,052±0,06a 1,333±0,15a 2,140±0,78ª 0,914±0,06a MS+12,0 BAP + 0,02 2,4D 1,087±0,06a 1,380±0,15a 1,720±0,48ª 0,948±0,06a Explante Explante 1 1,225±0,00a 1,568±0,05a 4,588±0,56ª 1,079±0,04a Explante 2 0,997±0,04b 1,162±0,07b 0,862±0,19b 0,789±0,03a Médias seguidas de letras iguais dentro de cada fator não diferem significativamente entre si pelo Teste de Tukeya 5% de probabilidade. (1) Dados originais transformados em x 1. São fatores preponderantes para o sucesso no processo de multiplicação in vitro o tipo e a concentração de citocinina utilizada variando de acordo com a espécie a qual se estuda. Grattapaglia e Machado, (1998) e Carvalho et al. (2004) estudando algumas espécies de gênero Agave, assim como, Batista et al (2001) com o gergelim (Sesamum indicum L.) abordaram em suas pesquisas a eficácia do uso da citocinina 6-benzilaminopurina (BAP) na indução do superbrotamento em gemas axilares e cotiledonares. O acréscimo de fitorreguladores em meios de cultura visa em especial suprir possíveis carências de teores endógenos de hormônios nos explantes que se encontram isolados das regiões produtoras na planta matriz. Concomitantemente, a adição de fitorreguladores estimula algumas respostas como alongamento ou multiplicação da parte aérea como no caso do sisal (Grattapaglia; Machado, 1998). Para efeito deste trabalho foi possível perceber a relevância da utlização da citocinina BAP combinada a auxina 2,4D na indução a organogenese e consequentemente a multiplicação das gemas. Com relação aos resultados alcançados com os tipos de explante, expostos na Tabela 1, saliente-se o trabalho de Raven et al (2007), do qual se aufere que a dominância das gemas apicais, para diversas espécies vegetais, resulta do fluxo basípeto de auxinas oriundas destas gemas em desenvolvimento, o qual inibe o crescimento de gemas laterias ou auxilares. Assim sendo, justifica-

5 se que o explante 1, procedente de gemas apicais, seja superior ao explante 2, originários de gemas laterias, quanto as variáveis analisadas, destacando-se a variável tamanho de broto. Deste modo, a exposição de auxina nas gemas apicais caracteriza o seu rápido desenvolvimento, impedindo, consequentemente o crescimento das gemas laterias de maneira espontânea, mesmo sendo os dois explantes submetidos a iguais concentrações adicionais dos fitohormônios (BAP e 2,4D). Enraizamento in vitro dos brotos Na tabela 2 encontram-se os valores médios dos fatores concentração e período de permanência in vitro das plantinhas no estádio de. Por esta tabela pode-se observar a superioridade da concentração 1,0 mg/l de AIB apenas para a variável número de raízes, quando confrontado com a concentração 0,0 mg/l de AIB. Todavia, a primeira não difere significativamente quando comparada com 0,5 mg/l de AIB para o mesmo fator. Observa-se ainda pela mesma tabela que não houve influência das concentrações com relação ao tamanho de brotos. Contudo, para o fator período de observação do, evidenciou-se que apenas tamanho de brotos apresentam variação significativa quando comparada com número de raízes como se constata na Tabela 2. As avaliações dos valores médios dos fatores concentração e período foram comparadas pelo Teste de Tukey a 5% de probabilidade. Tabela 2. Valores médios dos fatores concentração e período. Campina Grande- PB, Fatores Variáveis Número de raízes (1) Tamanho de broto Concentração (mg/l) MS + 0,0 AIB 2,308±0,26b 4,725±0,26a MS + 0,5 AIB 3,162±0,36ab 5,255±0,42a MS + 1,0 AIB 3,849±0,44a 4,820±0,33a Período 15 dias 2,965±0,31a 4,306±0,18b 30 dias 3,248±0,32a 5,560±0,31a Médias seguidas de letras iguais dentro de cada fator não diferem significativamente entre si pelo Teste de Tukey a 5% de probabilidade. (1) Dados originais transformados em x+1. O uso de concentrações adequadas de AIB é de extrema importância, e a dose ideal varia com a espécie (Hartmann et al., 2002). Em alguns casos, baixos níveis de auxina são também necessários para o alongamento da raiz, embora altas concentrações atuem inibindo o crescimento desse órgão (Taiz; Zeiger, 2004). Paiva e Gomes (2001), afirmam que o meio influencia na qualidade do sistema radicular e não apenas na porcentagem de, ponderando que o tipo de raiz influência na adaptação das plantas ao meio ex vitro, Grattaplagia e Machado (1990) ressaltam que quanto mais curtas as raízes, mais ativo o seu crescimento e maior a probabilidade de adequação das plantas. E neste contexto o ácido indolbutírico (AIB) é comprovadamente uma auxina eficaz na indução a formação do sistema radicular, o que de acordo com Karhu (1997) se deve à sua menor mobilidade e maior estabilidade química no corpo da planta. Conforme Grattapaglia e Machado (1990) e Woodhead e Bird (1998) a rizogênese, ou in vitro é dividido em três etapas: indução, iniciação e alongamento, onde a duração

6 de cada fase é compreendida entre 7 a 21 dias, variando de acordo com a espécie e das condições de cultivo que esta é exposta, o que explica a significância nesta pesquisa apenas para a variável tamanho de broto, tendo em vista que no período de 30 dias a planta não mais emite raízes, mas apenas alonga as já existentes. Neste mesmo sentido, Oliveira et al. (2001), afirmam que brotos micropropagados de bananeira com tamanho inferior a 1,5 cm carecem de uma maior permanência em meio de in vitro visando o alongamento destes, no intuito de evitar grandes perdas na fase de aclimatação Analisando-se as Figuras A, B, C, D, E e F visualiza-se a superioridade das gemas apicais em relação as gemas laterias. Nas figuras G, H, I, J, L e M observam-se em todas elas a capacidade das plantinhas emitirem sistema radicular. Fato igualmente evidenciado por Nascimento et al. (2008) ao testar diferentes concentrações da auxina AIB na indução da rizogênese da uvaieira (Eugenia pyriformis), o qual através de análises estatísticas comprovou que houve formação de raízes em todas as concentrações testadas, mesmo na ausência do regulador de crescimento (10% de ). Observou ainda, o mesmo autor, que as maiores médias quanto à variável de número de raízes foram obtidas na presença de 1,0 e 2,0 mg/l de AIB, concordando com os resultados encontrados na cultura do sisal. Aclimatação Tendo em vista completar o ciclo do desenvolvimento e ser esta uma etapa crítica e decisiva em todo o processo de propagação in vitro, o sisal respondeu bem à fase de aclimatação com a utilização do substrato de turfa e vermiculita anteriormente esterilizada, como pode ser observado nas Figuras N e M. De acordo com Jabur e Martins (2002), a seleção do substrato é de grande importância, pois é onde o sistema radicular irá desenvolver-se, auxiliando no crescimento da parte aérea da muda. Neste mesmo sentido, Cunha et al. (2006) e Araújo Neto et al. (2002), afirmam que o substrato deve reunir características físicas e químicas como maior teor de matéria orgânica que promovam, respectivamente, a retenção de umidade e disponibilidade de nutrientes, de modo que atendam às necessidades da planta. Resultados semelhantes, porém utilizando como substrato uma mistura de turfa com perlite, foram obtidos por González et al. (2000) em plantas de Vacciniun corymbosum L. cv. Berkeley. Observa-se na figura M, que as plantinhas após transferidas para o substrato, foram cobertas com copos de polipropileno, os quais eram pulverizados durante 7 dias afim de simular uma câmara úmida, pois conforme abordado por Souza et al. (2006) a perda excessiva de água pelas plantas propagadas in vitro é definida como uma característica preponderante no processo de aclimatação. Segundo o mesmo autor, esta prática é utilizada tendo em vista que o transplante das plantas in vitro para o meio de aclimatação acarreta um estresse hídrico, sendo dessa forma necessário manter a umidade alta e a temperatura amena, em especial na fase inicial do processo.

7 ISSN Volume 09 Número Ensaio de multiplicação. A. Explante tipo 2 (gemas laterais) com 15 dias de cultivo. B. Explante tipo 2 com 45 dias de cultivo. C. Explante tipo 2 com 100 dias de cultivo. D. Explante tipo 1 (gemas apicais) com 15 dias de cultivo. E. Explante tipo 1 com 45 dias de cultivo. F. A B C Explante tipo 1 com 100 dias de cultivo. 2. D E F Ensaio de Enraizamento. G. Broto com 15 dias de 1,0 mg/l de AIB. H. Broto com 15 dias de 0,5 mg/l de AIB. I. Broto com 15 dias de 0,0 mg/l de AIB. J. Broto com 30 dias de 1,0 mg/l de AIB. L. G H I Broto com 30 dias de 0,5 mg/l de AIB. M. Broto com 30 dias de 0,0 mg/l de AIB. N e O.; Aclimatação. J L M N O

8 Conclusões ISSN Volume 09 Número Com a realização desta pesquisa foi possível concluir que: Mesmo em menores concentrações os fitorreguladores 6-benzilaminopurine (BAP) e ácido 2,4- diclorofenoxiacético (2,4D), induzem a organogênese direta em gemas apicais e laterais e consequentemente a multiplicação destas, quando provenientes de rebentos de sisal; Explantes oriundos de gemas apicais se sobressaem nas variáveis: presença de broto, número de brotos, tamanho de brotos e superbrotamento quando comparados com explantes de gemas laterais. No processo de rizogênese todas as concentrações da auxina 4-indol-3-butírico (AIB) utilizadas induziram a formação do sistema radicular, com superioridade da dose de 1,0 mg/l de AIB para o número de raízes. Na etapa de aclimatação, as plantas responderam satisfatoriamente a utilização do substrato turfa e vermiculita previamente esterilizado.

9 Referências ISSN Volume 09 Número Araújo Neto, S. E. Et Al. Desenvolvimento De Mudas De Maracujazeiro Amarelo Com Uso De Diferentes Substratos E Recipientes. In: Congresso Brasileiro De Fruticultura, 2002, Belém. Anais Do Congresso Brasileiro De Fruticultura, Belém, P. 17. Batista, R. C. Et Al. Micropropagação In Vitro De Três Cultivares De Gergelim. Revista De Oleaginosas E Fibrosas. Campina Grande: Embrapa Cnpa, V.5, Nº3. P , Carvalho, J. M. F. C. Et Al. Indução In Vitro De Superbrotamento Em Gemas De Espécies Do Gênero Agave. Revista Brasileira De Oleaginosas E Fibrosas. Campina Grande, V.8, N.2/3, P , 2004.Carvalho, J. M. F. C. Et Al. Multiplicação In Vitro De Sisal. Campina Grande: Embrapa Algodão, Comunicado Técnico, 280, Carvalho, J. M. F. C.; Sena, D. V. A.; Técnicas Do Cultivo In Vitro No Sisal, Campina Grande: Embrapa Algodão, Documentos, 208, Cunha, A. M. Et Al. Efeito De Diferentes Substratos Sobre O Desenvolvimento De Mudas De Acacia Sp. Revista Árvore. Viçosa-Mg, V.30, N.2, P , Ferreira, M. E.; Caldas, L. S.; Pereira, E. A. Aplicações Da Cultura De Tecidos No Melhoramento Genético De Plantas. In: Torres, A. C.; Caldas, L. S.; Buso, J. A. (Ed.). Cultura De Tecidos E Transformação Genética De Plantas. Brasília: Embrapa-Spi / Embrapa-Cnph, V.1. P Gondim, T. M. S.; Souza, L. C. Caracterização De Frutos E Sementes De Sisal. Campina Grande: Embrapa Algodão, Circular Técnica, 127, Gonzalez, M.V.; Lopez, M. Valdes, A.E.; Ordas, R.J. Micropropagation Of Three Berry Fruit Species Using Nodal Segments From Field-Grown Plants. Annals Of Applied Biology. Cambridge, V. 137, P.73-78, Gonzáles, E. R.; Andrade, A. De.; Bertolo, A. L.; Et Al. Transformação Genética Do Eucalipto. Biotecnologia Ciência E Desenvolvimento, V.5, N. 26, P Grattapaglia, D.; Machado, M. A. Micropropagação. In: Torres, A.C.; Caldas, L.S. (Eds.). Técnicas E Aplicações Da Cultura De Tecidos De Plantas. Brasília: Embrapa-Cnph. P Grattapaglia, D.; Machado, M. A. Micropropagação. In: Torres, A. C.; Caldas, L.; Buso, J. A. Cultura De Tecidos E Transformação Genética De Plantas. Brasília: Embrapa- Spi/ Embrapa- Cnph, V.1 P Hartmann, H. T. Et Al. Plant Propagation: Principles And Practices. 7. Ed. New Jersey: Prentice Hall, p. Jabur, M. A.; Martins, A. B. G. Influência De Substratos Na Formação Dos Porta-Enxertos: Limoeirocravo (Citrus Limonia Osbeck) E Tangerineiracleópatra (Citrus Reshni Hort. Ex Tanaka) Em Ambiente Protegido. Revista Brasileira De Fruticultura, V.24, N.2, P , 2002.

10 Karhu, S.T. Rooting Of Blue Honeysuckle Microshoots. Plant Cell, Tissue And Organ Culture. The Netherlands. V. 48, N. 3, P , Moreira, J. A. N. Et Al. Declínio Do Sisal E Medidas Para Seu Soerguimento No Nordeste Brasileiro. Campina Grande: Embrapa - Algodão, p. (Embrapa- Algodão. Documento, 45). Nascimento, A.C. Et Al. Bap E Aib No Cultivo In Vitro De Eugenia Pyriformis Cambess. Revista Acadêmica Ciências Agrárias Ambientais, Curitiba, V. 6, N. 2, P , Oliveira, R. P.; Silveira, D. G.; Silva, S. O. Concentração De Bap E A Eficiência De Micropropagação De Bananeira Tetraplóide (Grupo Aaab). Scientia Agrícola, Piracicaba, V. 58, N. 1, P , Paiva, H. N.; Gomes, J. M. Propagação Vegetativa De Espécies Florestais. Viçosa, Mg: Universidade Federal De Viçosa, p. (Boletim 322). Raven, P. H.; Evert, R. F.; Eichhorn, S. E. Biologia Vegetal. 7ª Ed. Rio De Janeiro: Guanabara Koogan, Robert, M. L. Et Al. An Efficient Method For The Micropropagation Of Agave Species. Methods In Molecular Biology, Vol. 318: Plant Cell Culture Protocols, 2ª Ed. Totowa: Nj Sas/Stat User`S Guide. In: Sas Institute. Sas Online Doc: Version. Cary, 2000.Cd Rom. Souza, F. V. D.; Costa, M. A. P. C.; Silva Neto, H. P. Aclimatização. In: Souza, A. S.; Junhans, T. G.(Org.). Introdução A Micropropagação De Plantas. Cruz Das Almas: Embrapa Mandioca E Fruticultura Tropical, V. 1, P Taiz, L.; Zeiger, E. Fisiologia Vegetal. 3 Ed. Porto Alegre: Artmed, P. Woodhead, J. L.; Bird, K. T. Efficient Rooting And Acclimation Of Micropropagated Ruppia Maritima Loisel. Journal Of Marine Biotechnology, New York, V.6, N.3, P , 1998.